BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2

NGUYỄN XUÂN NAM

NGHIÊN CỨU DIỄN THẾ SINH THÁI
VÀ VI SINH VẬT CHUYỂN HÓA BÃ MÍA
THÀNH MÙN HỮU CƠ

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

HÀ NỘI, 2015


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2

NGUYỄN XUÂN NAM

NGHIÊN CỨU DIỄN THẾ SINH THÁI
VÀ VI SINH VẬT CHUYỂN HÓA BÃ MÍA
THÀNH MÙN HỮU CƠ
Chuyên ngành: Sinh thái học
Mã số: 60 42 01 20

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC
Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS. Đinh Thị Kim Nhung

HÀ NỘI, 2015

i

LỜI CẢM ƠN

Trong thời gian thực hiện đề tài, em đã nhận được nhiều sự giúp đỡ, chỉ
bảo và đóng góp ý kiến quý báu từ các thầy cô giáo, gia đình, bạn bè và đồng
nghiệp.
Em xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới PGS.TS. Đinh
Thị Kim Nhung, người trực tiếp hướng dẫn, chỉ bảo tận tình và đồng hành
giúp đỡ em trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu đề tài.
Em xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu trường Đại học Sư phạm Hà
Nội 2. Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới các thầy, cô giáo khoa Sinh - Kĩ
thuật nông nghiệp, trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 đã quan tâm, tạo điều
kiện và giúp đỡ em trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu và hoàn thành đề
tài.
Em xin cảm ơn tất cả các anh, chị và các bạn đang nghiên cứu, học tập
tại phòng thí nghiệm Bộ môn Vi sinh, khoa Sinh - Kĩ thuật nông nghiệp,
trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 đã giúp đỡ và có ý kiến đóng góp cho em
trong thời gian qua.
Em xin được bày tỏ lòng biết ơn và yêu thương tới gia đình, bạn bè và
đồng nghiệp đã luôn động viên, khích lệ và tạo mọi điều kiện cho em trong
quá trình thực hiện đề tài.
Trong quá trình thực hiện không thể tránh khỏi những thiếu sót, em kính
mong thầy cô giáo và các bạn đóng góp ý kiến để đề tài được hoàn thiện hơn.
Em xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, tháng 07 năm 2015
Học viên

Nguyễn Xuân Nam



ii

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan rằng số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn này
là trung thực và không trùng lặp với các đề tài khác. Tôi cũng xin cam đoan
rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn này đã được cảm ơn và các
thông tin trích dẫn trong luận văn đã được chỉ rõ nguồn gốc.
Tác giả

Nguyễn Xuân Nam


iii

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

1.

BG

: Bột giấy

2.

CFU

: Colony-forming unit


3.

CMC

: Cacboxyl Methyl Cellulose

4.

dd

: dung dịch

5.

G

: gram

6.

KL

: khuẩn lạc

7.

NM

: Nấm men


8.

NS

: Nấm sợi

9.

RBBR

: Remazol Brilliant Blue R

10.

VK

: Vi khuẩn

11.

VSV

: Vi sinh vật

12.

XK

: xạ khuẩn



iv

MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN ................................................................................................. i
LỜI CAM ĐOAN ........................................................................................... i
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ............................................................... iii
MỤC LỤC .................................................................................................... iv
DANH MỤC BẢNG ..................................................................................... vi
DANH MỤC HÌNH ..................................................................................... vii
MỞ ĐẦU ....................................................................................................... 1
1. Lí do chọn đề tài ..................................................................................... 1
2. Mục đích nghiên cứu ............................................................................... 2
3. Nội dung nghiên cứu ............................................................................... 2
4. Ý nghĩa khoa học của luận văn................................................................ 2
5. Những đóng góp mới của luận văn .......................................................... 2
NỘI DUNG .................................................................................................... 3
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ......................................................... 3
1.1. Diễn thế sinh thái và mùn hữu cơ ......................................................... 3
1.1.1. Diễn thế sinh thái ........................................................................... 3
1.1.2. Mùn hữu cơ .................................................................................... 4
1.2. Vi sinh vật tham gia chuyển hóa bã mía thành mùn hữu cơ .................. 6
1.2.1. Vi khuẩn......................................................................................... 6
1.2.2. Vi nấm ........................................................................................... 7
1.2.3. Xạ khuẩn ........................................................................................ 8
1.3. Tổng quan về bã mía ............................................................................ 9
1.3.1. Tình hình nghiên cứu về sự phân giải bã mía ................................. 9
1.3.2. Thành phần cấu trúc của bã mía .................................................. 10
1.3.3. Ứng dụng bã mía sau khi xử lý..................................................... 17
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................... 19

2.1. Đối tượng và môi trường nghiên cứu ................................................. 19


