ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

NGÔ THỊ THU HƯỜNG

NGHIÊN CỨU MÔI TRƯỜNG TÁI SINH
CỦA MỘT SỐ GIỐNG NGÔ (Zea mays L.)
PHỤC VỤ CHUYỂN GEN

LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

THÁI NGUYÊN - 2014


ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

NGÔ THỊ THU HƯỜNG

NGHIÊN CỨU MÔI TRƯỜNG TÁI SINH
CỦA MỘT SỐ GIỐNG NGÔ (Zea mays L.)
PHỤC VỤ CHUYỂN GEN
Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học
Mã số: 60 42 02 01

LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học: PGS. TS. NGUYỄN VŨ THANH THANH

THÁI NGUYÊN - 2014

3
LỜI CAM ĐOAN
Tơi xin cam đoan đây cơng trình nghiên cứu của tôi dưới sự hướng dẫn
của PGS.TS. Nguyễn Vũ Thanh Thanh, sự giúp đỡ của các cán bộ khoa Khoa
học sự sống - Đại học Khoa học - Đại học Thái Nguyên. Các số liệu, kết quả
trong luận văn là trung thực và chưa được ai công bố trong bất kỳ cơng trình
nào khác.
Tơi xin hồn tồn chịu trách nhiệm về những số liệu trong luận
văn này.
Thái Nguyên, ngày 13 tháng 09 năm 2014
Tác giả luận văn

Ngô Thị Thu Hường

3


4
LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS.
Nguyễn Vũ Thanh Thanh, khoa Khoa học sự sống, Trường Đại học Khoa học
- Đại học Thái Nguyên là người đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo, dìu dắt và
giúp đỡ tơi trong suốt thời gian thực hiện và hồn thành luận văn này.
Tơi xin được bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới Th.S Vũ Thanh Sắc,
giảng viên khoa Khoa học sự sống, Trường Đại học Khoa học - Đại học Thái
Nguyên, là người đã tạo điều kiện, chỉ bảo và góp ý những điều quý báu cho
tôi trong suốt thời gian thực hiện đề tài.
Tôi xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Trường Đại học Khoa học Đại học Thái Nguyên, Ban chủ nhiệm khoa Khoa học sự sống và các thầy cô
giáo, cán bộ trong Khoa, đặc biệt là sự quan tâm, giúp đỡ của các anh chị kỹ

thuật viên phịng thí nghiệm khoa Khoa học sự sớng.
Tơi xin gửi lời cảm ơn đến những người thân trong gia đình, bạn bè đã
luôn ở bên giúp đỡ, động viên và khích lệ tơi trong suốt quá trình học tập,
nghiên cứu.
Thái Nguyên, ngày 13 tháng 09 năm 2014
Tác giả luận văn

Ngô Thị Thu Hường

4


5
MỤC LỤC

5


6
CHỮ VIẾT TẮT TRONG LUẬN VĂN
STT

6

Chữ viết tắt

Chữ viết đầy đủ

1


BAP

6 – benzylaminopurine

2

đtg

Đồng tác giả

3

IAA

Indole-3-acetic acid

4

IBA

Indole-3-butyric acid

5

MS

Murashige & Skoog, 1962

6


NAA

1 - naphthaleneacetic acid

7

Nxb

Nhà xuất bản

8

N6

Chu et al., 1975

9

2,4-D

2,4 - Dichlorophenoxyacetic acid


7
DANH MỤC CÁC BẢNG

7


8

DANH MỤC CÁC HÌNH

8


9
MỞ ĐẦU
1. Đặt vấn đề
Cây ngô (Zea mays L.) là cây lương thực giàu dinh dưỡng có vai trị
quan trọng trong nền kinh tế toàn cầu, đứng thứ hai sau lúa mỳ. Cụ thể, ngô là
một trong ba cây ngũ cốc quan trọng nhất cung cấp lương thực cho loài
người, sử dụng làm thức ăn cho gia súc, là nguyên liệu cho các nhà máy sản
xuất và chế biến lương thực - thực phẩm - dược phẩm và ngô cũng là mặt
hàng nơng sản xuất khẩu có giá trị. Cây ngô được gieo trồng rộng khắp trên
thế giới, đứng thứ ba về diện tích, thứ hai về sản lượng và thứ nhất về năng
suất. Theo thống kê của FAO, năm 2012 cây ngơ trồng trên toàn thế giới với
diện tích 177,38 triệu ha, sản lượng 872,07 triệu tấn [56]. Tại Việt Nam, ngô
là cây lương thực trồng phổ biến, đứng thứ 2 chỉ sau lúa gạo. Hiện nay và
trong tương lai, ngơ vẫn tḥc nhóm cây ngũ cốc có vai trò quan trọng ở nước
ta, góp phần thúc đẩy phát triển kinh tế cả nước nói chung và nền kinh kế
nông nghiệp nói riêng.
Những năm gần đây, nhờ việc sử dụng phương pháp chuyển gen đã tạo
ra nhiều giống ngô mới có giá trị dinh dưỡng cao [38], [53]; có khả năng
chống chịu với các điều kiện môi trường bất lợi như chịu hạn, chịu lạnh [19],
[43], [52]; hay tạo ra những giống có khả năng kháng sâu bệnh, cơn trùng, …
Để thực hiện quy trình cải tiến giống bằng phương pháp chuyển gen thì
tái sinh cây là một trong những giai đoạn quan trọng không thể thiếu. Thực tế
nghiên cứu cho thấy, nuôi cấy in vitro ở ngô gặp nhiều khó khăn bởi khả năng
tái sinh của ngơ phụ thuộc nhiều vào đặc tính di truyền [38], [52]. Các giống
ngơ khác nhau có khả năng tái sinh khơng giớng nhau. Mặt khác, nguồn vật

liệu sử dụng trong tái sinh còn hạn chế, q trình tái sinh ngơ thường chỉ được
thực hiện thông qua sự tái sinh phôi hoặc mô sẹo [41]. Trong đó, mơ sẹo được
hình thành từ phơi non hay từ lát cắt của thân cây non.
9


