ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM
------   ------

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM
------   ------

BÙI THỊ HÀ
BÙI THỊ HÀ

NGHIÊN CỨU XẠ KHUẨN THUỘC CHI STREPTOMYCES
NGHIÊN CỨU XẠ KHUẨN THUỘC CHI STREPTOMYCES

SINH CHẤT KHÁNG SINH CHỐNG NẤM GÂY BỆNH

SINH CHẤT KHÁNG SINH CHỐNG NẤM GÂY BỆNH

TRÊN CÂY CHÈ Ở THÁI NGUYÊN

TRÊN CÂY CHÈ Ở THÁI NGUYÊN

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
Mã số:

60.42.30

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC
LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC

TS. VI THỊ ĐOAN CHÍNH

THÁI NGUYÊN - 2008

THÁI NGUYÊN - 2008


LỜI CẢM ƠN
LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới cô giáo TS. Vi Thị Đoan Chính
đã tận tình giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện và hoàn thành luận văn này.
Xin chân thành cảm ơn ThS. Nguyễn Phú Hùng và các cán bộ của bộ
môn Sinh học thuộc Khoa KHTN & XH - ĐHTN đã nhiệt tình giúp đỡ tôi.

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số
liệu, kết quả nghiên cứu trong luận văn là trung thực và chƣa từng đƣợc công
bố trong bất kỳ công trình nào khác.

Xin chân thành cảm ơn PGS. TS. Ngô Đình Quang Bính và các cán bộ
phòng Di truyền vi sinh học - Viện Công nghệ sinh học thuộc Viện khoa học
và công nghệ Việt Nam.
Xin cảm ơn Ban lãnh đạo Trƣờng Đại học Y - Dƣợc Thái Nguyên,

Thái nguyên, ngày 15 tháng 9 năm 2008
Tác giả

Khoa Sinh - KTNN, Khoa Sau Đại học - Trƣờng Đại học Sƣ phạm - ĐHTN
đã tạo nhiều điều kiện để tôi hoàn thành luận văn này.
Xin cảm ơn Ban chủ nhiệm khoa KHCB, Bộ môn Hóa - sinh đã tạo mọi
điều kiện cho tôi đƣợc học tập và hoàn thành luận văn này.

Tôi xin cảm ơn các thầy cô, bạn bè đồng nghiệp đã động viên, tạo mọi
điều kiện giúp đỡ tôi trong suốt quá trình làm luận văn.
Lời cảm ơn sâu sắc nhất tôi xin dành cho gia đình và những ngƣời thân
yêu của tôi.

Bùi Thị Hà


MỤC LỤC

1.4.1. Một số bệnh hại chè do nấm......................................................18
Trang

Trang phụ bìa
Lời cảm ơn
Lời cam đoan
Mục lục
Những chữ viết tắt
Danh mục các bảng
Danh mục các hình vẽ, đồ thị
MỞ ĐẦU..........................................................................................................1
Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. GIỚI THIỆU VỀ XẠ KHUẨN..................................................................3
1.1.1. Phân bố của xạ khuẩn trong tự nhiên............................................3
1.1.2. Đặc điểm hình thái của xạ khuẩn..................................................4
1.1.3. Sự hình thành bào tử của xạ khuẩn...............................................5
1.1.4. Cấu tạo của xạ khuẩn....................................................................6
1.2. CÁC PHƢƠNG PHÁP PHÂN LOẠI XẠ KHUẨN HIỆN ĐẠI... ...........8
1.2.1. Đặc điểm hình thái và tính chất nuôi cấy.....................................8
1.2.2. Đặc điểm hóa phân loại (Chemotaxonomy)..................................9

1.2.3. Đặc điểm sinh lý - sinh hóa.........................................................10
1.2.4. Phân loại số (Numerical taxonomy)............................................10
1.2.5. Phân loại xạ khuẩn chi Streptomyces..........................................11
1.3. CHẤT KHÁNG SINH TỪ XẠ KHUẨN.................................................12
1.3.1. Lƣợc sử nghiên cứu chất kháng sinh...........................................12
1.3.2. Sự hình thành chất kháng sinh ở xạ khuẩn..................................15
1.3.3. Các yếu tố ảnh hƣởng đến sinh tổng hợp chất kháng sinh........16
1.4. MỘT SỐ BỆNH HẠI CHÈ DO NẤM GÂY RA VÀ ỨNG DỤNG CỦA
CKS TRONG BẢO VỆ THỰC VẬT..................................................18

1.4.2. Các chất kháng sinh trong bảo vệ thực vật.................................21
Chƣơng 2 - NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Nguyên liệu và hóa chất.........................................................................24
2.1.1. Nguyên liệu................................................................................24
2.1.2. Hóa chất, dụng cụ và thiết bị.................. ...................................24
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu..........................................................................27
2.2.1. Phƣơng pháp phân lập nấm gây bệnh từ các mẫu chè...........................27
2.2.2. Phân lập và tuyển chọn xạ khuẩn..........................................................28
2.2.2.1. Phân lập xạ khuẩn theo Vinogradski........................................28
2.2.2.2. Xác định hoạt tính kháng sinh ................................................28
2.2.2.3.Tuyển chọn các chủng xạ khuẩn sinh chất kháng sinh............29
2.2.3. Bảo quản giống......................................................................................29
2.2.4. Nghiên cứu các đặc điểm sinh học và phân loại xạ khuẩn....................30
2.2.4.1. Đặc điểm hình thái...................................................................30
2.2.4.2. Đặc điểm nuôi cấy....................................................................31
2.2.4.3. Đặc điểm sinh lý - sinh hóa......................................................31
2.2.5. Lên men tạo kháng sinh.........................................................................32
2.2.5.1. Lựa chọn môi trƣờng lên men thích hợp .................................32
2.2.5.2. Ảnh hƣởng của nguồn cacbon..................................................33
2.2.5.3. Ảnh hƣởng của nguồn Nitơ......................................................33

2.2.6. Các phƣơng pháp sinh học phân tử trong phân lập gen 16S - rRNA....33
2.2.6.1. Tách chiết DNA của xạ khuẩn bằng đệm CTAB.....................33
2.2.62. Khuếch đại gen 16S - rRNA bằng phản ứng PCR...................34
2.2.6.3. Phƣơng pháp điện di trên gel agarose......................................35
2.2.7. Phƣơng pháp xử lý số liệu.....................................................................36

Chƣơng 3 - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Phân lập và thuần khiết các chủng nấm gây bệnh trên chè......................37


3.2. Phân lập và tuyển chọn xạ khuẩn.............................................................38

NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT TRONG LUẬN VĂN

3.2.1. Hoạt tính kháng nấm của các chủng xạ khuẩn............................38
3.2.2. Tuyển chọn các chủng xạ khuẩn có HTKN cao..........................41
3.3. Đặc điểm sinh học và đặc điểm phân loại của 2 chủng XK Đ1 và R2....42
3.3.1. Đặc điểm hình thái......................................................................42
3.3.2.Đặc điểm nuôi cấy........................................................................43
3.3.3. Đặc điểm sinh lý - sinh hóa.........................................................45
* Khả năng đồng hóa các nguồn cacbon...............................................45
* Nhiệt độ sinh trƣởng thích hợp .........................................................46
* Khả năng chịu muối...........................................................................46
* Khả năng sinh enzym ngoại bào........................................................47
3.3.4. Hoạt tính kháng sinh của 2 chủng R2 và Đ1..............................48
3.3.5. Vị trí phân loại của hai chủng xạ khuẩn R2 và Đ1....................50
3.4. Khả năng sinh tổng hợp CKS của 2 chủng xạ khuẩn đã lựa chọn...........52
3.4.1. Lựa chọn môi trƣờng lên men thích hợp.....................................52
3.4.2. Ảnh hƣởng của nguồn cacbon.....................................................54
3.4.3. Ảnh hƣởng của nguồn nitơ..........................................................56

3.5. Phân loại các chủng xạ khuẩn theo phƣơng pháp sinh học phân tử........57
3.5.1. Kết quả tách chiết DNA tổng số của các chủng xạ khuẩn..........57
3.5.2. Kết quả nhân gen 16S - rRNA bằng phản ứng PCR..................58
Chƣơng 4 - KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
4.1. Kết luận.........................................................................................60
4. 2. Kiến nghị về những nghiên cứu tiếp theo.....................................61
CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN....................62
TÀI LIỆU THAM KHẢO............................................................................63

XK

: Xạ khuẩn

VSV

: Vi sinh vật

CKS

: Chất kháng sinh

HSCC

: Hệ sợi cơ chất

HSKS

: Hệ sợi khí sinh

KTKS


: Khuẩn ty khí sinh

HTKS

: Hoạt tính kháng sinh

HTKN

: Hoạt tính kháng nấm

MT

: Môi trƣờng

KHVQH

: Kính hiển vi quang học

KHVĐT

: Kính hiển vi điện tử

DNA

: Deoxyribonucleic Acid

RNA

: Ribonucleic Acid


ISP

: International Streptomyces Project

TE

: Tris - Ethylendiamin tetracetic acid

SDS

: Sodiumdodecyl sulfat

TAE

: Tris - Acetate - Ethylendiamin tetracetic acid

PCR

: Polymerase chain reaction (phản ứng chuỗi polymerase)


DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

DANH MỤC CÁC BẢNG
Trang
Bảng 3.1. Đặc điểm một số mẫu chè làm nguồn phân lập các chủng nấm.....37
Bảng 3.2. Xạ khuẩn có hoạt tính kháng nấm theo nhóm màu................................39
Bảng 3. 3.Tính đối kháng của xạ khuẩn với 3 chủng nấm gây bệnh trên chè.......40
Bảng 3. 4. Hoạt tính kháng nấm của 2 chủng xạ khuẩn..................................41

