BỘ Y TẾ
TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI

PHẠM THỊ LÊ NA
MÃ SINH VIÊN:1101343

NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH BÀO
CHẾ PHỨC HỢP LIPID
AMPHOTERICIN B
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ

HÀ NỘI – 2016


BỘ Y TẾ
TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI

PHẠM THỊ LÊ NA MÃ
SINH VIÊN: 1101343

NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH BÀO
CHẾ PHỨC HỢP LIPID
AMPHOTERICIN B
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ

Người hướng dẫn:
1.TS. Trần Thị Hải Yến
2. DS. Dƣơng Thị Thuấn
Nơi thực hiện:
Bộ môn Bào chế

HÀ NỘI – 2016


LỜI CÁM ƠN
Đầu tiên, em xin gửi lời cám ơn chân thành và sâu sắc đến :
TS. Trần Thị Hải Yến
DS. Dƣơng Thị Thuấn
Là ngƣời thầy đã hƣớng dẫn, chỉ bảo em trong suốt quá trình em làm đề tài
khóa luận. Nhờ sự hƣớng dẫn, chỉ bảo tận tình của cô và của chị mà em mới hoàn
thành đƣợc khóa luận tốt nghiệp này.
Em cũng xin gửi lời cám ơn đến toàn thể các thầy cô, các anh chị kỹ thuật
viên của bộ môn Bào chế-Đại học Dƣợc Hà Nội đã luôn tạo điều kiện giúp đỡ em
trong thời gian nghiên cứu thực nghiệm.
Nhân đây, em cũng xin gửi lời cảm ơn các thầy cô trong ban giám hiệu, các
phòng ban và cán bộ nhân viên trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội, những ngƣời đã dạy
bảo em suốt 5 năm học tập tại trƣờng.
Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè đã luôn quan
tâm động viên, khích lệ giúp em hoàn thành khóa luận.
Hà Nội, tháng 5 năm 2016
Sinh viên
Phạm Thị Lê Na


MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ .............................................................................................................1
Chƣơng 1. TỔNG QUAN ...........................................................................................2
1.1. Amphotericin B ....................................................................................................2
1.1.1. Công thức hóa học ....................................................................................2
1.1.2. Đặc tính lý hóa ..........................................................................................2
1.1.3. Tác dụng dƣợc lý ......................................................................................3

1.1.4. Dƣợc động học ..........................................................................................3
1.1.5. Chỉ định .....................................................................................................4
1.1.6. Tác dụng không mong muốn (thƣờng gặp) ..............................................4
1.1.7. Liều dùng ..................................................................................................4
1.1.8. Một số chế phẩm tiêm của AMB trên thị trƣờng ......................................5
1.2. Phức hợp phospholipid chứa amphotericin B ......................................................5
1.2.1. Nguyên lý hình thành phức hợp phospholipid amphotericin B ................5
1.2.2. Tá dƣợc tạo phức ......................................................................................6
1.2.3. Độ ổn định.................................................................................................8
1.2.4. Ƣu, nhƣợc điểm ........................................................................................8
1.2.5. Bào chế phức hợp lipid chứa AMB ........................................................10
1.2.6. Phƣơng pháp chụp ảnh bằng kính hiển vi điện tử để đánh giá hình thái
của phức hợp lipid.............................................................................................12
1.3. Một số nghiên cứu về phức hợp lipid AMB ......................................................12
Chƣơng 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.............................15
2.1. Đối tƣợng nghiên cứu, nguyên vật liệu, thiết bị nghiên cứu ..............................15
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu ....................................................................................16


2.2.1. Phƣơng pháp bào chế phức hợp lipid AMB ...........................................16
2.2.2. Phƣơng pháp chụp kính hiển vi điện tử quét đông lạnh. ........................17
2.2.3. Phƣơng pháp đánh giá hỗn dịch chứa phức hợp lipid AMB ..................18
Chƣơng 3. KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM ..................................................................20
3.1. Thẩm định phƣơng pháp định lƣợng AMB........................................................20
3.1.1. Khảo sát tính thích hợp của hệ thống sắc kí ...........................................20
3.1.2. Độ đặc hiệu .............................................................................................20
3.1.3. Tính tuyến tính ........................................................................................21
3.1.4. Độ lặp lại .................................................................................................22
3.2. Bào chế phức hợp lipid AMB bằng phƣơng pháp thay đổi dung môi ...............23
3.2.1. Khảo sát dung môi hòa tan dƣợc chất .....................................................23

3.2.2. Khảo sát tỉ lệ dƣợc chất/lipid ..................................................................24
3.2.3. Khảo sát biện pháp bốc hơi dung môi ....................................................26
3.2.4. Khảo sát tỉ lệ pha nƣớc/pha dung môi hữu cơ ........................................28
3.3. Bào chế phức hợp lipid AMB bằng phƣơng pháp vi dòng chảy ........................30
3.3.1. Khảo sát tốc độ bơm của hai máy bơm nhu động ...................................30
3.3.2. Khảo sát nhiệt độ phối hợp hai pha.........................................................32
3.3.3. Khảo sát nhiệt độ cất quay ......................................................................34
3.3.4. Khảo sát kích thƣớc đầu kim ..................................................................35
3.3.5. Định lƣợng mẫu phức hợp lipid AMB bằng phƣơng pháp đo quang .....37
3.4. So sánh phƣơng pháp thay đổi dung môi và phƣơng pháp vi dòng chảy ..........38
3.4.1. Về quy trình bào chế ...............................................................................38
3.4.2. Về cảm quan mẫu bào chế ......................................................................40
3.4.3. Về kích thƣớc tiểu phân và hiệu suất quy trình ......................................41


KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT .....................................................................................43
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC


DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
Viết tắt

Từ/cụm từ đầy đủ

AMB

Amphotericin B

BP 2013


Dƣợc điển Anh 2013

DĐVN IV

Dƣợc điển Việt Nam IV

DMHC

Pha dung môi hữu cơ

DMPC

α – Dimyristoylphosphatidylcholin

DMPG

1- α-Dimyristoylphosphatidylglycerol

DMSO

Dimethyl sufoxide

DSPG

Distearoylphosphatidylglycerol

DSC

Nhiệt quét vi sai (Differential Scanning Calorimetry)


FRR

Tỉ số tốc độ dòng (Fow Rate Ratio)

HSPC

Phosphatidylcholin

nành

hydrogen

(Hydrogenated soy phosphatidylcholine)

KTTP

Kích thƣớc tiểu phân

KHV

Kính hiển vi

MHF

đậu

Tập trung vi dòng chảy (Microfluidic Hydrodynamic
Focusing)


NSX

Nhà sản xuất

PN

Pha nƣớc

TFR

Tổng tốc độ dòng (Total Flow Rate)

TKHH

Tinh khiết hóa học

TKPT

Tinh khiết phân tích

TLTK

Tài liệu tham khảo

USP 2015

Dƣợc điển Mỹ 2015

hóa



DANH MỤC BẢNG BIỂU
Bảng 1.1. Một số chế phẩm tiêm của AMB trên thị trƣờng.................................................... 5
Bảng 1.2. So sánh ƣu nhƣợc điểm giữa liposome và phức hợp lipid AMB .......................... 8
Bảng 2.1. Nguyên liệu ............................................................................................................. 15
Bảng 3.1. Kết quả khảo sát tính thích hợp của hệ thống sắc kí............................................ 20
Bảng 3.2. Mối tƣơng quan giữa nồng độ AMB và diện tích pic............................................. 21
Bảng 3.3. Kết quả khảo sát độ lặp lại...................................................................................... 22
Bảng 3.4. Thành phần công thức khảo sát dung môi hòa tan AMB..................................... 23
Bảng 3.5. KTTP và phân bố KTTP của mẫu CT1 và CT2 ................................................... 24
Bảng 3.6. Thành phần công thức khảo sát tỉ lệ dƣợc chất/lipid ............................................ 25
Bảng 3.7. KTTP, phân bố KTTP và hiệu suất quy trình của hai biện pháp bốc hơi dung
môi ............................................................................................................................................ 27
Bảng 3.8. Thành phần các công thức khảo sát tỉ lệ PN/DMHC ........................................... 28
Bảng 3.9. KTTP và phân bố KTTP của các mẫu khảo sát ở các tỉ lệ PN/DMHC khác nhau
...................................................................................................................................................

29

Bảng 3.10. Các mẫu khảo sát ở các tốc độ bơm khác nhau .................................................. 31
Bảng 3.11. KTTP và phân bố KTTP của các mẫu khảo sát ở các tốc độ bơm khác nhau . 31
Bảng 3.12. KTTP và phân bố KTTP của hai mẫu khảo sát nhiệt độ phối hợp hai pha....... 33
Bảng 3.13. KTTP và phân bố KTTP của các mẫu khảo sát ở các nhiệt độ cất quay khác
nhau ........................................................................................................................................... 34
Bảng 3.14. KTTP và phân bố KTTP của các mẫu khảo sát kích thƣớc đầu kim tiêm ........ 36
Bảng 3.15. Kết quả đo quang của mẫu CT8.1.3 .................................................................... 38
Bảng 3.16. So sánh hai mẫu bào chế bằng hai phƣơng pháp về quy trình bào chế ............. 40
Bảng 3.17. KTTP và hiệu suất quy trình của hai phƣơng pháp bào chế .............................. 41



DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1. Cấu trúc giả định của phức hợp lipid AMB ................................................6
Hình 1.2. Phân tử HSPC và DSPG..............................................................................7
Hình 1.3. Hình ảnh của một thiết bị vi dòng chảy đơn giản .....................................11
Hình 2.1. Thiết bị trộn vi dòng chảy để tạo thành phức hợp lipid AMB. .................17
Hình 3.1. Đồ thị biểu diễn mối tƣơng quan giữa nồng độ AMB và diện tích pic .....22
Hình 3.2. Hình thái của các mẫu quan sát dƣới KHV điện tử quét đông lạnh ..........26
Hình 3.3. Mẫu CT2.1 và CT2.2.................................................................................27
Hình 3.4. Biểu đồ biểu diễn KTTP và phân bố KTTP của các mẫu khảo sát ở các tỉ
lệ PN/DMHC khác nhau............................................................................................29
Hình 3.5. Biểu đồ biểu diễn KTTP và phân bố KTTP các mẫu bào chế ở các tốc độ
bơm khác nhau ..........................................................................................................32
Hình 3.6. Đồ thị biểu diễn KTTP của hai mẫu khảo sát nhiệt độ phối hợp hai pha .33
Hình 3.7. Biểu đồ biểu diễn KTTP và phân bố KTTP của các mẫu khảo sát ở 3 nhiệt
độ cất quay khác nhau ...............................................................................................35
Hình 3.8. Biểu đồ biểu diễn KTTP và phân bố KTTP của các mẫu khảo sát kích
thƣớc đầu kim tiêm....................................................................................................37
Hình 3.9. Sơ đồ quy trình bào chế phức hợp lipid AMB bằng phƣơng pháp thay đổi
dung môi và phƣơng pháp vi dòng chảy ...................................................................39
Hình 3.10. Mẫu bào chế theo phƣơng pháp vi dòng chảy và thay đổi dung môi ....40
Hình 3.11. Đồ thị biểu diễn KTTP của hai mẫu bào chế bằng hai phƣơng pháp khác
nhau ...........................................................................................................................41


1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Amphotericin B (AMB) là một kháng sinh polyen đƣợc chỉ định trong
trƣờng hợp nhiễm nấm nặng toàn thân do hoạt tính kháng nấm mạnh và phổ tác
dụng rộng. Tuy nhiên, dƣợc chất này hầu nhƣ không tan trong nƣớc, sinh khả dụng

