Bài 1. ĐỊNH LƯỢNG VI SINH VẬT TỔNG SỐ
I. Nguyên tắc
Định lượng vi sinh vật bằng phương pháp đếm khuẩn lạc cho phép xác định số
lượng tế bào vi sinh vật còn sống hiện diện trong mẫu. Tế bào sống là tế bào có khả
năng phân chia tạo thành khuẩn lạc trên môi trường chọn lọc. Phương pháp này có đặc
điểm là cho phép định lượng chọn lọc vi sinh vật tùy môi trường và điều kiện nuôi
cấy. Phương pháp đếm khuẩn lạc có thể được thực hiện bằng kỹ thuật hộp trải hay hộp
đổ. Trong phương pháp này, cần thực hiện pha loãng mẫu thành nhiều độ pha loãng
bậc 10 liên tiếp sao cho có độ pha loãng với mật độ tế bào thích hợp để xuất hiện các
khuẩn lạc riêng lẻ trên bề mặt thạch với số lượng đủ lớn để hạn chế sai số khi đếm và
tính toán. Mật độ tế bào quá lớn làm các khuẩn lạc chồng chéo lên nhau hoặc tạo thành
màng sinh khối. Ngược lại, số lượng khuẩn lạc trên một đĩa quá nhỏ sẽ không có giá
trị thống kê. Số lượng khuẩn lạc tối ưu được đề nghị bởi các cơ quan có uy tín như
FDA, AOAC là 25 – 250 khuẩn lạc/đĩa.
Số lượng khuẩn lạc xuất hiện trên đĩa phụ thuộc vào lượng mẫu sử dụng, môi
trường và điều kiện ủ. Các tế bào trên đĩa không tăng trưởng và hình thành khuẩn lạc
với tốc độ như nhau, do vậy nhiều tế bào chưa kịp hình thành khuẩn lạc nếu thời gian
ủ không đủ dài. Thông thường, điều kiện nuôi cấy (môi trường, nhiệt độ, thời gian)
cần đảm bảo sao cho số khuẩn lạc xuất hiện tối đa. Phương pháp đếm khuẩn lạc dễ cho
sai số lớn nên cần thực hiện lặp lại trên ít nhất 2 đĩa. Ngoài ra, do có khả năng nhiều tế
bào hình thành chung một khuẩn lạc nên số đếm khuẩn lạc không nhất thiết trùng lặp
với số tế bào ban đầu được đưa lên môi trường nên kết quả đếm và mật độ tế bào ban
đầu được đưa lên môi trường nên kết quả đếm và mật độ tế bào thường được trình bày
bằng số đơn vị hình thành khuẩn lạc CFU/ml thay vì số tế bào/ml.
Mặc dù vẫn có một số nhược điểm nhưng phương pháp đếm khuẩn lạc vẫn là
phương pháp tốt nhất để xác định mật độ tế bào sống. Ngoài ra, phương pháp này còn
có ưu điểm là độ nhạy cao, cho phép định lượng vi sinh vật ở mật độ thấp trong mẫu.
Phương pháp này được sử dụng rộng rãi trong kiểm nghiệm vi sinh vật trong nước,
thực phẩm, bệnh phẩm, mỹ phẩm.
II. Nguyên liệu - Dụng cụ - Thiết bị
-

Mẫu mỹ phẩm: Phấn phủ Pond’s magic power
Đĩa petri
1


-

Ống nghiệm
Que cấy trải
Micropipette
Đầu típ (100μl, 1000μl)
Đèn cồn
Bộ kít bọc thức ăn
Cốc thủy tinh
Ống đong
Bình tam giác
Cân điện tử
Box cấy
Máy hấp
Bếp hồng ngoại

III. Môi trường - Hóa chất
-

-

Môi trường PCA nuôi cấy vi khuẩn:
Trypton
5g

Cao nấm men
2,5g
Glucose
1g
Agar
16g
Nước cất
1000ml
Môi trường PGA nuôi cấy nấm mốc:
Khoai tây
200g (khoai tây cắt lát, đun nhừ, chắt dịch chiết)
Glucose
20g
Agar
20g
Nước cất
1000ml

IV. Cách tiến hành

-

Thu mẫu:
Thu mẫu phấn phủ Pond’s magic power tại khu vực chợ D, thành phố Buôn Ma
Thuột, tỉnh Đắk Lắk. Mẫu mỹ phẩm này đã qua sử dụng.

