ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA
KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

ĐỒ ÁN CHUYÊN NGÀNH

THU NHẬN HP CHẤT TỰ NHIÊN BẰNG
PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY RỄ TƠ

GVHD: TS. Lê Thò Thủy Tiên
SVTH: Trần Tú Bửu
MSSV: 60700186

Tp HCM, Tháng 6/2011


LỜI CẢM ƠN
Em xin cảm ơn các thầy cô bộ môn Công nghệ Sinh học trường Đại học Bách Khoa
Tp. HCM đã tận tình truyền đạt kiến thức cho em, giúp em có được những kiến thức cần
thiết hỗ trợ cho việc thực hiện đồ án.
Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến cô Lê Thị Thủy Tiên đã rất nhiệt tình hướng dẫn
và giúp đỡ em trong suốt quá trình nghiên cứu và hoàn thành đồ án của mình.

i


MỤC LỤC
Đề mục
Trang
Lời cảm ơn ................................................................................................................... i

Mục lục ....................................................................................................................... ii
Danh mục bảng........................................................................................................... iv
Danh mục hình ........................................................................................................... iv
Danh mục ảnh ............................................................................................................. v
Lời mở đầu .................................................................................................................. 1
Chương 1. TỔNG QUAN .......................................................................................... 2
1.1. Hợp chất tự nhiên (HCTN)........................................................................................ 2
1.1.1. Khái niệm ................................................................................................... 2
1.1.2. Phân loại ..................................................................................................... 3
1.1.3. Con đường sinh tổng hợp các HCTN........................................................... 4
1.1.4. Ý nghĩa của HCTN đối với bản thân thực vật và đối với con người ............. 7
1.2. Vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes ......................................................................... 8
1.2.1. Lịch sử về Agrobacterium rhizogenes ......................................................... 8
1.2.2. Gene Ri T-DNA ở Agrobacterium rhizogenes ............................................. 9
1.3. Kĩ thuật thu nhận HCTN in vitro ............................................................................. 11
1.4. Rễ tơ ....................................................................................................................... 14
Chương 2. KỸ THUẬT NUÔI CẤY RỄ TƠ .......................................................... 20
2.1. Giai đoạn chuẩn bị mẫu cấy .................................................................................... 20
2.2. Giai đoạn chuyển gene và cảm ứng tạo rễ tơ ........................................................... 22
2.2.1. Kĩ thuật chuyển gene vào tế bào thực vật nhờ vi khuẩn Agrobacterium
rhizogenes và cảm ứng tạo rễ tơ .............................................................................. 22
2.2.2. Loại bỏ vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes ............................................. 24
2.2.3. Kiểm tra và chọn lọc dòng đã chuyển gene ............................................... 24
ii


2.3. Nuôi cấy rễ tơ để sản xuất HCTN ........................................................................... 25
2.3.1. Nuôi cấy rễ tơ trên quy mô bioreactor để thu nhận HCTN ......................... 25
2.3.2. Khảo sát các điều kiện trong quá trình nuôi cấy rễ tơ thu nhận HCTN....... 26
2.3.3. Các dạng thiết bị bioreactor được sử dụng để nuôi cấy rễ tơ ...................... 28

2.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng tổng hợp HCTN ở hệ thống nuôi cấy rễ tơ ...... 32
2.4.1. Sự lựa chọn dòng ...................................................................................... 33
2.4.2. Hình thái của rễ tơ sau khi đã chuyển gene ................................................ 33
2.4.3. Mối quan hệ giữa sự tổng hợp HCTN với các giai đoạn phát triển của rễ tơ
(phase) trong quá trình nuôi cấy .............................................................................. 35
2.4.4. Thành phần của môi trường....................................................................... 35
2.4.5. Hàm lượng khí .......................................................................................... 36
2.4.6. Chất cảm ứng ............................................................................................ 37
2.4.7. Ánh sáng ................................................................................................... 38
2.4.8. Các yếu tố khác ......................................................................................... 39
2.5. Lưu trữ và bảo quản rễ tơ ........................................................................................ 40
Chương 3. Một số kết quả nghiên cứu về phương pháp nuôi cấy rễ tơ để thu nhận
HCTN ........................................................................................................................... 42
3.1. Thu nhận resveratrol bằng phương pháp nuôi cấy rễ tơ của cây đậu phộng ............. 42
3.1. Thu nhận plumbagin bằng phương pháp nuôi cấy rễ tơ Plumbago indica ................ 43
3.2. Thu nhận ginsenoside bằng phương pháp nuôi cấy rễ tơ của Panax ginseng ........... 45
3.3. Thu nhận betalain bằng phương pháp nuôi cấy rễ tơ của Beta vulgaris ................... 48
Chương 4. KẾT LUẬN............................................................................................ 51
Tài liệu tham khảo ..................................................................................................... 53

iii


Danh mục bảng
Bảng 1.1: Danh mục HCTN (theo Chapman và Hall, 1998) .............................................. 3
Bảng 2.1: Ảnh hưởng của các chủng A. rhizogenes khác nhau lên sự cảm ứng rễ tơ từ mẫu
lá của A. hypogaea. ......................................................................................................... 33
Bảng 2.2: Sự tăng hàm lượng HCTN ở hệ thống nuôi cấy rễ tơ bằng cách sử dụng các
chất cảm ứng khác nhau. ................................................................................................. 38