đƣờng uống thấp nên AMB thƣờng đƣợc bào chế dƣới dạng thuốc tiêm. Dạng chế
phẩm tiêm ban đầu của AMB là dạng micell (chế phẩm Fungizone). Nhƣng ở dạng
bào chế này, AMB không bền trong hệ tuần hoàn và nhanh chóng chuyển từ dạng
micell sang dạng lipoprotein gây độc cho tế bào vật chủ, đặc biệt là độc tính trên
thận. Hai dạng bào chế chứa AMB mới là liposome và phức hợp lipid với hệ mang
dƣợc chất có bản chất lipid, làm giảm độc tính trên thận so với thuốc tiêm quy ƣớc
dạng micell. Tuy nhiên so với dạng bào chế liposome, phức hợp lipid có hàm lƣợng
AMB cao hơn, quy trình bào chế đơn giản hơn nên giá thành thấp hơn. Do đó,
nghiên cứu bào chế phức hợp lipid AMB là một vấn đề đƣợc quan tâm hiện nay.
Các nghiên cứu trong nƣớc trƣớc đây đã bào chế thành công phức hợp lipid AMB
bằng phƣơng pháp thay đổi dung môi nhƣng phƣơng pháp này có một số nhƣợc điểm :
tốn thời gian bào chế, hiệu suất tạo phức thấp, khó triển khai trên quy mô lớn… bên cạnh
đó chƣa có nghiên cứu nào trong nƣớc sử dụng kĩ thuật vi dòng chảy để bào chế phức
hợp lipid AMB. Vì vậy, để góp phần ứng dụng phức hợp lipid làm chất mang thuốc
và giảm độc tính của thuốc, chúng tôi nghiên cứu đề tài
‘‘Nghiên cứu quy trình bào chế phức hợp lipid Amphotericin B ” nhằm
mục tiêu :
Xây dựng được quy trình bào chế phức hợp lipid Amphotericin B bằng
phương pháp thay đổi dung môi và phương pháp vi dòng chảy.


2

Chƣơng 1. TỔNG QUAN

1.1. Amphotericin B
1.1.1. Công thức hóa học

Công thức phân tử: C47H73NO17.
Khối lƣợng phân tử: 924,08 [23].

1.1.2. Đặc tính lý hóa
 Lý tính:
- Bột kết tinh màu vàng hoặc vàng cam [1], [23].
- Độ tan: thực tế không tan trong nƣớc, hòa tan trong dimethyl sulphoxide và trong
propylene glycol, hơi tan trong dimethylformamid, rất ít tan trong methanol, thực tế
không tan trong ethanol 96% [23].
 Hóa tính: Do AMB có hệ dây nối đôi luân phiên, nhóm amin và nhóm carboxylic
tự do nên AMB có tính chất sau:
- Tính lƣỡng thân [1].
- Tạo muối hơi tan trong nƣớc khi tác dụng với acid hydrocloric hoặc các dung dịch
kiềm [1].
- Dung dịch amphotericin B 0,0005% trong methanol có 3 cực đại hấp thụ ở 362,
381 và 405 nm. Tỉ lệ độ hấp thụ ở 362 nm so với 381 nm là 0,57- 0,61, tỉ lệ độ hấp
thụ ở 381 nm so với 405 nm là 0,87-0,93 [1].


3

1.1.3. Tác dụng dƣợc lý
Cơ chế tác dụng của AMB, cũng nhƣ của các polyen khác, dựa trên sự liên kết
giữa đuôi kỵ nƣớc của AMB với đuôi ergosterol trên màng tế bào nấm, tạo các kênh
trên màng tế bào, làm thay đổi tính thấm và tính khử cực của màng tế bào nấm, làm
rò rỉ các chất bên trong tế bào ra ngoài và cuối cùng làm chết tế bào nấm. AMB
cũng có thể liên kết với các cholesterol trên màng tế bào ngƣời, điều này là nguyên
nhân chính gây tác dụng phụ nghiêm trọng của AMB. Ái lực của AMB với
ergosterol màng lớn hơn với cholesterol màng nên AMB thể hiện tác dụng chống
nấm chủ yếu nhƣng vẫn tiềm tàng tác dụng phụ nghiêm trọng, đặc biệt là tổn
thƣơng thận với các biểu hiện: suy thận, tăng creatinin và ure huyết, rối loạn chuyển
hoá, tăng kali máu,… [2].
Trên mặt lâm sàng, amphotericin B có tác dụng kìm nấm đối với một số loại

nấm nhƣ Absidia spp. , Aspergillus spp. , Basidiobolus spp. , Blastomyces
dermatitidis , Candida spp. , Coccidioides immitis , Conidiobolus spp. ,
Cryptococcus

neoformans

,

Histoplasma

capsulatum

,

Mucor

spp.

,

Paracoccidioides brasiliensis , Rhizopus spp. , Rhodotorula spp. , và Sporothrix
schenckii. Nồng độ ức chế tối thiểu đối với các loại nấm này là 0,03 - 1 mcg/ml [2].
1.1.4. Dƣợc động học
- Hấp thu: AMB hấp thu kém qua đƣờng tiêu hóa, chủ yếu đƣợc tiêm truyền tĩnh
mạch để điều trị nhiễm nấm hệ thống, chỉ dùng đƣờng uống để điều trị nhiễm nấm
đƣờng tiêu hóa và niêm mạc miệng.
- Phân bố: AMB liên kết với protein ở mức cao. Thuốc phân bố rộng rãi trong cơ
thể nhƣng chỉ một lƣợng nhỏ vào dịch não tủy. Nửa đời của thuốc trong huyết
tƣơng khoảng 24h, khi dùng thời gian dài, nửa đời cuối cùng có thể tới 15 ngày. Chi
tiết về sự phân bố trong các mô vẫn chƣa đƣợc biết.