Hình 1. Phấn phủ Pond’s magic power


Chuẩn bị:

2


-

Pha nước muối sinh lý vô trùng: Pha nước muối NaCl 0,9%. Phân phối vào các
ống nghiệm với thể tích 9ml/ống. Nút bông, báo và đem hấp khử trùng ở 1,5

-

atm/20 – 30 phút.
Pha chế môi trường và khử trùng: Pha chế môi trường PCA và PGA sau đó nút

-

bông và báo lại rồi đem hấp khử trùng.
Chuẩn bị đĩa petri chứa môi trường vô trùng: hấp khử trùng đĩa.
Chuẩn bị hộp đầu típ vô trùng: Cho đầu típ vào hộp petri, gói báo và đem hấp khử trùng.
Chuẩn bị que cấy trải: Cho que cấy vào giấy bạc, gói lại rồi đem hấp khử trùng.
Lưu ý: Để tiết kiệm thời gian, cần bố trí hấp 1 lần duy nhất cho các phần chuẩn bị trên.

-

Đổ đĩa: Đĩa môi trường phải được đổ trong điều kiện vô trùng ở box cấy (lau bằng
cồn 70o, UV trong 30 phút). Đổ đĩa phải được thực hiện dưới ngọn lửa đèn cồn.
Thao tác nhanh, chính xác, tránh mở nắp đĩa quá lâu, chạm tay vào bên trong đĩa
hoặc để bình môi trường đứng khi không đậy nút. Đĩa đổ xong cần đậy nắp lại và

-


ghi tên môi trường sau đó chờ môi trường đông hẳn mới sử dụng.
Các dụng cụ được cho vào box cấy trong quá trình bật UV: que cấy trải, ống
nghiệm chứa nước muối sinh lý, đĩa petri chứa môi trường, đầu típ, cốc thủy tinh

đựng đầu típ, bộ kít bọc thức ăn, diêm, cốc thủy tinh đựng cồn 70o.
 Tiến hành:
Cân mẫu: cân 1g phấn phủ.
Pha loãng mẫu tuần tự thành dãy các nồng độ thập phân: 10 -1, 10-2, 10-3. Mỗi bậc
pha loãng là 1/10 được thực hiện bằng cách dùng 1g mẫu thêm vào 9ml nước muối
sinh lý. Sau khi lắc kỹ sẽ được độ pha loãng 1/10. Tiếp tục tiến hành cho đến độ
pha loãng cuối cùng.

-

Hình 2.

Phương

pháp pha

loãng mẫu

Dùng
micropipette và đầu típ vô trùng, thao tác vô trùng chuyển 0,1ml dịch chứa vi sinh
vật ở độ pha loãng 10 -1, 10-2, 10-3 trải lên đĩa petri chứa 2 môi trường PCA và

-

PGA.
Nhúng đầu que cấy trải vào cồn 70 o, hơ qua ngọn lửa đèn cồn để khử trùng. Để

đầu que cấy nguội trong không gian vô trùng của ngọn lửa.
3


-

Mở đĩa petri, đặt nhẹ nhàng que cấy trải lên bề mặt thạch của đĩa petri. Dùng đầu
que cấy xoay, trải đều dịch giống lên bề mặt thạch. Trong khi trải, thực hiện xoay
đĩa một vài lần, mỗi lần khoảng ½ chu vi đĩa tạo điều kiện cho que cấy trải dịch

-

giống đều khắp bề mặt môi trường.
Đậy nắp đĩa petri, sử dụng bộ kít bọc thức ăn bọc kỹ đĩa, để đông tự nhiên.
Ủ các đĩa petri trong tủ ấm 30oC trong 24 – 48h cho đến khi xuất hiện các khuẩn lạc.
Lưu ý: Các thao tác pha loãng mẫu và cấy mẫu đều được thực hiện trong điều kiện

vô trùng ở box cấy, khử trùng tay bằng cồn 70 o. Cần ghi chú tên người thao tác, tên
chủng vi sinh vật, tên môi trường, ngày tháng tiến hành thí nghiệm lên tất cả các đĩa
petri, ống nghiệm môi trường, bình nuôi cấy,…