10
Xuất phát từ các lý do trên, chúng tôi đã lựa chọn đề tài: “Nghiên cứu
môi trường tái sinh của một số giống ngô (Zea mays L.) phục vụ chuyển
gen”.
2. Mục tiêu nghiên cứu
Xác định được các điều kiện thích hợp để tái sinh cây từ phôi non và từ
mô sẹo của 5 giống ngô.
3. Nội dung nghiên cứu
- Xác định thành phần môi trường nuôi cấy phù hợp để tái sinh cây trực
-

tiếp từ phôi non của 5 giống ngô.
Xác định thành phần môi trường phù hợp để tạo mô sẹo từ phôi non và thân

-

non của 5 giống ngô.
Xác định môi trường phù hợp để tái sinh cây từ mơ sẹo hình thành từ phơi

-

non của 5 giống ngô.
Xác định điều kiện thích hợp để đưa cây ngô in vitro ra ngoài môi trường.
4. Ý nghĩa khoa học

- Là cơ sở cho công tác chuyển gen nhằm tạo cây ngô chuyển gen mang
các đặc tính tốt.

10


11
Chương 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Sơ lược về cây ngô
1.1.1. Nguồn gốc, phân loại và đặc điểm sinh học cây ngơ
• Ng̀n gớc

Cây ngơ có tên khoa học là Zea mays L., thuộc chi Maydeae, họ Hòa
thảo (Poaceae), bộ Hòa thảo (Poales), lớp Một lá mầm, ngành Hạt kín, phân
giới thực vật bậc cao [55].
Có nhiều giả thuyết khác nhau về nguồn gốc cây ngô dựa trên những
kết quả nghiên cứu khảo cổ học, di truyền học, thực vật học và địa lý học. Các
nhà khoa học tìm thấy hóa thạch phấn ngô ở Mexico. Từ những nghiên cứu
đó người ta cho rằng q trình thuần hóa ngơ ban đầu diễn ra ở Mexico, đây
được coi là trung tâm phát sinh thứ nhất và vùng Andet (Pêru) được coi là
trung tâm thứ hai. Sau đó phân tán khắp thế giới vào cuối thế kỉ XV đầu thế kỉ
XVI khi có sự tiếp xúc của người châu Âu với châu Mĩ [7], [56]. Ở Việt Nam,
cây ngơ có nguồn gốc từ Trung Quốc, được trồng vào khoảng thế kỷ XVII, do
Trần Thế Vinh người Sơn Tây đi sứ thấy loài cây này đã đem về trồng và gọi
nó là “ngô” (theo “Vân Đài loại ngữ” của Lê Q Đơn).
•

Phân loại
Vào đầu thế kỷ XX, người đầu tiên phân loại ngô là Keruika. Sau đó

năm 1920, Sturtevantel đi sâu nghiên cứu về cấu trúc cơ quan sinh sản, kết
hợp với phương pháp phân loại hình thái như: cấu tạo mày, cấu tạo bên ngoài
hạt, cấu tạo bên trong hạt (tỷ lệ amilopectin và amiloza). Ơng đã phân loại
ngơ thành các loài phụ (các nhóm) sau đây [6]:

1- Ssp amilaceae - ngô bột
2- Ssp indentata - ngô răng ngựa
11


12
3- Ssp indurate - ngô đá rắn
4- Ssp everta - ngô nổ
5- Ssp saccharata - ngô đường
6- Ssp ceratina - ngô nếp
7- Ssp tunicate - ngô bọc
Đây là cách phân loại theo đặc điểm thực vật học, ngồi ra ngơ cịn
được phân loại theo nơng học, sinh thái học, thời gian sinh trưởng và thương
phẩm [10].
• Đặc điểm sinh học cây ngô

Cây ngô trồng ở khắp nơi, là cây sống một năm, cao 1 - 2 m. Các giống
ngơ có đặc điểm chung về hình thái, giải phẫu. Cây ngơ bao gồm những bộ
phận sau: rễ, thân, lá, hoa (bông cờ, bắp ngô) và hạt.
 Rễ ngô

Giống như các cây hòa thảo khác ngô có hệ rễ chùm. Căn cứ vào
hình thái, vị trí và thời gian phát sinh có thể chia rễ ngô thành 3 loại: rễ
mầm, rễ đốt và rễ chân kiềng. Rễ mầm (rễ tạm thời, rễ hạt) mọc từ trụ lá
mầm, chức năng chính của rễ này là hút nước, thức ăn khi cây còn non. Rễ

đốt (rễ phụ cố định) phát triển từ các đốt thấp của thân nằm dưới mặt đất,
mọc vòng quanh các đốt bắt đầu lúc ngô được 3 - 4 lá, mọc theo thứ tự từ
dưới lên trên. Rễ đốt giúp cây hút nước và dinh dưỡng. Rễ chân kiềng (rễ
chống) mọc quanh các đốt phần thân sát gốc trên mặt đất, rễ này giúp cây
chống đổ, bám chặt vào đất, tham gia hút nước và thức ăn cho cây. Thân
cây đặc và khá chắc, chia nhiều lóng (dóng) to dần từ dưới lên, nằm giữa
các đốt và kết thúc bằng bông cờ.
12


13
 Lá ngô

Lá ngô mọc từ mắt trên đốt và đối xứng xen kẽ nhau, hình dải 50 - 100
cm, rộng 5 - 10 cm. Căn cứ vào vị trí và hình thái lá trên cây, lá ngơ được chia
thành các nhóm: lá mầm, lá thân, lá ngọn, lá bi.
 Hoa ngơ

Cây ngơ có hoa đơn tính cùng gốc, hoa đực nhỏ hơn mọc thành bông ở
ngọn gọi là cờ; hoa cái mọc sát nhau, được bao bằng lá bắc to, vòi nhụy dài,
quả dĩnh, hạt xếp thành hàng, các bắp ngơ là các cụm hoa cái hình bơng được
bao bọc trong một số lớp lá và được bao chặt vào thân [2], [10].