- Chuyển hóa: chƣa đƣợc làm rõ.
- Thải trừ: AMB bài tiết rất chậm qua thận, với 2 – 5% liều đã dùng bài tiết dƣới
dạng hoạt tính sinh học. Sau khi ngừng điều trị, vẫn có thể tìm thấy thuốc trong nƣớc


4

tiểu ít nhất sau 7 tuần. Có thể do vậy mà amphotericin B có nguy cơ gây độc cao với
thận. Không loại đƣợc AMB ra khỏi cơ thể bằng thẩm tách máu [2].
1.1.5. Chỉ định
- Thuốc uống (viên, hỗn dịch) dùng tại chỗ để điều trị nhiễm nấm Candida albicans
ở miệng và đƣờng tiêu hóa.
- Thuốc tiêm tĩnh mạch amphotericin B thông thƣờng dùng điều trị nhiễm khuẩn
nấm

hệ

thống

nặng

do

nấm

Aspergillus,

Blastomyces,

Candida,


Coccidioidesimmitis, Cryptococcus, Histoplasma, Mucor, Paracoccidioides và
Sporotrichum.
- Dạng liposome hoặc phức hợp với lipid: đƣợc chỉ định cho những trƣờng hợp đã
đƣợc điều trị bằng AMB thông thƣờng mà thất bại hoặc những trƣờng hợp mà
amphotericin B thông thƣờng có thể gây độc cho thận hoặc suy thận [2].
1.1.6. Tác dụng không mong muốn (thƣờng gặp)
- Phản ứng chung: Rét run và sốt, đau đầu, đau cơ hoặc khớp.
- Máu: Thiếu máu đẳng sắc, kích thƣớc hồng cầu bình thƣờng và hồi phục đƣợc.
- Tiêu hóa: Rối loạn tiêu hóa, đau bụng, đi ngoài, buồn nôn, nôn, chán ăn.
- Chuyển hóa: Rối loạn điện giải, giảm kali huyết, giảm magnesi huyết.
- Tiết niệu: Giảm chức năng thận kèm theo tăng creatinin và urê huyết [2].
1.1.7. Liều dùng
Đường tiêm tĩnh mạch:
- AMB thông thƣờng: bắt đầu với liều 0,25 mg/kg/ngày, tăng dần tới tối đa 1
mg/kg/ngày, trƣờng hợp nặng, liều có thể cần tới 1,5 mg/kg/ngày hoặc cách 1 ngày.
- AMB dạng liposome: bắt đầu với liều 1 mg/kg/ngày, tăng dần tới 3-4 mg/kg/ngày.
- Dạng phức hợp phospholipid: thƣờng dùng với liều 5 mg/kg/ngày.
Đường uống:
- Viên 10 mg hoặc hỗn dịch chứa 100 mg/ml.
- Nhiễm nấm Candida ở miệng: hỗn dịch dùng 1ml/lần ×4 lần/ngày, giữ thuốc trong
miệng ít nhất 1 phút trƣớc khi nuốt, viên tan trong miệng dùng 4 lần/ngày.
- Nhiễm nấm Candida ở ruột: 100 – 200 mg/ngày, 4 lần/ngày [2].


5

1.1.8. Một số chế phẩm tiêm của AMB trên thị trƣờng

Trên thị trƣờng hiện nay có một số chế phẩm thƣơng mại của AMB,

chúng khác nhau về hình thái, kích thƣớc tiểu phân, chất mang và dạng bào chế.
Bảng 1.1. Một số chế phẩm tiêm của AMB trên thị trƣờng [6], [13], [22].
TT

Tên chế phẩm

1

Fungizone

Chất mang
Natri
deoxycholat

Dạng cấu

KTTP

Dạng bào chế

Micell

10-100 nm

Bột đông khô

Liposome

80 nm


Bột đông khô

1,6 - 11µm

Hỗn dịch

trúc

HSPC,
2

AmBisome®

DSPG,
Cholesterol

3

4

Abelcet®,

DMPC,

Ampholip

DMPG

Amphotec®,


Cholesteryl

AmphocilTM

sulfate

Phức hợp
lipid dạng
chuỗi
Phức hợp
lipid hình
đĩa

0,12-0,14
µm

Bột đông khô

1.2. Phức hợp phospholipid chứa amphotericin B
1.2.1. Nguyên lý hình thành phức hợp phospholipid amphotericin B
Phân tử Amphotericin B có tính lƣỡng thân, một đầu chứa nhiều nhóm
hydroxyl thân nƣớc, một đầu là một chuỗi hydrocarbon chứa nhiều nối đôi đơn luân
phiên thân dầu. Trong môi trƣờng nƣớc và ở điều kiện thích hợp, khi tỉ lệ %mol
AMB/phospholipid dƣới 25%, AMB sẽ liên kết giới hạn ở dạng monomer với
phospholipid tạo thành liposome. Nhƣng ở tỉ lệ %mol AMB/phospholipid từ 25% đến
100%, AMB sẽ liên kết với phospholipid để tạo thành cấu trúc dạng chuỗi.
Bằng các phƣơng pháp quan sát thích hợp, các nhà nghiên cứu đã suy đoán
rằng, khi tỉ lệ %mol AMB/phospholipid tăng quá 25%, AMB đủ khả năng phá vỡ
màng phospholipid kép và chen vào màng làm phá vỡ cấu trúc liposome. Mặt khác,



6

AMB làm cố định phospholipid bằng cách đan xen vào lớp phospholipid kiểu ngón
tay đan vào nhau. Phần polyen thân dầu của phân tử AMB liên kết với chuỗi
hydrocarbon của lipid, phần thân nƣớc chứa các nhóm hydroxyl hƣớng về phía lõi,
gốc phosphat của phân tử lipid hƣớng về nhóm amin của phân tử AMB, hình thành
một hình trụ tròn. Các hình trụ tròn xếp cạnh nhau hình thành phức hợp lipid AMB
có hình dải ruy băng [10].