V. Kết quả


Ở môi trường nuôi cấy vi khuẩn PCA

Hình 3. Khuẩn lạc mọc trên trên môi trường PCA
-

Ở đĩa petri có độ pha loãng 10-1 đều xuất hiện khuẩn lạc đơn:

4


Đĩa 1: 11 khuẩn lạc/đĩa
Đĩa 2: 5 khuẩn lạc/đĩa
Ở đĩa petri có độ pha loãng 10-2 đều xuất hiện khuẩn lạc đơn:
+ Đĩa 1: 2 khuẩn lạc/đĩa
+ Đĩa 2: 1 khuẩn lạc/đĩa
Ở cả 2 đĩa petri có độ pha loãng 10-3 không xuất hiện khuẩn lạc đơn.
 Ở môi trường nuôi cấy vi khuẩn PGA
+
+

Hình 4. Khuẩn lạc mọc trên môi trường PGA
-

-

Ở đĩa petri có độ pha loãng 10-1 đều xuất hiện khuẩn lạc đơn:
+ Đĩa 1: 9 khuẩn lạc/đĩa
+ Đĩa 2: 3 khuẩn lạc/đĩa
Ở cả 2 đĩa petri có độ pha loãng 10-2 không xuất hiện khuẩn lạc đơn.
Ở cả 2 đĩa petri có độ pha loãng 10-3 không xuất hiện khuẩn lạc đơn.

VI. Kết luận
Hiện nay chưa có tiêu chuẩn nhà nước về vi sinh vật trong mỹ phầm. Một số chỉ
tiêu vi sinh vật thường được kiểm tra là tổng số vi khuẩn hiếu khí, tổng số nấm men,
nấm mốc, kiểm tra sự hiện diện của các vi sinh vật như Staphylococcus aureus, E. coli,
Candida albicans,…
Dựa vào số khuẩn lạc đếm được sau nuôi cấy, tính mật độ của VSV (vi khuẩn,

nấm mốc) theo công thức sau:
A (CFU/g hay CFU/ml) =
Trong đó:
A: Tổng số tế bào (đơn vị hình thành khuẩn lạc) trong 1g hoặc 1ml mẫu
5


N: Tổng số khuẩn lạc đếm được trên các đĩa đã chọn
ni: tổng số đĩa có số khuẩn lạc được chọn tại mỗi độ pha loãng
v: dung tích mẫu (ml) cấy vào mỗi đĩa
fi: độ pha loãng có số khuẩn lạc được chọn tại các đĩa đếm.
Tuy nhiên, trong thí nghiệm định lượng vi sinh vật tổng số trong mẫu mỹ phẩm
(phấn phủ Pond’s magic power) thì số lượng khuẩn lạc xuất hiện trong môi trường
nuôi cấy là quá ít nên không có giá trị thống kê (Số lượng khuẩn lạc tối ưu được đề
nghị bởi các cơ quan có uy tín như FDA, AOAC là 25 – 250 khuẩn lạc/đĩa). Do đó,
không thể áp dụng được công thức trên để xác định mật độ vi sinh vật.
Vì vậy, có thể kết luận rằng mẫu mỹ phẩm phấn phủ Pond’s magic power là mẫu
mỹ phẩm sạch, sự xuất hiện của vi sinh vật là không đáng kể.

6


Bài 2. MỘT SỐ PHẢN ỨNG SINH HÓA CỦA VI SINH VẬT
I. Thử nghiệm catalase
1. Nguyên tắc
Các vi sinh vật hiếu khí và kỵ khí tùy ý chứa chuỗi truyền điện tử có cytochrome
đều có enzyme catalase (trừ các Streptococcus spp.). Enzyme này là một trong các
thành viên của hệ thống các enzyme có vai trò bảo vệ tế bào khỏi các tổn thương bởi
các dẫn xuất độc tính cao của oxi phân tử trong tế bào hiếu khí và kỵ khí tùy ý. Các vi
sinh vật này có khả năng biến dưỡng năng lượng theo phương thức hô hấp với oxi là

chất nhận điện tử cuối cùng trong chuỗi truyền điện tử tạo H 2O2. Catalase thủy phân
H2O2 thành H2O và O2, ngăn cản sự tích tụ của phân tử có độc tính cao này trong tế
bào. Tuy nhiên, ngoài catalase, nhiều enzyme peroxidase khác trong hệ thống các
enzyme bảo vệ tế bào khỏi stress oxi hóa cũng có khả năng thủy phân H 2O2. Các
enzyme này cũng chỉ hiện diện ở các tế bào, vi sinh vật hiếu khí và kỵ khí tùy ý có khả
năng biến dưỡng năng lượng theo phương thức hô hấp hiếu khí. Sự thủy phân H 2O2 sẽ
giải phóng O2 được ghi nhận qua hiện tượng sủi bọt khí.
2H2O2