Bảng 3.5. Đặc điểm nuôi cấy của chủng R2 và Đ1.........................................44
Bảng 3.6. Khả năng đồng hóa nguồn cacbon của 2 chủng xạ khuẩn Đ1 và R2....45
Bảng 3.7. Nhiệt độ sinh trƣởng thích hợp của 2 chủng R2 và Đ1...................46
Bảng 3.8. Khả năng chịu muối của 2 chủng R2 và Đ1...................................47
Bảng 3.9. Hoạt tính kháng sinh của 2 chủng R2 và Đ1 với 3 chủng nấm
kiểm định.........................................................................................................48
Bảng 3.10. So sánh đặc điểm phân loại của chủng R2 với S. misawaensis....50
Bảng 3.11. So sánh đặc điểm phân loại của chủng Đ1 với A. brunneofungu.52
Bảng 3.12: Hoạt tính kháng sinh của 2 chủng xạ khuẩn trên các môi trƣờng
lên men khác nhau...........................................................................................53
Bảng 3.13. Ảnh hƣởng của nguồn cacbon lên khả năng sinh tổng hợp CKS
của 2 chủng R2 và Đ1.....................................................................................55
Bảng 3.14. Ảnh hƣởng của nguồn nitơ lên khả năng sinh tổng hợp CKS của 2
chủng R2 và Đ1...............................................................................................56

Trang
Hình 3.1. Ba chủng nấm phân lập từ các mẫu chè bị bệnh.............................38
Hình 3. 2. Tỷ lệ các chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng nấm theo nhóm màu.................39
Hình 3.3. Tỷ lệ các chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng nấm.........................40
Hình 3.4. Hoạt tính kháng nấm của 2 chủng xạ khuẩn lựa chọn.....................42
Hình 3.5. Cuống sinh bào tử và bề mặt bào tử chủng R2................................42
Hình 3.6. Cuống sinh bào tử và bề mặt bào tử chủng Đ1...............................43
Hình 3.7. Khả năng hình thành sắc tố melanin của 2 chủng...........................44
Hình 3.8. Hoạt tính enzym của các chủng xạ khuẩn.......................................47
Hình 3.9. Hoạt tính kháng 3 chủng nấm kiểm định của 2 chủng Đ1 và R2....49
Hình 3.10: Ảnh hƣởng của môi trƣờng đến khả năng tổng hợp CKS ............54
Hình 3.11: Ảnh hƣởng của nguồn cacbon đến khả năng tổng hợp CKS.........55
Hình 3.12 : Ảnh hƣởng của nguồn nitơ đến khả năng tổng hợp CKS.............57
Hình 3.13. Ảnh điện di DNA tổng số của 2 chủng xạ khuẩn.........................58
Hình 3.14. Ảnh điện di sản phẩm PCR của 2 chủng xạ khuẩn nghiên cứu.....59



-1-

-22. Mục tiêu nghiên cứu của đề tài

MỞ ĐẦU

- Phân lập và tuyển chọn các chủng xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces có

1. Đặt vấn đề
Việt Nam là nước nông nghiệp nằm trong vùng nhiệt đới nóng ẩm.

hoạt tính kháng nấm gây bệnh trên cây chè.

Mưa là điều kiện rất thuận lợi cho VSV phát triển, đặc biệt là các VSV gây

- Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học và đặc điểm phân loại của một

bệnh thực vật. Vì vậy việc sử dụng hoá chất trong bảo vệ thực vật từ lâu đã phổ

số chủng xạ khuẩn có hoạt tính chống nấm mạnh, có nhiều triển vọng ứng

biến ở Việt Nam. Song việc sử dụng hoá chất bảo vệ thực vật thường là độc hại

dụng.

và khi tồn dư trong đất, nước và nông sản sẽ ảnh hưởng nghiêm trọng tới sức

3. Đối tƣợng và nội dung nghiên cứu của đề tài


khoẻ con người, gây ô nhiễm môi trường và mất cân bằng sinh thái.
Chính vì vậy, Hội nghị tư vấn khu vực châu Á Thái bình dương của FAO
năm 1992 đã khẳng định đấu tranh sinh học là nền tảng của chương trình IPM
(Quản lý dịch hại tổng hợp) với chiến lược là sử dụng tác nhân sinh học để hạn
chế sự phát triển của các quần thể ký sinh. Một trong những hướng nghiên cứu
theo xu hướng này là sử dụng các tác nhân sinh học để hạn chế các quần thể
VSV gây bệnh. Trong số các tác nhân sinh học thường được sử dụng để ức chế
VSV gây bệnh, xạ khuẩn là nhóm có nhiều tiềm năng nhất vì tỷ lệ loài có khả
năng sinh CKS cao, trong đó có nhiều CKS có khả năng chống nấm mạnh.
Thái nguyên là tỉnh giàu tiềm năng về nông, lâm nghiệp. Trong đó cây
chè là cây loại cây chủ đạo và hàng năm các bệnh do nấm cũng đã gây ra
những thiệt hại nặng nề, làm giảm năng suất và chất lượng sản phẩm. Vì vậy
việc tìm kiếm các chủng xạ khuẩn có khả năng sinh chất kháng sinh chống

* Đối tượng nghiên cứu
- Các chủng xạ khuẩn sinh chất kháng sinh chống nấm phân lập từ đất
Thái Nguyên.
- Các chủng vi nấm gây bệnh trên cây chè ở Thái Nguyên.
* Nội dung nghiên cứu
1. Phân lập các chủng nấm gây bệnh trên cây chè để sử dụng làm VSV
kiểm định.
2. Phân lập và tuyển chọn các chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng nấm
từ các mẫu đất khác nhau.
3. Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học và đặc điểm phân loại của một
số chủng xạ khuẩn có hoạt tính chống nấm mạnh đã được lựa chọn.
4. Nghiên cứu ảnh hưởng của một số điều kiện nuôi cấy đến khả năng
tạo thành CKS của các chủng đã lựa chọn.

nấm gây bệnh thực vật có tầm quan trọng đặc biệt góp phần vào công tác bảo

vệ thực vật và xây dựng nền nông nghiệp an toàn và bền vững.
Xuất phát từ những lý do trên, từ xu hướng nghiên cứu trên thế giới
hiện nay cũng như để góp phần khai thác nguồn vi sinh vật vô cùng phong
phú của Thái Nguyên. Chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu xạ khuẩn
thuộc chi Streptomyces sinh chất kháng sinh chống nấm gây bệnh trên cây
chè ở Thái Nguyên”.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên



Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




-3-

-4amylaza, xenluloza…một số axit amin và axit hữu cơ. Một số xạ khuẩn có thể

Chƣơng 1

gây bệnh cho người, động vật [7].

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1.2. Đặc điểm hình thái của xạ khuẩn
* Khuẩn lạc

1.1. GIỚI THIỆU VỀ XẠ KHUẨN


Đặc điểm nổi bật của xạ khuẩn là có hệ sợi phát triển, phân nhánh

1.1.1. Phân bố của xạ khuẩn trong tự nhiên
Xạ khuẩn (Actinobacteria) thuộc nhóm vi khuẩn thật (Eubacteria) phân

mạnh và không có vách ngăn (chỉ trừ cuống bào tử khi hình thành bào tử). Hệ

bố rất rộng rãi trong tự nhiên. Chúng có trong đất, nước, rác, phân chuồng,

sợi xạ khuẩn mảnh hơn của nấm mốc với đường kính thay đổi trong khoảng

bùn, thậm chí cả trong cơ chất mà vi khuẩn và nấm mốc không phát triển

0,2

được. Sự phân bố của xạ khuẩn phụ thuộc vào khí hậu, thành phần đất, mức

1 m đến 2

3 m, chiều dài có thể đạt tới một vài cm [10],[22].

Kích thước và khối lượng hệ sợi thường không ổn định và phụ thuộc
vào điều kiện sinh lý và nuôi cấy. Kích thước của hệ sợi xạ khuẩn là một

độ canh tác và thảm thực vật.
Theo Waksman thì trong một gam đất có khoảng 29.000 - 2.400.000

trong những đặc điểm phân biệt khuẩn lạc của xạ khuẩn và khuẩn lạc của nấm
mốc vì hệ sợi của nấm mốc có đường kính rất lớn, thay đổi từ 5


mầm xạ khuẩn, chiếm 9 - 45% tổng số VSV [43].
Sự phân bố của xạ khuẩn còn phụ thuộc nhiều vào độ pH môi trường,

50 m, dễ

quan sát bằng mắt thường.

chúng có nhiều trong các lớp đất trung tính và kiềm yếu hoặc axit yếu 6,8 - 7,5.

Khuẩn lạc của xạ khuẩn thường chắc, xù xì có dạng da, dạng vôi, dạng

Xạ khuẩn có rất ít trong lớp đất kiềm hoặc axit và càng hiếm trong các lớp đất

nhung tơ hay dạng màng dẻo. Khuẩn lạc xạ khuẩn có màu sắc khác nhau: đỏ,

rất kiềm, số lượng xạ khuẩn trong đất cũng thay đổi theo thời gian trong năm.

da cam, vàng, nâu, xám, trắng…tuỳ thuộc vào loài và điều kiện ngoại cảnh.

Một trong những đặc tính quan trọng nhất của xạ khuẩn là khả năng
hình thành chất kháng sinh, 60 - 70% xạ khuẩn được phân lập từ đất có khả

Kích thước và hình dạng của khuẩn lạc có thể thay đổi tuỳ loài và tuỳ
vào điều kiện nuôi cấy như thành phần môi trường, nhiệt độ, độ ẩm…
Đường kính mỗi khuẩn lạc chỉ chừng 0,5

năng sinh chất kháng sinh.
Cho tới nay khoảng hơn 8000 chất kháng sinh hiện biết trên thế giới thì
có tới 80% là do xạ khuẩn sinh ra [6]. Trong số đó có trên 15% có nguồn gốc

từ các loại xạ khuẩn hiếm như Micromonospora Actinomadura, Actinoplanes,

2 mm nhưng cũng có khuẩn

lạc đạt tới đường kính 1cm hoặc lớn hơn.
Khuẩn lạc có 3 lớp, lớp vỏ ngoài có dạng sợi bện chặt, lớp trong tương
đối xốp, lớp giữa có cấu trúc tổ ong.