v

2.1.1. Đối tượng nghiên cứu .................................................................. 19
2.1.2. Môi trường nghiên cứu và hóa chất ............................................. 19
2.2. Thuốc thử và thiết bị .......................................................................... 20
2.2.1. Thuốc thử ..................................................................................... 20
2.2.2. Thiết bị......................................................................................... 20
2.3. Phương pháp nghiên cứu .................................................................... 20
2.3.1. Phương pháp xác định độ ẩm tuyệt đối của bã mía ...................... 20
2.3.2. Tạo khối ủ từ bã mía .................................................................... 21
2.3.3. Phương pháp vi sinh vật .............................................................. 23
2.3.4. Phương pháp toán học thống kê và xử lý số liệu .......................... 30
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ....................... 31
3.1. Diễn thế sinh thái của khối ủ bã mía trong quá trình mùn hóa ............ 31
3.1.1. Sự thay đổi trạng thái của bã mía trong quá trình mùn hóa ........... 32
3.1.2. Sự thay đổi nhiêt độ của các khối ủ bã mía thí nghiệm và đối
chứng ..................................................................................................... 37
3.1.3. Sự thay đổi khối lượng khối ủ bã mía thí nghiệm và đối
chứng .................................................................................................... 38
3.2. Vi sinh vật phân lập được từ quá trình mùn hóa bã mía ..................... 41
3.3. Khảo sát hoạt tính sinh enzyme ngoại bào và sự đối kháng của vi
sinh vật tuyển chọn ................................................................................... 44
3.3.1. Khảo sát khả năng sinh enzyme ngoại bào của các chủng VSV
có hoạt tính ............................................................................................ 44
3.3.2. Đặc điểm hình thái của 3 chủng VSV tuyển chọn ......................... 49
3.3.3. Tính đối kháng của các chủng VSV tuyển chọn ............................ 53
3.4. Đánh giá khả năng phân giải bã mía thành mùn hữu cơ...................... 55

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ...................................................................... 57
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 58
PHỤ LỤC .................................................................................................... 62


vi

DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1. Thành phần hóa học của bã mía.................................................... 11
Bảng 2. 1. Môi trường phân lập và nuôi cấy VSV ........................................ 19
Bảng 2. 2. Thành phần môi trường thử hoạt tính enzyme ngoại bào ............. 19
Bảng 2. 3. Các khối ủ và tỉ lệ thành phần phối trộn trong khối ủ bã mía ....... 22
Bảng 2. 4. Lượng VSV bổ sung vào cơ chất ................................................ 29
Bảng 3.1. Sự thay đổi trạng thái trong các khối ủ bã mía (Đ) và (T) ............... 32
Bảng 3. 2. Sự thay đổi độ mủn của bã mía trong các khối ủ ......................... 36
Bảng 3.3. Vi sinh vật phân lập được trong khối ủ đối chứng và thí
nghiệm (Đ và T) ......................................................................... 42
Bảng 3. 4. Khảo sát khả năng sinh enzyme ngoại bào của các chủng
VSV có hoạt tính ........................................................................ 44
Bảng 3.5. Bảng tỷ lệ VSV có hoạt tính enzyme ngoại bào............................ 46
Bảng 3. 6. Một số đặc điểm hình thái của 3 chủng tuyển chọn ..................... 49


vii

DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Cấu trúc lập thể của cellulose ....................................................... 11
Hình 1.2. Cấu trúc của hemicellulose ........................................................... 14
Hình 1.3. Các đơn vị cơ bản của lignin ......................................................... 15
Hình 1.4. Cấu trúc lignin .............................................................................. 16

Hình 3. 1. Khối ủ bã mía trong thùng xốp khi bắt đầu ủ ............................... 31
Hình 3. 2. Khối ủ bã mía trong thùng xốp ở ngày thứ 56 .............................. 31
Hình 3.3. Biến thiên nhiệt độ của khối ủ bã mía (Đ và T) ............................... 37
Hình 3.4. Biến thiên khối lượng khối ủ bã mía (Đ và T) trong 70 ngày .... 39
Hình 3.5. Các khuẩn lạc VSV phân lập từ khối ủ (T) ................................... 43
Hình 3.6. Hoạt tính enzyme ngoại bào của một số chủng vi sinh vật
tuyển chọn từ các khối ủ bã mía ................................................... 47
Hình 3.7. Khảo sát hoạt tính enzyme ngoại bào của VSV trên môi trường
chứa xylan .................................................................................... 48
Hình 3. 8. Hình thái chủng Bacillus TV12...................................................... 51
Hình 3. 9. Hình thái chủng Trichoderma TM11 ............................................. 52
Hình 3. 10. Hình thái chủng Streptomyces TX4 ............................................. 53
Hình 3.11. Kết quả kiểm tra tính đối kháng của các chủng VSV tuyển
chọn.............................................................................................. 54
Hình 3.12. Trồng rau Dền trên đất ruộng trộn mùn bã mía bổ sung 3
chủng Bacillus TV12, Streptomyces TX4, Trichoderma TM11 ......... 55
Hình 3.13. So sánh chiều cao của cây rau Dền sau 168h .............................. 56


1

MỞ ĐẦU
1. Lí do chọn đề tài
Hiện nay, vấn đề môi trường đang được hầu hết các quốc gia trên thế
giới đặc biệt chú trọng. Ô nhiễm môi trường đang ngày càng trở lên trầm
trọng, kéo theo những thiên tai biến động ảnh hưởng tới môi trường sinh thái.
Một trong những nguồn thải gây ô nhiễm môi trường là các chất thải khó
được phân hủy trong môi trường tự nhiên. Trong đó, các phế phụ phẩm công
nghiệp, nông nghiệp là một trong những vấn đề được đặc biệt quan tâm. Mía
là một trong những cây công nghiệp lấy đường quan trọng của ngành công