Catalase

2H2O + O2↑

2. Nguyên liệu - Dụng cụ - Hóa chất
-

Khuẩn lạc thuần từ môi trường PCA (bài 1)
Lam kính
Que cấy vòng
Đèn cồn
Micropipette
Đầu típ (100μl, 1000μl)
H2O2
Cốc thủy tinh

3. Cách tiến hành
Cần khử trùng que cấy, đầu típ, micropipette, lam kính cần được khử trùng bằng
cồn 70o.
Khử trùng đầu que cấy trên ngọn lửa đèn cồn cho đến khi nóng đỏ. Dùng que cấy
lấy một ít sinh khối từ khuẩn lạc thuần đặt lên một lam kính sạch, chà nhẹ. Dùng

micropipette nhỏ một giọt H2O2 lên sinh khối vi sinh vật trên phiến kính. Ghi nhận sự
sủi bọt.
4. Kết quả và nhận xét
7


Hình 5. Hoạt tính catalase ở 2 chủng vi sinh vật

Phản ứng dương tính được nhận thấy ở thí nghiệm trên chính là do các phân tử
oxy sinh ra làm xuất hiện bọt khí, điều này chứng tỏ rằng 2 chủng vi sinh vật đều có
hoạt tính catalase phân hủy H2O2 và giải phóng O2  2 chủng này đều là vi sinh vật kỵ
khí hoặc hiếu khí tùy ý.
2H2O2

Catalase

2H2O + O2↑

Hầu hết các vi sinh vật hiếu khí và kỵ khí tùy ý đều có hệ enzyme catalase.
Enzyme này là một trong các thành viên của hệ thống các enzyme có vai trò bảo vệ tế
bào khỏi các tổn thương bởi các dẫn xuất độc tính cao của oxi phân tử trong tế bào
hiếu khí và kỵ khí tùy ý.
Ngoài ra, các enzyme này có khả năng biến dưỡng năng lượng theo phương thức
hô hấp hiếu khí tạo năng lượng cho tế bào.
II. Thử nghiệm amylase
1. Nguyên tắc
Enzyme ngoại bào α – amylase xúc tác sự phân hủy tinh bột thành đường maltose.
Phân tử đường này có tính tan tốt hơn, có thể vào tế bào và được vi sinh vật dùng làm
nguồn năng lượng và carbon. Hoạt tính phân hủy tinh bột được phát hiện dựa theo
nguyên tắc sau đây. Tinh bột là một polysaccharide có cấu trúc không gian tương đối

phức tạp. Khi môi trường chứa tinh bột được nhuộm bằng iod, iod sẽ bị giữ lại trong
cấu trúc mạng không gian này của tinh bột và làm môi trường có màu xanh đậm. Nếu
8


vi sinh vật có khả năng phân giải tinh bột thì cấu trúc này bị phá vỡ, do đó sẽ xuất hiện
vòng phân giải trong suất bao quanh khuẩn lạc.
2. Nguyên liệu - Dụng cụ - Thiết bị
-

Khuẩn lạc thuần từ môi trường PCA (bài 1)
Đĩa petri
Que cấy vòng
Đèn cồn
Bộ kít bọc thức ăn
Cốc thủy tinh
Ống đong
Bình tam giác
Cân điện tử
Box cấy
Máy hấp
Bếp hồng ngoại

3. Môi trường - Hóa chất
-

Môi trường tinh bột:
Cao thịt

10g


Tinh bột

20g

Agar

20g

Nước cất

1000ml

4. Cách tiến hành

-

Chuẩn bị:
Pha chế môi trường và khử trùng: Pha chế môi trường PCA và môi trường tinh bột

-

sau đó nút bông và báo lại rồi đem hấp khử trùng.
Chuẩn bị đĩa petri chứa môi trường vô trùng: hấp khử trùng đĩa.
Lưu ý: Để tiết kiệm thời gian, cần bố trí hấp 1 lần duy nhất cho các phần chuẩn bị trên.