Hình 1.1. Cây ngơ thí nghiệm trờng ngoài đờng ṛng

Hạt ngơ gồm 5 phần chính: vỏ hạt, lớp alơron, phôi, nội nhũ và chân
hạt. Vỏ hạt là một màng nhẵn bao xung quanh hạt. Lớp alơron nằm dưới vỏ
hạt và bao lấy nội nhũ và phôi. Nội nhũ là phần chính của hạt chứa các tế bào
dự trữ chất dinh dưỡng. Nội nhũ có 2 phần: nội nhũ bột và nội nhũ sừng. Tỷ
lệ giữa nội nhũ bột và nội nhũ sừng khác nhau tùy từng giống ngô. Phôi ngô

13


14
chiếm 1/3 thể tích của hạt, gồm có các phần: ngù (phần ngăn cách giữa nội
nhũ và phôi), lá mầm, trụ dưới lá mầm, rễ mầm và chồi mầm [12].
1.1.2. Giá trị kinh tế của cây ngô
Ngô là một trong những cây ngũ cốc quan trọng trong nền kinh tế tồn
cầu, ngơ đứng thứ 3 sau lúa mì và lúa gạo. Nhưng ngơ lại giàu dinh dưỡng
hơn lúa mì và lúa gạo, góp phần ni sống gần 1/3 dân số trên toàn thế giới,
đặc biệt là các nước thuộc châu Mỹ La Tinh. Ngơ cũng là cây trồng điển hình
được ứng dụng nhiều thành tựu khoa học về các lĩnh vực di truyền học, chọn
giống, công nghệ sinh học, cơ giới hóa, điện khí hóa và tin học vào cơng tác
nghiên cứu và sản xuất [12].
Hạt ngơ có giá trị dinh dưỡng cao, trong ngô chứa tương đối đầy đủ các
chất dinh dưỡng cần thiết cho người và gia súc. Với tỷ lệ tinh bột 65 - 83%,
ngô được dùng làm nguyên liệu cho công nghiệp. Từ ngô người ta đã sản xuất
khoảng 670 mặt hàng khác nhau của các ngành công nghiệp lương thực - thực
phẩm, công nghiệp dược và công nghiệp nhẹ. Hàng năm trên thế giới lượng
ngô xuất nhập khẩu lên đến khoảng 70 triệu tấn. Các nước xuất khẩu ngô chủ
yếu là Mỹ, Pháp, Achentina, Mexico…. Có thể nói ngơ là cây thức ăn chăn
ni quan trọng bậc nhất hiện nay. Hầu như 70% chất dinh dưỡng trong thức
ăn tổng hợp là từ ngô. Cây ngô còn là thức ăn xanh và ủ chua lý tưởng cho gia
súc, đặc biệt là bò sữa. Theo thống kê của CIMMYT, giai đoạn 1997 - 1999,
thế giới dùng ngô làm thức ăn chăn nuôi là 60% - khoảng 400 triệu tấn/năm.
Các nước phát triển có tỷ lệ dùng ngơ làm thức ăn chăn nuôi thường trên
70%. Một số nước có tỷ lệ này rất cao như Mỹ 76%, Bồ Đào Nha 91%,
Malaysia 91% (CIMMYT, 2001).
Ở nước ta nhu cầu thức ăn chăn nuôi là rất lớn, cần khoảng 4 triệu
tấn ngô mỗi năm. Riêng quý đầu năm 2014 cả nước đã phải nhập khẩu 2,33

triệu tấn ngô [57]. Lượng ngơ cần sử dụng sẽ ngày càng gia tăng vì ngành
14


15
chăn nuôi đang phát triển rất mạnh, bên cạnh đó ngành thủy sản cũng tiêu
thụ khá nhiều. Ngoài các vai trò trên, ngô còn là một trong những nguồn
nguyên liệu thực vật sản xuất xăng sinh học. Bột ngô dùng để nấu cồn, sản
xuất đường glucose làm môi trường nuôi cấy nấm Pennicilin, Streptomicin,
sản xuất axit acetic. Lõi ngô là nguyên liệu sản xuất nhiều hợp chất hóa
học như aceton, nhựa hóa học. Phơi ngơ chứa 17,2 - 56,8% lipid nên có thể
dùng để ép dầu [2].
1.1.3. Tình hình sản xuất ngơ trên thế giới và Việt Nam
1.1.3.1. Tình hình sản xuất ngơ trên thế giới
Ngơ là cây trồng có địa bàn phân bố rộng, được gieo trồng khắp trên
thế giới với sản lượng hàng năm cao hơn bất kỳ cây lương thực nào. Năm
1961, năng suất ngơ trung bình trên thế giới mới chỉ đạt 20 tạ/ha thì đến năm
2011 đã là 51,84 tạ/ha, tăng gấp 1,5 lần. Ngô được trồng ở hầu hết các nơi
trên thế giới như Châu Mỹ, Châu Âu, Châu Úc, Châu Phi và Châu Á. Do điều
kiện khí hậu, thổ nhưỡng, tập quán canh tác dẫn đến diện tích, sản lượng và
năng suất ngơ ở các khu vực có sự chênh lệch nhau, điều đó được thể hiện ở
bảng 1.1 [54].
Bảng 1.1. Tình hình sản xuất ngô ở một số khu vực trên thế giới
giai đoạn 2009 - 2011