Danh mục hình
Hình 1.1: Các con đường sinh tổng hợp HCTN ở thực vật. ............................................... 5
Hình 1.2: Con đường acid shikimic ................................................................................... 6
Hình 1.3: Mối liên hệ giữa con đường MVA và con đường MEP. ..................................... 7
Hình 1.5: Mô hình chung của Ri-plasmid........................................................................ 11
Hình 1.6: Ri-plasmid – pRiA4b ...................................................................................... 11
Hình 1.7: Quá trình nuôi cấy dịch treo tế bào .................................................................. 13
Hình 1.8: Quá trình nuôi cấy mô, cơ quan....................................................................... 13
Hình 2.1: Sơ đồ cơ bản của quá trình nuôi cấy rễ tơ ....................................................... 21
Hình 2.2: Quá trình chuyển gene vào tế bào thực vật nhờ A. rhizogenes ......................... 23
Hình 2.3: Thiết bị nuôi cấy chìm có sục khí. ................................................................... 28
Hình 2.4: Thiết bị cột sủi bọt nuôi cấy rễ tơ B. vulgaris .................................................. 29
Hình 2.5: Thiết bị cột sủi bọt chia thành nhiều đoạn ....................................................... 29
Hình 2.6: Thiết bị kết hợp giữa khuấy và sục khí ............................................................ 30
Hình 2.7: Thiết bị phun dạng sương mù .......................................................................... 30
Hình 2.8: Thiết bị nuôi cấy ngập chìm tạm thời – RITA®................................................ 31
Hình 2.9: Hệ thống nuôi cấy dạng phun sương điều khiển tự động ................................. 32
Hình 2.12: Tốc độ tăng sinh khối và hàm lượng ginsenoside ở 3 dạng hình thái rễ tơ khác
nhau được nuôi trên môi trường SH không chứa hormone thực vật. ................................ 35
Hình 3.1: Cấu trúc hóa học của dạng trans- và cis- của resveratrol và các hợp chất
stilbenoid liên quan. ........................................................................................................ 43
Hình 3.3: Cấu trúc chung của ginsenoside [14] ............................................................... 45
Hình 3.6: Betalain có trong dịch chiết thu nhận từ rễ bình thường và hệ thống nuôi cấy rễ
tơ của B. vulgaris cv. Detroit Dark Red.......................................................................... 49

iv


Hình 3.7: Hoạt tính ức chế các DPPH tự do của dịch chiết từ rễ bình thường và hệ thống
nuôi cấy rễ tơ của B. vulgaris cv. Detroit Dark Red. ....................................................... 49

Hình 3.8: Giá trị ORAC của chất chiết từ rễ bình thường và hệ thống nuôi cấy rễ tơ B.
vulgaris cv. Detroit Dark Red. ........................................................................................ 49
Hình 3.9: Các bioreactor sử dụng để nuôi rễ tơ Beta vulgaris cv. Detroit Dark Red. ....... 50

Danh mục ảnh
Hình 1.4: Lông rễ được cảm ứng bởi A. rhizogenes và mô sẹo được cảm ứng bởi A.
tumefaciens. ...................................................................................................................... 9
Hình 1.9: Rễ tơ Beta vulgaris phát triển trên môi trường agar ......................................... 14
Hình 1.10: Rễ tơ Harpagophytum procumbens trong bioreactor ..................................... 14
Hình 1.11: Rễ tơ G. glabra nuôi trong môi trường lỏng .................................................. 14
Hình 1.12: Rễ tơ của cây đậu phộng ............................................................................... 14
Hình 2.10: Rễ tơ phát triển trong thiết bị dạng phun sương ............................................. 32
Hình 2.11: Rễ tơ Panax ginseng được nuôi trên môi trường SH sau 4 tuần, biểu hiện ra ba
kiểu hình thái khác nhau.. ............................................................................................... 34
Hình 2.13: Hình thái của rễ tơ M. lanceolata trước và sau khi lưu trữ.. ........................... 41
Hình 3.2: Rễ tơ Arachis hypogaea L nuôi cấy trong erlen để sản xuất resveratrol. .......... 43
Hình 3.4: Sự sản xuất ginsenoside từ rễ tơ của nhân sâm trong các bioreactor (5 ÷ 20 l) ở
quy mô phòng thí nghiệm ............................................................................................... 47
Hình 3.5: Hệ thống bioreactor (10,000 l) sử dụng nuôi cấy rễ tơ P. ginseng .................... 47

v


LỜI MỞ ĐẦU
Các nghiên cứu về hợp chất biến dưỡng thứ cấp của thực vật đã và đang phát triển rất
mạnh từ 50 năm trở lại đây. Ngoài việc đóng vai trò lớn trong hệ thống tự vệ của thực vật,
các hợp chất biến dưỡng thứ cấp còn mang lại rất nhiều lợi ích cho con người. Rất nhiều
các sản phẩm phục vụ trong ngành dược phẩm, mỹ phẩm, phụ gia thực phẩm có nguồn
gốc từ các hợp chất biến dưỡng thứ cấp của thực vật. Việc tổng hợp các hợp chất này đã
được nghiên cứu rất nhiều trên các hệ thống nuôi cấy in vitro như các hệ thống nuôi cấy

