LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

LÊN MEN ETHANOL:
KHẢO SÁT SỰ SINH TRƯỞNG CỦA
NẤM MEN CỐ ĐỊNH TRONG GEL ALGINATE
Nhiệm vụ luận văn:
• Tiến hành quá trình lên men cồn bằng nấm men cố định theo phương pháp
chu kì.
• Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ lên men, pH ban đầu của môi trường và
nồng độ đường ban đầu đến sự sinh trưởng và khả năng tạo cồn của nấm men cố
định.

SVTH

: BÙI THANH HUYỀN

GVHD

: LÊ VĂN VIỆT MẪN


NHẬN XÉT CỦA
GIÁO VIÊN HƯỚNG DẪN
...................................................................................................................................
............................................................................................................................................
............................................................................................................................................
............................................................................................................................................
............................................................................................................................................
............................................................................................................................................
............................................................................................................................................
............................................................................................................................................

............................................................................................................................................
............................................................................................................................................
............................................................................................................................................
............................................................................................................................................
............................................................................................................................................
............................................................................................................................................
............................................................................................................................................
............................................................................................................................................
............................................................................................................................................


Xin chân thành cảm ơn thầy cô, gia đình và bạn bè đã giúp đỡ tôi
hoàn thành luận văn tốt nghiệp này.

i


MỤC LỤC
NHẬN XÉT CỦA
GIÁO VIÊN HƯỚNG DẪN...............................................................1
MỤC LỤC............................................................................................ii
MỤC LỤC CÁC HÌNH.......................................................................v
MỤC LỤC CÁC BẢNG...................................................................xii
LỜI MỞ ĐẦU...................................................................................xiv
CHƯƠNG 1..........................................................................................1
1. SƠ LƯỢC VỀ KĨ THUẬT CỐ ĐỊNH TẾ BÀO .....................................................1
1.1. Định nghĩa .........................................................................................................1
1.2. Ưu điểm của tế bào cố định so với tế bào tự do ..............................................1
1.3. Nhược điểm của tế bào cố định so với tế bào tự do..........................................2
2. CÁC PHƯƠNG PHÁP CỐ ĐỊNH TẾ BÀO............................................................3

2.1. Phương pháp gắn tế bào lên bề mặt chất mang ................................................3
2.2. Phương pháp kết nối tế bào...............................................................................4
2.3. Phương pháp bẫy...............................................................................................4
3. CỐ ĐỊNH TẾ BÀO TRONG GEL ALGINATE.....................................................6
3.1. Cơ chế tạo gel alginate ......................................................................................7

ii


3.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến tính chất của hạt gel................................................9
4. ỨNG DỤNG NẤM MEN CỐ ĐỊNH TRONG SẢN XUẤT ETHANOL............11
5. LÊN MEN CỒN BẰNG NẤM MEN Saccharomyces cerevisiae CỐ ĐỊNH
TRONG GEL ALGINATE.........................................................................................13
5.1. Đặc điểm nấm men Saccharomyces cerevisiae...............................................13
5.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh trưởng nấm men.......................................13
5.3. Sự sinh trưởng và hoạt tính của nấm men cố định .........................................16
5.4. Khả năng sinh tổng hợp cồn của nấm men cố định........................................18
5.5. Ảnh hưởng của phương pháp và thiết bị đến quá trình lên men ethanol bằng
nấm men cố định ....................................................................................................18
5.6. Ảnh hưởng của các yếu tố khác.......................................................................18

............................................................................................................19
CHƯƠNG 2........................................................................................20
1. NGUYÊN LIỆU......................................................................................................20
1.1. Nấm men..........................................................................................................20
1.2. Chất mang alginate..........................................................................................20
1.3. Môi trường lên men.........................................................................................21
1.4. Các hóa chất khác............................................................................................21
2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU..........................................................................22
2.1. Nội dung nghiên cứu........................................................................................22

2.2. Cố định tế bào nấm men trong gel alginate bằng phương pháp bẫy..............22
2.3. Khảo sát quá trình lên men cồn bằng nấm men cố định theo phương pháp chu
kì..............................................................................................................................23

CHƯƠNG 3........................................................................................26
1. ẢNH HƯỞNG CỦA NHIỆT ĐỘ ĐẾN SỰ SINH TRƯỞNG CỦA NẤM MEN
CỐ ĐỊNH TRONG GEL ALGINATE ......................................................................26
1.1. Bố trí thí nghiệm..............................................................................................26
1.2. Nhận xét về sự sinh trưởng của nấm men cố định trong gel alginate.............27
1.3. So sánh sự sinh trưởng của nấm men cố định và nấm men tự do (mẫu đối
chứng) ở cùng điều kiện nhiệt độ lên men.............................................................35
1.4. Hoạt tính của nấm men cố định trong các điều kiện nhiệt độ lên men khác
nhau.........................................................................................................................39
2. ẢNH HƯỞNG CỦA pH ĐẾN SỰ SINH TRƯỞNG CỦA NẤM MEN CỐ ĐỊNH
TRONG GEL ALGINATE ........................................................................................47
iii