Khu vực

Diện tích (triệu ha)

Năng suất (tạ/ha)


Sản lượng (triệu tấn)

2009

2010

2011

2009

2010

2011

2009

2010

2011

Châu Âu

13,8

14,1

16,45

60,7


60,6

65,99

84,0

85,6

108,5

Châu Á

53,5

53,7

54,81

43,8

45,8

49,41

234,5

246,1

270,9


Châu Mỹ

61,4

63,1

64,5

71,9

71,0

67,96

441,5

447,9

438,4

Thế giới

158,8

161,9

170,39

51,6


52,1

51,84

819,7

844,4

883,4

(Nguồn FAOSTAT, 2012)

15


16
Qua bảng 1.1 cho thấy, châu Mỹ luôn dẫn đầu cả về năng suất, sản
lượng và diện tích trồng ngô. Châu Mỹ chiếm 37,85% diện tích và 49,65%
sản lượng. Đứng thứ hai là châu Á với diện tích trồng ngơ chiếm 32,2% diện
tích trồng ngơ thế giới nhưng năng suất thấp chỉ đạt 49,41 tạ/ha (năm 2011)
và xếp ở vị trí thứ ba. Châu Âu có năng suất khá cao nhưng diện tích trồng
ngơ rất thấp, chiếm chưa đến 10% diện tích trồng ngơ thế giới, do đó sản
lượng chỉ đạt 12,28% tổng sản lượng thế giới. Trong những năm gần đây, diện
tích trồng ngơ ở khu vực châu Á và châu Âu đang dần mở rộng, khiến cho sản
lượng ngô của châu Âu tăng vọt thêm 26,8% chỉ trong 1 năm (2010 - 2011).
Ngược lại, ở Châu Mỹ diện tích trồng ngơ tăng nhưng năng suất và sản lượng
giảm.
Những năm gần đây nhờ áp dụng các thành tựu khoa học kỹ thuật tiên
tiến, đặc biệt là việc mở rộng diện tích trồng ngơ lai nên năng suất và sản

lượng ngơ thế giới có sự nhảy vọt, nhất là ở các nước có nền kinh tế phát
triển, kỹ thuật thâm canh tốt và sử dụng 100% giống ngô lai trong sản xuất.
Bên cạnh đó, việc ứng dụng cơng nghệ sinh học tạo ra các giống ngô chuyển
gen năng suất cao, có khả năng chống chịu sâu bệnh cũng góp phần làm tăng
sản lượng ngơ thế giới.
1.1.3.2. Tình hình sản xuất ngô ở Việt Nam
Ngô được đưa vào nước ta cách đây khoảng 300 năm và trở thành cây
lương thực quan trọng thứ hai sau cây lúa, là cây màu được trồng ở nhiều
vùng sinh thái khác nhau, đa dạng về mùa vụ gieo trồng và hệ thống canh tác.
Trong những năm gần đây, nhờ chính sách khuyến khích của Nhà nước cộng
thêm tiến bộ kỹ thuật, đặc biệt là về giống, cây ngơ đã có những bước tăng
trưởng đáng kể về diện tích, sản lượng và năng suất.
16


17
Bảng 1.2. Tình hình sản xuất ngơ ở Việt Nam từ 1975 - 2012

Năm
1975
1990
2000
2006
2007
2008
2009
2010
2011
2012


Diện tích

Sản lượng

(triệu ha)
(triệu tấn)
0,267
0,28
0,432
0,67
0,730
2,01
1,033
3,85
1,096
4,30
1,440
4,57
1,089
4,37
1,126
4,61
1,121
4,84
1,118
4,80
(Nguồn: FAOSTAT 2013 [55])

Năng suất
(tạ/ha)

10,51
15,54
27,47
37,31
39,26
31,75
40,14
40,90
43,13
42,95

Trước đây, sản xuất ngô ở Việt Nam còn mang tính nhỏ lẻ và phân tán,
chủ yếu là tự cung tự cấp theo nhu cầu của hộ nông dân. Hầu hết diện tích ngơ
được gieo trồng là các giống ngơ địa phương nên năng suất thấp. Năm 1975,
diện tích ngơ chưa đến 300 nghìn ha, năng suất 10,51 tạ/ha.
Nếu như năm 1990, năng suất ngô nước ta mới chỉ bằng 34% so với
trung bình thế giới, năm 2000 bằng 59,8% thì đến năm 2012 đã đạt 86,9%.
Từ 2006, ngành sản xuất ngơ của Việt Nam đã có những bước phát triển
đáng kể về cả diện tích (1,033 triệu ha) và sản lượng (3,85 triệu tấn). Năm
2011 là năm tạo ấn tượng của ngô Việt Nam, sản lượng ngô đạt mức cao
nhất từ trước đến nay với 4,84 triệu tấn và năng suất 43,13 tạ/ha. Thành tựu
nhảy vọt này có được là nhờ tạo ra các giống ngô lai và mở rộng diện tích
trồng ngơ lai, kết hợp áp dụng các biện pháp kỹ thuật canh tác hiện đại.
Năm 2006, giống lai chiếm khoảng 90% diện tích ngơ cả nước. Việt Nam
đã đuổi kịp các nước trong khu vực về khả năng nghiên cứu tạo giống ngô
lai và đang ở giai đoạn đầu đi vào công nghệ cao (công nghệ gen, ni cấy
bao phấn và nỗn) [2], [12].