Hình 1.1. Cấu trúc giả định của phức hợp lipid AMB [22]
1.2.2. Tá dƣợc tạo phức
Phospholipid sử dụng để chế tạo phức hợp lipid bao gồm: phosphatidylcholin
(PC), Phosphatidylglycerol (PG), phosphatidylethanolamin (PE), phosphatidylserin
(PS), phosphatidylinositol (PI), acid phosphatidic (PA), sphingomyelin (SPM), có
thể sử dụng đơn độc hoặc phối hợp. Các phospholipid có thể là phospholipid tự
nhiên hoặc chiết xuất từ tự nhiên nhƣ từ trứng, đậu nành. Đại diện tốt nhất là
phospholipid

Dimyristoylphosphatidylcholin

(DMPC)

và

Dimyristoylphosphatidylglycerol (DMPG) sử dụng hỗn hợp và tốt nhất là ở tỉ lệ
mol DMPC:DMPG=7:3. Các phospholipid bão hòa nhƣ là hydrogenate soy
phosphatidylcholin có thể sử dụng [12]. Phosphatidylcholin đậu nành hydrogen hóa



7

(HSPC) cũng đƣợc dùng phối hợp với Distearoyl Phosphatidyl Glycerol (DSPG) và
tốt nhất ở tỉ lệ mol HSPC:DSPG=7:3 [4].

Hình 1.2. Phân tử HSPC và DSPG
Một số ƣu điểm của HSPC là: bền về hóa học hơn so với phosphatidylcholin
đậu nành chƣa hydrogen hóa do hạn chế đƣợc các quá trình peroxyd hóa gốc acid
béo chƣa no, do đó giúp màng lipid bền vững hơn, hạn chế hỏng màng gây rò rỉ
dƣợc chất [3], [9].
DSPG đóng vai trò quan trọng trong cơ chế hình thành của phức hợp lipid
AMB theo cơ chế sau: ở pH trung tính, DSPG có một nhóm phosphat bị ion hóa do
đó, phân tử tích điện âm. Khi AMB đƣợcphân tán trong dung môi đƣợc acid hóa,
các proton trong môi trƣờng sẽ có xu hƣớng chuyển giao cho các nhóm amin của
amphotericin B. Kết quả là các phân tử AMB sẽ tích điện dƣơng. Do đó sự tích điện
trái dấu, các phân tử thu hút nhau, các nhóm tích điện trái dấu của chúng tạo thành
một cặp ion. Nhƣ vậy, sự hấp dẫn phân tử giữa AMB và phân tử DSPG đƣợc tăng
lên rất nhiều. Các chuỗi hydrocarbon béo của các phospholipid bị thu hút bởi tƣơng
tác kỵ nƣớc vào chuỗi dài của liên kết đôi không có nhóm thế của polyen [16].
Việc lựa chọn phospholipid cho thành phần của phức hợp lipid AMB là rất
quan trọng, ảnh hƣởng đến các đặc tính của phức hợp. Vì vậy, việc lựa chọn phải
căn cứ trên các đặc điểm sau:
- Mức độ bão hòa của lipid: phospholipid không bão hòa (nhƣ phosphatidylcholin
lòng đỏ trứng, phosphatydylglycerol,…) dễ bị peroxyd hóa dẫn đến hỏng màng, rò
rỉ dƣợc chất. Vì vậy, phospholipid bão hòa (nhƣ dipalmytoyl phosphatidylcholin,
dipalmitidyl phosphatidic,…) đƣợc sử dụng nhiều hơn [3],[16].


8


- Nhiệt độ chuyển pha (TC): liên quan đến hiện tƣợng chuyển pha của phospholipid.
Ở dƣới nhiệt độ chảy, phospholipid ở trạng thái gel có cấu trúc bền chặt, khó thấm,
còn ở trên nhiệt độ chuyển pha, phospholipid chuyển sang trạng thái lỏng với cấu
trúc sắp xếp lỏng lẻo [3].
- Độ tinh khiết: tùy theo mục đích nghiên cứu và sử dụng mà yêu cầu nguyên liệu có
độ tinh khiết khác nhau.
1.2.3. Độ ổn định
Tá dƣợc tạo phức là phospholipid nên phức hợp lipid kém bền cả về mặt vật
lý và hóa học trong quá trình bảo quản [3].
- Về hóa học: phospholipid là hợp chất dễ bị oxy hóa và thủy phân. Quá trình oxy
hóa tăng nhanh do sự tác động của các yếu tố nhƣ pH môi trƣờng, nhiệt độ, nồng độ
đệm, ion kim loại, sự tích điện của lớp phospholipid kép…Sự oxy hóa xảy ra mạnh
nhất ở các phospholipid không no và cũng có thể xảy ra ở phospholipid no nếu ở
nhiệt độ cao. Bảo quản ở nhiệt độ thấp, bảo vệ tránh ánh sáng và oxy môi trƣờng
đƣợc cho là sẽ làm chậm quá trình oxy hóa. Ngoài ra, có thể cho thêm các chất
chống oxy hóa (α-tocoferol, BHA, BHT…), sử dụng EDTA tạo phức loại trừ ion
kim loại, dùng khí trơ nhƣ nitơ trong quá trình bào chế cũng làm giảm đáng kể quá
trình oxy hóa [3],[8].
- Về vật lý: sự ổn định vật lý đƣợc đánh giá trên các tiêu chí về KTTP, chỉ số PDI,
sự tích điện bề mặt. Trong quá trình bảo quản, có thể xảy ra kết tụ các tiểu phân
phức hợp lipid. Nếu sử dụng phospholipid có nhiệt độ chảy thấp để bào chế phức
hợp thì có thể xảy ra hiện tƣợng chuyển pha (từ pha gel có cấu trúc bền chặt sang
pha lỏng có dạng liên kết lỏng lẻo) trong quá trình bảo quản. Ngoài ra, tính thấm
của phức hợp lipid cũng giống nhƣ liposome phụ thuộc vào nhiều yếu tố: loại
phospholipid, hàm lƣợng và tính chất của dƣợc chất cũng nhƣ điều kiện bảo quản.
Bảo quản ở nhiệt độ thấp làm cho phospholipid ổn định hơn nên kéo dài đƣợc tuổi
thọ của chế phẩm [3].
1.2.4. Ƣu, nhƣợc điểm
Bảng 1.2. So sánh ƣu nhƣợc điểm giữa liposome và phức hợp lipid AMB