-

Đổ đĩa: Đĩa môi trường phải được đổ trong điều kiện vô trùng ở box cấy (lau bằng
cồn 70o, UV trong 30 phút). Đổ đĩa phải được thực hiện dưới ngọn lửa đèn cồn.

Thao tác nhanh, chính xác, tránh mở nắp đĩa quá lâu, chạm tay vào bên trong đĩa
hoặc để bình môi trường đứng khi không đậy nút. Đĩa đổ xong cần đậy nắp lại và

-

ghi tên môi trường sau đó chờ môi trường đông hẳn mới sử dụng.
Các dụng cụ được cho vào box cấy trong quá trình bật UV: que cấy vòng, đĩa petri

chứa môi trường, bộ kít bọc thức ăn, diêm, cốc thủy tinh đựng cồn 70o.
 Tiến hành:
Cấy ria vi khuẩn đã phân lập được ở bài 1 trên môi trường PCA để tạo giống thuần.
Khử trùng đầu que cấy trên ngọn lửa đèn cồn cho đến khi nóng đỏ. Mở nắp đĩa
petri chứa vi khuẩn, làm nguội que cấy và lấy giống, khử trùng lại đĩa.
9


-

Dùng một tay mở nắp đĩa petri chứa môi trường làm thuần, một tay ria đầu que
cấy trên bề mặt thạch. Ria trên bề mặt thạch theo những đường zigzac trên khoảng

-

¼ đĩa thạch. Tránh trường hợp đầu que cấy đâm vào môi trường làm lủng thạch.
Khử trùng que cấy trên ngọn lửa đèn cồn. Xoay đĩa petri ¼ vòng tròn.
Mở nắp đĩa petri chứa môi trường làm thuần và đợi que cấy nguội bằng cách áp đầu

-

que cấy lên nắp đĩa. Bắt đầu ria đường thứ hai từ một vị trí trên đường ria đầu tiên.

Tiếp tục ria các đường tiếp theo tương tự cho đến khi ria kín bề mặt thạch. Khử

-

trùng lại que cấy sau khi ria xong.
Đậy nắp đĩa petri, dùng bộ kít bọc thực ăn bọc kỹ đĩa, để đông tự nhiên.
Ủ các đĩa petri trong tủ ấm 30oC trong 24 – 48h cho đến khi xuất hiện các khuẩn lạc.
Lưu ý: Các thao tác cấy mẫu được thực hiện trong điều kiện vô trùng ở box cấy,

khử trùng tay bằng cồn 70 o. Cần ghi chú tên người thao tác, tên chủng vi sinh vật, tên
môi trường, ngày tháng tiến hành thí nghiệm lên tất cả các đĩa petri, ống nghiệm môi
trường, bình nuôi cấy,…
-

Cấy ria vi khuẩn từ môi trường PCA qua môi trường tinh bột trên đĩa petri: Các
bước tiến hành tương tự bước làm thuần giống.

5. Kết quả và nhận xét
Sau khi ủ trong tủ ấm một thời gian thì trên đĩa petri chứa môi trường tinh bột có
xuất hiện khuẩn lạc.
Sự xuất hiện khuẩn lạc chứng tỏ rằng vi sinh vật có khả năng tiết ra enzyme
amylase để phân giải tinh bột thành đường. Vi sinh vật sử dùng lượng đường này để
tạo nguồn dinh dưỡng và năng lượng giúp vi sinh vật sinh trưởng, phát triển.

10


Hình 6. Khuẩn lạc mọc trên môi trường tinh bột

III. Thử nghiệm gelatinase

1. Nguyên tắc
Một số vi sinh vật có thể tổng hợp nhóm enzyme gelatinase ngoại bào xúc tác sự
thủy phân của gelatin thành polypeptide và acid amin. Để nhận biết khả năng làm tan
gelatine của vi sinh vật, cơ chất này được bổ sung làm đông đặc môi trường nuôi cấy.
Sau khi cấy chủng, vi sinh vật có khả năng tiết gelatinase sẽ làm môi trường tan chảy
thành dạng lỏng.
2. Nguyên liệu - Dụng cụ - Thiết bị
-