2.1. Bố trí thí nghiệm..............................................................................................47
2.2. Sự sinh trưởng của nấm men cố định trên môi trường có giá trị pH ban đầu
khác nhau................................................................................................................47
2.3. So sánh sự sinh trưởng của nấm men cố định và nấm men tự do (mẫu đối
chứng) trên môi trường có pH ban đầu như nhau..................................................54
2.4. Hoạt tính của nấm men cố định trên các môi trường có giá trị pH ban đầu
khác nhau................................................................................................................58
3. ẢNH HƯỞNG CỦA NỒNG ĐỘ CHẤT KHÔ BAN ĐẦU ĐẾN SỰ SINH
TRƯỞNG CỦA NẤM MEN CỐ ĐỊNH TRONG GEL ALGINATE .....................64
3.1. Bố trí thí nghiệm..............................................................................................64
3.2. Sự sinh trưởng của nấm men cố định trên các môi trường có nồng độ chất
khô ban đầu khác nhau............................................................................................65

3.3. So sánh sự sinh trưởng của nấm men cố định và nấm men tự do (mẫu đối
chứng) trên môi trường có cùng nồng độ chất khô ban đầu .................................69
3.4. Hoạt tính của nấm men cố định trên các môi trường có nồng độ chất khô ban
đầu khác nhau..........................................................................................................72

CHƯƠNG 4........................................................................................78
1. KẾT LUẬN.............................................................................................................78
2. KIẾN NGHỊ............................................................................................................79

TÀI LIỆU THAM KHẢO................................................................80

iv


MỤC LỤC CÁC HÌNH
Hình 1: Đặc điểm cấu tạo của phân tử alginate [11]........................6
Hình 2: Cơ chế tạo gel theo phương pháp khuếch tán [11].............8
Hình 3: Cơ chế tạo gel theo phương pháp tạo gel bên trong [11]...8
Hình 4: Quá trình lên men cồn........................................................11
Hình 5: Tế bào nấm men Saccharomyces cerevisiae tự do..........16
Hình 6: Tế bào nấm men Saccharomyces cerevisiae trong mạng
lưới gel alginate..................................................................................16
Hình 7: Mật độ tế bào trong hạt (thí nghiệm 1, chu kì I)..............28
Hình 8: Mật độ tế bào ngoài hạt (thí nghiệm 1, chu kì I)..............28
Hình 9: Mật độ tế bào trong hạt (thí nghiệm 1, chu kì II).............29
Hình 10: Mật độ tế bào ngoài hạt (thí nghiệm 1, chu kì II)...........29
Hình 11: Mật độ tế bào trong hạt (thí nghiệm 3, chu kì I)............30
v



Hình 12: Mật độ tế bào ngoài hạt (thí nghiệm 3, chu kì I)............30
Hình 13: Mật độ tế bào trong hạt (thí nghiệm 3, chu kì II)...........31
Hình 14: Mật độ tế bào ngoài hạt (thí nghiệm 3, chu kì II)...........31
Hình 15: Mật độ tế bào trong hạt (thí nghiệm 5, chu kì I)............32
Hình 16: Mật độ tế bào ngoài hạt (thí nghiệm 5, chu kì I)............32
Hình 17: Mật độ tế bào trong hạt (thí nghiệm 5, chu kì II)...........33
Hình 18: Mật độ tế bào ngoài hạt (thí nghiệm 5, chu kì II)...........33
Hình 19: Mật độ tế bào trong mẫu kiểm chứng (thí nghiệm 2)....36
Hình 20: Sự thay đổi tổng mật độ tế bào trong bình lên men ở
30oC theo thời gian
(thí nghiệm 1 – 2)...............................................................................36
Hình 21: Mật độ tế bào trong mẫu kiểm chứng (thí nghiệm 4)....37
Hình 22: Sự thay đổi tổng mật độ tế bào trong bình lên men ở
35oC theo thời gian
(thí nghiệm 3 – 4)...............................................................................37
Hình 23: Mật độ tế bào trong mẫu kiểm chứng (thí nghiệm 6)....38
Hình 24: Sự thay đổi tổng mật độ tế bào trong bình lên men ở
40oC theo thời gian
(thí nghiệm 5 - 6)................................................................................38

vi


Hình 25: Sự thay đổi nồng độ chất khô trong quá trình lên men ở
30oC
(thí nghiệm 1 - 2)...............................................................................40
Hình 26: Sự thay đổi nồng độ đường khử trong quá trình lên men
ở 30oC
(thí nghiệm 1 - 2)................................................................................40
Hình 27: Sự thay đổi nồng độ chất khô trong quá trình lên men ở