nghiệp đường. Tính đến cuối năm 2012, thì tổng diện tích trồng mía toàn thế
giới đạt gần 26,1 triệu ha và tổng sản lượng mía thu hoạch đạt 1,83 tỷ tấn.
Lượng bã mía thải ra ước tính chiếm 30% lượng mía đem ép [12]. Nguồn bã
mía nếu không được xử lý sẽ đem lại một nguy cơ khổng lồ về lượng phế phụ
phẩm gây ô nhiễm môi trường [17].
Trên thế giới, nhiều công trình khoa học đã nghiên cứu về enzyme phân
hủy cellulose Michel Warzywoda et al (1992) [35], Rabinovich M. L. et al
(2002) [30]. Sau đó là các công trình ứng dụng để xử lý các phế phụ phẩm
(mùn cưa, trấu, rơm rạ và một số nguyên liệu khác) thành phân bón hữu cơ
như Nakasaki K.(2011) [29]. Ở Việt Nam, trong những năm gần đây, vấn đề
về xử lý bã mía, rơm rạ sau thu hoạch đã nhận được nhiều sự quan tâm của
các nhà khoa học như Lê Văn Tri (2000) [21], Khưu Phương Yến Anh (2010)
[1], Phạm Thị Thanh Nhàn (2014) [11]. Tuy nhiên, chưa có công trình nghiên
cứu đầy đủ về diễn thế sinh thái và khu hệ vi sinh vật tham gia chuyển hóa bã
mía thành mùn hữu cơ, góp phần làm giảm thiểu sự ô nhiễm từ nguồn phế
phụ phẩm công nghiệp, nông nghiệp.
Chính vì vậy, chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu diễn thế sinh thái
và vi sinh vật chuyển hóa bã mía thành mùn hữu cơ”.


2

2. Mục đích nghiên cứu
Nghiên cứu diễn thế sinh thái và nhóm vi sinh vật tham gia quá trình
chuyển hóa bã mía thành mùn hữu cơ sử dụng trồng cây.
3. Nội dung nghiên cứu
3.1. Diễn thế sinh thái của khối ủ bã mía trong quá trình mùn hóa.
3.2. Phân lập vi sinh vật từ quá trình mùn hóa bã mía.
3.3. Khảo sát hoạt tính sinh enzyme ngoại bào và sự đối kháng của vi
sinh vật tuyển chọn.

3.4. Đánh giá khả năng phân giải bã mía thành mùn hữu cơ.
4. Ý nghĩa khoa học của luận văn
4.1. Ý nghĩa khoa học
Cung cấp dẫn liệu khoa học làm sáng tỏ mối quan hệ giữa các nhóm vi
sinh vật trong quá trình chuyển hóa bã mía thành mùn hữu cơ.
4.2. Ý nghĩa thực tiễn
Trên cơ sở nghiên cứu diễn thế sinh thái khối ủ bã mía chuyển thành
mùn hữu cơ sử dụng cho việc trồng cây.
5. Những đóng góp mới của luận văn
Khảo sát được diễn thế sinh thái của các nhóm vi sinh vật tham gia vào
quá trình mùn hóa bã mía; Phân lập được 83 chủng VSV, có 37 chủng vi
khuẩn, 28 chủng nấm sợi, 15 chủng xạ khuẩn, 3 chủng nấm men trong khối ủ
bã mía; Tuyển chọn được 03 chủng: Bacillus TV12, Streptomyces TX4,
Trichoderma TM11 có khả năng phân giải cellulose mạnh; Bước đầu đánh giá
khả năng sinh trưởng của cây rau Dền (Amaranthus tricolor) trên mùn khối ủ
bã mía đã bổ sung 3 chủng VSV tuyển chọn.


3

NỘI DUNG
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Diễn thế sinh thái và mùn hữu cơ
1.1.1. Diễn thế sinh thái
Hệ sinh thái bao gồm quần xã sinh vật và sinh cảnh của quần xã. Trong
hệ sinh thái, các sinh vật luôn tác động lẫn nhau và tác động qua lại với các
nhân tố vô sinh của môi trường tạo nên một hệ thống sinh học hoàn chỉnh và
tương đối ổn định. Trong hệ sinh thái, trao đổi chất và năng lượng giữa các
sinh vật trong nội bộ quần xã và giữa quần xã với sinh cảnh, chúng biểu hiện

chức năng của một tổ chức sống.
Diễn thế sinh thái là quá trình biến đổi tuần tự của quần xã qua các giai
đoạn tương ứng với sự biến đổi của môi trường. Song song với quá trình biến
đổi quần xã trong diễn thế là quá trình biến đổi các điều kiện tự nhiên của môi
trường như khí hậu, thổ nhưỡng,… Gồm những kiểu diễn thế sinh thái.
Diễn thế nguyên sinh là diễn thế khởi đầu từ môi trường chưa có
sinh vật.
Diễn thế thứ sinh là diễn thế xuất hiện ở môi trường đã có một quần xã
sinh vật sống.
Diễn thế phân hủy là quá trình không dẫn tới một quần xã sinh vật ổn
định, mà theo hướng dần dần bị phân hủy dưới tác dụng của nhân tố sinh học.
Nghiên cứu diễn thế, ta có thể nắm được quy luật phát triển của quần
xã sinh vật, hình dung được những quần xã tồn tại trước đó và dự đoán những
dạng quần xã sẽ thay thế trong những hoàn cảnh mới.
Sự hiểu biết về diễn thế cho phép ta chủ động điều khiển sự phát triển
của diễn thế theo hướng có lợi cho con người bằng những tác động lên điều


4

kiện sống như: cải tạo đất, đẩy mạnh biện pháp chăm sóc, phòng trừ sâu bệnh,
tiến hành các biện pháp thủy lợi, khai thác, cải tạo giống, bảo vệ hợp lý nguồn
tài nguyên [16].
1.1.2. Mùn hữu cơ
Mùn là một thể hữu cơ phức tạp, là một bộ phận rất quan trọng trong
đất. Quá trình hình thành mùn gắn liền với quá trình phát sinh của đất. Mùn là
cơ sở chủ yếu hình thành độ phì nhiêu của đất, là sản phẩm phân giải xác hữu
cơ và tổng hợp những hợp chất được phân giải của vi sinh vật, những phản
ứng xảy ra trong quá trình tạo mùn là những phản ứng sinh hoá, có tác động
bởi các enzyme do vi sinh vật tiết ra.