mô, tế bào thực vật và các hệ thống nuôi cấy tế bào thực vật được chuyển gene từ vi sinh
vật. Ở mỗi hệ thống đều có những lợi thế và hạn chế khác nhau. Mặc dù vi sinh vật được
xem là nguồn sản xuất enzyme và các hợp chất tự nhiên tối ưu nhất, nhưng đối với các
sản phẩm biến dưỡng thứ cấp của thực vật thì các hệ thống này có nhiều hạn chế do sự
hạn chế những hiểu biết cơ bản về con đường sinh tổng hợp của nhiều hợp chất tự nhiên
thực vật. Do đó, hệ thống nuôi cấy mô và tế bào thực vật vẫn là đối tượng ưu tiên để sản
xuất hợp chất tự nhiên thực vật. Trong đó, rễ tơ là một đối tượng có nhiều ưu thế và đang
được quan tâm phát triển rất nhiều, có nhiều tiềm năng lớn trong việc nâng lên quy mô
sản xuất công nghiệp. Tuy nhiên, do được biết đến muộn hơn so với các hệ thống nuôi
cấy tế bào và nuôi cấy mô thực vật khác, số lượng các nghiên cứu về hệ thống nuôi cấy rễ
tơ ở nhiều đối tượng vẫn còn hạn chế và cần được phát triển mạnh hơn để có thể đưa vào
ứng dụng trong sản xuất.

1


Chương 1.

TỔNG QUAN

1.1. Hợp chất tự nhiên (HCTN)
1.1.1.

Khái niệm

Hợp chất tự nhiên (HCTN), còn được gọi là hợp chất thứ cấp, là sản phẩm của hoạt
động biến dưỡng thứ cấp ở thực vật. Quá trình trao đổi chất ở thực vật được chia thành 2
dạng là biến dưỡng bậc 1 và biến dưỡng bậc 2 (biến dưỡng thứ cấp). Ở quá trình biến
dưỡng bậc 1 thì thực vật chủ yếu tạo ra vật chất và năng lượng phục vụ cho nhu cầu tăng
trưởng và phát triển của chúng, việc tạo ra các vật chất đó diễn ra thường xuyên và liên

tục trong suốt quá trình tồn tại của thực vật. Còn ở quá trình biến dưỡng thứ cấp thì thực
vật chỉ tổng hợp ra các hợp chất thứ cấp để bảo vệ thực vật khỏi các yếu tố tác động bên
ngoài (stress, tia UV, sự tấn công của vi sinh vật, …) , chúng không có vai trò trong sự
tăng trưởng và phát triển của thực vật. Các hợp chất thứ cấp không được tổng hợp thường
xuyên mà chỉ được tạo ra khi có các tín hiệu về sự tác động của các yếu tố ngoại cảnh đến
thực vật.
Thực vật sản xuất ra một số lượng phong phú các HCTN. Cơ sở dữ liệu của
NAPRALERT vào năm 1988 đã thống kê được khoảng 88.000 hợp chất, hầu hết chúng
có nguồn gốc từ thực vật. Mỗi năm có khoảng 4000 hợp chất mới được phát hiện ra. Năm
1998, từ điển về các sản phẩm tự nhiên (Dictionary of Natural Products) theo Chapman
và Hall đã đưa ra bảng số liệu chứa khoảng 85.000 danh mục về hợp chất thứ cấp. Số liệu
này được trình bày trong bảng 1 [26].

2


Bảng 1.1: Danh mục HCTN (theo Chapman và Hall, 1998)
Tổng số lượng danh mục

85,058

Trong đó bao gồm:
aliphatics

5200

polyketides

2442


carbohydrates
oxygen heterocycles
simple aromatics

3210
1348
4527

benzofuranoids
benzopyranoids
flavonoids

387
2694
8128

tannins
lignans
polycyclic aromatics

750
1565
2448

terpenoids

amino acid
alkaloids

1.1.2.


27,463

3921
15,765

hemimonosesquiditri-

56
1946
8650
7834
5582

tetrapolysteroids

352
51
4600

indole
isoquinoline
steroidal

3693
3498
873

Phân loại


Các hợp chất thự nhiên có thể được phân loại theo nhiều cách khác nhau như dựa vào
công thức hóa học của HCTN, dựa vào nguồn thực vật, hoặc dựa vào con đường sinh tổng
hợp ra HCTN. Dựa vào công thức hóa học thì HCTN được chia thành 3 nhóm lớn là
terpenoid, hợp chất chứa phenol và hợp chất chứa nitơ. Trong đó nhóm lớn nhất là
terpenoid.
3


1.1.2.1.