35oC
(thí nghiệm 3 - 4)................................................................................41
Hình 28: Sự thay đổi nồng độ đường khử trong quá trình lên men
ở 35oC
(thí nghiệm 3 - 4)................................................................................41
Hình 29: Sự thay đổi nồng độ chất khô trong quá trình lên men ở
40oC
(thí nghiệm 5 - 6)................................................................................42
Hình 30: Sự thay đổi nồng độ đường khử trong quá trình lên men
ở 40oC
(thí nghiệm 5 - 6)................................................................................42
Hình 31: Ảnh hưởng của nhiệt độ lên men đến nồng độ cồn thu
được khi quá trình lên men kết thúc ..............................................43
Hình 32: Sự thay đổi pH trong quá trình lên men ở 30oC (thí
nghiệm 1 - 2).......................................................................................45
Hình 33: Sự thay đổi pH trong quá trình lên men ở 35oC (thí
nghiệm 3 - 4).......................................................................................45
vii


Hình 34: Sự thay đổi pH trong quá trình lên men ở 40oC (thí
nghiệm 5 - 6).......................................................................................46
Hình 35: Mật độ tế bào trong hạt (thí nghiệm 7, chu kì I)............48
Hình 36: Mật độ tế bào ngoài hạt (thí nghiệm 7, chu kì I)............48
Hình 37: Mật độ tế bào trong hạt (thí nghiệm 7, chu kì II)...........49
Hình 38: Mật độ tế bào ngoài hạt (thí nghiệm 7, chu kì II)...........49
Hình 39: Mật độ tế bào trong hạt (thí nghiệm 9, chu kì I)............50
Hình 40: Mật độ tế bào ngoài hạt (thí nghiệm 9, chu kì I)............50
Hình 41: Mật độ tế bào trong hạt (thí nghiệm 9, chu kì II)...........51
Hình 42: Mật độ tế bào ngoài hạt (thí nghiệm 9, chu kì II)...........51

Hình 43: Mật độ tế bào trong hạt (thí nghiệm 11, chu kì I)..........52
Hình 44: Mật độ tế bào ngoài hạt (thí nghiệm 11, chu kì I)..........52
Hình 45: Mật độ tế bào trong hạt (thí nghiệm 11, chu kì II).........53
Hình 46: Mật độ tế bào ngoài hạt (thí nghiệm 11, chu kì II).........53
Hình 47: Mật độ tế bào trong mẫu kiểm chứng (thí nghiệm 8)....55
Hình 48: Sự thay đổi tổng mật độ tế bào trong bình lên men theo
thời gian
(pH đầu 5,5 - thí nghiệm 7 – 8)........................................................55
Hình 49: Mật độ tế bào trong mẫu kiểm chứng (thí nghiệm 10). .56
viii


Hình 50: Sự thay đổi tổng mật độ tế bào trong bình lên men theo
thời gian
(pH đầu 3,5 - thí nghiệm 9 – 10)......................................................56
Hình 51: Mật độ tế bào trong mẫu kiểm chứng (thí nghiệm 12). .57
Hình 52: Sự thay đổi tổng mật độ tế bào trong bình lên men theo
thời gian
(pH đầu 2,5 - thí nghiệm 11 – 12)....................................................57
Hình 53: Sự thay đổi nồng độ chất khô trong quá trình lên men
(pH đầu 5,5 - thí nghiệm 7 - 8)........................................................59
Hình 54: Sự thay đổi nồng độ đường khử trong quá trình lên men
(pH đầu 5,5 - thí nghiệm 7 - 8)........................................................59
Hình 55: Sự thay đổi nồng độ chất khô trong quá trình lên men
(pH đầu 3,5 - thí nghiệm 9 - 10).......................................................59
Hình 56: Sự thay đổi nồng độ đường khử trong quá trình lên men
(pH đầu 3,5 - thí nghiệm 9 - 10)......................................................60
Hình 57: Sự thay đổi nồng độ chất khô trong quá trình lên men
(pH đầu 2,5 - thí nghiệm 11 - 12)....................................................60
Hình 58: Sự thay đổi nồng độ đường khử trong quá trình lên men