Mùn hữu cơ là sản phẩm hình thành trong đất do quá trình tích lũy và
phân giải không hoàn toàn trong điều kiện hiếu khí, yếm khí xác thực vật,
động vật và các tồn dư sinh vật khác trong đất do các vi sinh vật đất. Thành
phần của mùn được đặc trưng bởi các hợp chất chính: axit humic, axit fulvic,
axit ulmic và các muối của chúng [37].
Nguyên lý chung được nhiều nhà khoa học đất và sinh lý thực vật đồng
ý là sự sinh trưởng và năng suất của cây trồng được quyết định bởi chất dinh
dưỡng, nước và không khí trong đất, điều kiện môi trường như ánh sáng và
nhiệt độ. Tuy nhiên, nhiều nghiên cứu cho thấy chất mùn hữu cơ trong đất có
ảnh hưởng rất lớn đến cây trồng. Số lượng và chất lượng của chất mùn hữu cơ
trong đất có tương quan chặt đến năng suất cây trồng.
Mùn không những là nơi tích lũy chất hữu cơ làm nên độ phì nhiêu của
đất mà còn là nhân tố tạo nên kết cấu đất. Sự hình thành và phân giải mùn đều
do vi sinh vật đóng vai trò tích cực. Vì vậy các điều kiện ngoại cảnh ảnh
hưởng đến vi sinh vật cũng ảnh hưởng đến hàm lượng mùn trong đất. Đặc biệt
nước ta ở trong vùng nhiệt đới nóng ẩm, sự hoạt động của vi sinh vật rất
mạnh ảnh hưởng lớn đến sự tích lũy và phân giải mùn. Các biện pháp canh tác


5

như cày bừa, xới xáo, bón phân,... đều ảnh hưởng trực tiếp đến vi sinh vật và
qua đó ảnh hưởng đến hàm lượng mùn trong đất. Trong điều kiện khô hanh
quanh năm, tốc độ mùn hoá chậm, nhưng nếu thường xuyên ngập nước, mùn
hoá thực hiện dưới tác động của vi sinh vật yếm khí sẽ sinh ra những axit hữu
cơ và các chất khử (CH4, H2S...), những chất này kìm hãm sự hoạt động của
vi sinh vật làm cho tốc độ mùn hoá chậm hẳn và xác hữu cơ biến thành than
bùn. Nhiệt độ thích hợp cho quá trình mùn hoá là 25 - 30C [3], [39].
Chất mùn hữu cơ trong đất ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và năng suất
của cây trồng thông qua các đặc tính lý, hóa và sinh của đất như: chất mùn

hữu cơ cung cấp chất đạm, lân, lưu huỳnh và các chất vi lượng một cách từ từ
cho cây trồng. Bởi vậy, mùn hữu cơ được xem như là một kho tích trữ dưỡng
chất từ phân hóa học. Vai trò này rất quan trọng, giúp hạn chế việc mất phân
sau khi bón vì nếu không chúng bị bốc hơi hoặc rửa trôi đi. Những chất dinh
dưỡng được mùn hữu cơ giữ lại này sau đó được phóng thích cho cây hấp thụ
khi cần thiết. Đồng thời, chất mùn hữu cơ cải thiện cấu trúc của đất, làm đất
có nhiều lỗ rỗng hơn vì thế đất trở nên thông thoáng, giúp sự di chuyển của
nước trong đất được dễ dàng, và giữ được nhiều nước hơn và làm tăng mật độ
số vi sinh vật trong đất, bao gồm cả vi sinh vật có lợi.
Ảnh hưởng của chất mùn đến sự sinh sinh trưởng của cây trồng không
phải chỉ đơn thuần bằng những cách trên mà còn có vai trò kích thích cho cây
trồng phát triển. Tính kích thích này là do sự hiện diện của những chất có
chức năng như là những chất điều hòa sinh trưởng thực vật có trong mùn hữu
cơ, có hoạt tính tương tự như IAA, Gibberillin, Cytokinin [21]. Hoặc những
chất ngăn cản sự phân hủy auxin.
Mùn hữu cơ kích thích sự nẩy mầm của hạt, rễ, chồi và sự tăng trưởng
của cây con. Tùy thuộc vào chất lượng và số lượng của chất mùn mà mức độ
kích thích có khác nhau. Chất mùn hữu đã được ứng dụng trong trong việc thúc
đẩy sự nẩy mầm của hạt và sự phát triển của cây con [37].


6

1.2. Vi sinh vật tham gia chuyển hóa bã mía thành mùn hữu cơ
Vi sinh vật không phải là một nhóm phân loại trong sinh giới mà là bao
gồm tất cả các sinh vật có kích thước hiển vi, không thấy rõ được bằng mắt
thường, do đó phải sử dụng kính hiển vi thường hoặc kính hiển vi điện tử.
Ngoài ra muốn nghiên cứu vi sinh vật người ta phải sử dụng tới phương pháp
nuôi cấy vô khuẩn.
Phần lớn vi sinh vật thuộc về ba nhóm Cổ khuẩn, Vi khuẩn và Nguyên