Khuẩn lạc thuần từ môi trường PCA (bài 1)
Đĩa petri
Que cấy vòng
Đèn cồn
Bộ kít bọc thức ăn
Cốc thủy tinh
Ống đong
Bình tam giác
Cân điện tử
Box cấy
Máy hấp
Bếp hồng ngoại

3. Môi trường - Hóa chất
-

Môi trường gelatine:
NaCl

3g


K2HPO4

1,5g

KH2PO4

1,5g

Gelatine

4g

Glucose

0,05g

Pepton

0,1g

Cao thịt

5g

Agar

15g

Nước cất


1000ml

4. Cách tiến hành

-

Chuẩn bị:
Pha chế môi trường và khử trùng: Pha chế môi trường PCA và môi trường gelatine

-

sau đó nút bông và báo lại rồi đem hấp khử trùng.
Chuẩn bị đĩa petri chứa môi trường vô trùng: hấp khử trùng đĩa.
11


Lưu ý: Để tiết kiệm thời gian, cần bố trí hấp 1 lần duy nhất cho các phần chuẩn bị trên.
-

Đổ đĩa: Đĩa môi trường phải được đổ trong điều kiện vô trùng ở box cấy (lau bằng
cồn 70o, UV trong 30 phút). Đổ đĩa phải được thực hiện dưới ngọn lửa đèn cồn.
Thao tác nhanh, chính xác, tránh mở nắp đĩa quá lâu, chạm tay vào bên trong đĩa
hoặc để bình môi trường đứng khi không đậy nút. Đĩa đổ xong cần đậy nắp lại và

-

ghi tên môi trường sau đó chờ môi trường đông hẳn mới sử dụng.
Các dụng cụ được cho vào box cấy trong quá trình bật UV: que cấy vòng, đĩa petri

chứa môi trường, bộ kít bọc thức ăn, diêm, cốc thủy tinh đựng cồn 70o.

 Tiến hành:
Cấy ria vi khuẩn đã phân lập được ở bài 1 trên môi trường PCA để tạo giống thuần.
Khử trùng đầu que cấy trên ngọn lửa đèn cồn cho đến khi nóng đỏ. Mở nắp đĩa
-

petri chứa vi khuẩn, làm nguội que cấy và lấy giống, khử trùng lại đĩa.
Dùng một tay mở nắp đĩa petri chứa môi trường làm thuần, một tay ria đầu que
cấy trên bề mặt thạch. Ria trên bề mặt thạch theo những đường zigzac trên khoảng

-

¼ đĩa thạch. Tránh trường hợp đầu que cấy đâm vào môi trường làm lủng thạch.
Khử trùng que cấy trên ngọn lửa đèn cồn. Xoay đĩa petri ¼ vòng tròn.
Mở nắp đĩa petri chứa môi trường làm thuần và đợi que cấy nguội bằng cách áp đầu

-

que cấy lên nắp đĩa. Bắt đầu ria đường thứ hai từ một vị trí trên đường ria đầu tiên.
Tiếp tục ria các đường tiếp theo tương tự cho đến khi ria kín bề mặt thạch. Khử

-

trùng lại que cấy sau khi ria xong.
Đậy nắp đĩa petri, dùng giấy bọc thực ăn bọc kỹ đĩa, để đông tự nhiên.
Ủ các đĩa petri trong tủ ấm 30oC trong 24 – 48h cho đến khi xuất hiện các khuẩn lạc.
Lưu ý: Thao tác cấy mẫu được thực hiện trong điều kiện vô trùng ở box cấy, khử

trùng tay bằng cồn 70o. Cần ghi chú tên người thao tác, tên chủng vi sinh vật, tên môi
trường, ngày tháng tiến hành thí nghiệm lên tất cả các đĩa petri, ống nghiệm môi
trường, bình nuôi cấy,…

-

Cấy ria vi khuẩn từ môi trường PCA qua môi trường gelatine trên đĩa petri: Các

-

bước tiến hành tương tự bước làm thuần giống.
Khi trên đĩa petri chứa môi trường gelatine đã xuất hiện khuẩn lạc, kiểm tra hoạt
tính gelatinase của vi khuẩn bằng cách ấn nhẹ đầu que cấy lên bề mặt môi trường.