Streptoverticillium, Streptosporangium… Điều đáng chú ý là các xạ khuẩn

Khuẩn ty trong mỗi lớp có chức năng sinh học khác nhau. Các sản

hiếm đã cung cấp nhiều chất kháng sinh có giá trị đang dùng trong y học như

phẩm trong quá trình trao đổi chất như: CKS, độc tố, enzym, vitamin, axit

gentamixin, tobramixin, vancomixin, rosamixi.

hữu cơ…có thể được tích luỹ trong sinh khối của tế bào xạ khuẩn hay được

Ngoài ra, xạ khuẩn tham gia tích cực vào các quá trình chuyển hoá

tiết ra trong môi trường.

nhiều hợp chất trong đất, nước. Dùng để sản xuất nhiều enzym như proteaza,

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




-5-

-6-

* Khuẩn ty

Bào tử xạ khuẩn được bao bọc bởi màng muco polysaccharide giàu

Trên môi trường đặc, hệ sợi của xạ khuẩn phát triển thành 2 loại: một

protein với độ dày khoảng 300

400 A0 chia 3 lớp. Các lớp này tránh cho bào

loại cắm sâu vào môi trường gọi là hệ sợi cơ chất (khuẩn ty cơ chất substrate

tử khỏi những tác động bất lợi của điều kiện ngoại cảnh như nhiệt độ,

mycelium) với chức năng chủ yếu là dinh dưỡng. Một loại phát triển trên bề

pH…Hình dạng, kích thước chuỗi bào tử và cấu trúc màng bào tử là những

mặt thạch gọi là hệ sợi khí sinh (khuẩn ty khí sinh aerial mycelium) với chức

tính trạng tương đối ổn định và là đặc điểm quan trọng dùng trong phân loại


năng chủ yếu là sinh sản.

xạ khuẩn. Tuy nhiên những tính trạng này cũng có thể có những thay đổi nhất

Nhiều loại chỉ có hệ sợi cơ chất nhưng cũng có loại (như chi
Sporichthya) lại chỉ có hệ sợi khí sinh. Khi đó HSKS vừa làm nhiệm vụ sinh
sản vừa làm nhiệm vụ dinh dưỡng.

định khi nuôi cấy trên môi trường có nguồn nitơ khác nhau [13].
Muốn kích thích sự hình thành bào tử trước hết phải kích thích sự sinh
trưởng của khuẩn ty khí sinh. Nếu môi trường giàu dinh dưỡng quá thì quá

Độ dài của khuẩn ty xạ khuẩn trong giai đọan phát triển là 11 m/giờ

trình sinh bào tử thường bị kìm hãm. Trong nhiều trường hợp khi kích thích

[43] và chất nhân của tế bào xạ khuẩn sắp xếp đều đặn theo chiều dài của sợi.

sự hình thành bào tử, hiệu suất sinh tổng hợp CKS giảm đi.

Do đó một đoạn sợi (mầm xạ khuẩn) hoặc một bào tử xạ khuẩn gặp điều kiện

1.1.4. Cấu tạo của xạ khuẩn

thuận lợi sẽ trương lên, sau đó 1 - 2 giờ xuất hiện quá trình tổng hợp ARN,

Xạ khuẩn có cấu trúc tế bào tương tự như vi khuẩn Gram dương, toàn

nhân các gene cần thiết từ genom và tiến hành tổng hợp protein, cứ như vậy


bộ cơ thể chỉ là một tế bào bao gồm các thành phần chính: thành tế bào, màng

sợi được hình thành và phát triển. Một số xạ khuẩn có sinh ra nang bào tử bên

sinh chất, nguyên sinh chất, chất nhân và các thể ẩn nhập.

trong chứa các bào tử nang [7].

Thành tế bào của xạ khuẩn có kết cấu dạng lưới, dày 10 - 20 nm có tác

1.1.3. Sự hình thành bào tử của xạ khuẩn

dụng duy trì hình dáng của khuẩn ty, bảo vệ tế bào. Thành tế bào gồm 3 lớp:

Bào tử xạ khuẩn được hình thành trên các nhánh phân hóa của khuẩn ty

Lớp ngoài cùng dày khoảng 60

120A0, khi già có thể đạt tới 150

khí sinh - gọi là cuống sinh bào tử. Đó là cơ quan sinh sản đặc trưng cho xạ

200A0, lớp giữa rắn chắc, dày khoảng 50A0, lớp trong dày khoảng 50A0. Các

khuẩn. Hình thái, cuống sinh bào tử và bào tử là các đặc điểm quan trọng nhất

lớp này chủ yếu cấu tạo từ các lớp glucopeptide bao gồm các gốc N - axetyl

trong phân loại xạ khuẩn.


glucozamin liên kết với N - axetyl muramic bởi các liên kết 1,4 -

Cuống sinh bào tử của xạ khuẩn có dạng thẳng hoặc lượn sóng (RF),

Khi xử lý bằng lyzozym, các liên kết 1,4 -

glucozit.

glucozit bị cắt đứt, thành tế bào

dạng xoắn lò xo (S), chuỗi bào tử không phát triển hoặc xoắn đơn giản có

bị phá huỷ tạo thành thể sinh chất (protoplast), cấu trúc sợi cũng bị phá huỷ

hình móc câu (RA). Bào tử hình thành đồng thời trên tất cả chiều dài của

khi xử lý tế bào với hỗn hợp este chlorofom và các dung môi hoà tan lipit

cuống sinh bào tử theo 2 cách: kết đoạn hay cắt khúc và thường có hình trụ,

khác. Nguyên nhân là do lớp ngoài cùng có cấu tạo chủ yếu bằng lipit (thành

ovan, cầu, que với mép nhẵn hoặc xù xì, có gai hoặc gai phát triển dài thành

HSKS có nhiều lipit hơn so với HSCC) khác với nấm. Thành tế bào xạ khuẩn

dạng lông [9].

không chứa xenllulose và kitin nhưng chứa nhiều enzym tham gia vào quá


Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên



Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




-7-

-8-

trình trao đổi chất và quá trình vận chuyển vật chất qua màng tế bào [25],[30],

chất, chống chịu với nhiệt độ bất lợi, chống chịu với các kháng sinh, chuyển

[32], [35] [36].

gene, sản xuất các chất kháng sinh trong đất và môi trường tuyển chọn [3].

Căn cứ vào thành phần hoá học, thành tế bào xạ khuẩn được chia thành

Xạ khuẩn thuộc loại cơ thể dị dưỡng, nguồn cacbon chúng thường dùng
là đường, tinh bột, rượu và nhiều chất hữu cơ khác. Nguồn nitơ hữu cơ là

4 nhóm chính [6], [8].
Nhóm I: Thành phần chính của thành tế bào là axit L - 2,6
diaminopimelic (L - ADP) và glyxin. Chi Streptomyces thuộc nhóm này.

Nhóm II: Thành phần chính của thành tế bào là axit meso - 2,6 -

protein, pepton, cao ngô, cao nấm men. Nguồn nitơ vô cơ là nitrat, muối
amôn…Khả năng đồng hoá các chất ở các loài hay chủng xạ khuẩn khác nhau
là khác nhau.
1.2. CÁC PHƢƠNG PHÁP PHÂN LOẠI XẠ KHUẨN HIỆN ĐẠI

diaminopimelic (m - ADP) và glyxin.
Nhóm III: Thành phần chính của thành tế bào là axit meso - 2,6 -

Cùng với sự phát triển mạnh của sinh học phân tử, hóa sinh học, lý sinh
học...nên việc định tên một chủng xạ khuẩn được tiến hành tương đối nhanh

diaminopimelic.
Nhóm IV: Thành phần chính của thành tế bào là axit meso - 2,6 -

chóng và chính xác với nhiều phương pháp mới như phân loại số, nghiên cứu
chủng loại phát sinh...Song người ta vẫn chủ yếu dựa vào các đặc điểm hình

diaminopimelic, arabinose và galactose.
Dưới lớp thành tế bào là màng sinh chất dày khoảng 50 nm được cấu
tạo chủ yếu bởi 2 thành phần là photpholipit và protein. Chúng có vai trò đặc
biệt quan trọng trong quá trình trao đổi chất và quá trình hình thành bào tử
của xạ khuẩn.

thái, nuôi cấy đặc điểm sinh lý, sinh hóa, miễn dịch học và sinh học phân tử.
1.2.1. Đặc điểm hình thái và tính chất nuôi cấy
Đặc điểm hình thái và tính chất nuôi cấy là một trong những thông tin
quan trọng để phân loại xạ khuẩn. Để làm cho các chủng xạ khuẩn cần định


Nguyên sinh chất và nhân tế bào xạ khuẩn không có khác biệt lớn so

loại biểu hiện đầy đủ các đặc điểm, người ta thường xuyên nuôi cấy chúng

với tế bào vi khuẩn. Trong nguyên sinh chất của xạ khuẩn cũng chứa mezoxom

trên môi trường dinh dưỡng khác nhau trong điều kiện nhiệt độ và thời gian

và các thể ẩn nhập (các hạt polyphosphate: hình cầu, bắt màu với thuốc nhuộm

nhất định. Tiến hành quan sát mô tả chụp ảnh và ghi lại những đặc điểm hình

sudan III và các hạt polysaccharide bắt màu với dung dịch lugol).

thái và nuôi cấy của xạ khuẩn, đặc biệt là cơ quan mang bào tử, hình dạng và

Tuy nhiên, điểm khác biệt của xạ khuẩn so với các sinh vật prokaryote
ở chỗ chúng có tỷ lệ G + C rất cao trong DNA, thường lớn hơn 55%, trong
khi đó ở vi khuẩn tỷ lệ này chỉ là 25

bề mặt bào tử.
Theo Pridham và cộng sự [38], cuống sinh bào tử chia thành 3 nhóm:
RF cho những cuống sinh bào tử thẳng và lượn sóng. RA cho những cuống

45% [11].