(pH đầu 2,5 - thí nghiệm 11 - 12)....................................................61
Hình 59: Ảnh hưởng của pH ban đầu đến nồng độ cồn thu được
khi quá trình lên men kết thúc........................................................61
Hình 60: Sự thay đổi pH trong quá trình lên men (pH đầu 5,5 - thí
nghiệm 7 - 8).......................................................................................63
ix


Hình 61: Sự thay đổi pH trong quá trình lên men (pH đầu 3,5 - thí
nghiệm 9 - 10).....................................................................................64
Hình 62: Sự thay đổi pH trong quá trình lên men (pH đầu 2,5 - thí
nghiệm 11 - 12)...................................................................................64
Hình 63: Mật độ tế bào trong hạt (thí nghiệm 13, chu kì I)..........65
Hình 64: Mật độ tế bào ngoài hạt (thí nghiệm 13, chu kì I)..........66
Hình 65: Mật độ tế bào trong hạt (thí nghiệm 13, chu kì II).........66
Hình 66: Mật độ tế bào ngoài hạt (thí nghiệm 13, chu kì II).........67
Hình 67: Mật độ tế bào trong hạt (thí nghiệm 15, chu kì I)..........67
Hình 68: Mật độ tế bào ngoài hạt (thí nghiệm 15, chu kì I)..........68
Hình 69: Mật độ tế bào trong hạt (thí nghiệm 15, chu kì II)........68
Hình 70: Mật độ tế bào ngoài hạt (thí nghiệm 15, chu kì II).........69
Hình 71: Mật độ tế bào trong mẫu kiểm chứng (thí nghiệm 14). .70
Hình 72: Sự thay đổi tổng mật độ tế bào trong bình lên men theo
thời gian
(nồng độ chất khô ban đầu 20oBx - thí nghiệm 13 – 14)...............70
Hình 73: Mật độ tế bào trong mẫu kiểm chứng (thí nghiệm 16). .71
Hình 74: Sự thay đổi tổng mật độ tế bào trong bình lên men theo
thời gian
(nồng độ chất khô ban đầu 25oBx - thí nghiệm 15 – 16 )..............71
x



Hình 75: Sự thay đổi nồng độ chất khô trong quá trình lên men
(nồng độ chất khô ban đầu 20oBx - thí nghiệm 13 - 14)...............73
Hình 76: Sự thay đổi nồng độ đường khử trong quá trình lên men
(nồng độ chất khô ban đầu 20oBx - thí nghiệm 13 - 14)...............73
Hình 77: Sự thay đổi nồng độ chất khô trong quá trình lên men
(nồng độ chất khô ban đầu 25oBx - thí nghiệm 15 - 16)...............74
Hình 78: Sự thay đổi nồng độ đường khử trong quá trình lên men
(nồng độ chất khô ban đầu 25oBx - thí nghiệm 15 - 16)...............74
Hình 79: Ảnh hưởng của nồng độ chất khô ban đầu đến nồng độ
cồn thu được khi quá trình lên men kết thúc.................................75
Hình 80: Sự thay đổi pH trong quá trình lên men
(nồng độ chất khô ban đầu 20oBx - thí nghiệm 13 - 14)...............76
Hình 81: Sự thay đổi pH trong quá trình lên men
(nồng độ chất khô ban đầu 25oBx - thí nghiệm 15 - 16)................77

xi


MỤC LỤC CÁC BẢNG
Bảng 1: Các ứng dụng của tế bào cố định trong alginate [5]........10
Bảng 2: Ứng dụng nấm men cố định trong sản xuất ethanol........12
Bảng 3: Các giá trị tối ưu đạt được trong nghiên cứu của Roukas
T..........................................................................................................16
Bảng 4: Bố trí các thí nghiệm...........................................................23
Bảng 5: Các phương pháp phân tích...............................................24
Bảng 6: Thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ..................27
Bảng 7: Tốc độ lên men (g/l.h) của nấm men ở các giá trị nhiệt độ
lên men khác nhau.............................................................................43
Bảng 8: Thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của giá trị pH ban đầu.47