sinh. Trong giới Nấm, thì nấm men, nấm sợi và dạng sợi của mọi nấm lớn đều
được coi là vi sinh vật. Như vậy là vi sinh vật không có mặt trong hai giới
Động vật và Thực vật. Người ta ước tính trong số 1,5 triệu loài sinh vật có
khoảng 200000 loài vi sinh vật (100000 loài động vật nguyên sinh và tảo,
90000 loài nấm, 2500 loài vi khuẩn lam và 1500 loài vi khuẩn). Tuy nhiên
hàng năm, có thêm hàng nghìn loài sinh vật mới được phát hiện, trong đó có
không ít loài vi sinh vật có mặt ở Việt Nam [5]. Trong đó, nhiều loài vi sinh
vật tham gia chuyển hóa bã mía thành mùn hữu cơ khi có enzyme ngoại bào
phân hủy các thành phần có trong bã mía như vi khuẩn, vi nấm, xạ khuẩn.
1.2.1. Vi khuẩn
Đây là các vi khuẩn hiếu khí, hoạt động tối ưu trong phạm vi pH 6 7,5. Chúng có thể thuộc nhóm vi khuẩn ưa lạnh, ưa ấm hoặc ưa nhiệt. Nhóm
vi khuẩn hoạt động mạnh trong giai đoạn đầu của quá trình ủ, mặc dù khả
năng chuyển hóa các hợp chất giàu cellulose của chúng yếu hơn so với nấm
và xạ khuẩn nhưng chúng hoạt động với số lượng lớn hơn trong đống ủ. Nhiệt
độ của đống ủ tăng cao là điều kiện bất lợi cho một số loài vi khuẩn, để duy
trì sự tồn tại trong đống ủ một số vi khuẩn có hình thức sinh sản bào nang.
Khi nhiệt độ khối ủ giảm xuống là điều kiện thuận lợi cho các bào nang nảy
mầm và lúc này vi khuẩn lại tiếp tục hoạt động trở lại [34].


7

Môi trường có độ ẩm cao thường làm tăng khả năng phân giải cellulose
và hemicellulose của các nhóm vi khuẩn, nhưng chủ yếu là các nhóm vi
khuẩn hiếu khí. Một số nhóm vi khuẩn có khả năng phân giải cellulose:
Pseudomonas, Bacillus, Cellulomonas, Vibrio, Cellvibro, Ruminococcus
falvefeciens, R. albus,... Thực tế, nhóm vi khuẩn hiếu khí thuộc chi
Pseudomonas và Bacillus có tần xuất phân lập được cao nhất. Các vi khuẩn
kị khí phân lập được trong dạ cỏ của động vật nhai lại như Ruminococcus
falvefeciens, R. albus [5].

1.2.2. Vi nấm
Vi nấm (Microfungi) thuộc Giới nấm (Fungi). Vi nấm là tất cả các nấm
không có mũ nấm (quả thể) có thể thấy rõ bằng mắt thường. Người ta gọi
những nấm có mũ nấm là các nấm bậc cao. Nghiên cứu vi nấm bắt buộc phải
quan sát dưới kính hiển vi và phải nuôi cấy trong các điều kiện vô khuẩn như
đối với vi khuẩn.
Căn cứ vào hình thái chia vi nấm thành hai nhóm khác nhau: nhóm
Nấm men và nhóm Nấm sợi. Chúng chỉ khác nhau về hình thái chứ không
phải là những taxon phân loại riêng biệt. Nhiều nấm men cũng có dạng sợi và
rất khó phân biệt với nấm sợi [5].
1.2.2.1. Nấm Sợi
Sợi nấm có dạng hình ống phân nhánh bên trong chứa chất nguyên sinh
có thể lưu động. Về chiều dài chúng có sự sinh trưởng vô hạn nhưng về đường
kính thì thường chỉ thay đổi trong phạm vi 1-30µm (thông thường là 5-10 µm).
Đầu sợi nấm có hình viên trụ, phần đầu gọi là vùng kéo dài (extension
zone). Lúc sợi nấm sinh trưởng mạnh mẽ đây là vùng thành tế bào phát triển
nhanh chóng, vùng này có thể dài đến 30 µm. Dưới phần này thành tế bào dày
lên và không sinh trưởng thêm được nữa. Màng nguyên sinh chất thường bám
sát vào thành tế bào. Trên màng nguyên sinh chất có một số phần có kết cấu


8

gấp nếp có tác dụng tiết xuất các chất vào môi trường như: enzyme phân hủy
cellulose, hemicellulose hay lignin,… Trong đó nấm sợi có khả năng phân
giải cellulose thuộc các chi: Penicillium, Aspergillus, Trichoderma [13].
1.2.2.2. Nấm men
Thuật ngữ Nấm men chỉ là tên chung để chỉ nhóm vi nấm thường có
cấu tạo đơn bào và thường sinh sôi nảy nở bằng phương pháp nẩy chồi
(budding). Nấm men không thuộc về một taxon phân loại nào nhất định,

chúng có thể thuộc ngành Nấm túi (Ascomycota) hoặc ngành Nấm đảm
(Basidiomycota).
Nảy chồi là cách sinh sản vô tính điển hình của nấm men. Nấm men
còn có hình thức sinh sản phân cắt như vi khuẩn. Có thể hình thành một hay
vài vách ngăn để phân cắt tế bào mẹ thành những tế bào phân cắt. Dạng sinh
sản hữu tính ở nấm men là dạng các bào tử túi (ascospore) được sinh ra từ các
túi (asci). Có thể xảy ra sự tiếp hợp (conjugation) giữa hai tế bào nấm men
tách rời hoặc giữa tế bào mẹ và chồi [5].
1.2.3. Xạ khuẩn
Xạ khuẩn là nhóm vi khuẩn đặc biệt. Chúng có khuẩn lạc khô và đa số
có dạng hình phóng xạ (actino-) nhưng khuẩn thể lại có dạng sợi phân nhánh
như nấm (myces). Vì xạ khuẩn có cấu trúc nhân nguyên thuỷ như mọi vi
khuẩn khác, chiều ngang của sợi cũng nhỏ như vi khuẩn. Xạ khuẩn phân bố
rộng rãi trong tự nhiên. Số lượng đơn vị sinh khuẩn lạc (CFU) xạ khuẩn trong
1g đất thường đạt tới hàng triệu. Trên môi trường đặc đa số xạ khuẩn có hai
loại khuẩn ty: khuẩn ty khí sinh và khuẩn ty cơ chất. Nhiều loại chỉ có khuẩn
ty cơ chất nhưng cũng có loại (như chi Sporichthya) lại chỉ có khuẩn ty khí sinh.
Một số chủng xạ khuẩn có khả năng phân giải cellulose như: Streptomyces
roseosporus, Streptomyces albofaciens [9].