Xạ khuẩn thuộc loại vi khuẩn Gram dương nên ngoài yếu tố di truyền
trong nhiễm sắc thể còn có các yếu tố di truyền ngoài nhiễm sắc thể, chúng có

sinh bào tử xoắn, thô sơ và ngắn. S cho những cuống sinh bào tử phát triển

mạnh và xoắn.

thể tự nhân lên mà được Lederberg gọi là plasmid. Các plasmid đem lại cho tế

Việc sử dụng các đặc điểm hình thái và tính chất nuôi cấy vẫn coi là

bào nhiều đặc tính chọn lọc quý giá như có thêm khả năng phân giải một số hợp

những dữ liệu cơ bản dùng trong phân loại xạ khuẩn. Tuy nhiên như ta đã biết

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên






-9-

-10-

xạ khuẩn rất không bền vững về mặt di truyền, thường xuyên xảy ra sự sắp

Trong phân loại xạ khuẩn thì typ thành tế bào là đặc điểm quan trọng

xếp lại trong phân tử DNA. Trong cùng một loài có thể biểu hiện khác nhau

nhất. Khi muốn đưa ra một loài mới hoặc mô tả một loài có ý nghĩa nào đó,


về hình thái hay những loài khác nhau có thể giống nhau về mặt hình thái. Vì

người ta không thể nào không xác định thành tế bào.

vậy để phân loại được chính xác, ngày nay người ta phải dùng thêm các chỉ

1.2.3. Đặc điểm sinh lý - sinh hóa

tiêu khác bổ sung như các đặc điểm sinh lý, sinh hóa, miễn dịch học hay sinh

Để phân loại xạ khuẩn đến loài, người ta sử dụng hàng loạt các đặc

học phân tử [45].

điểm sinh lý, sinh hóa khác như khả năng đồng hóa các nguồn cacbon và nitơ,

1.2.2. Đặc điểm hóa phân loại (Chemotaxonomy)

nhu cầu các chất kích thích sinh trưởng, khả năng biến đổi các chất khác nhau

Đặc điểm hóa phân loại được sử dụng rộng rãi và hiệu quả trong vòng

nhờ hệ thống enzym. Nhu cầu về oxy, giới hạn pH, nhiệt độ tối ưu, khả năng

20 năm trở lại đây. Đây là phương pháp cơ bản và có hiệu quả thông qua việc

chịu muối và các yếu tố khác của môi trường, mối quan hệ với chất kìm hãm

định tính và định lượng thành phần hóa học của tế bào VSV.


sinh trưởng và phát triển khác nhau, tính chất đối kháng và nhạy cảm với chất

Hóa phân loại chủ yếu dựa vào các đặc điểm sau:

kháng sinh, khả năng tạo thành chất kháng sinh và các sản phẩm trao đổi chất

- Typ thành tế bào dựa trên cơ sở phân tích axit amin trong thành phần
peptit và đường trong thành tế bào hay các polysaccarit gắn vào thành tế bào.

đặc trưng khác của xạ khuẩn.
Hopwood (1975) khẳng định rằng phần lớn các đặc điểm sinh lý - sinh

- Typ peptidoglycan (PG) dựa vào các thông tin về thành phần và cấu

hóa cùng đặc điểm nuôi cấy dễ bị biến động và có giá trị thấp về mặt phân

trúc của mạch tetrapeptit của PG cầu nối peptit và các liên kết giữa các mắt

loại. Do tính không ổn định và biến dị cao của xạ khuẩn mà ngày nay những

xích của PG.

nguyên tắc sử dụng các đặc điểm sinh lý - sinh hóa để phân loại xạ khuẩn

- Axit mycolic là các phần tử có mạch dài phân nhánh thuộc chi
Nocardia, Rhodococus, Mycobacterium và cornebacter. Đây là đặc điểm phân
loại cơ bản cho các chi đó.

cũng phải thay đổi [29].

1.2.4. Phân loại số (Numerical taxonomy)
Để phát hiện những loài mới trên cơ sở sự khác nhau về đặc điểm sinh

- Axit béo thường được sử dụng trong phân loại là axit béo bão hòa

lý, sinh hóa người ta còn sử dụng các kết quả dựa trên phân loại số.

mạch thẳng và không bão hòa với mạch phân nhánh kiểu iso và enteiso metyl

Phương pháp này dựa trên sự đánh giá về số lượng mức độ giống nhau

hóa ở nguyên tử cacbon thứ 10. Sự có mặt của axit 10 - metylloctade canoit

giữa các VSV theo một số lớn các đặc điểm chủ yếu là các đặc điểm hình

(axit tubereulostearinoic) là đặc điểm để phân loại đến chi [11].

thái, sinh lý, sinh hóa.

- Photpholipit có 5 typ photpholipit (P I, PII, PIII, PIV, PV) có thành phần
đặc trưng có ý nghĩa cho phân loại xạ khuẩn.

Để so sánh các chủng xạ khuẩn với nhau từng đôi một, người ta căn cứ
vào hệ số giống nhau (hệ số S - Similarity) có 2 công thức tính hệ số S hay
được sử dụng.
- Công thức của Sokal và Michener (SSM )

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




-11SSM(AB)

NS
NS

NS
NS

Nd

-12mặt khuẩn lạc thường được phủ bởi KTKS dạng nhung, dày hơn cơ chất, đôi

100

khi có tính kỵ nước.
Xạ khuẩn chi Streptomyces sinh sản vô tính bằng bào tử. Trên đầu sợi

Trong đó: SSM : Mức độ giống nhau giữa hai cá thể A, B (%)

khí sinh hình thành cuống sinh bào tử và chuỗi bào tử. Cuống sinh bào tử có

NS+ : Số các tính trạng giống nhau

những hình dạng khác nhau tùy loài: thẳng, lượn sóng, xoắn, có móc, vòng ...


(AB)

Bào tử được hình thành trên cuống sinh bào tử bằng hai phương pháp

Nd : Số các tính trạng khác nhau
NS- Số các tính trạng đối lập nhau.

phân đoạn và cắt khúc. Bào tử xạ khuẩn có hình bầu dục, hình lăng trụ, hình

- Công thức của Jacard (SJ)

cầu với đường kính khoảng 1,5 µm. Màng bào tử có thể nhẵn, gai, khối u, nếp

:

S J (AB)

NS

nhăn...tùy thuộc vào loài xạ khuẩn và môi trường nuôi cấy.

NS
100
Nd

Thường trên môi trường có nguồn đạm vô cơ và glucoza, các bào tử

Trong đó: S J : mức độ giống nhau giữa hai chủng A, B (%)
(AB)


NS: Tổng số các đặc điểm dương tính (giống nhau) của hai chủng

biểu hiện các đặc điểm rất rõ. Màu sắc của khuẩn lạc và hệ sợi khí sinh cũng
rất khác nhau tùy theo nhóm Streptomyces, màu sắc này cũng có thể biến đổi
khi nuôi cấy trên môi trường khác nhau. Vì vậy mà ủy ban Quốc tế về phân

so sánh.
Nd : Tổng số các đặc điểm khác nhau (tổng số các đặc điểm

loại xạ khuẩn ISP đã nêu ra các môi trường chuẩn và phương pháp chung để
phân loại nhóm VSV này.

dương tính của chủng này và âm tính của chủng kia).
Kết quả cuối cùng của phân loại số là vẽ được sơ đồ phân nhánh (kiểu

Các loài xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces có cấu tạo giống vi khuẩn

"rễ cây") của các thông số. Ở sơ đồ này những chủng giống nhau nhiều nhất

Gram dương, hiếu khí, dị dưỡng các chất hữu cơ. Nhiệt độ tối ưu thường là

được xếp vào một nhóm. Bằng phân loại số người ta chia xạ khuẩn chi

25 - 300C, pH tối ưu 6,5 - 8,0. Một số loài có thể phát triển ở nhiệt độ cao hơn

Streptomyces thành 2 nhóm lớn, 37 nhóm nhỏ và 13 cụm với những đại diện

hoặc thấp hơn (xạ khuẩn ưa nhiệt và ưa lạnh).
Xạ khuẩn chi này có khả năng tạo thành số lượng lớn các CKS ức


nhất định [44].

chế vi khuẩn, nấm sợi, các tế bào ung thư, virus và nguyên sinh động vật.

1.2.5. Phân loại xạ khuẩn chi Streptomyces
Chi Streptomyces là một giống xạ khuẩn bậc cao được Wakman và

Cho đến nay để xác định thành phần loài của chi Streptomyces, các nhà

Henrici đặt tên năm 1943 [43]. Đây là chi có số lượng loài được mô tả lớn

phân loại đã sử dụng hàng loạt các điều kiện và các khóa phân loại khác

nhất. Các đại diện chi này có HSKS và HSCC phát triển phân nhánh. Đường

nhau [48],[49].

kính sợi xạ khuẩn khoảng 1 - 10 µm, khuẩn lạc thường không lớn có đường

1.3. CHẤT KHÁNG SINH TỪ XẠ KHUẨN

kính khoảng 1 - 5 mm. Khuẩn lạc chắc, dạng da mọc đâm sâu vào cơ chất. Bề

1.3.1. Lƣợc sử nghiên cứu chất kháng sinh

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên







-13-

-14-

Theo định nghĩa của Outchinnikov [48]. Chất kháng sinh là chất có

Năm 1999 một kháng sinh mới khác được phát hiện có tác dụng ngăn

nguồn gốc thiên nhiên và các sản phẩm cải biến của chúng bằng con đường

chặn hiện tượng cholesterol, tăng sức đề kháng đối với các chất độc của

hóa học có khả năng tác dụng chọn lọc đối với sự phát triển của VSV, tế bào

chuột, ngoài ra kháng sinh này còn có hoạt tính chống nấm gây bệnh mạnh.

ung thư ở ngay nồng độ thấp.