Nhóm terpenoid:

Các hợp chất thuộc nhóm terpenoid đa phần đều có nguồn gốc từ con đường sinh tổng
hợp isoprenoid, thực vật sử dụng hợp chất isoprene chứa 5 carbon như là những viên gạch
để xây dựng nên các hợp chất terpenoid chứa từ 10 carbon trở lên. Các hợp chất đó được
phân loại theo số lượng carbon như sau:


Monoterpene: 10C



Sesquiterpene: 15C



Diterpene: 20C




Steroid và triterpene: 30C



Tetraterpene (carotenoid): 40C



Polyterpeneoid: [C5].n với n >8

Hợp chất tiêu biểu của nhóm terpene được quan tâm đến nhiều là saponin.
1.1.2.2.

Nhóm hợp chất phenol:

Là hợp chất có chứa nhân phenol, các hợp chất này thường được tổng hợp từ các đơn
vị cấu trúc cơ bản là phenolalanine hoặc tyrosine (9C).
Các hợp chất tiêu biểu thuộc nhóm này là lignin, tanin, flavonoid,…
1.1.2.3.

Hợp chất chứa nitơ:

Là các hợp chất có chứa N trong cấu trúc, hầu hết chúng được tổng hợp từ các acid
amin, gồm 2 nhóm được quan tâm đến nhiều nhất là alkaloid (Vinca alkaloid, Taxol, …)
và cyanogenic glycoside.
1.1.3.

Con đường sinh tổng hợp các HCTN

Trong quá trình trao đổi chất của thực vật, các HCTN được tổng hợp theo 4 con đường

chính là: con đường acid shikimic, con đường acid malonic, con đường acid mevalonic và
con đường methylerythritol phosphate (MEP) hay còn gọi là con đường non-mevalonate.

4


Carbon
Chu trình Calvin
Carbohydrates
Sự hô hấp
Đường

Con đường

phân

Pentose

Phosphoenolpyru
vate

Erythrose-4-phosphate
Con đường

Acetyl Co-A
Chu trình
Tricarboxylic

Con đường
Malonic acid


Aliphatic
amino acid

Shikimic acid
Con đường
Mevalonic acid

Amino acid
chứa vòng

Terpenes
(vd: gossypol)
Các hợp chất thứ
cấp chứa nitơ
(vd: alkaloid,…)
Các hợp chất thứ
cấp chứa phenol
(Vd: lignin, flavonoid, tannin,…)

Hình 1.1: Các con đường sinh tổng hợp HCTN ở thực vật.
Con đường acid shikimic: là con đường tổng hợp ra các amino acid là tyrosine,
phenylalanine, tryptophan làm tiền chất cho việc tổng hợp nên các hợp chất có chứa nhân
phenol và 1 số hợp chất alkaloid có chứa nhân thơm.
5


Hình 1.2: Con đường acid shikimic
Con đường acid malonic: đi từ tiền chất là Acetyl-CoA và tổng hợp ra các hợp chất
thuộc nhóm hợp chất phenol.

Con đường acid mevalonic (MVA) và con đường methylerythritol phosphate (MEP)
chủ yếu tổng hợp ra các hợp chất thuộc nhóm terpenoid. Cả 2 con đường sử dụng tiền
chất là sản phẩm của quá trình đường phân (pyruvate). Con đường MEP diễn ra trong lục
lạp và con đường MVA diễn ra trong tế bào chất.
6


Hình 1.3: Mối liên hệ giữa con đường MVA và con đường MEP.
1.1.4.

Ý nghĩa của HCTN đối với bản thân thực vật và đối với con người

Khi gặp một điều kiện bất lợi nào đó hay gặp sự tấn công của các loài khác thì động vật
có khả năng di chuyển đến nơi an toàn và có các vũ khí tự vệ như móng vuốt, răng
nanh,…để chống chọi lại các tác động đó. Khác với động vật, thực vật không có khả
năng di chuyển nên chúng cần phải có một cách thức nào đó để chống chọi với các điều
kiện bất lợi. Vì vậy, việc thực vật tổng hợp ra các HCTN chính là cách thức tự vệ của
chúng. Các HCTN có vai trò hữu ích đối với bản thân thực vật như sau:
 Là hàng rào bảo vệ thực vật chống lại các động vật ăn thực vật: gây độc, gây tê
hoặc gây mùi khó chịu cho động vật ăn chúng.


Là hàng rào ngăn cản sự tấn công của các vi sinh vật gây bệnh.



Hấp thu tia UV: các hợp chất chứa nhân phenol như courmarin, flavonoid, …
7



 Ngăn cản sự tăng trưởng của các thực vật cạnh tranh: ức chế sự nảy mầm của hột,
ngăn cản sự tăng trưởng chồi và rễ của các thực vật cạnh tranh (phenylpropanoid, dẫn
xuất từ acid benzoic): hiện tượng cảm nhiễm.