9

ƢU, NHƢỢC ĐIỂM

Liposome

Phức hợp

TLTK

Có

Có

[21]

Có

Có

[3]

Có

Có

[3]

Cao


[11],

(25-100%)

[14]

ƢU ĐIỂM
Là hệ vận chuyển thuốc có tính tƣơng hợp
sinh học cao do có tá dƣợc là phospholipid
Làm giảm độc tính của thuốc, tăng hiệu
quả điều trị do làm thay đổi phân bố sinh
học của dƣợc chất có độc tính cao (giảm
phân bố ở cơ quan lành, tăng phân bố ở cơ
quan bệnh)
Dƣợc chất đƣợc bảo vệ tránh tác động của
ngoại môi trong quá trình bảo quản, đặc
biệt là trong quá trình dẫn thuốc tới đích
sinh học của cơ thể
Tỉ lệ dƣợc chất
(%mol dƣợc chất/lipid)

Thấp (<9%)

Tƣơng
Hiệu quả điều trị

đƣơng

[11]


liposome
Khả năng giảm độc tính trên thận

Tƣơng
đƣơng

[11]

liposome
NHƢỢC ĐIỂM
Chỉ thích hợp với quy mô phòng thí
nghiệm, rất khó để sản xuất quy mô lớn

[3],

Có

Có

Có

Có

[5]

Có

Có


[3]

[19]

Sử dụng dung môi hữu cơ để hòa tan lipid
gây tác động bất lợi đến sức khỏe ngƣời sử
dụng và môi trƣờng
Độ ổn định thấp, kém ổn định về mặt vật lý
và hóa học. Tá dƣợc là phospholipid dễ bị


10

ảnh hƣởng của nhiệt độ, pH, vi sinh của
môi trƣờng do đó tuổi thọ ngắn.
Kích thƣớc tiểu phân

Nhỏ
(< 300nm)

Lớn hơn
liposome

[11]

(< 11 µm)
1.2.5. Bào chế phức hợp lipid chứa AMB
1.2.5.1. Phƣơng pháp thay đổi dung môi
Phức hợp lipid chứa AMB đƣợc bào chế bằng các quy trình giống với các
quy trình bào chế liposome. Tùy thuộc vào tỉ lệ mol dƣợc chất/lipid mà tạo ra

liposome hay tạo ra phức hợp lipid chứa tỉ lệ AMB cao. Phƣơng pháp bào chế đƣợc
đề cập đến là phƣơng pháp hydrat hóa film, phƣơng pháp thay đổi dung môi (tiêm
polyol), phƣơng pháp siêu âm, đông khô [11].
Với phƣơng pháp tiêm ethanol để bào chế phức hợp lipid, hòa tan
phospholipid và dƣợc chất vào ethanol. Bơm nhanh dung dịch này vào môi trƣờng
nƣớc hoặc hệ đệm, vừa bơm vừa khuấy từ. Do thay đổi dung môi, phức hợp đƣợc
tạo thành. Các thông số ảnh hƣởng đến hiệu suất và chất lƣợng phức hợp là: nồng
độ phospholipid/ethanol, đƣờng kính bơm và áp suất bơm, môi trƣờng nƣớc, tốc độ
khuấy môi trƣờng,...Phƣơng pháp này có ƣu điểm đơn giản, dễ thực hiện, hỗn dịch
thu đƣợc có kích thƣớc tƣơng đối đồng nhất. Tuy nhiên quy trình bào chế tốn thời
gian, hiệu suất tạo phức thấp, khó triển khai ở quy mô lớn [3].
1.2.5.2. Phƣơng pháp vi dòng chảy
Vì phức hợp lipid chứa AMB đƣợc bào chế bằng các quy trình giống với các
quy trình bào chế liposome [11] nên chúng tôi nghiên cứu các công nghệ bào chế
liposome mới để áp dụng vào việc bào chế phức hợp lipid chứa AMB nhằm khắc
phục những hạn chế của phƣơng pháp truyền thống.
Vi dòng chảy (microfluidics) là một công nghệ mới để bào chế liposome, bởi
vì nó cho phép điều khiển một cách chính xác quá trình hydrat hóa lipid. Bào chế


11

liposome sử dụng phƣơng pháp vi dòng chảy có một số ƣu điểm hơn so với phƣơng
pháp truyền thống là: đơn giản, tốn ít thời gian và hiệu suất bắt giữ thuốc cao [24].
Có 2 hệ thống vi dòng chảy đƣợc sử dụng để bào chế liposome là hệ thống vi
dòng chảy nhỏ giọt bào chế liposome có kích thƣớc lớn (có đƣờng kính trên 10 µm)
và MHF ( microfluidic hydrodynamic focusing- tập trung vi dòng chảy) bào chế
liposome có kích thƣớc nano. Nhƣợc điểm của hai công nghệ này là yêu cầu những
thiết bị kích cỡ micromet không sẵn có với quy mô nghiên cứu phòng thí nghiệm
[24].

Để đơn giản việc sử dụng công nghệ vi dòng chảy trong phòng thí nghiệm,
Pradhan và cộng sự (2008) đã phát triển một phƣơng pháp đơn giản, rẻ tiền với
những đặc điểm đặc trƣng của phƣơng pháp vi dòng chảy, nhƣng không cần đến
thiết bị kích cỡ micromet [24].