Đó là kháng sinh loposomal HA - 92, được tách ra từ xạ khuẩn Streptomyces

Người đầu tiên đặt nền móng cho khoa học nghiên cứu CKS là
Alexander Fleming - Nhà sinh vật học người Anh, đã phát hiện ra penixillin

CDRLL - 312.
Năm 2003, nhiều nước trên thế giới vẫn tiếp tục phát hiện được hàng

loạt các CKS mới. Tại Nhật Bản, chất kháng sinh mới là yatakemycin đã

vào tháng 10 năm 1928.
Sau một thập kỷ, nhờ sự nỗ lực hợp tác của các nhà vi sinh học và sinh

được tách chiết từ xạ khuẩn Streptomyces sp. TP - A0356 bằng phương pháp

hóa học Anh, Mỹ, penixillin đã được nghiên cứu, sản suất với số lượng lớn và

sắc kí cột. CKS này có khả năng kìm hãm sự phát triển của nấm Aspergillus

trở thành "một loại thuốc thần kỳ". Năm 1945, A.Fleming, E. Chain và

fumigalus và Candida albicans. Ngoài ra chất này còn có khả năng chống lại

H.W.Florey đã được nhận giải thưởng Nobel vì đã khám phá ra giá trị to lớn

các tế bào ung thư với giá trị Mic là 0,01- 0,3 mg/ml [15].

của penixillin mở ra một kỷ nguyên mới trong y học - kỷ nguyên kháng sinh.
Những năm 1940 - 1959 được coi là thời kỳ hoàng kim của việc nghiên
cứu CKS với hàng loạt CKS mới liên tiếp được phát hiện như: gramixidin,
'

Năm 2007, tại Hàn Quốc đã phân lập được loài xạ khuẩn Streptomyces
sp. C684 sinh CKS laidlomycin, chất này có thể tiêu diệt cả những tụ cầu đã
kháng methicillin và các cầu khuẩn kháng vancomycin [47].

tiroxidin do Rene Jules Dubos phát hiện năm 1939, streptomycin do


Ngày nay, với sự phát triển mạnh mẽ của sinh học hiện đại cùng sự hỗ

Waksman phát hiện năm 1941, erythomycin do Gurre phát hiện năm 1952...

trợ của nhiều ngành khoa học khác đã giúp cho việc tìm kiếm và ứng dụng

Cùng với việc phát hiện ra các CKS mới, công nghệ lên men sản xuất CKS

CKS đạt được những thành tựu rực rỡ. Để sản xuất CKS con người không chỉ

cũng ra đời và dần được hoàn thiện [31].

tìm kiếm những chủng VSV sinh CKS từ tự nhiên mà còn cải tạo chúng bằng

Ngay từ những năm 1950, CKS đã được nghiên cứu sử dụng trong việc

nhiều phương pháp như dùng kỹ thuật di truyền và công nghệ gene, gây đột

phòng chống bệnh, kích thích sự tăng trưởng của động vật nuôi và cây trồng.

biến định hướng, chọn dòng gene sinh tổng hợp, tạo và dung hợp tế bào trần

CKS thu hút được sự quan tâm của các nhà khoa học thuộc nhiều lĩnh vực

để tạo ra các chủng có HTKS cao, đồng thời nhằm mục đích tìm kiếm các loại

khác nhau trên thế giới.

kháng sinh mới và quý trong thời gian ngắn [7],[41].


Tốc độ tìm kiếm các CKS trong thời gian gần đây vẫn diễn ra nhanh

Những thành tựu gần đây trong sinh học phân tử như tái tổ hợp ADN,

chóng, nhiều trung tâm nghiên cứu khoa học về y học, dược phẩm và nông

kỹ thuật tách dòng gene và biểu hiện tổng hợp ở vi khuẩn E.coli không những

nghiệp tại nhiều nước trên thế giới vẫn liên tục phát hiện được hàng loạt các

đem lại kết quả to lớn trong phát triển chủng giống mà còn mở ra phương

CKS mới có giá trị ứng dụng trong thực tiễn.

hướng đầy triển vọng trong sản xuất các CKS.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên



Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




-15-

-16-

1.3.2. Sự hình thành chất kháng sinh ở xạ khuẩn


1.3.3. Các yếu tố ảnh hƣởng đến sinh tổng hợp chất kháng sinh

Một trong những đặc điểm quan trọng nhất của xạ khuẩn là khả năng
hình thành CKS. Trong số 8000 CKS hiện biết trên thế giới có trên 80% là có

1.3.3.1. Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy
* Nhiệt độ
Nhiệt độ có ảnh hưởng rất lớn đến sinh trưởng và khả năng tổng hợp

nguồn gốc từ xạ khuẩn [6].
Một trong những tính chất của các CKS có nguồn gốc từ VSV nói

CKS của xạ khuẩn. Đa số các xạ khuẩn phát triển tốt ở nhiệt độ 28 - 300C,

chung và từ xạ khuẩn nói riêng là có tác dụng chọn lọc. Mỗi CKS chỉ có tác

nhưng nhiệt độ tối ưu cho sinh trưởng tổng hợp CKS thường chỉ nằm trong

dụng với một nhóm VSV nhất định. Hầu hết CKS có nguồn gốc xạ khuẩn đều

khoảng 18 - 280C [20].

có phổ kháng khuẩn rộng. Khả năng kháng khuẩn của các CKS là một đặc

* pH môi trường

điểm quan trọng để phân loại xạ khuẩn.

Sinh tổng hợp chất kháng sinh phụ thuộc rất nhiều vào pH môi trường.


Có nhiều quan điểm khác nhau về khả năng hình thành CKS. Một số

pH tác động trực tiếp đến tính chất hệ keo của tế bào, đến hoạt lực của các

tác giả cho rằng sự hình thành CKS là do cơ chế giúp cho VSV tồn tại trong

enzym và tác động gián tiếp qua môi trường. pH thích hợp cho sinh tổng hợp

môi trường tự nhiên. Số khác cho rằng, sự hình thành CKS là do sự cạnh

CKS thường là trung tính, pH kiềm hay axit đều ức chế quá trình tổng hợp

tranh trong môi trường dinh dưỡng. Hầu hết các tác giả cho rằng kháng sinh

CKS [24],[46].

là sản phẩm chuyển hóa thứ cấp được hình thành vào cuối pha tích lũy thừa,

* Độ thông khí

đầu pha cân bằng của chu kỳ sinh trưởng [5].

Xạ khuẩn là loại VSV có nhu cầu thông khí cao hơn so với các VSV

Mặc dù CKS có cấu trúc khác nhau và VSV sinh ra chúng cũng đa dạng,
nhưng quá trình sinh tổng hợp chúng chỉ theo một số con đường nhất định.
- CKS được tổng hợp từ một chất chuyển hóa sơ cấp, thông qua một
chuỗi phản ứng enzym.


khác, nhất là ở giai đoạn nhân giống (khoảng từ giờ thứ 6 đến giờ thứ 12 của
quá trình nuôi cấy)[21]. Do vậy để đảm bảo thông khí tốt, người ta thường bổ
sung vào môi trường lên men benzilthioxyanat... làm tăng khả năng hòa tan
oxy. Nồng độ oxy thích hợp cho sinh tổng hợp CKS là 2 - 8ml O2/ 100ml

- CKS được hình thành từ hai hoặc ba chất chuyển hóa sơ cấp khác nhau.

môi trường lên men [8].

- CKS được hình thành bằng con đường polyme hóa các chất chuyển

* Tuổi giống

hóa sơ cấp, sau đó tiếp tục biến đổi qua các phản ứng enzym khác.

Việc tổng hợp CKS không chỉ phụ thuộc vào điều kiện lên men, mà

Nhiều chủng xạ khuẩn có khả năng tổng hợp đồng thời hai hay nhiều

còn phụ thuộc vào chất lượng của bào tử và giống sinh dưỡng. Tuổi giống

CKS có cấu trúc hóa học và có tác dụng tương tự nhau. Quá trình sinh tổng

cấy truyền vào môi trường lên men cho hiệu suất CKS cao nhất thường là 24

hợp CKS phụ thuộc vào cơ chế điều khiển đa gene, ngoài các gene chịu trách

giờ tuổi. Lượng giống cấy truyền khoảng từ 2 - 10% [14].

nhiệm tổng hợp CKS, còn có cả các gene chịu trách nhiệm tổng hợp các tiền

chất, enzym và cofactor.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên



Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




-17-

-18-

1.3.3.2. Ảnh hưởng của thành phần môi trường lên men

Đây là thành phần không thể thiếu trong môi trường lên men. Nếu môi

CKS là sản phẩm thứ cấp nên quá trình sinh tổng hợp CKS phụ thuộc

trường lên men có nguồn dinh dưỡng tự nhiên thì hầu hết các nguyên tố vi

chặt chẽ vào thành phần môi trường dinh dưỡng. Trước hết là nguồn cacbon,

lượng đã có sẵn. Việc bổ sung các chất giàu nguyên tố vi lượng vào môi

nitơ, tỷ lệ C/N và các chất khoáng...[5],[26],[29].

trường sẽ làm thay đổi đáng kể khả năng tổng hợp CKS của nhiều chủng xạ


* Nguồn cacbon

khuẩn.

Các hợp chất cacbon có ý nghĩa hàng đầu trong sự sinh trưởng và hình

* Hình thức lên men

thành CKS. Đối với nhiều chủng xạ khuẩn, nguồn cacbon thích hợp là tinh

Trong tổng hợp CKS, phương pháp nuôi cấy cũng là một trong những

bột. Tuy nhiên, tùy từng chủng khác nhau mà khả năng sử dụng các loại

yếu tố quyết định. Khi nuôi cấy bề mặt, đặc điểm hai pha thường không quan

đường là khác nhau, có chủng sử dụng tốt các loại đường đơn như glucoza,

sát thấy và CKS được tạo thành trong suốt pha sinh trưởng. Quá trình sản

mannoza, fructoza...có chủng sử dụng tốt loại đường đôi như sacaroza,

xuất CKS thường được tiến hành theo phương pháp nuôi cấy chìm trong nồi

maltoza...Ngoài ra một số chủng còn có thể sử dụng các loại acid hữu cơ và

lên men có cách khuấy đảo và sục khí.

chất béo làm nguồn thức ăn cacbon trong lên men sinh CKS.