Bảng 9: Tốc độ lên men (g/l.h) của nấm men ở các giá trị pH ban
đầu khác nhau....................................................................................62

xii


Bảng 10: Thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của nồng độ chất khô
ban đầu...............................................................................................64
Bảng 11: Tốc độ lên men (g/l.h) của nấm men trên các môi trường
có nồng độ chất khô ban đầu khác nhau.........................................75

xiii


LỜI MỞ ĐẦU
Kĩ thuật cố định tế bào bắt đầu được quan tâm nghiên cứu từ thập niên 1970. Từ
đó, các quá trình hóa sinh và sinh học sử dụng tế bào cố định ngày càng trở nên phổ
biến. Các phương pháp cố định tế bào rất phong phú và đa dạng. Trong đó, phương
pháp bẫy được ứng dụng nhiều trong các quá trình lên men công nghiệp do kĩ thuật cố
định khá đơn giản và phù hợp với nhiều loài vi sinh vật. Các công trình nghiên cứu về
tế bào cố định bằng phương pháp bẫy thường quan tâm đến việc lựa chọn chất mang,
điều kiện cố định tế bào, thời gian sử dụng hạt gel chứa tế bào và khả năng ứng dụng
tế bào cố định trong quá trình lên men liên tục. Tuy nhiên, chưa có công trình nghiên
cứu nào khảo sát về sự sinh trưởng của các tế bào khi được cố định trong mạng lưới
gel. Vấn đề này rất quan trọng vì nó không chỉ ảnh hưởng đến hiệu suất của quá trình
lên men mà còn liên quan trực tiếp đến quá trình thu nhận và tinh sạch sản phẩm cũng
như khả năng tái sử dụng các hạt gel chứa tế bào.
Trong khuôn khổ luận văn này, chúng tôi thực hiện quá trình lên men cồn sử
dụng nấm men Saccharomyces cerevisiae cố định trong gel alginate theo phương pháp
chu kì, khảo sát sự ảnh hưởng của nhiệt độ, pH đầu và nồng độ chất khô của môi

trường đến sự sinh trưởng và hoạt tính của nấm men cố định.

xiv


Chương 1: Tổng quan

CHƯƠNG 1

TỔNG QUAN
1. SƠ LƯỢC VỀ KĨ THUẬT CỐ ĐỊNH TẾ BÀO
1.1. Định nghĩa
Tế bào cố định được định nghĩa là tế bào được định vị trong một khu vực không
gian xác định mà vẫn giữ được hoạt tính sinh học. Các tế bào cố định có thể được sử
dụng trong phương pháp lên men liên tục hoặc trong phương pháp lên men chu kỳ [2,
5].
Kĩ thuật cố định tế bào chỉ ra một hướng mới trong việc thực hiện các quá trình
hóa sinh và sinh học như: sản xuất kháng sinh, enzyme, ethanol, acid và xử lý nước
thải (khử nitrogen và loại kim loại nặng ra khỏi nước thải),… Những tiềm lực của kĩ
thuật này đang được tiếp tục nghiên cứu [22].
1.2. Ưu điểm của tế bào cố định so với tế bào tự do
• Tạo điều kiện thuận lợi cho việc tách tế bào khỏi môi trường lên men, đơn
giản hóa khâu thu nhận sản phẩm trao đổi chất và sinh khối [2].
• Có thể tái sử dụng tế bào cho nhiều chu kì liên tiếp [2, 5, 8, 24].
• Cho phép tạo ra mật độ nấm men lớn trong thiết bị lên men [2, 8, 22, 24, 45].
• Cho phép thực hiện quá trình lên men liên tục với tốc độ dòng nạp liệu và tháo
sản phẩm khá cao mà tế bào ít bị rửa trôi [8, 22, 45].
• Cho phép điều khiển tốc độ sinh trưởng của vi sinh vật trong các hệ thống hoạt
động liên tục mà không phụ thuộc vào tốc độ pha loãng [2].
1



Chương 1: Tổng quan

• Có thể sử dụng các kích thước tối ưu của khối tập hợp vi sinh vật để thu được
hoạt tính cao nhất [2].
• Hạn chế sự ảnh hưởng của tạp khuẩn lên hoạt tính của tế bào [2].
• Tăng độ ổn định hoạt tính trao đổi chất của tế bào khi có sự thay đổi pH, nhiệt
độ hay sự có mặt của các chất ức chế trong môi trường lên men [2, 5, 45]. So với các
quá trình hóa học, các quá trình sinh học có ưu điểm là tiết kiệm năng lượng, ít gây ô
nhiễm môi trường do chúng thường diễn ra ở nhiệt độ tương đối thấp, áp suất thường
và ít tạo sản phẩm phụ. Tuy nhiên, các xúc tác sinh học lại rất dễ bị vô hoạt khi môi
trường thay đổi: nhiệt độ cao, pH quá acid hay quá kiềm, sự có mặt của dung môi hữu
cơ,… Vì vậy, cố định chúng là một trong những phương pháp hiệu quả để loại trừ các
bất lợi trên [5].
Như vậy, nếu tế bào cố định được giữ ở trạng thái sống bằng việc cung cấp đủ
các chất dinh dưỡng thích hợp và nếu chức năng sinh học của chúng hữu ích (trong
điều kiện lên men thuận tiện), các tế bào cố định này rất tiện lợi. Có thể coi các tế bào
sống cố định như các chất xúc tác sinh học có khả năng tự gia tăng số lượng và tự tái
tạo [5, 45, 46]. Hoạt tính xúc tác của tế bào sống cố định có thể duy trì trong thời gian
dài sử dụng để lên men liên tục hoặc lên men theo chu kì.
1.3. Nhược điểm của tế bào cố định so với tế bào tự do
• Không áp dụng được cho các quá trình lên men mà sản phẩm là sinh khối vi
sinh vật hay sản phẩm trao đổi chất nội bào.
• Một số chất mang có độ bền cơ học và hóa học thấp, dễ bị biến dạng, hòa tan
trong quá trình lên men [45].
• Trong trường hợp cố định tế bào trong mạng lưới gel, sự phát triển sinh khối
vi sinh vật cũng có thể phá hủy mạng lưới gel, dẫn đến sự rò rỉ và rửa trôi tế bào ra
khỏi chất mang. Khi đó, việc thu nhận và tinh sạch sản phẩm cũng phức tạp tương tự
như các quá trình lên men sử dụng tế bào tự do [5].