Giúp chống chịu về mặt cơ học: lignin, …



Hấp dẫn các tác nhân thụ phấn cho hoa, phát tán trái và hạt: các hợp chất tạo màu

và hương thơm như flavonoid, anthocyanin, …
Đối với con người, các HCTN có vai trò trong nhiều lĩnh vực như y học, nông nghiệp,
thực phẩm, mỹ phẩm, …
 Trong y học, các HCTN có sự đóng góp rất lớn và vẫn đang được nhiều nhà khoa
học quan tâm nghiên cứu để phát triển mạnh các hợp chất có chức năng chữa bệnh như
các hợp chất có khả năng chống bệnh ung (Taxol từ cây thông đỏ, Vinca alkaloid,…), các
hợp chất ức chế các vi khuẩn gây bệnh (glucosinolate có khả năng ức chế các vi khuẩn
gây loét dạ dày).
 Trong nông nghiệp thì các HCTN được ứng dụng như các “ thuốc trừ sâu, thuốc
diệt cỏ tự nhiên” không gây ô nhiễm môi trường.
 Trong thực phẩm và mỹ phẩm, HCTN được ứng dụng chủ yếu là các chất tạo màu,
tạo mùi thơm. Chúng có đặc điểm là không gây ảnh hưởng xấu đến sức khỏe như các chất
phụ gia hóa học, tuy nhiên chúng có nhược điểm là không bền và khó bảo quản hơn so
với các chất hóa học.
HCTN có ý nghĩa rất lớn đối với con người, việc sản xuất các HCTN cần được phát
triển với quy mô công nghiệp để tăng sản lượng cũng như giảm giá thành sản phẩm. Do
đó việc nghiên cứu và phát triển các hệ thống nuôi cấy in vitro cho năng suất tổng hợp các
HCTN cao nhất là một vấn đề rất cấp thiết.
1.2. Vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes

1.2.1.

Lịch sử về Agrobacterium rhizogenes

Agrobacterium được biết đến từ rất lâu trong nông nghiệp với vai trò là các vi khuẩn cố
định đạm, cung cấp nguồn nitơ cho cây trồng. Trong những thập kỉ gần đây thì các nhà
khoa học đã chú ý đến vai trò của hai loài vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes và
Agrobacterium tumefaciens trong mục đích chuyển gene vào thực vật. Chúng được xem
như là các “kĩ sư trao đổi chất”, được áp dụng để chuyển gene vào tế bào thực vật nhằm
8


mục đích đẩy mạnh quá trình sinh tổng hợp ra các hợp chất thứ cấp cần thiết. Trong đó,
Agrobacterium tumefaciens được biết đến với vai trò cảm ứng tạo ra các khối u (mô sẹo)
và Agrobacterium rhizogenes thì được biết đến với vai trò cảm ứng tạo ra các rễ bất định
ở thực vật hai lá mầm.
Agrobacterium rhizogenes, còn có tên khoa học khác là Rhizobium rhizogenes, là một
loài vi khuẩn đất gram âm, thuộc họ Rhizobiaceae nằm trong bộ Rhizobiales cố định đạm.
Chúng có khả năng nhận biết được các phân tử tín hiệu từ các tế bào thực vật bị tổn
thương và tấn công vào vị trí đó. Sự nhiễm của thực vật bởi vi khuẩn Agrobacterium
rhizogenes dẫn đến sự phát triển mạnh mẽ của các rễ bất định đã được chuyển gene ngay
tại vị trí bị nhiễm. Do đó Agrobacterium rhizogenes là một yếu tố cần được quan tâm đến
trong việc cảm ứng tạo rễ bất định từ tế bào thực vật in vitro.

Hình 1.4: Lông rễ được cảm ứng bởi A. rhizogenes và mô sẹo được cảm ứng bởi A.
tumefaciens.
1.2.2.

Gene Ri T-DNA ở Agrobacterium rhizogenes


Khi các vi khuẩn A.rhizogenes nhiễm vào vết thương của thực vật thì chúng sẽ chuyển
gene của chúng vào các tế bào thực vật tại vị trí đó. Các gene được chuyển từ
A.rhizogenes vào trong bộ gene của tế bào thực vật được gọi tên là T-DNA (transfer
9


DNA). T-DNA sau khi chuyển vào thì sẽ được gắn ổn định vào bộ gene của thực vật. Tuy
các gene mã hóa T-DNA có nguồn gốc từ vi khuẩn nhưng nó có mang các trình tự điều
tiết ở Eukaryote nên có thể biểu hiện được trong tế bào thực vật. Đoạn gene T-DNA này
nằm trong 1 plasmid lớn (khoảng 200 kbp) của A.rhizogenes và plasmid này được đặt tên
là Ri- plasmid (root inducing plasmid) do A.rhizogenes có khả năng cảm ứng tạo rễ bất
định [26]. Ri-plasmid được chia thành 2 nhóm chính là agropine and mannopine, vi khuẩn
A. rhizogenes chứa Ri-plasmid thuộc loại agropine được sử dụng chủ yếu cho quá trình
chuyển gene vào tế bào thực vật để cảm ứng tạo rễ tơ. Ri-plasmid được chia thành nhiều
vùng như vùng gây độc (gọi tắt là vùng vir), vùng chuyển gene (T-DNA), vùng ori, vùng
phiên mã,..Chỉ có đoạn T-DNA của plasmid mới được chuyển vào bộ gene của thực vật
và việc chuyển gene này thông qua sự hỗ trợ bởi các đoạn gene trong vùng vir của Riplasmid. Vùng vir chiếm khoảng 35 kb trong Ri-plasmid và mã hóa sáu locus phiên mã
(vir A, B, C, D, E, G), có chức năng quan trọng trong quá trình chuyển gene. Sự phiên mã
của vùng vir được cảm ứng với nhiều hợp chất thuộc nhóm phenol, điển hình là
acetosyringone. Acetosyringone và các hợp chất liên quan được xác định là có vai trò làm
tăng tần số của quá trình chuyển gene thông qua Agrobacterium ở nhiều loài thực vật.
Nhiều loại đường cũng đóng vai trò như chất bổ trợ hoạt động cho acetosyringone để cảm
ứng sự biểu hiện của gene vir ở mức độ cao.
T-DNA của Ri-plasmid được quy thành hai phần là phải (TR-DNA) và trái (TL-DNA).
Phần TR-DNA mang gene aux và gene ags. Gene ags mã hóa các enzyme cần cho quá
trình tổng hợp ra các hợp chất opine (dẫn xuất của các amino acid và nhóm đường). Gene
aux (aux1 và aux2) mã hóa ra các enzyme tham gia vào quá trình sinh tổng hợp ra chất
điều hòa sinh trưởng thực vật là IAA (indole-3-acetic acid). Trong đó, gene aux1 tạo ra
enzyme là tryptophan monooxygenase để chuyển hóa tryptophan thành indole-3acetamide (IAM), sau đó IAM sẽ được chuyển thành IAA nhờ vào hoạt động xúc tác của
enzyme indoleacetamide hydrolase, sản phẩm của gene aux2. Phần TL-DNA mang gene