1.4. MỘT SỐ BỆNH HẠI CHÈ DO NẤM GÂY RA VÀ ỨNG DỤNG

* Nguồn nitơ

CỦA CKS TRONG BẢO VỆ THỰC VẬT

Hầu hết các chủng xạ khuẩn sinh CKS đều đòi hỏi cả hai nguồn nitơ
hữu cơ và vô cơ. Nguồn nitơ hữu cơ thích hợp nhất thường là các hợp chất từ

1.4.1. Một số bệnh hại chè do nấm
1.4.1.1. Bệnh phồng lá chè

thực vật như bột đậu tương, cao ngô. Cao ngô là nguồn bổ sung cả nitơ và

Bệnh được phát hiện năm 1868 ở Ấn Độ, nhưng đến năm 1895 Masse mới

protein, tuy nhiên lượng phốt phát vô cơ trong cao ngô cao sẽ ức chế sinh

nghiên cứu phát hiện nguyên nhân gây bệnh. Bệnh do nấm Esobasidium

tổng hợp CKS[27]. Nguồn nitơ vô cơ thường sử dụng là muối amon. Muối

vexans Mase gây ra [1],[4].

nitrat không thích hợp cho sự sinh tổng hợp CKS của nhiều chủng xạ khuẩn.
* Nguồn photphat vô cơ

Bệnh phát sinh ở lá non, cành non, vết bệnh phần lớn ở mép lá. Đầu tiên
trên lá xuất hiện những chấm nhỏ hình giọt dầu màu vàng nhạt. Sau đó vết


Photphat vô cơ đóng vai trò như là tác nhân điều chỉnh sinh tổng hợp

bệnh lớn dần, màu nhạt dần. Phía dưới vệt bệnh (mặt dưới lá) phồng lên và

CKS. Nồng độ photphat thích hợp cho sinh tổng hợp CKS thường không

mặt trên lõm xuống, phía lồi có hạt phấn màu trắng, có giới hạn rõ rệt với phần

vượt quá 10 mg/ml. Nồng độ photphat ban đầu cao sẽ làm tăng lượng axit

lá khoẻ. Cành bị nấm hại sẽ bị chết [50].

nucleic dẫn đến kéo dài pha sinh trưởng, rút ngắn pha tổng hợp, làm tăng

Đám bào tử (Basidiospore) của nấm bệnh có hình gậy, phía đỉnh phân

ATP trong tế bào, dẫn đến giảm hoặc ngừng hẳn sinh tổng hợp CKS.

nhánh, mỗi nhánh đính một bào tử có hình bầu dục hoặc hình thận không màu.

* Các yếu tố vi lượng

Lúc đầu bào tử là đơn bào, về sau ở giữa có vách ngăn tạo thành hai bào tử.
Bào tử rất dễ rụng.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




-19-

-20-

Dưới điều kiện độ ẩm cao, nhiệt độ thấp bệnh phát sinh mạnh. Các thời
điểm bệnh thường phát sinh mạnh là tháng 3 đến tháng 5 và tháng 9 đến tháng
10. Nhiệt độ thích hợp là 15

1.4.1.3. Bệnh đốm trắng
Ở Việt Nam, bệnh đốm trắng có ở mọi vùng chè, phát sinh trên vườn
chè mới trồng, gây hại ở lá non và cành non. Mùa mưa bệnh phát sinh mạnh

0

20 C.

nhất. Tác nhân gây bệnh là do nấm Phyllosticta theafolia Hara [4].

1.4.1.2. Bệnh đốm nâu

Lúc đầu vết bệnh còn nhỏ, hình tròn, màu nâu phần giữa lõm xuống có

Bệnh đốm nâu (còn gọi là khô lá
chè hình bánh xe) là bệnh hại lá thường


màu trắng sáng, xung quanh có màu lông sẫm. Đường kính vết bệnh 0,5

thấy ở các nương chè Việt Nam. Bệnh

mm. Thời kỳ sau, nhiều vết nhỏ liên kết với nhau tạo thành vết lớn không có

phát sinh vào tháng 5, 6 mưa nhiều và

hình dạng nhất định, cuống lá bị bệnh dễ làm cho lá rụng. Bệnh có thể phát

bệnh phát sinh mạnh nhất vào tháng 8,

sinh ở tất cả cành non. Mặt trên vết bệnh có những vết nhỏ màu đen. Bệnh

9. Bệnh nặng có thể làm khô lá và rụng

đốm trắng có những nốt mốc và có những vết nhỏ hình mũi kim.

1,5

sớm. Tác nhân gây bệnh là do nấm

Sợi nấm hoặc bào tử tồn tại trong lá bị rụng hoặc ở cành cây để qua

Colletotrichum camelliae Masse [1],[4].

đông. Mùa xuân bào tử phát tán và xâm nhập vào các cành non và lá bánh tẻ.

Bệnh đốm nâu chủ yếu hại lá già, cành và quả. Trên lá vết bệnh bắt đầu


Nhiệt độ từ 18

250C rất thích hợp cho sự phát sinh của bệnh. Mùa xuân và

từ mép lá, màu nâu, không có hình dáng nhất định hoặc hình bán nguyệt.

mùa thu, mưa nhiều là điều kiện cho sự phát sinh mạnh. Trên các giống chè

Trên vết bệnh có các đường tròn đồng tâm, ở giữa vết bệnh lá bị khô, màu

lá nhỏ (như Đại bạch trà, Gruzia) bệnh cũng phát sinh mạnh.

xám tro đen lan dần theo hình gợn sóng bánh xe. Trên cành cũng có triệu
trứng như vậy, bộ phận bị bệnh có thể bị rách (vỡ) ra [50].
Bào tử nấm tồn tại trên vết bệnh và lá bệnh, thậm chí cả khi lá rơi

1.4.1.4. Bệnh đốm xám
Bệnh đốm xám là bệnh phổ biến
ở các vùng trồng chè. Bệnh phát sinh

xuống đất. Năm sau, khi nhiệt độ tăng lên, bào tử phát tán nhờ gió mưa

vào mùa mưa, nhiệt độ 27

truyền đến các lá chè và sau lây nhiễm 5

Bệnh nặng làm lá chè khô rụng, cây

18 ngày thì xuất hiện vết bệnh.


Bệnh ưa nóng ẩm nên thường phát sinh vào tháng 7, 8. Sau mưa liên tục
10

15 ngày bệnh phát triển rất nặng.

300C.

chè còi cọc. Tác nhân gây bệnh là do
nấm Pestalossia theae Sawada [1],[4].

Ở vùng đất thấp có mực nước ngầm cao, thoát nước không tốt, phân bón

Vết bệnh trên lá có màu nâu sẫm,

không đủ đều tạo điều kiện cho bệnh phát sinh. Trong quá trình chăm sóc

lúc đầu chỉ có chấm nhỏ màu đen sau đó lan ra khắp lá. Bệnh thường bắt đầu

chè bị xây xát nhiều, ánh sáng quá mạnh hoặc khi gặp mưa, bệnh phát sinh

từ mép lá và làm cho lá rụng. Vết bệnh có hình gợn sóng, trên vết bệnh có

càng nặng, giống chè lá to bệnh dễ phát sinh mạnh.

các hình vân đen. Lá thường bị rụng khi bệnh lan khắp lá hoặc 1/2 lá.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




-21-

-22-

Những điểm nhỏ trên lá là bào tử phân sinh đính trên cuống ngắn và

rõ rệt tỷ lệ mắc bệnh của cây. Thông thường, một loại xạ khuẩn đối kháng có

đính bào tử. Bào tử có 3 ngăn, đầu nhỏ có cuống, đầu lớn có 3 lông, bào tử

thể ức chế một vài loại nấm gây bệnh nhưng có những loài hoạt phổ rộng có

màu nâu xẫm.

thể ức chế nhiều tác nhân gây bệnh có trong đất.

1.4.1.5. Bệnh thối búp chè

Không phải tất cả các xạ khuẩn có hoạt tính kháng nấm invitro đều thể

Bệnh thối búp chè thường thấy ở

hiện trong đất (khoảng 4 - 5%) nhưng chúng có vai trò quan trọng trong việc

các nước trồng chè của vùng Châu Á.


ức chế nấm gây bệnh và ngăn ngừa khả năng nhiễm bệnh cho cây. Đây là

Bệnh này được phát hiện ở Phú Hộ từ

quy luật cân bằng sinh học trong tự nhiên. Nếu sự cân bằng mất đi, lập tức sẽ

năm 1961 - 1962 trên những nương chè

nảy sinh ra bệnh khi trong đất có mầm gây bệnh. Xạ khuẩn chống nấm ngoài

tăng sản và lấy hom giống. Tác nhân gây

việc tiết ra các CKS, còn tác động lên khu hệ VSV thông qua các enzym

bệnh là do nấm Colletotrichum theae

phân giải. Ngoài ra, nhiều XK còn tiết ra các chất kích thích sinh trưởng thực

Petch [4].

vật cũng như kích thích các khu hệ VSV có lợi trong vùng rễ [14].