• Một số chất mang và phương pháp cố định có thể làm giảm hoạt tính của tế
bào.
• Chất mang cản trở sự khuếch tán của cơ chất và sản phẩm ra vào khối hạt [45].
• Chi phí cho chất mang và quá trình cố định tế bào khá cao nên sẽ ảnh hưởng
đến giá thành của sản phẩm [45].

2


Chương 1: Tổng quan

2. CÁC PHƯƠNG PHÁP CỐ ĐỊNH TẾ BÀO
Để sử dụng tốt tế bào cố định, ngoài việc bảo quản và nuôi cấy các dòng tế bào
có hoạt tính và đặc điểm như mong muốn, ta còn phải quan tâm đến việc lựa chọn
phương pháp cố định thích hợp cho từng loại tế bào, từng mục đích sử dụng cụ thể.
Việc này rất quan trọng vì dù có rất nhiều phương pháp cố định tế bào nhưng không có
phương pháp nào là lý tưởng cho mọi loại tế bào, mọi mục đích sử dụng.
Các phương pháp cố định tế bào có thể chia thành ba nhóm:
• Phương pháp gắn tế bào lên bề mặt chất mang (carrier – binding)
• Phương pháp kết nối tế bào (cross – linking)
• Phương pháp bẫy (entrapment)
Mỗi phương pháp đều có ưu điểm và nhược điểm riêng. Khi lựa chọn phương
pháp cố định, ta phải xem xét tới mục đích của việc cố định, đặc tính của tế bào, loại
phản ứng, loại thiết bị phản ứng,… [5]
2.1. Phương pháp gắn tế bào lên bề mặt chất mang
Phương pháp này dựa trên liên kết của tế bào với chất mang không tan trong
nước thông qua liên kết đồng hóa trị, liên kết ion, lực hấp phụ vật lý hay các liên kết
sinh học đặc trưng.
Các chất mang sử dụng trong phương pháp này rất đa dạng:
• Polysaccharide không tan trong nước: Cellulose, dextran, dẫn xuất agarose,…

• Protein: Gelatin, albumin,…
• Polimer tổng hợp: Dẫn xuất polysterene, nhựa trao đổi ion, polyurethane,…
• Vật liệu vô cơ: Gạch, cát, thủy tinh, gốm sứ, magnetite,…
Các chất mang này có thể được biến đổi thành những dẫn xuất thích hợp hay hoạt
hóa trước khi sử dụng [5].
Ưu điểm:
• Trong một số trường hợp, tế bào không bị rửa trôi khỏi chất mang do liên kết
giữa tế bào và chất mang khá bền vững (Ví dụ: Liên kết đồng hóa trị).
• Tế bào dễ dàng tiếp xúc với cơ chất vì tế bào được định vị trên bề mặt khối
chất mang.