rol (root loci) mã hóa các vật chất cần thiết cho sự biệt hóa rễ từ tế bào thực vật đã được
chuyển gene. Gene rol bao gồm 4 loại là rolA, rolB, rolC, rolD có vai trò bổ trợ nhau
trong việc tạo ra rễ tơ, trong đó rolB giữ vai trò quan trọng nhất. Cả hai phần TR-DNA và
TL-DNA đều có chức năng trong việc tạo rễ, tuy nhiên TL-DNA có vai trò quan trọng hơn
cả trong việc cảm ứng tạo rễ tơ. Ở hai đầu của T-DNA có hai đoạn trình tự nhận biết để

10


đảm bảo việc cắt chính xác đoạn T-DNA từ Ri-plasmid chuyển vào bộ gene của thực vật,
hai trình tự đó còn được gọi là “borders” của T-DNA (Hình 1.5).

Hình 1.5: Mô hình chung của Ri-plasmid.
Bản đồ giới hạn gene của một loại Ri-plasmid có tên là pRiA4b được mô phỏng theo
mô hình cụ thể như sau [36]:

Hình 1.6: Ri-plasmid – pRiA4b
Trong đó, tms là gene mã hóa auxin nằm ở TR-DNA.
1.3.

Kĩ thuật thu nhận HCTN in vitro

Với những lợi ích to lớn của các HCTN, việc sản xuất HCTN đã được phát triển từ rất
lâu thông qua phương pháp nuôi trồng thực vật, nuôi trồng các cây thuốc. Tuy nhiên, việc
thu nhận HCTN trực tiếp từ thực vật có nhiều nhược điểm như các trở ngại về điều kiện
11


địa lý, về thời gian nuôi trồng, mùa vụ và vấn đề nhiễm bệnh ở cây trồng... Cũng như
phương pháp tổng hợp hóa học khó mà thực hiện được do công thức hóa học của đa số

các HCTN là khá phức tạp và dược tính của các chất tổng hợp hóa học đã được xem xét là
kém hiệu quả hơn so với các HCTN tương ứng. Từ những hạn chế của các phương pháp
trên mà các nhà khoa học và các nhà công nghệ sinh học đã không ngừng nghiên cứu và
phát triển các hệ thống nuôi cấy in vitro như là một phương pháp thay thế để sản xuất
HCTN. Các hệ thống nuôi cấy in vitro được ứng dụng trong sản xuất HCTN bao gồm hệ
thống nuôi cấy tế bào, nuôi cấy mô và cơ quan thực vật.
Hệ thống nuôi cấy tế bào thực vật được sử dụng phổ biến để sản xuất ra các HCTN.
Các bằng chứng về việc dịch treo tế bào có thể sản xuất được HCTN được biết đến rất
muộn trong kĩ thuật nuôi cấy in vitro. Bởi lẽ có một khoảng thời gian dài trước đây các
nhà khoa học đã cho rằng các tế bào không phân hóa như mô sẹo và dịch treo tế bào sẽ
không có khả năng tổng hợp được HCTN như các tế bào đã phân hóa và các mô chuyên
biệt. Zenk và các cộng sự sau đó đã chứng minh bằng thực nghiệm rằng các luận điểm
trên là sai với việc tổng hợp được 2.5 g anthraquinone trên một lít môi trường nuôi cấy tế
bào không phân hóa Morinda citrifolia [5]. Từ đó mở một cánh cửa rộng lớn cho các nhà
khoa học phát triển việc sử dụng hệ thống tế bào thực vật in vitro để sản xuất ra các
HCTN được quan tâm nhiều trong công nghiệp (đặc biệt là các HCTN sử dụng trong
ngành dược và ngành sản xuất thuốc nhuộm).
Bên cạnh các hệ thống nuôi cấy tế bào không phân hóa thì hệ thống nuôi cấy mô và cơ
quan cũng được quan tâm rất nhiều trong sản xuất HCTN. Do có nhiều HCTN không thể
tổng hợp được từ các tế bào không phân hóa đồng thời các mô và cơ quan phân hóa có
khả năng tổng hợp được HCTN ổn định hơn hệ thống tế bào không phân hóa nên đây là
một hướng có tiềm năng lớn trong việc nâng cao hàm lượng HCTN. Trong đó, hai hệ
thống được quan tâm nhiều nhất là hệ thống nuôi cấy rễ tơ và hệ thống nuôi cấy chồi bất
định [5]. Hai hệ thống này được mở rộng nghiên cứu dựa trên sự phát triển của các kĩ
thuật gene với sự hiểu biết khá tường tận về bộ gene của vi khuẩn Agrobacterium.
Kĩ thuật nuôi cấy tế bào và nuôi cấy mô, cơ quan để thu nhận HCTN có thể được tóm
tắt theo 2 sơ đồ như sau [5]:

12



Hình 1.7: Quá trình nuôi cấy dịch treo tế bào

Hình 1.8: Quá trình nuôi cấy mô, cơ quan
13


1.4.

Rễ tơ

Rễ tơ là tên gọi dùng để chỉ các lông rễ được sản sinh ra mạnh mẽ tại vị trí bị nhiễm
bởi vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes. T-DNA từ A. rhizogenes sau khi chuyển vào tế
bào thực vật thì chúng sẽ được gắn vào bộ gene của thực vật, từ đó tế bào thực vật sẽ làm
nhiệm vụ biểu hiện các gene rol và gene aux (tổng hợp ra IAA) làm tăng khả năng tạo các
lông rễ một cách mạnh mẽ ngay tại vị trí bị tổn thương ở mô thực vật đó. Số lượng các
lông rễ được tạo ra khá nhiều, phát triển thành một hệ thống lông rễ, hay còn gọi là hệ
thống rễ tơ.
Sau đây là hình ảnh một số rễ tơ được nuôi cấy trong các môi trường lỏng và môi
trường đặc:

Hình 1.9: Rễ tơ Beta vulgaris phát
triển trên môi trường agar
Hình 1.11: Rễ tơ G. glabra nuôi trong
môi trường lỏng

Hình 1.10: Rễ tơ Harpagophytum
procumbens trong bioreactor

Hình 1.12: Rễ tơ của cây đậu phộng


14


Điểm đặc trưng nổi bật của hệ thống rễ tơ là chúng có khả năng phát triển nhanh và ổn
định trên môi trường nuôi cấy không cần bổ sung chất điều hòa sinh trưởng thực vật
(CĐHSTTV). Bên cạnh đó, khả năng tổng hợp ra các HCTN của hệ thống rễ tơ cũng cao
hơn rất nhiều so với thực vật nguyên vẹn cũng như là so với hệ thống dịch treo tế bào ở
nhiều loài thực vật. Với sự chuyển gene của A. rhizogenes vào tế bào, rễ tơ có khả năng
tổng hợp ra nhiều loại HCTN với hiệu suất cao mà các tế bào không phân hóa và các rễ
bất định không chuyển gene không tổng hợp được hay tổng hợp với hàm lượng không
đáng kể. Rễ tơ được xem như là một nguồn nguyên liệu có giá trị trong sản xuất các
HCTN có lợi như dược phẩm, các chất phụ gia trong ngành mỹ phẩm và thực phẩm. Vào
năm 2002, Seven đã tổng kết lại những hợp chất alkaloid quan trọng nhất trong ngành
dược được sản xuất bởi các hệ thống rễ tơ, bao gồm Atropa belladonna L., Catharanthus
tricophyllus L., và Datura candida L [43].
Nhờ vào những đặc điểm như phát triển nhanh, dễ duy trì ổn định và khả năng tổng
hợp một số lượng lớn HCTN, hệ thống rễ tơ thể hiện tiềm năng lớn trong việc sản xuất
các HCTN thông qua các hệ thống nuôi cấy liên tục. Điều này có ý nghĩa lớn trong việc
sản xuất các sản phẩm HCTN trên quy mô công nghiệp với hiệu xuất cao, giảm chi phí
trong quá trình sản xuất từ đó giảm giá thành sản phẩm.
Bên cạnh việc chuyển T-DNA của A. rhizogenes vào tế bào thì ta còn có thể chuyển
các gene ngoại lai vào trong tế bào thông qua việc tái tổ hợp đoạn gene đó vào trong đoạn
T-DNA của A. rhizogenes. Các gene này có thể là gene biểu hiện ra các hợp chất mục tiêu
hay có thể là các gene mã hóa các enzyme chìa khóa trong con đường sinh tổng hợp ra
HCTN mong muốn. Phương pháp này có thể giúp ta điều khiển hay định hướng cho quá
trình sinh tổng hợp HCTN ở rễ tơ để tổng hợp ra một loại hợp chất tự nhiên với hàm
lượng cao. Nghiên cứu của Lodhi (1996) đã chứng minh rằng hàm lượng anthraquinone
và alizarin trong hệ thống nuôi cấy rễ tơ của Rubia peregrina L. tăng cao khi gắn đoạn
gene mã hóa ra enzyme isochorismate synthase vào đoạn T-DNA; và theo Banerjee