5. Kết quả và nhận xét

12


Hình 7. Khuẩn lạc mọc trên môi trường gelatine

Sau khi ủ trong tủ ấm một thời gian thì trên đĩa petri chứa môi trường gelatin có
xuất hiện khuẩn lạc, môi trường không chuyển màu và không bị biến đổi từ dạng rắn
sang dạng lỏng. Sở dĩ môi trường gelatine không bị biến đổi từ dạng rắng sang dạng
lỏng là do vi khuẩn không có khả năng tiết enzyme gelatinase.

13


Bài 3. ĐỊNH LƯỢNG COLIFORMS TỔNG SỐ
I. Nguyên tắc
Coliforms là những trực khuẩn gram âm không sinh bào tử, hiếu khí hoặc kỵ khí
tùy ý, có khả năng lên men lactose sinh acid là sinh hơi trong 37 oC trong 24 – 48 giờ.
Trong thực tế phân tích, Coliforms còn được định nghĩa là các vi khuẩn có khả năng

lên men sinh hơi trong khoảng 48 giờ khi được ủ ở 37 oC trong môi trường Lauryl
Sulphate Broth LSB và Brilliant Green Lactose Bile Salt.
Số lượng Coliforms trong mẫu nước, thực phẩm chứa mật độ thấp của nhóm vi
khuẩn này có thể được xác định bằng phương pháp MPN (Most Protable Number).
Phương pháp này dựa vào nguyên tắc mẫu được pha loãng thành một dãy thập phân
(hai nồng độ kế tiếp nhau khác nhau 10 lần); 3 hoặc 5 mẫu độ pha loãng thập phân liên
tiếp được ủ trong ống nghiệm chứa môi trường thích hợp có ống Durham. Mỗi nồng
độ pha loãng được ủ từ 3 đến 5 ống lặp lại. Theo dõi sự sinh hơi để định tính sự hiện
diện trong từng ống nghiệm, đây là các ống dương tính. Ghi nhận số ống nghiệm cho
phản ứng dương tính ở mỗi nồng độ pha loãng và dựa vào bảng MPN để suy ra số
lượng nhóm vi sinh vật tương ứng hiện diện trong 1g (hoặc 1ml) mẫu ban đầu.
II. Nguyên liệu - Dụng cụ - Thiết bị
-

Mẫu pate
Ống nghiệm
Ống Durham
Micropipette
Đầu típ (100μl, 1000μl)
Que cấy vòng
Đèn cồn
Bộ kít bọc thức ăn
Cốc thủy tinh
Ống đong
Bình tam giác
Cân điện tử
Box cấy
Máy hấp
Bếp hồng ngoại


III. Môi trường – Hóa chất
-

Môi trưởng Lauryl Sulphate Broth LBS (Môi trường phát hiện):
Triptose

20g

Lactose

5g
14


NaCl

5g

KH2PO4

2,75g

K2HPO4

2,75g

Lauryl sunfate 0,1g
Nước cất
-


1000ml

Môi trường Brilliant Green Bile Lactose Broth BGBL (Môi trường khẳng định):
Peptone

10g

Lactose

10g

Mật heo

20g

Brilliant green 0,0133g
Nước cất

1000ml

IV. Cách tiến hành


-

Thu mẫu:
Thu mẫu pate tại khu vực chợ D, thành phố Buôn Ma Thuột, tỉnh Đắk Lắk.
Chuẩn bị:
Pha nước muối sinh lý vô trùng: Pha nước muối NaCl 0,9%. Phân phối vào các
ống nghiệm với thể tích 9ml/ống. Nút bông, báo và đem hấp khử trùng ở 1,5


-

atm/20 – 30 phút.
Pha chế môi trường và khử trùng: Pha chế môi trường LSB và BGBL, phân phối
vào các ống nghiệm, mỗi ống nghiệm 10ml môi trường. Thả ống Durham vào các

-

ống nghiệm sau đó nút bông và báo lại rồi đem hấp khử trùng.
Chuẩn bị hộp đầu típ vô trùng: Cho đầu típ vào hộp petri, gói báo và đem hấp khử trùng.
Lưu ý: Để tiết kiệm thời gian, cần bố trí hấp 1 lần duy nhất cho các phần chuẩn bị trên.