Kim tiêm

Nước

Hình 1.3. Hình ảnh của một thiết bị vi dòng chảy đơn giản
Trên hình 1.3, bơm tiêm mang nƣớc đƣợc tiêm vào một góc connecter bởi
dây làm bằng chất dẻo. Một bơm tiêm khác chứa lipid đã đƣợc hòa tan trong
ethanol đƣợc kết nối với connecter bởi một kim tiêm. Trong một thiết lập kinh
điển, 1 ml lipid đƣợc hòa tan trong ethanol và 10 ml nƣớc cất đƣợc nạp vào trong
một bơm tiêm 1 ml và một bơm tiêm 10 ml. Các bơm tiêm này đƣợc đƣa lên trên
một thiết bị bơm dung dịch ( model 975, Harvard Apparatus, Holliston, MA, USA)


12

và đƣợc di chuyển với tốc độ giống nhau. Phƣơng pháp tiêm vi dòng chảy thế này
tƣơng tự nhƣ điều kiện tiêm ethanol, nhƣng nó có khả năng điều chỉnh KTTP bằng
cách chuẩn bị thiết bị trộn một cách chính xác và một tỉ lệ pha nƣớc-ethanol cố
định. Trái ngƣợc với công nghệ sản xuất liposome khác, phƣơng pháp này đơn giản,
nhanh, giá cả phải chăng, và có thể sẵn sàng áp đƣợc ở bất cứ phòng thí nghiệm nào
[24], [15].
Các thông số ảnh hƣởng đến sự hình thành và kích thƣớc tiểu phân hỗn dịch
trong phƣơng pháp vi dòng chảy là: nhiệt độ của pha lipid khi phối hợp, độ dài của
chuỗi phospholipid, tổng tốc độ dòng ( total flow rate – TFR) và tỉ lệ tốc độ dòng
của pha nƣớc và pha dung môi ( flow rate ratio-FRR) [25],[12].

1.2.6. Phƣơng pháp chụp ảnh bằng kính hiển vi điện tử quét để đánh giá hình
thái của phức hợp lipid
Mục đích của phƣơng pháp này là để quan sát hình thái của phức hợp cũng
nhƣ chứng minh phƣơng pháp bào chế đã tạo ra phức hợp lipid AMB, chứ không
phải là liposome [11].
Có hai phƣơng pháp chụp khác nhau: phƣơng pháp khắc lạnh (Freezeetching) và khắc nóng (heat-etching). Nguyên lí chung là: mẫu đƣợc làm lạnh đột
ngột trong ni-tơ lỏng hoặc propanol lỏng, sau đó bẻ gãy cấu trúc, lộ diện cấu trúc
không gian của mặt cắt gãy. Với phƣơng pháp khắc lạnh: mặt cắt gãy đƣợc in hình
lên platin carbon, hình sao chép lại rồi đƣợc quan sát dƣới kính hiển vi điện tử. Với
phƣơng pháp khắc nóng: mặt cắt gãy đƣợc gia nhiệt để nƣớc đá thăng hoa, lộ diện
rõ hơn cấu trúc không gian của mẫu cần quan sát. Soi mẫu dƣới kính hiển vi điện tử
[7].
Nghiên cứu về phức hợp lipid rifampicin, Singh C. và cộng sự (2014) đã
dùng phƣơng pháp chụp kính hiển vi điện tử gia nhiệt (Hot stage microscopy) để
quan sát cấu trúc của rifampicin trong phức hợp so sánh với rifampicin tự do. Kết
quả cho thấy rifampicin trong phức hợp ở dạng vô định hình khác với dạng tinh thể
của dƣợc chất ban đầu [18].
1.3. Một số nghiên cứu về phức hợp lipid AMB


13

Nghiên cứu ở nƣớc ngoài
Janoff và cộng sự (2002) đã tiến hành bào chế phức hợp lipid AMB bằng
phƣơng pháp hydrat hóa film. Dung môi hòa tan dƣợc chất đƣợc sử dụng là DMSO
hoặc methanol. Lipid sử dụng là DMPC và DMPG với tỉ lệ mol là 7:3. Dung dịch
hydrat hóa film là đệm phosphat, hoặc dung dịch muối hoặc dung dịch đệm glycin.
Bằng phƣơng pháp này, tỉ lệ phần trăm mol dƣợc chất/lipid để tạo phức hợp là từ 650%, tốt nhất là từ 30-50%. Máy nghiền keo đã đƣợc sử dụng trong khoảng 30 phút
để làm giảm kích thƣớc tiểu phân. Để chọn lựa các tiểu phân trong khoảng tối ƣu,
tác giả dùng phƣơng pháp lọc tiếp tuyến với hai cỡ lỗ lọc khác nhau, lần đầu lọc với

màng tiếp tuyến có kích cỡ lỗ lọc 5 µm, dịch lọc lại tiếp tục lọc qua màng lọc tiếp
tuyến có kích cỡ 2 µm [11].
Larabi và cộng sự (2004) đã bào chế phức hợp lipid chứa AMB bằng phƣơng
pháp bốc hơi dung môi pha đảo. AMB đƣợc hòa tan trong methanol sau đó cho vào
dung dịch lipid (DMPC:DMPG ở các tỉ lệ khác nhau) đã hòa tan trong dung môi
hữu cơ. Thêm nƣớc tinh khiết và khuấy từ ở nhiệt độ phòng. Cô áp suất giảm loại
dung môi thu đƣợc phức hợp lipid. Tỉ lệ mol các thành phần AMB:DMPC:DMPG =
5:7:3 tƣơng tự nhƣ thành phần của Abelcet. Soi kính hiển vi điện tử cho thấy cấu
trúc hình đĩa mỏng [17].
Janoff và cộng sự cũng đã nghiên cứu về cấu trúc của phức hợp lipid có tỉ lệ
mol DMPC:DMPG = 7:3 cố định nhƣng thay đổi tỉ lệ mol AMB trên tổng số lipid khác
nhau. Kết quả cho thấy với tỉ lệ mol AMB <5%, cấu trúc pha gel của phospholipid ở
20oC sẽ bị sang pha tinh thể lỏng ở nhiệt độ 25oC. Nhƣng với tỉ lệ mol AMB 25% và
50%, phức hợp lipid không có nhiệt chuyển pha ở 40oC [5].
Các nghiên cứu trong nƣớc
Nguyễn Thị Mỹ (2014) đã nghiên cứu bào chế phức hợp lipid chứa AMB có
tỉ lệ mol HSPC và DSPG là 7:3, môi trƣờng phân tán là đệm phosphat pH 7,4, tỉ lệ
dƣợc chất/tổng số mol lipid là 25% cho hiệu suất nạp dƣợc chất cao (87,06%), kích
thƣớc tiểu phân là 648,3nm; phân bố kích thƣớc tiểu phân tƣơng đối đồng đều
(PDI=0,363) [4].