(2002) thì rễ tơ của A. belladonna được chuyển gene P450 2E1 thể hiện khả năng tổng
hợp HCTN với mức độ rất cao [43].
Với tiềm năng lớn của rễ tơ trong sản xuất HCTN, các hệ thống rễ tơ của nhiều loài
thực vật đã được nghiên cứu rộng rãi cho mục đích sản xuất HCTN in vitro. Sau đây là
bảng tổng kết một số loài thực vật được nghiên cứu về việc tổng hợp HCTN bằng phương
pháp nuôi cấy rễ tơ in vitro cùng với tên loại HCTN tương ứng được tổng hợp [2]:
15


Bảng 1.1: HCTN được tổng hợp từ hệ thống rễ tơ của một số loài thực vật
Tên thực vật

HCTN

Aconitum heterophyllum

Aconite

Ajuga replans var. atropurpurea

Phytoecdysteroid

Ambrosia sp.

Polyacetylenes and thiophene

Amsonia elliptica

Indole alkaloid


Anisodus luridus

Tropane alkaloid

Armoracia laphthifolia

Peroxidase, Isoperoxidase,Fusicoccin

Artemisia absinthum

Tinh dầu

Artemisia annua

Artemisinin

Astragalus mongholicus

Cycloartane saponin

Atropa belladonna

Atropine

Azadirachta indica A. Juss.

Azadirachtin

Beta vulgaris


Betalain pigment

Bidens sp.

Polyacetylene and thiophene

Brugmansia candida

Tropane alkaloid

Calystegia sepium

Cuscohygrine

Campanula medium

Polyacetylene

Carthamus

Thiophene

Cassia obtusifolia

Anthraquinone
Polypeptide pigmen

Catharanthus roseus

Indole alkaloid, Ajmalicine


Catharanthus tricophyllus

Indole alkaloid

Centranthus ruber

Valepotriate
16


Tên thực vật

HCTN

Chaenatis douglasis

Thiarubrin

Cinchona ledgeriana

Quinine

Coleus forskohlii

Forskolin

Coreopsis

Polyacetylene


Datura candida

Scopolamine, Hyoscyamine

Datura stramonium

Hyoscyamine, Sesquiterpene

Daucus carota

Flavonoid, Anthocyanin

Digitalis purpurea

Cardioactive glycoside

Duboisia myoporoides

Scopolamine

Duboisia leichhardtii

Scopolamine

Echinacea purpurea

Alkamide

Fagra zanthoxyloids Lam.


Benzophenanthridine
Furoquinoline alanine

Fagopyrum

Flavanol

Fragaria

Polyphenol

Geranium thubergee

Tannin

Glycyrrhiza glabra

Flavonoid

Gynostemma pentaphyllum

Saponin

Hyoscyamus albus

Tropane alkaloid, Phytoalexin

Hyoscyamus muticus


Tropane alkaloid
Hyoscyamine, Proline

Hyoscyamus niger

Hyoscyamine

Lactuca virosa

Sesquiterpene lactone

17


Tên thực vật

HCTN

Leontopodium alpinum

Anthocyanins & tinh dầu

Linum flavum

Lignan (5-methoxy podophyllotoxin)

Lippia dulcis

Sesquiterpene, (hernandulcin)


Lithospermum erythrorhizon

Shikonin, Benzoquinone

Lobelia cardinalis

Polyacetylene glucoside

Lobelia inflata

Lobeline, Polyacetylene

Lotus corniculatus

Condensed tannin

Nicotiana hesperis

Nicotine, Anatabine

Nicotiana rustica

Nicotine, Anatabine

Nicotiana tabacum

Nicotine, Anatabine

Panax ginseng


Saponin

Panax Hybrid (P. ginseng X P.
quinqifolium)

Ginsenoside

Papaver somniferum

Codeine

Perezia cuernavcana

Sesquiterpene quinone

Pimpinella anisum

Tinh dầu

Platycodon grandiflorum

Polyacetylene glkucoside

Rauwolfia serpentina

Reserpine

Rubia peregrina

Anthraquinone


Rubia tinctorum

Anthroquinone

Rudbeckia sp.

Polyacetylene and thiophene

Salvia miltiorhiza

Diterpenoid

Scopolia japanica

Hyoscyamine

18


Tên thực vật

HCTN

Scutellaria baicalensis

Flavonoids and phenylethnoid

Serratula tinctoria


Ecdysteroid

Sesamum indicum

Naphthoquinone

Solanum aculeatissi

Steroidal saponin

Solanum lacinialum

Steroidal alkaloid

Solanum aviculare

Steroidal alkaloid

Swainsona galegifolia

Swainsonine

Swertia japonica

Xanthon

Tagetus patula

Thiophene


Tanacetum parthenium

Sesquiterpene coumarin ether

Tricosanthes kirilowii maxim var
japonicum

Defense related protein

Trigonella foenum graecum

Diosgenin

Valeriana officinalis L.

Valepotriate

Vinca minor

Indole alkaloid (vincamine)

Withania somnifera

Withanoloide

19