-

Các dụng cụ được cho vào box cấy trong quá trình bật UV: que cấy vòng, ống
nghiệm chứa nước muối sinh lý, ống nghiệm chứa môi trường, micropipette, đầu típ,

cốc thủy tinh đựng đầu típ, bộ kít bọc thức ăn, diêm, cốc thủy tinh đựng cồn 70o.
 Tiến hành:
Cân mẫu: cân 1g pate
Pha loãng mẫu tuần tự thành dãy các nồng độ thập phân:10 -1, 10-2, 10-3. Mỗi bậc
pha loãng là 1/10 được thực hiện bằng cách dùng 1g mẫu thêm vào 9ml nước muối
sinh lý. Sau khi lắc kỹ sẽ được độ pha loãng 1/10. Tiếp tục tiến hành cho đến độ
-

pha loãng cuối cùng.
Dùng micropipette và đầu típ vô trùng, thao tác vô trùng chuyển 1ml dịch mẫu đã

-


pha loãng vào các ống môi trường LSB. Mỗi độ pha loãng lặp lại 3 lần.
Ủ các ống LSB ở 37oC trong 48 giờ.
15


-

Các ống nghiệm xuất hiện khí trong ống Durham được xếp là dương tính. Ghi

-

nhận số ống dương tính ở mỗi độ pha loãng.
Dùng que cấy vòng chuyển dịch từ các ống LSB dương tính sang môi trường BGBL.
Ủ các ống BGBL ở 37oC trong 48 giờ.
Ghi nhận các ống BGBL dương tính. Đếm số ống dương tính ở mỗi độ pha loãng
rồi tra bảng MPN để suy ra số lượng nhóm vi sinh vật tương ứng hiện diện trong
1g mẫu ban đầu.
Lưu ý: Các thao tác pha loãng mẫu và cấy mẫu được thực hiện trong điều kiện vô

trùng ở box cấy, khử trùng tay bằng cồn 70 o. Cần ghi chú tên người thao tác, tên chủng
vi sinh vật, tên môi trường, ngày tháng tiến hành thí nghiệm lên tất cả các đĩa petri, ống
nghiệm môi trường, bình nuôi cấy,…
V. Kết quả


Phát hiện Coliforms trong mẫu pate

Hình 8. Thí nghiệm phát hiện Coliforms trong mẫu pate


Trong môi trường LSB, ở ống nghiệm có độ pha loãng 10 -1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5 có
sự xuất hiện bọt khí trong ống Durham, môi trường LSB có màu vàng đục hơn so với
ban đầu. Những ống nghiệm ở các độ pha loãng còn lại không có sự xuất hiện của bọt
khí và màu của môi trường không thay đổi so với ban đầu.


Khẳng định sự có mặt của Coliforms trong mẫu pate

16


Hình 9. Thí nghiệm khẳng định sự có mặt của Coliforms trong mẫu pate

Trong môi trường BGBL, ở tất cả ống nghiệm có độ pha loãng 10 -1, 10-2, 10-3, 10-4,
10-5, 10-6 đều không thấy sự xuất hiện bọt khí trong ống Durham và màu môi trường
không bị thay đổi.
VI. Nhận xét
Môi trường LSB là môi trường phát hiện Coliforms nhưng không phải là môi
trường chọn lọc nên một số vi sinh vật khác vẫn có khả năng sử dụng lactose tạo acid
lactic và sinh hơi dẫn tới hiện tượng dương tính giả. Điều này nghĩa là trong ống
Durham có sự xuất hiện bọt khí nhưng lại không có sự xuất hiện của Coliforms.
Môi trường BGBL là môi trường khẳng định sự có mặt của Coliforms và đây là
môi trường chọn lọc của Coliforms. Trong ống Durham không xuất hiện bọt khí chứng
tỏ rằng Coliforms không hiện diện trong mẫu thực phẩm.
 Mẫu thực phẩm (pate) sạch.
Lưu ý: Trong môi trường BGBL, sử dụng mật heo có thể ức chế hầu hết các vi
khuẩn Gram (+) và vi khuẩn Gram (-) không phải Coliforms. Môi trường BGBL có
nồng độ đặc hiệu nhằm ngăn cản vi khuẩn kỵ khí lên men lactose sinh trưởng ở 44 oC,
tránh được hiện tượng dương tính giả. Lúc này, Coliforms phát triển làm đục môi
trường và sinh khí trong ống Durham do lên men lactose.


17