Bệnh thường xuất hiện ở lá non, cuống lá và cành non. Vết bệnh lúc
đầu bằng đầu kim có màu đen, sau đó lan dần ra hết cả búp và cành chè. Sau

* Các chất kháng sinh có nguồn gốc xạ khuẩn trong phòng trừ nấm gâ y
bệnh thực vật

20 mm. Khi thời tiết nóng ẩm lá dễ


Để tránh dịch bệnh trong nông nghiệp, người ta có thể sử dụng một số

bị rụng. Trong vườn ươm thường hay bị nặng hơn ở nương chè hái búp. Từ

biện pháp kỹ thuật, như thay đổi cơ cấu cây trồng, mùa vụ. Tuy nhiên biện

tháng 7 đến tháng 9 thường có mưa kéo dài, bệnh dễ gây hại nặng. Nhiệt độ

pháp này gây xáo trộn hệ sinh thái đồng ruộng, tạo điều kiện để phát sinh một

10 ngày vết bệnh có thể dài tới 15

8

27 C và độ ẩm > 90% là điều kiện thuận lợi cho bệnh phát sinh. Bào tử nấm

số bệnh mà trước đây ít gặp. Việc tuyển chọn các dòng cây kháng bệnh cũng

lan truyền nhờ mưa gió. Chè để cành và vườn ươm bón nhiều phân đạm và

chỉ được vài năm, sau đó các tác nhân gây bệnh lại kháng lại.

0

trên nền thâm canh cao, thường bị bệnh nặng hơn.

Việc sử dụng CKS trong trồng trọt nhằm các mục đích như chống bệnh

1.4.2. Các chất kháng sinh trong bảo vệ thực vật


do nấm gây ra trên rau quả và cây trồng, chống bệnh do vi khuẩn gây ra, diệt

* Xạ khuẩn chống nấm gây bệnh thực vật

côn trùng và cỏ dại... kiềm chế các bệnh thực vật sinh ra từ đất. So với thuốc

Các nhà bệnh học thực vật trên toàn thế giới đã điều tra nghiên cứu

hóa học, dùng các CKS trong bảo vệ thực vật vừa có tác dụng nhanh, dễ phân

tình hình sử dụng CKS trong việc ngăn chặn các bệnh thực vật. Tuy còn ở

hủy, có tác dụng chọn lọc cao, độ độc thấp không gây ô nhiễm môi trường,

mức thấp nhưng đã thu được những thành tựu nhất định trong nền nông

còn có khả năng ức chế các VSV đã kháng thuốc hóa học. CKS và dịch lên

nghiệp hiện đại.

men các chủng sinh CKS còn dùng để xử lý hạt giống với mục đích tiêu diệt

Sự đối kháng giữa các VSV trong đất là cơ sở của biện pháp sinh học

nguồn bệnh ở bên ngoài và trong hạt, diệt bệnh cả ở các bộ phận nằm trên đất

phòng chống bệnh cây. Sự có mặt của xạ khuẩn đối kháng trong đất làm giảm

của cây và khử trùng đất [15].


Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên






-23-

-24-

Ngày nay, việc sử dụng các CKS trong bảo vệ thực vật được phổ biến
rộng rãi trên thế giới nhất là ở các nước Nga, Nhật, Trung Quốc, Ấn Độ...Ở

Chƣơng 2
NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Trung Quốc đã tuyển chọn được nhiều chủng xạ khuẩn từ đất và nghiên cứu
sản xuất nhiều CKS phòng chống bệnh cây có hiệu quả cao như policin chống

2.1 NGUYÊN LIỆU VÀ HÓA CHẤT

bệnh đạo ôn, jangamicin chống bệnh khô vằn.

2.1.1. Nguyên liệu

Năm 2002, ở Ấn Độ đã phân lập được chủng Streptomyces sp. 201 có

khả năng sinh CKS mới là z - methylheptyl iso - nicotinate, chất kháng sinh

2.1.1.1 Mẫu cây
Mẫu nghiên cứu là các lá chè, búp chè bị bệnh thu thập từ các địa điểm

này có khả năng kháng được nhiều loại nấm gây bệnh như Fusarium

khác nhau của Thái Nguyên, được bảo quản trong tủ lạnh không quá 24 giờ.

oxysporum, F. solani...[15].

2.1.1.2. Mẫu đất

Ở Việt Nam cũng đã sử dụng nhiều chế phẩm kháng sinh trong bảo vệ
thực vật nhập từ Trung Quốc hay Nhật Bản và đã phân lập được một số chủng
xạ khuẩn có khả năng chống Pyricularia oryzae gây bệnh đạo ôn và F. oxysporum
gây bệnh thối rễ ở thực vật [2]. Tuy nhiên việc sử dụng CKS trong lĩnh vực
bảo vệ thực vật ở nước ta còn ở mức độ thấp bởi tập quán canh tác chỉ quen
dùng một số hóa chất bảo vệ thực vật nhất định.

Các mẫu đất được lấy ở các độ sâu 5 - 10 cm tại các địa điểm khác
nhau của tỉnh Thái Nguyên.
2.1.1.3. Vi sinh vật kiểm định
Ngoài các chủng nấm phân lập được từ các lá chè bị bệnh, 3 chủng nấm
gây bệnh thực vật được sử dụng làm VSV kiểm định là:
- Rhizoctonia solani VCM 3047

Ngoài ra, giá thành của các chế phẩm sinh học chưa phù hợp với điều

- Fusarium oxysporum VCM 3028


kiện sản xuất của người nông dân. Do đó cần có sự phối hợp thống nhất trong

- Fusarium moniliforme VCM 3027

việc nghiên cứu, sản xuất các chế phẩm phòng trị sinh học với việc truyền

Các chủng nấm này nhận được từ phòng Di truyền VSV - Viện Công

thông, xây dựng phương pháp canh tác mới nhằm thu được hiệu quả to lớn

nghệ Sinh học thuộc Viện khoa học và công nghệ Việt Nam.

trong phòng chống dịch bệnh, nâng cao năng suất cây trồng và hiệu quả kinh

2.1.2 Hóa chất, dụng cụ và thiết bị

tế đồng thời bảo vệ môi trường và sức khỏe con người [14].

2.1.2.1. Hóa chất
- Các loại đường chuẩn: glucose, saccarose, lactose, fructose,
mantose... của hãng Merck (Đức), Trung Quốc sản xuất
- Các loại muối: K2HPO4, KH2PO4, KI, MgSO4. 7H2O, KNO3, NaCl,
FeSO4. 7H2O, (NH4)2SO4, CaCO3, MnCl2, Na2CO3, ZnCl2, ZnSO4.... nhập từ
Trung Quốc, Anh sản xuất

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




-25-

-26-

- Các loại cao: Cao thịt, cao nấm men, cao malt, peptone... của hãng

Trypton - 5, cao nấm men - 3; thạch - 18; H2O - 1lít; pH 7 - 7,2.
* Môi trường ISP -2 (g/l)

Merck (Đức).
- Các loại hóa chất khác: thạch, tinh bột tan, casein, CMC (Carboxyl
Methyl Cellulose)... của Nhật, Trung Quốc, Việt Nam sản xuất.
- Các dung môi: etanol, iso-propanol, metanol, aceton.. của Trung Quốc.
2.1.2.2. Dụng cụ và thiết bị

Cao nấm men - 3; Cao malt - 10; Dextrose - 4; Thạch - 20; Nước cất - 1lit;
pH 7 - 7,2.
* Môi trường ISP - 3 (g/l)
Bột kiều mạch - 20; Muối A - 1ml; Thạch - 20; Nước cất - 1lit; pH - 7,2.

- KHVQH Olympus (Nhật)

- Tủ ấm, tủ sấy Memmert (Đức)

* Môi trường ISP - 4 (g/l)


- KHVĐT Joel (Nhật)

- Cân phân tích, cân kỹ thuật

Tinh bột tan - 10; K2HPO4 - 1,0; MgSO4. 7H2O - 1,0; NaCl - 1,0; (NH4)2SO4 -

- Máy lắc (Hàn Quốc)

- Nồi khử trùng (Đài Loan)

2; CaCO3 - 2; dung dịch khoáng - 1ml; thạch - 18g; H2O - 1lít; pH 7 - 7,2.

- Box cấy vô trùng Nuaire (Mỹ)

- Máy đo pH 151 Martini

* Môi trường ISP - 5 (g/l)

- Máy ly tâm Hettich (Đức)

- Máy cất nước Hamilton.

Asparagin - 1; Glixerin - 10; K2HPO4 - 1; Muối A - 1ml; Thạch - 20; Nước

- Các dụng cụ thủy tinh của Trung Quốc, Đức, Việt Nam...

cất - 1lit; pH 7,0 - 7,4.

2.1.2.3. Các công thức môi trường


* Môi trường ISP - 6 (g/l)

Môi trường phân lập và giữ giống nấm

Peptone - 10; cao nấm men - 1; xitrat sắt - 0,5; thạch - 18; H2O - 1lít; pH 7 - 7,2.

*Môi trường CZ (Czapek - Dox - Agar) (g/l)

* Môi trường ISP - 7 (g/l)

NaNO3 - 2; KH2PO4 - 1; MgSO4. 7H2O - 0,5; KCl - 0,5; FeSO4 - 0,01;

Glycerol - 15; L - tyrosine - 0,5; L - asparagine - 1; FeSO4.7H2O - 0,01; K2 HPO4 -

Thạch - 20; H2O - 1lít.

0,5; MgSO4. 7H2O - 0,5; Nacl - 0,5; Muối A - 1ml; Thạch - 20; Nước cất -

*Môi trường khoai tây (PDA - Potato Dextrose Agar) (g/l)

1lit; pH 7,2 - 7,4.

Khoai tây miếng - 200; Thạch - 18; đường - 20, H2O 1lít; pH 7 - 1,4.

* Môi trường ISP - 9 (g/l)

Môi trường phân lập, giữ giống và nghiên cứu xạ khuẩn

(NH4)2SO4 - 2,64; KH2PO4 - 2,38; K2HPO4 - 5,65; MgSO4 - 1; dung dịch


* Môi trường Gause - I (g/l)

muối B - 1ml; nguồn cacbon - 10; thạch - 20; H2O - 1lít; pH 6,8 - 7.