17



18
Bên cạnh những thuận lợi và thành tựu đã đạt được, ngành ngơ Việt
Nam cịn gặp nhiều thách thức. Dù diện tích hay sản lượng đều tăng nhanh so
với mức bình qn chung của thế giới nhưng năng suất ngơ vẫn cịn thấp. Bên
cạnh đó, nhu cầu sử dụng ngơ của nước ta ngày càng lớn. Sản lượng ngô
trong nước không đủ phục vụ cho con người và phát triển ngành chăn nuôi.
Hàng năm, Việt Nam vẫn phải nhập khẩu lượng lớn ngơ để chế biến thức ăn
gia súc. Vì vậy, việc nghiên cứu tạo giống ngơ có năng suất cao, khả năng
chống chịu tốt, đồng thời đáp ứng yêu cầu chất lượng là nhiệm vụ rất quan
trọng và cấp thiết đối với các cơ quan nghiên cứu, chọn tạo giống.
1.2. Tình hình nghiên cứu tái sinh ngô trên thế giới và ở Việt Nam
1.2.1. Nghiên cứu tái sinh ngô trên thế giới
Nuôi cấy in vitro cây ngô được bắt đầu từ rất sớm vào những năm
1930, khi Lampe và Mills nuôi cấy nội nhũ và phôi non trong môi trường có
bổ sung dịch chiết khoai tây nhưng mơ chỉ sinh trưởng có giới hạn [48]. Larue
(1949) là người đầu tiên thực hiện thành công nuôi cấy liên tục trong một thời
gian dài phôi non và phôi ngô trưởng thành để xác định nhu cầu dinh dưỡng
cho sinh trưởng và phát triển.
Tái sinh cây từ phôi non hoặc bộ phận khác của những loài ngũ cốc lần
đầu tiên được miêu tả trong những năm 1960 đến 1980 [49]. Phôi non được
sử dụng làm nguồn vật liệu chính trong các nghiên cứu nuôi cấy mô ở ngô. Lu
đã sử dụng phôi có kích thước 1 - 1,5 mm thu được sau 2 tuần thụ phấn cấy
vào môi trường MS bổ sung 2,4-D từ 0,25 - 2,0 mg/l và sucrose 3 - 12% [37].
Năm 1975, Green và Phillips sử dụng nguyên liệu là phôi chưa trưởng thành
để nghiên cứu khả năng tái sinh ngô [32].
Vào năm 1985 Amstrong và Green thực hiện tái sinh cây ngô thông qua
mô sẹo, đồng thời mô tả hai loại mô sẹo của phôi đó là: mô sẹo loại I có đặc
điểm cứng, đặc, nhỏ, màu trắng - vàng và có thể sản sinh ra các loại mô khác
18



19
giống như phôi soma. Loại mô sẹo này thường tăng trưởng chậm hoặc khó
ni cấy trong thời gian dài. Mơ sẹo loại II được quan sát trong 1 số loại ngơ
có các đặc điểm đặc trưng là mơ sẹo xớp, màu vàng, sinh trưởng nhanh, tỷ lệ
tái sinh cao. Chúng có tỷ lệ phơi hóa cao, cho phép ni cấy trong thời gian
dài. Trong đó, mơ sẹo được hình thành thông qua sự nảy mầm của phôi.
Ngoài ra, nhiều nghiên cứu cho thấy tỷ lệ tái sinh cây trực tiếp từ phôi cao
hơn tỷ lệ tái sinh thông qua mô sẹo [20].
Giai đoạn đầu của q trình tái sinh phơi ngô là giai đoạn phôi soma
trưởng thành nảy mầm được cảm ứng bởi nồng độ sucrose cao (60 g/l) trong
điều kiện khơng có ánh sáng và khơng có chất điều hịa sinh trưởng. Giai
đoạn thứ hai của q trình tái sinh in vitro cây ngô là giai đoạn phát triển chồi
và rễ, được cảm ứng tốt khi giảm nồng độ đường sucrose [28].
Năm 1989, Vain đánh giá ảnh hưởng của ethylene trong nuôi cấy in
vitro, sử dụng AgNO3 như chất ức chế hoạt động của ethylene. Khi đó tỷ lệ
tạo mô sẹo dạng II (mô sẹo xốp, vàng, cho tỷ lệ tái sinh cao) được nâng cao
khi phôi non được nuôi cấy trong môi trường MS chứa AgNO 3 từ 5 đến 20
mg/l. Nghiên cứu đã chỉ ra rằng khả năng tái sinh của mơ sẹo trong mơi
trường có AgNO3 tăng cao hơn [47].
Năm 2004, Zhang nghiên cứu 15 dòng ngô Tangsipingtou thuần bằng
nuôi cấy in vitro để đánh giá ảnh hưởng của kiểu gen, mơi trường, chất kích
thích sinh trưởng và phương pháp tạo mơ sẹo có nguồn gốc từ phôi non và tái
sinh cây. Kết quả cho thấy cả 15 dịng đều có thể tạo mơ sẹo, sự già hóa của
mơ sẹo làm khả năng tái sinh cây giảm đến một mức độ nhất định [52].
Shohael (2003) thực hiện nghiên cứu 3 dịng ngơ CML-161; CML-323;
CML-327. Phơi non được nuôi cấy trên môi trường N6, tỷ lệ tạo mô sẹo 56,33
- 72,0%. Kết quả cho thấy môi trường đạt tỷ lệ mô sẹo cao nhất (72,0%) là
môi trường N6 có bổ sung L-proline 2,3 g/l, hydrolysate casein 200 mg/l và