9

1.3. Tổng quan về bã mía
1.3.1. Tình hình nghiên cứu về sự phân giải bã mía
1.3.1.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới
Trên thế giới, xử lí phế phụ phẩm nông nghiệp đã được các nhà khoa
học trên các quốc gia quan tâm. Đặc biệt là nghiên cứu các chủng VSV có
khả năng phân giải cellulose (thành phần chính của tế bào thực vật có trong
phần lớn ở rơm rạ, bã mía) và sử dụng chúng để làm nguyên liệu ủ phân bón

phục vụ cho nền nông nghiệp. Các công trình nghiên cứu như: Michel
Warzywoda et al (1992) [35], nghiên cứu về nấm Trichoderma reesei.
Nakasaki K. (2011) [29], xử lý các phế phụ phẩm rơm rạ thành phân bón hữu
cơ. Roshan Kumar (2014) [26], nghiên cứu về đa dạng xạ khuẩn phân giải
trên các môi trường khác nhau. Tất cả các công trình nghiên cứu trên đều
nhằm mục đích tận dụng năng lượng từ nguồn phế thải công, nông nghiệp
phục vụ cho nền sản xuất nông nghiệp và bảo vệ môi trường trước các nguồn
thải hữu cơ.
1.3.1.1. Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam
Ở Việt Nam, hiện trạng sử dụng bã mía đang là một vấn đề cần được
quan tâm bởi sản lượng bã từ các nhà máy đường tương đối lớn khoảng gần
4,5 triệu tấn/ năm [12]. Chủ yếu các nhà máy đường đang sử dụng trực tiếp
làm nguồn nhiệt năng quay vòng lại các chu trình sản xuất. Với thực tại đó
đang làm lãng phí lượng lớn nguồn năng lượng hữu cơ. Bởi vậy, nghiên cứu
bã mía chuyển hóa thành mùn hữu cơ làm phân bón sử dụng trong nông
nghiệp là vấn đề đáng quan tâm. Có nhiều nhà khoa học của Việt Nam đã
bước đầu nghiên cứu về một loài hay nhóm loài thuộc một chi phân hủy
cellulose từ nhiều nguồn khác nhau. Tăng Thị Chính (2001) [2], đã nghiên
cứu VSV phân giải cellulose trong phân hủy rác thải. Trên rơm rạ, Khưu
Phương Yến Anh (2010) [1], Trần Thị Ngọc Sơn (2011) [15]. Trên vỏ cà phê,


10

Lê Hồng Phú (2003) [14], Trần Thị Thanh Thuần (2009) [18]. Hoặc hệ VSV
trên rơm rạ Phạm Thị Thanh Nhàn (2014) [11]. Công trình xử lí lá mía bằng
VSV của Đặng Minh Hằng (2002) [7]. Hay công trình nghiên cứu nghiền nhỏ
bã mía với công xuất lớn của Nguyễn Minh Tùng (2009) [19] trong dây
truyền làm phân vi sinh. Hiện nay, chưa có công trình nghiên cứu về nhóm vi
sinh vật cùng tham gia phân giải bã mía thành mùn hữu cơ. Bởi vậy, nghiên

cứu khu hệ sinh vật phân giải bã mía là vấn đề cần thiết nhằm đưa ra giải
pháp xử lý nguồn năng lượng sinh khối đang bị lẵng phí gây ô nhiễm môi
trường.
1.3.2. Thành phần cấu trúc của bã mía
Cây Mía có tên khoa học Succharum officinarum L., thuộc họ lúa
(Poaceae). Cây thân thảo cao, thân đặc cao từ 2 - 4m, chia thành nhiều đốt rõ
dài 2 - 5cm, đường kính 40 - 60mm, bên trong có màu trắng ngà, nhiều xơ,
chứa nhiều nước. Lá phủ một lớp sáp, lá to, bẹ có nhiều lông dễ rụng. Cụm
hoa là chùy rộng và to ở ngọn cây, bông nhỏ có một hoa sinh sản.
Mía là cây trồng phổ biến tại Việt Nam để sản xuất đường. Thân cây
mía chứa khoảng 80 - 90% nước dịch, trong nước dịch đó chứa khoảng 16 18% đường vào thời kì mía chín già. Thân mía sau ép lấy nước dịch thu được
phụ phẩm là bã mía. Mật rỉ đường cũng là một phụ phẩm của ngành sản xuất
đường thu được sau khi kết tinh đường tinh thể. Theo Hiệp hội Mía đường
Việt Nam (VSSA), mỗi năm các nhà máy đường ép gần 15 triệu tấn mía, phát
sinh ra ≈ 4,5 triệu tấn bã mía. Bã mía chiếm ≈ 30% lượng mía đem ép. Thành
phần chủ yếu của bã mía gồm: nước (40 - 50%), xơ (45 - 48%), chất hòa tan đường (2,5%) [20], [38].