14

Tuy nhiên nghiên cứu trên chƣa chỉ ra sự khác nhau về cấu trúc giữa
liposome AMB và phức hợp lipid AMB.
Chƣa có nghiên cứu trong nƣớc về bào chế phức hợp lipid AMB bằng
phƣơng pháp vi dòng chảy.



15

Chƣơng 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tƣợng nghiên cứu, nguyên vật liệu, thiết bị nghiên cứu
- Đối tƣợng nghiên cứu: phức hợp lipid AMB.
- Nguyên liệu:
Bảng 2.1. Nguyên liệu
STT

Tên nguyên liệu

Nguồn gốc

Tiêu chuẩn

1

Amphotericin B

Trung Quốc

USP 2015

2

Acetonitril

Merck – Đức

TKPT


3

Acid hydrochlorid đặc

Trung Quốc

BP 2013

4

Chloroform

Trung Quốc

DĐVN IV

5

Distearoyl phosphatidylglycerol

Lipoid – Đức

NSX

6

Dinatri EDTA

Trung Quốc


TKHH

7

Dimethyl sufoxide

Jansen – Đức

BP 2013

8

Ethanol

Trung Quốc

DĐVN IV

Lipoid – Đức

NSX

9

Hydrogenated soy
phosphatidylcholine

10


Isopropanol

Trung Quốc

BP 2013

11

Kali dihydrophosphat

Trung Quốc

TKHH

12

Methanol

Trung Quốc

DĐVN IV

13

Methanol

J.C Baker

TKPT


14

Natri hydroxyd

Trung quốc

TKHH

15

Nƣớc cất pha tiêm

Việt Nam

DĐVN IV

- Thiết bị nghiên cứu:
+ Hệ thống cất quay Rovapor R – 210 (Buchi – Đức), bình cầu NS 29/32, dung tích
1000 ml (Buchi – Đức).
+ Hệ thống thiết bị phân tích kích thƣớc Mastersizer 3000E (Malvern, Anh).
+ Hệ thống sắc kí lỏng hiệu năng cao Chemstation 1260 (Agilent, Mỹ).
+ Bể siêu âm Wiseclean (Wisd laboratory instruments, Đức).


16

+ Máy đo pH InoLab (WTW, Đức).
+ Kính hiển vi điện tử JSM-5410LV (Jeol, Nhật).
+ Bơm nhu động FLEXFLO ® A-100N ( Blue-White Industries, Mỹ).
+ Bơm nhu động FLOCON-1003 ( Frankfurt, Đức).

+ Kim tiêm 26G x 1/2’’, 25G x 1’’, 23G x 1’’ ( Việt Nam).
+ Cân phân tích Sartorius BP121S (Sartorius, Đức).
+ Tủ sấy, tủ lạnh.
+ Các dụng cụ thủy tinh, lọ thủy tinh trung tính, nút cao su, nắp nhôm.
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.2.1. Phƣơng pháp bào chế phức hợp lipid AMB
2.2.1.1. Phƣơng pháp thay đổi dung môi
Hòa tan AMB trong dung môi hữu cơ đã đƣợc acid hóa đến pH khoảng 0,5-1
bằng dung dịch HCl 2,5N trong cùng dung môi hữu cơ, siêu âm cho tan hoàn toàn,
đƣợc dung dịch 1. Cân và hòa tan bằng siêu âm HSPC, DSPG với tỉ lệ HSPC :
DSPG = 7:3 trong hỗn hợp CHCl3:dung môi hòa tan dƣợc chất (1:1), đƣợc dung
dịch 2. Phối hợp hai dung dịch 1 và 2, siêu âm để thu đƣợc dung dịch đồng nhất 3.
Bơm chậm dung dịch 3 với tốc độ khoảng 0,5 ml/phút vào dung dịch NaCl 0,9% đã
gia nhiệt từ 60oC đến 70oC. Vừa bơm vừa khuấy từ 150 vòng/phút và duy trì nhiệt
độ của hỗn hợp trong khoảng nhiệt độ trên cho đến khi phối hợp hết dung dịch 3.
Bốc hơi dung môi hỗn hợp vừa thu đƣợc cho đến khi loại hết dung môi hữu cơ.
2.2.1.2. Phƣơng pháp vi dòng chảy
Hòa tan AMB trong dung môi hữu cơ đã đƣợc acid hóa đến pH khoảng 0,5-1
bằng dung dịch HCl 2,5N trong cùng dung môi hữu cơ, siêu âm cho tan hoàn toàn,
đƣợc dung dịch 1. Cân và hòa tan bằng siêu âm HSPC, DSPG với tỉ lệ HSPC :
DSPG = 7:3 trong hỗn hợp CHCl3:dung môi hòa tan dƣợc chất (1:1), đƣợc dung
dịch 2. Phối hợp hai dung dịch 1 và 2, siêu âm để thu đƣợc dung dịch đồng nhất 3.
Phối hợp dung dịch 3 (pha dung môi hữu cơ) và dung dịch NaCl 0,9% bằng cách
sử dụng hai bơm nhu động, trong đó bơm Flexflo bơm dung dịch 3, bơm Flocon
bơm dung dịch NaCl 0,9%. Cần chuẩn bị các thông số nhƣ: tốc độ của hai bơm nhu