2,4-D 1,0 mg/l [42].
19


20
Năm 2004, Huang và Wei nghiên cứu hệ thống tái sinh cây ngô hiệu
quả khi sử dụng phôi trưởng thành từ 7 dịng ngơ. Phơi lấy từ những hạt
trưởng thành đã khử trùng và cắt làm đôi dùng để tạo mô sẹo trên môi trường
cảm ứng bổ sung 2,4-D 4,0 mg/l. Tần số cảm ứng của mô sẹo đầu tiên
(primary calli) trên 90% đối với tất cả các dòng. Mô sẹo đó được chuyển lên
môi trường cấy chuyển bổ sung 2,4-D 2,0 mg/l. Mô sẹo sinh phôi được hình
thành trên môi trường này và tỉ lệ tăng cao khi bổ sung 0,2 mg/l BAP hay bổ
sung nitrat bạc 10 mg/l. Cây con tái sinh thành công chuyển sang môi trường
MS bổ sung IAA 0,6 mg/l để tạo rễ. Tần số hình thành chồi tương đối cao
(19,8 - 32,4%), đặc biệt là dịng Mo17 đạt 25,6% [34].
Binott (2005) ni cấy phơi non từ 12 dịng ngơ bố mẹ thuần chủng và
con lai tương ứng của chúng để đánh giá khả năng tạo mơ sẹo, phơi hóa và tái
sinh cây. Hạt non thu ở các giai đoạn 10, 15, 18, 21 và 24 ngày tuổi sau khi
thụ phấn và được khử trùng bề mặt. Phôi non đem cấy trên môi trường tạo mô
sẹo bao gồm N6 bổ sung 2,4-D từ 0 - 2 mg/l, L-proline 2,87 g/l, hydrolysate
casein 0,1 g/l, glycine 2 g/l, sucrose 30 g/l và gelrite 3 g/l. Ở nồng độ 2 mg/l
mơ sẹo hình thành từ 80 đến 90% đối với phôi non của con lai và từ 50 đến
80% đối với phơi non của dịng bố mẹ. Khả năng phơi hóa được tiến hành ở 6
dịng thuần và 4 dòng lai. Kết quả thu được chỉ có 4 dịng thuần và 3 dịng lai
tái sinh cây thành cơng [34].
Năm 2011, Gorji nghiên cứu các dịng ngơ thuần về khả năng tạo mô
sẹo và tái sinh cây. Kết quả là trong môi trường N6 tần số tạo mô sẹo cao nhất
khi bổ sung dicamba 2 mg/l, trong môi trường MS có bổ sung 2,4-D ở nồng
độ 1 mg/l. Mơi trường N6 bổ sung dicamba thúc đẩy quá trình tạo mô sẹo cao
hơn so với môi trường N6 bổ sung 2,4-D. Tỷ lệ hình thành rễ cao nhất khi đưa

chồi vào mơi trường MS có bổ sung 2 mg/l NAA. Trên mơi trường MS có bổ
sung BAP 1 mg/l và IAA 0,5 mg/l thúc đẩy tần số hình thành chồi cao, tỷ lệ
tái sinh cây đạt từ 53 - 67% [31].
20


21
Nguyên liệu được sử dụng phổ biến nhất trong nuôi cấy tái sinh ngơ
phục vụ mục đích chuyển gen là phôi chưa trưởng thành [27], [28], [35], [50].
Tuy nhiên, việc tạo phơi chưa trưởng thành là một q trình khắt khe, cần thời
gian để trồng cây, thụ phấn, tách các phôi chưa trưởng thành. Cây mẹ trồng
theo mùa và mẫu cấy được thu vào một khoảng thời gian nhất định mới cho
kết quả tái sinh tốt [29], [31]. Vì vậy, việc nghiên cứu tìm ra các nguyên liệu
khác dễ dàng thu nhận hơn là một trong những thách thức lớn để có thể tiến
hành chuyển gen nhanh và hiệu quả hơn [24].
Trong tái sinh ngô, các thân non chưa trưởng thành lần đầu tiên được
sử dụng bởi Songstad [46]. Trên mơi trường N6 trung bình bổ sung 2,4-D, Lproline và AgNO3 từ ngun liệu thân non hình thành mơ sẹo loại II trên các
dịng mơ hình như A188 và B73. Ưu điểm của việc sử dụng các thân non chưa
trưởng thành là có thể ni cấy trong vịng 6 - 7 tuần, không cần đợi đến giai
đoạn sinh sản, thụ phấn, thụ tinh, phôi phát triển. Đây là nguyên liệu lí tưởng
nhất vì mẫu cấy khơng cần thơng qua q trình giảm phâm và thụ tinh, giảm
được sự biến đổi di truyền.
Sidorov (2006) nghiên cứu việc tạo mô sẹo bắt ngồn từ hạt ở một vài
kiểu gen ngô bao gồm dòng lai kinh tế. Những hạt nảy mầm trên môi trường
MS cơ bản chứa picloram 10 mg/l và BAP 3 mg/l gây ra sự phát triển chồi
nách ở vùng đốt thân. Đốt thân của hạt gieo sau 7 - 10 ngày được tách ra và
cấy trên môi trường tạo mô sẹo bổ sung với picloram 2,2 mg/l và 2,4-D 0,5
mg/l. Dòng L4 và L9 có tần số tạo mô sẹo sinh phôi khoảng 38 - 42% từ mô
sẹo tạo bởi đoạn đốt thân. Tần số tạo mô sẹo từ đốt thân của hạt nảy mầm trên
môi trường không có chất điều hòa sinh trưởng là 0 - 3% [44].