11

Bảng 1.1. Thành phần hóa học của bã mía
Thành phần

Khối lượng (%)

Cellulose

40 – 50

Hemicellulose


20 – 25

Lignin

18 – 23

Tro

1–4

Sáp

<1

1.3.2.1. Cellulose
a, Cellulose
Cellulose tham gia thành phần cấu tạo cơ bản của thành tế bào thực vật,
(trong gỗ chứa khoảng 95% cellulose, sợi bông vải 97 - 98%, sợi đay 75%)
[35], giúp cho các mô thực vật có độ bền cơ học và tính đàn hồi. Cellulose là
polysaccharide do các mắt xích α-glucose [C6H7O2(OH)3]n nối với nhau bằng
liên kết β-1,4-glycoside. Phân tử khối của cellulose rất lớn, khoảng từ 10000 150000u [34]. Trong đó có các nhóm hydroxyl đều nằm trên mặt phẳng nằm
ngang [20].

Hình 1.1. Cấu trúc lập thể của cellulose
Các phân tử cellulose kết hợp với nhau tạo thành micel tức là bó sợi có
chiều dài 50 - 100Å. Các micel lại tạo thành bó microfibril với đường kính
khoảng 250 Å nhờ nhiều liên kết hydro tạo sợi bền chắc. Toàn bộ cấu trúc này
được bao bọc bởi lignin và hemicellulose [24].
Trong môi trường chua, nghèo dinh dưỡng hoặc rất chua và háo khí,

trong số các vi sinh vật phân hủy cellulose thì nấm giữ vai trò quan trọng.


12

Trong môi trường dư ẩm, cellulose lại do vi khuẩn yếm khí như Clostridium,
Plectridium phân hủy là chính [3].
b, Enzyme phân hủy cellulose
Liên kết chủ yếu trong cấu trúc của cellulose là β-1,4-glycoside. Để
thủy phân hoàn toàn cấu trúc của polysaccharide này cần có một hệ enzyme
cellulase với những tác động đặc trưng riêng biệt. Dựa theo nghiên cứu về hệ
enzyme cellulase của nấm Trichoderma reesei, hệ enzyme thủy phân
cellulose gồm 3 loại enzyme:
(1) Endoglucanase hoặc β-1,4-D-glucan glucanohydrolase là enzyme
thủy phân các liên kết β-1,4-glycoside trong phân tử cellulose ở các điểm
ngẫu nhiên bên trong chuỗi polymer hình thành các đầu chuỗi khử tự do và
các chuỗi oligosaccharide ngắn. Các Endoglucanase không thể thủy phân
cellulose tinh thể hiệu quả nhưng nó sẽ phá vỡ các liên kết tại khu vực vô
định hình tương đối dễ tiếp cận.
(2) Exoglucanase bao gồm các β-1,4-D-glucan glucanohydrolase (EC
3.2.1.74), giải phóng D-glucose từ β-glucan và cellodextrin và các β-1,4-Dglucan cellobiohydrolase (EC 3.2.1.91), thủy phân D-cellobiose. Tỷ lệ thủy
phân của enzyme cellobiohydrolase bị hạn chế bởi sự sẵn có các đầu khử của
mạch cellulose.
(3) β-glucosidase hay β-D-glucoside glucohydrolase (EC 3.2.1.21) giải
phóng phân tử D-glucose từ cellodextrin hòa tan và một loạt các glucoside
khác.
Rất ít sinh vật có khả năng phân giải cellulose để làm nguồn cung cấp
thức ăn. Vì vậy cellulose không có giá trị dinh dưỡng cao; chúng chỉ có tác
dụng điều hòa hệ thống tiêu hóa, làm giảm lượng mỡ, cholesterol trong máu và
tăng cường đào thải chất cặn bã. Vi khuẩn trong dạ cỏ của các động vật nhai lại

và các động vật nguyên sinh trong ruột mối là những VSV có khả năng sinh
enzyme phân giải cellulose, một số VSV đất cũng có khả năng này [31].


13

1.3.2.2. Hemicellulose
a, Hemicellulose
Hemicellulose là một trong ba sinh khối tự nhiên chính. Cùng với
cellulose và lignin, hemicellulose tạo nên thành phần lignocellulose, cấu trúc
nên thành tế bào thực vật. Hemicellulose là loại polymer phức tạp và phân
nhánh, độ trùng hợp khoảng 70 đến 200 đơn phân. Thành phần cơ bản của
hemicellulose là β-D xylopyranose, liên kết với nhau bằng liên kết β-1,4glycoside. Chúng tạo nên chất nền, khảm vào khung cấu trúc của cellulose
[13]. Cấu trúc và thành phần của hemicellulose rất khác biệt trong các loại tế
bào khác nhau và ở các nhóm thực vật khác nhau.
Hemicellulose là polysaccharide dễ tan trong dung dịch kiềm, trong
nước nóng và dễ bị phân hủy bởi axit loãng. Về thành phần hóa học,
hemicellulose được sắp xếp theo 4 nhóm phổ biến dựa theo sự khác nhau về
thành phần các đơn phân và cấu trúc của chúng: Xylan, mannan, β-glucan đều
là các polymer của xyloglucan. Các nhóm này khác biệt nhau về cấu trúc
chuỗi, vị trí hay loại liên kết glycoride trong mạng lưới phân tử. Chuỗi chính
của hemicellulose có thể chứa chỉ một nhóm chức (homopolymer) như Xylan,
hoặc hai hay nhiều đơn vị tạo nên một heteropolyme như glucomannan [25].
Chuỗi chính trong hemicellulose ngắn hơn rất nhiều so với chuỗi phân tử
cellulose. Ngoài ra, chúng có các nhóm phụ được phân nhánh ở một vài
trường hợp. Xylan là thành phần của hemicellulose ở màng tế bào thứ cấp,
chiếm khoảng 20 - 30% tổng sinh khối của cây hai lá mầm (cây gỗ cứng và
cây dạng thân cỏ). Trong một vài tổ chức mô của cây một lá mầm (cỏ và ngũ
cốc), xylan được tìm thấy chiếm tỷ lệ tới 50% [22]. Một số hemicellulose
được cấu tạo từ một số phân tử monosaccaride không cùng loại như: Dgalactose, D-arabinose, D-xylose, D-manose, D-axit glucononic [31].