3


Chương 1: Tổng quan

Nhược điểm:
• Trong trường hợp tế bào liên kết với chất mang bằng liên kết ion hoặc lực hấp
phụ vật lý, chúng bị rửa trôi ra khỏi chất mang khá dễ dàng.
• Khó tìm ra điều kiện tối ưu cho việc cố định tế bào.
• Hiệu suất gắn tế bào lên chất mang đôi khi khá thấp (40 – 60% so với tổng số
tế bào trước khi cố định) [5].
2.2. Phương pháp kết nối tế bào
Phương pháp này không dùng các chất mang mà sử dụng các tác nhân hóa học để
kết nối các tế bào với nhau tạo thành những khối hạt.
Các tác nhân thông dụng: Glutaraldehyde (nối các nhóm amino thông qua liên
kết base Shiff), diisocyanate (tạo liên kết nhóm urea và amino) [5].
Phương pháp này ít được sử dụng trong sản xuất công nghiệp do chất dinh dưỡng
trong môi trường lên men khó tiếp cận đến các tế bào tại vị trí trung tâm của khối hạt.
2.3. Phương pháp bẫy

So với các phương pháp trên, phương pháp bẫy tế bào trong các mạng lưới
polymer được sử dụng phổ biến nhất [24].
Phương pháp này có thể phân loại như sau [5]:
• Bao tế bào bằng hệ thống lỗ xốp (lattice type): Các tế bào được nhốt trong cấu
trúc mạng gel của một số loại polymer.
• Gói tế bào trong bao vi thể (microcapsule type): Tế bào được nhốt trong các
bao vi thể làm bằng các màng polymer bán thấm.
• Kiểu liposome: Tế bào được nhốt trong các màng lỏng từ các chất mang tính
lưỡng cực (amphiphatic).
• Kiểu membrane: Tế bào được tách khỏi môi trường bằng màng vi lọc hoặc
màng siêu lọc.
Phương pháp bẫy được sử dụng rất phổ biến để cố định tế bào vi sinh vật, thực
vật và động vật. Trong đó, phương pháp bao tế bào bằng hệ thống lỗ xốp là thông
dụng nhất. Các chất mang thường dùng để cố định tế bào theo kiểu này:
Polyacrylamide, alginate, carrageenan và một số loại polymer khác [5, 24, 45].

4


Chương 1: Tổng quan

Ưu điểm:
• Cấu trúc gel của chất mang bảo vệ tế bào khỏi sự ảnh hưởng của những biến
đổi bất lợi của môi trường bên ngoài hạt gel.
• Giữ được khả năng sống cao cho tế bào [45].
Nhược điểm:
• Các cơ chất có phân tử lượng lớn khó tiếp xúc với tế bào bị “nhốt bên trong
chất mang”.
• Khó khăn trong việc tái sử dụng chất mang [5].


5


Chương 1: Tổng quan

3. CỐ ĐỊNH TẾ BÀO TRONG GEL ALGINATE
Alginate là một chất đồng trùng hợp của acid D-mannuronic và acid L-guluronic
có nhiều trong thành phần các loài rong biển, đặc biệt là rong nâu [11].

Hình 1: Đặc điểm cấu tạo của phân tử alginate [11].
(a): Các monomer
(b): Cấu trúc phân tử
(c): Sự phân bố các phân đoạn.
Alginate thường được sử dụng để cố định tế bào vì có những ưu điểm [11]:
• Phổ biến trong thiên nhiên.
• Dễ sản xuất.
• Không độc đối với tế bào.
• Bền cơ học.
• Việc khuếch tán cơ chất và sản phẩm vào hay ra khỏi hạt gel alginate được
thực hiện dễ dàng.
• Kỹ thuật cố định đơn giản.

6


Chương 1: Tổng quan

3.1. Cơ chế tạo gel alginate
Có hai phương pháp cơ bản để tạo gel alginate: phương pháp khuếch tán
(diffusion gelation) và phương pháp tạo gel bên trong (internal gelation).

3.1.1. Phương pháp khuếch tán
Phương pháp khuếch tán được đặc trưng bằng việc cho các ion liên kết ngang
(như ion Ca2+) khuếch tán từ dung dịch lỏng bên ngoài vào giọt dung dịch alginate
[11].
Phương pháp khuếch tán được sử dụng rất rộng rãi trong kĩ thuật cố định tế bào.
Để cố định tế bào theo phương pháp này, người ta trộn dung dịch alginate trong nước
với huyền phù tế bào và nhỏ từng giọt hỗn hợp này vào dung dịch calcium chloride để
tạo thành các hạt calcium alginate không tan có chứa tế bào [2, 5].
Kĩ thuật này cho phép tạo gel nhanh, mỗi giọt dung dịch alginate tạo thành một
hạt gel chứa các tế bào vi sinh vật bên trong.
Một tính chất quan trọng khác của phương pháp khuếch tán là hạt gel tạo thành
có sự phân bố alginate không đồng đều, nồng độ alginate cao ở bề mặt hạt và giảm dần
vào tâm hạt. Nồng độ alginate trên bề mặt có thể cao gấp năm lần nồng độ của dung
dịch alginate ban đầu và nồng độ tại vùng tâm là bằng không. Sự không đồng nhất này
phụ thuộc vào phân tử lượng của alginate, nồng độ các ion tạo gel và không tạo gel
trong dung dịch [2, 11].
3.1.2. Phương pháp tạo gel bên trong
Phương pháp này tạo gel bằng cách đặt một nguồn các ion liên kết ngang ở dạng
vô hoạt vào dung dịch alginate và các ion được giải phóng dần dần để kết hợp với
alginate. Sự giải phóng các ion liên kết ngang được kiểm soát bằng cách thay đổi pH
hoặc sử dụng các muối ít tan (có độ hòa tan giới hạn). Đối với ion calcium, người ta
dùng các muối CaCO3, CaSO4 hoặc các phức của calcium với EDTA, citrate… [11]
So với phương pháp khuếch tán, phương pháp tạo gel bên trong tạo nên những
hạt gel có tính đồng nhất cao hơn do quá trình tạo gel xảy ra chậm hơn [2, 11].