1.2.2. Nghiên cứu tái sinh ngô ở Việt Nam
Ở Việt Nam những năm gần đây đã có một số cơng trình nghiên cứu có
liên quan đến điều kiện ni cấy tạo mơ sẹo trên đối tượng cây ngô. Các
nghiên cứu về điều kiện tạo mơ sẹo và chồi cây ngơ, đó là: “nghiên cứu môi
21


22
trường ni cấy in vitro phục vụ chọn dịng chịu hạn và chuyển gen ở ngô
(Zea mays L.) địa phương miền núi”, của Phạm Thị Thanh Nhàn và đtg [11].
Kết quả nghiên cứu cho thấy môi trường N6 bổ sung 2,4-D 7 mg/l; casein 100
mg/l; L-prolin 2,88 mg/l; sucrose 40 g/l; agar 8 g/l cho tỉ lệ tạo mô sẹo cao
nhất. Tuổi phơi thích hợp để tạo mơ sẹo là phôi 25 - 27 ngày đối với vụ đông,
phôi 18 - 20 ngày đối với vụ hè.
Tác giả Lê Huy Hàm, Ngô Hữu Tình và đtg đã nghiên cứu chọn tạo
dịng thuần ở ngơ bằng phương pháp ni cấy hạt phấn [5], [13]. Phạm Thị Lý
Thu khi nghiên cứu hệ thống tái sinh phục vụ chuyển gen ở ngô đã sử dụng
phôi non để nghiên cứu kết quả cho thấy tần số tạo mơ sẹo của 2 dịng ngơ
HR8 và HR9 đạt lần lượt là 75,2% và 74,1%, tỷ lệ tái sinh cây đạt 24,9% và
21,4% [14].
Nguyễn Văn Đồng (2009), tiến hành nghiên cứu khả năng tái sinh từ
phôi non của 45 dịng ngơ Việt Nam thuộc 3 nhóm ngơ tẻ, ngơ nếp và ngơ
ngọt, sử dụng dịng đối chứng là dịng ngơ mơ hình HR8 có khả năng tái sinh
cao. Kết quả nghiên cứu cho thấy 4 dịng ngơ tẻ VH1, VH11, VH19, VH29 ; 3
dịng ngơ nếp VHN9, VHN10, VHN16 và 2 dịng ngơ ngọt VHD2, VHD5 có
khả năng tái sinh cao đồng thời mang một số đặc tính nơng học tốt sử dụng
làm nguồn vật liệu cho các nghiên cứu tiếp theo về chuyển gen [4].
1.3. Ảnh hưởng của chất kích thích sinh trưởng và thành phần môi
trường đến khả năng tạo mô sẹo và tái sinh cây ở ngơ
1.3.1. Ảnh hưởng của chất điều hịa sinh trưởng

Các chất điều hịa sinh trưởng thực vật có vai trò lớn ảnh hưởng đến sự
sinh trưởng, phân chia tế bào và kiểm sốt sự biệt hóa cũng như phát sinh
hình thái của thực vật. Trong ni cấy tế bào in vitro, các chất điều hòa sinh
trưởng là thành phần quan trọng nhất và việc sử dụng các chất này mợt cách
hợp lí có ý nghĩa quyết định đến thành cơng của tồn bộ tiến trình ni cấy.
u cầu đối với từng chất thay đổi theo loài thực vật, loại mô, hàm lượng chất
22


23
điều hòa sinh trưởng nội sinh của chúng. Các chất điều hịa sinh trưởng được
sử dụng trong ni cấy mơ thực vật chủ ́u thuộc nhóm auxin và nhóm
cytokinin [15].
• Auxin
Bản chất hóa học của auxin tự nhiên trong tế bào thực vật là axit indol
axetic (IAA) nó là dạng auxin đầu tiên, chủ yếu và quan trọng nhất trong tất
cả các loại chất kích thích sinh trưởng thực vật. Auxin gồm có auxin tự nhiên
và auxin tổng hợp (2,4-D, IBA, NAA …) [8]. Trong ni cấy in vitro, auxin
có tác dụng kích thích sinh trưởng kéo dài tế bào, thúc đẩy sự sinh trưởng của
mẫu thơng qua hoạt hóa sự phân chia, làm giãn tế bào, kích thích quá trình
tổng hợp, trao đổi chất, điều hịa sự phân rễ và chồi… Ngoài ra auxin còn có
tác dụng kích thích sự hình thành phơi vơ tính trong dung dịch huyền phù
nuôi cấy [8], [15].
Tùy theo loại auxin, hàm lượng sử dụng và đối tượng ni cấy mà tác
dụng sinh lí của auxin là kích thích sinh trưởng mơ, hoạt hóa sự hình thành rễ
hay thúc đẩy sự phân chia mạnh mẽ của tế bào dẫn tới hình thành mơ sẹo [3].
Nồng độ auxin thấp dẫn tới sự hình thành rễ phụ, nồng độ auxin cao sẽ dẫn tới
hình thành mơ sẹo. Tuy nhiên nếu quá cao sẽ ức chế sự phát triển của rễ. Hàm
lượng IAA có thể sử dụng từ 1 - 50 mg/l. Hàm lượng IAA và NAA thường sử
dụng từ 0,1 - 10 mg/l. Còn 2,4-D được bổ sung vào môi trường cho hiệu quả

tạo mô sẹo ở nhiều loại thực vật [1], [18].
Vai trò của các chất điều hịa sinh trưởng trong ni cấy mơ ở cây ngũ
cốc đã được Bhaskaran và Smith (1990) tổng kết. Nhìn chung, chất điều hịa
sinh trưởng nhóm auxin điển hình là 2,4-D với nồng độ 1 - 3 mg/l cần thiết
cho sự hình thành mơ sẹo phơi hóa từ phơi hợp tử. 2,4-D là yếu tố quan trọng
trong sự khởi đầu phát triển của mơ sẹo và mơ sẹo có khả năng tạo phôi từ
phôi non của ngô [20].
23