14

Hình 1.2. Cấu trúc của hemicellulose
b, Enzyme phân hủy hemicellulose
Xylan là cơ chất điển hình trong nhóm hemicellulose của thực vật.
Enzyme xylanase, thủy phân xylan, được sản xuất chủ yếu từ VSV. Các VSV
có khả năng sinh enzyme xylanase ngoại bào bao gồm chủ yếu là vi khuẩn và
nấm mốc [13].
Do tính không đồng nhất của xylan, sự thủy phân đòi hỏi một hệ thống
enzyme phức tạp. Enzyme này thường bao gồm hai loại: enzyme cắt mạch
chính không phân nhánh (β-1,4-endoxylanse và β-xylosidase) và enzyme cắt
mạch nhánh (α-arabinofuranosidase, α-glucuronidase, esterase xylan acetyl và
esterase axit phenolic). Tất cả các enzyme này tác động tương hỗ để chuyển
đổi xylan thành các cấu tử đường của nó. Hệ thống các enzyme thủy phân
xylan đa chức năng như vậy khá phổ biến ở vi khuẩn và nấm.
1.3.2.3. Lignin
a, Lignin
Lignin hoặc lignen là một hợp chất hóa học phức tạp phổ biến nhất
trong gỗ, và là một phần không tách rời của thành tế bào thứ cấp ở thực vật và


15

một số loài tảo [27]. Thuật ngữ này được giới thiệu vào năm 1819 bởi de
Candolle và có nguồn gốc từ tiếng Latin: lignum có nghĩa là gỗ. Đây là một
trong những polymer hữu cơ phong phú nhất trên trái đất, chỉ sau cellulose,
nó chiếm 30% carbon hữu cơ phi hóa thạch [23], và từ 1/4 tới 1/3 khối lượng
khô của gỗ. Hàm lượng lignin trong gỗ thay đổi không những phụ thuộc vào

loài cây mà còn phụ thuộc vào tuổi cây, điều kiện địa lý. Trong cây lá kim
chứa khoảng 20 - 30%, cây lá rộng 20 - 25%, trong khi cỏ là 5 - 9% [33].
Lignin được tìm thấy ở tế bào thực như thực hạt kín và hạt trần, Dương
xỉ và cây Thạch tùng. Đặc biệt lignin chiếm tỷ lệ cao ở những mô mạch được
chuyên hóa để vận chuyển chất lỏng. Lignin không được tìm thấy ở rêu, địa y
và tảo - là các loại thực vật không có quản bào. Lignin là hợp chất raxemic
với khối lượng phân tử lớn, có đặc tính thơm và kị nước. Lignin có cấu tạo vô
định hình, không tan trong nước và tan trong acid vô cơ [27]. Lignin là
polymer, được cấu thành từ các đơn vị phenylpropene, điển hình là: guaiacyl
(G), trans-coniferyl alcohol; syringyl (S), trans-sinapyl alcohol; ρhydroxylphenyl (H), trans-ρ-courmary alcohol. Chúng là một polyphenol có
cấu trúc mở, chủ yếu đóng vai trò chất liên kết trong thành tế bào thực vật,
liên kết chặt chẽ với mạng cellulose và hemicellulose. Do vậy, khó có thể tách
lignin ra hoàn toàn. [24]

Hình 1.3. Các đơn vị cơ bản của lignin


16

Cấu trúc của lignin đa dạng, tùy thuộc vào loại gỗ và tuổi cây. Ngoài
việc phân loại lignin theo các loại gỗ: gỗ cứng, gỗ mềm và cỏ, lignin có thể
được phân thành hai loại chính: guaicyl lignin và guaicyl-syringyl lignin.
Những nghiên cứu gần đây chỉ ra rằng lignin hoàn toàn không đồng nhất
trong cấu trúc. Lignin dường như bao gồm vùng vô định hình và các vùng có
cấu trúc hình thuôn hoặc hình cầu. Thêm vào đó, cấu trúc hóa học và cấu trúc
không gian của lignin đều bị ảnh hưởng bởi mạng lưới polysaccharide [24].

Hình 1.4. Cấu trúc lignin
Ở nhiệt độ phản ứng cao (trên 200⁰C) lignin bị kết khối thành những
phần riêng biệt và tách ra khỏi cellulose.

b. Enzyme phân hủy lignin
Lignin cấu trúc từ nhiều đơn phân có vòng thơm, có đặc tính không ưa
nước. Do đó rất khó phân huỷ. Cấu tạo lignin gồm các mạch phenylpropanoid
phức tạp, cấu trúc không đồng nhất. Chính vì tính chất đó nên việc phân huỷ
sinh học lignin đòi hỏi hệ enzyme oxy hóa khử mạnh. Trong các enzyme oxy
hóa khử phân hủy lignin, enzyme có hoạt tính mạnh là ligninase (lignin
peroxidase, với phản ứng đặc hiệu phân huỷ H2O2) và manganese peroxidase