7


Chương 1: Tổng quan


Hình 2: Cơ chế tạo gel theo phương pháp khuếch tán [11]

Hình 3: Cơ chế tạo gel theo phương pháp tạo gel bên trong [11]
GDL: D-glucono-δ-lactone

8


Chương 1: Tổng quan

3.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến tính chất của hạt gel
Alginate có một tính chất đặc biệt là có thể tạo gel ở nhiệt độ thường và hạt gel
tạo thành rất bền nhiệt. Hạt gel có thể được xử lý ở nhiệt độ cao mà không bị tan chảy.
Nhưng điều đó không có nghĩa là quá trình tạo gel ít phụ thuộc vào nhiệt độ. Ngược
lại, nhiệt độ ảnh hưởng rất lớn đến quá trình tạo gel. Trên thực tế, nhiệt độ có thể được
dùng để điều chỉnh quá trình tạo gel. Tính chất của hạt gel cũng thay đổi khi chúng
được tạo ra ở các nhiệt độ khác nhau [2, 11].
Ngoài ra, quá trình tạo gel alginate còn phụ thuộc vào nhiều yếu tố khác: nguồn
gốc, cấu tạo hóa học và nồng độ dung dịch alginate, nồng độ ion tạo gel, tỉ lệ giữa ion
tạo gel và không tạo gel, pH, sự có mặt của các tác nhân tạo phức (complexing agent)
như phosphate, citrate [2, 11].
Nhiều nghiên cứu cho thấy khi nồng độ alginate càng cao thì sự co rút của hạt gel
càng ít, mạng lưới gel sẽ nhiều hơn, hạt gel xốp và giữ nước nhiều hơn [2].
Theo A. Martinsen, các tính chất vật lý của hạt gel cũng phụ thuộc rất nhiều vào
thành phần cấu tạo, cấu trúc chuỗi và kích thước phân tử alginate. Hạt gel có độ bền cơ
cao nhất, độ co rút thấp nhất, có độ ổn định tốt nhất đối với các cation đơn trị và có độ
xốp tốt nhất khi alginate có hàm lượng acid L-guluronic chiếm hơn 70% và độ dài
trung bình của phân đoạn G cao hơn 15 gốc guluronic [29].
Cũng theo A. Martinsen, đối với alginate có phân tử lượng lớn hơn 2,4.10 5, độ
bền hạt gel không phụ thuộc vào phân tử lượng nữa [29]. Có thể giải thích điều này

như sau: Mạch phân tử alginate ngắn sẽ tạo thành các mắt lưới nhỏ. Alginate có mạch
phân tử dài hơn sẽ chứa nhiều gốc guluronic hơn và các mắt lưới tạo thành cũng có
kích thước lớn hơn. Khi kích thước mắt lưới đạt một giá trị nhất định thì dù có tăng độ
dài mạch phân tử thì cũng không làm thay đổi đáng kể kích thước của các mắt lưới [2].
Nghiên cứu của Martinsen và cộng sự [30] cho thấy:
• Tốc độ khuếch tán của serum albumin ra khỏi hạt gel calcium alginate phụ
thuộc vào nồng độ và thành phần uronic acid của alginate (tỉ lệ ManA/GulA), điều
kiện tạo hạt gel, pH, nhiệt độ.
• Hệ số khuếch tán giảm khi tăng nồng độ alginate, tăng tỉ lệ ManA/GulA và
giảm pH. Sự khuếch tán ra khỏi hạt gel có nồng độ alginate phân bố đều thì nhanh hơn
trường hợp hạt gel có alginate tập trung nhiều trên bề mặt.
• Nhiệt độ ảnh hưởng đến quá trình khuếch tán theo định luật Arrhenius với
năng lượng hoạt hóa 23kJ/mol.

9