24
2,4-D là chất điều hòa sinh trưởng được sử dụng phổ biến nhất để cảm
ứng tạo mô sẹo từ phôi. Việc bổ sung các citokynin kết hợp với 2,4-D có thể
làm tăng phản ứng của phơi trong một số lồi cỏ. Kiểu gen là một yếu tố có
vai trị cơ bản trong q trình phơi cảm ứng ở ngơ [27], [35], [36], [51].
Khi nghiên cứu tạo mô sẹo và tái sinh cây từ phơi non dịng ngơ lai F1
(M947 x M948) và (M950 x M951) của Das (2001) cho thấy mơi trường MS
có bổ sung 2,4-D 2 mg/l là hiệu quả nhất [26]. Sairam (2003) cũng đã tạo
được mô sẹo từ các mẫu mô phân sinh chồi đỉnh với tần số tương đối cao
(80%) khi bổ sung 2,4-D 5 mg/l vào môi trường nuôi cấy.
Shohael (2003) nghiên cứu ảnh hưởng của 2,4-D đến sự tạo mô sẹo từ
phôi của 3 dịng ngơ CML-161; CML-323; CML-327 đi đến kết luận nồng độ
1,0 mg/l cho tỷ lệ mô sẹo cao nhất [42]. Ombori (2008) đã sử dụng nồng độ
2,4-D từ 1,5 - 2,5 mg/l và thấy các dịng ngơ có nồng độ 2,4-D tối ưu khác
nhau [39].

• Cytokinin
Đa phần cytokinin là dẫn xuất của purin. Loại cytokinin đầu tiên phát
hiện được là zeatin tách từ mầm ngơ. Ngồi ra cịn có hàng loạt cytokinin
khác như kinetin, dihydrozeatin, benzyladenin, chlorephenylurea…, trong đó

kinetin khơng có mặt trong tự nhiên, thu nhận bằng cách xử lý nhiệt DNA [8].
Cytokinin liên quan tới sự phân bào, duy trì sự trẻ hóa các cơ quan, làm giảm
hiện tượng ưu thế ngọn, kích thích sự phân hóa chồi từ mô sẹo nuôi cấy. Hàm
lượng cytokinin cao sẽ hoạt hóa thành chồi bất định, chồi nhiều nhưng kích
thước nhỏ [17]. Các cytokinin thường dùng là: BAP, kinetin…
Những năm 1960, các nhà nghiên cứu thấy rằng BAP có thể kích thích
nhiều q trình, BAP được sử dụng trong ni cấy mô để kéo dài chồi và phát
sinh phôi với các nồng độ khác nhau tùy theo đối tượng thực vật và mục đích
ni cấy [8].
24


25
Cytokinin có mặt trong mọi thực vật, với hàm lượng cao nhất trong phôi
và trong quả đang phát triển. Hoạt tính của chúng được tăng cường khi chúng
tương tác với myo-inositol và có thể bị mất khi kết hợp với glycoside [8].
Việc sử dụng chất điều hịa sinh trưởng nhóm cytokinin kết hợp với
auxin trong q trình hình thành phơi soma từ các mẫu mô sẹo của các cây
ngũ cốc cũng đã được nghiên cứu. Theo Cho (1998), bổ sung BAP 0,1 mg/l
kết hợp với 2,4-D 2 mg/l vào môi trường ni cấy là rất cần thiết đối với sự
hình thành và duy trì mơ sẹo phơi hóa [25].
Barnabás (1999) đã bổ sung vào môi trường kinetin 1 mg/l và NAA
0,05 mg/l để thu được cây tái sinh với tỷ lệ 22,2% ở kiểu gen A21 [22].
Hassan (2001) sử dụng môi trường tái sinh N6 bổ sung 2,4-D 2 mg/l và
kinetin 1,5 mg/l để tạo cây tái sinh hoàn chỉnh, khắc phục hiện tượng tái sinh
tạo rễ nhưng không tạo chồi hay tạo chồi nhưng không tạo rễ [33].
Nghiên cứu của Huang và Wie (2004) cho thấy rằng trong môi trường
nuôi cấy bổ sung 2,4-D 2 mg/l kết hợp với BAP 0,2 mg/l làm tăng hiệu quả
tạo mô sẹo phôi hóa từ phơi non của 2 dịng ngơ nội phối C8605 và 9046 [34].
1.3.2. Vai trò của thành phần môi trường


• Vai trò của nitrat bạc
Songstad (1988) nghiên cứu tác động của các chất kháng ethylene như
norbornadiene, nitrat bạc và tiền chất ethylene 1-aminocyclopropane-1carboxylic acid (ACC) lên sự tái sinh cây ngô. Tính số lượng cây thu được
trên gram trọng lượng tươi từ mô sẹo nuôi cấy của dòng ngô PA91 và H99, sự
tái sinh cây gia tăng 12 lần khi xử lý norbornadiene 250 µM và nitrat bạc 100
µM. Những kết quả thu được cho thấy rằng chất ức chế hoạt động của
ethylene như norbornadiene và nitrat bạc có thể sử dụng để làm tăng tỉ lệ tái
sinh cây từ mô sẹo ngô [45].
25