Tinh bột tan - 20; K2HPO4 - 0,5; MgSO4. 7H2O - 0,5; NaCl - 0,5; (NH4)2SO4 2; KNO3 - 0,5; FeSO4 - 0,01; Thạch - 18 g; H2O - 1lit; pH 7 - 7,4.
* Môi trường Gause - II (g/l)

- Dung dịch muối A (%): FeSO4 - 0,1; ZnSO4 - 0,15; MnCl2 - 0,1;
Nước cất - 100ml.
- Dung dịch muối B (%): CuSO 4 - 0,64; FeSO4 - 0,11; MgCl2 - 0,79;

Nước chiết thịt - 30ml; pepton - 5; NaCl - 5; glucoza - 10; Thạch - 18g; H2O -

nước cất - 100ml.

1lít; pH 7 - 7,4.

* Môi trường 79 (g/l)

* Môi trường ISP - 1 (g/l)

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên



Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên





-27-

-28-

Glucoza -10; peptone -10; cazein thủy phân - 2; cao nấm men - 2; NaCl - 6,

CZ. Thu nhận giống thuần khiết trong ống thạch nghiêng và bảo quản trong tủ

K2HPO4 - 0,2; thạch - 18; H2O - 1lít; pH 7 - 7,4.

lạnh ở 40C [14].

* Môi trường A4 - H (g/l)

2.2.2. Phân lập và tuyển chọn xạ khuẩn

Glucoza - 15; bột đậu tương - 15; NaCl - 5; CaCO3 - 1; H2O - 1lít; pH 7.

2.2.2.1. Phân lập xạ khuẩn theo Vinogradski

* Môi trường A - 4 (g/l)

Cân 1g đất cho vào bình nón 50 ml chứa 9ml nước cất vô trùng, lắc trên

Glucoza - 10; bột đậu tương - 10; NaCl - 5; CaCO3 - 1; H2O - 1lít; pH 7.

máy lắc 30 phút. Dùng pipet vô trùng hút 0,5 ml dịch đất sang ống nghiệm có

* Môi trường Tinh bột (g/l)


chứa 4,5 ml nước vô trùng và tiếp tục pha loãng đến 10-2, 10-3...10-6. Từ mỗi

Tinh bột - 20; K2HPO4 - 0,5; MgSO4 - 0,5; KNO3 - 1; NaCl - 0,5; FeSO4 -

nồng độ pha loãng ở các nồng độ 10-3 đến 10-6, nhỏ 0,1ml sang đĩa Petri chứa

0,01; Agar - 30,0; Nước - 1 lít; pH 7,2 - 7,4.

môi trường Gause - I. Dùng que gạt vô trùng chang đều, sau đó nuôi ở nhiệt

* Môi trường Czapek Glycerin (g/l)

độ phòng từ 4 - 7 ngày. Trên mỗi mẫu đất, khuẩn lạc của xạ khuẩn được cấy 3

Glycerin - 30,0; NaNO3 - 2,0; K2HPO4 - 1.0; MgSO4 - 0,5; KCl - 0,5; FeSO4 -

pha sang đĩa Petri chứa môi trường Gause - I để làm sạch. Sau đó nuôi ở nhiệt

0,01; Agar - 20,0; Nước - 1 lít.

độ phòng 4 - 7 ngày, từ các khuẩn lạc được làm sạch cấy truyền sang ống

* Môi trường Czapek Gluco (g/l)

nghiệm chứa môi trường thạch nghiêng Gause - I, tiếp tục nuôi ở điều kiện

Gluco - 30,0; NaNO3 - 2,0; K2HPO4 - 1.0; MgSO4 - 0,5; KCl - 0,5; FeSO4 -

trên trong 10 - 14 ngày [12].


0,01; Agar - 20,0; Nước - 1 lít.

Theo ISP màu sắc khuẩn ty khí sinh của các chủng xạ khuẩn được chia

2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu

thành 8 nhóm màu: White (W) nhóm trắng, Gray (Gy) nhóm xám, Red (R)

2.2.1. Phƣơng pháp phân lập nấm gây bệnh từ các mẫu chè

nhóm đỏ, Yellow (Y) nhóm vàng, Green (Gn) nhóm xanh, Blue (B) nhóm

Chọn các mẫu chè có triệu chứng điển hình, mới. Rửa mẫu bệnh sạch

xanh da trời, Violet (V) nhóm tím, và nhóm màu không xác định (X)

đất cát dưới vòi nước,cắt chọn mảnh mô bệnh thích hợp. Khử trùng bề mặt

[16],[19], [42].

các mảnh mô trên bằng cồn (etanol 70%) trong vòng 3 phút. Rửa lại bằng

2.2.2.2. Xác định hoạt tính kháng sinh

nước cất vô trùng, thấm khô mảnh mô bằng giấy thấm vô trùng. Dùng dao mổ

Phương pháp thỏi thạch (dùng để sơ tuyển Xạ khuẩn)

vô trùng cắt các mảnh mô trên thành các mảnh nhỏ 1 - 3mm (chứa cả phần


Xạ khuẩn được nuôi cấy trên môi trường ISP - 4 hoặc Gause - I trong

mô bệnh và mô khỏe). Dùng panh vô trùng đặt các mảnh mô nhỏ trên vào môi

đĩa petri sau 7 ngày dùng khoan nút chai khoan các thỏi thạch đặt vào đĩa

trường Czapek trên đĩa petri. Ghi chú cẩn thận bằng bút viết kính: ngày, cây,

petri đã cấy VSV kiểm định. Sau đó để vào tủ lạnh 4 - 5h cho CKS khuếch

0

bệnh.. Để đĩa môi trường đã đặt mẫu trong tủ ấm 30 C. Theo dõi sự phát triển

tán vào môi trường thạch sau đó để vào tủ ấm. VSV kiểm định nuôi ở 28 -

của sợi nấm mọc ra từ mô bệnh. Khi nấm đã phát triển từ mô bệnh ra môi

300C, đọc kết quả sau vài ngày [7].

trường, lấy phần đỉnh sợi nấm chuyển sang môi trường thích hợp: PDA hoặc

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên



Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên





-29-

-30-

HTKS được xác định dựa vào kích thước vòng vô khuẩn (D - d, mm),

2.2.4. Nghiên cứu các đặc điểm sinh học và phân loại xạ khuẩn

D là kích thước vòng vô khuẩn và d là đường kính thỏi thạch.

2.2.4.1. Đặc điểm hình thái

Phương pháp đục lỗ (Xác định hoạt tính kháng sinh trong dịch thể)

Quan sát màu sắc của hệ sợi khí sinh

Dùng khoan nút chai đục các lỗ trên môi trường thạch đã cấy VSV

Dựa theo tài liệu của ISP, Gause và cộng sự (1983), xác định màu sắc

kiểm định trong đĩa petri. Nhỏ vào các lỗ khoan dung dịch cần thử (các bước

của HSKS dựa vào bảng màu của Tresner và Bakus. Căn cứ vào màu sắc

tiếp theo tiến hành như phương pháp thỏi thạch).

HSKS của các chủng mới phân lập để phân thành các nhóm màu theo Gause


Phương pháp khoanh giấy lọc (Xác định hoạt tính kháng sinh trong dung môi)

và cộng sự: White (W) nhóm trắng, Gray (Gy) nhóm xám, Red (R) nhóm đỏ,

Khoanh giấy lọc F8 có đường kính 6mm được tẩm một lượng dịch
0

CKS (1ml/10 khoanh giấy lọc). Sau đó sấy khô ở 40 C, đặt khoanh giấy lọc
đã tẩm CKS vào đĩa petri đã cấy VSV kiểm định (các bước tiếp theo giống

Yellow (Y) nhóm vàng, Green (Gn) nhóm xanh...
Quan sát màu sắc của hệ sợi cơ chất
Màu sắc của HSCC được xác định qua quan sát trực tiếp trên môi

phương pháp thỏi thạch).

trường thạch đĩa hoặc thạch nghiêng và mô tả theo thang màu chuẩn của

2.2.2.3. Tuyển chọn các chủng xạ khuẩn sinh chất kháng sinh

Bondarsev (1953), Tresner và cộng sự (1961).

Từ ống thạch nghiêng giống đã hoạt hóa được cấy truyền sang các bình
nón dung tích 250 ml chứa 100 ml môi trường Gause - I và nuôi lắc 220 vòng/

Quan sát cuống sinh bào tử
Xạ khuẩn được nuôi cấy trên môi trường Gause - I có găm lamen
nghiêng 450 trên bề mặt môi trường. Sau 7 - 9 ngày nuôi ở nhiệt độ phòng lấy

phút trong 48 giờ ở nhiệt độ phòng.

Giống phát triển được cấy truyền với tỷ lệ 10% sang bình nón dung tích

ra quan sát hình dạng chuỗi sinh bào tử trên lamen dưới kính hiển vi quang

250 ml chứa 80 ml môi trường Gause - I dịch thể. Quá trình lên men kéo dài

học. Chuỗi sinh bào tử có các dạng thẳng hay hơi lượn sóng ký hiệu là RF

96 giờ ở nhiệt độ phòng trên máy lắc 220 vòng /phút. Sau đó thử HTKS trong

(Rectiflexibiles), hình móc câu hay hình xoắn không hoàn toàn ký hiệu là RA

dịch lọc [7].

(Retinaculiaperti) và xoắn hoàn toàn ký hiệu là S (Spirales) [33], [35], [41].

2.2.3. Bảo quản giống

Quan sát bề mặt bào tử

Các chủng xạ khuẩn đã lựa chọn được cấy trên môi trường thạch

Dùng màng cacbon đặt trực tiếp lên bề mặt khuẩn ty khí sinh có bào tử,

nghiêng Gause - I ở nhiệt độ phòng. Sau 10 - 14 ngày khi xạ khuẩn mọc tốt,

sau đó quan sát và chụp ảnh dưới kính hiển vi điện tử quét. Bào tử có các hình

các ống giống được bảo quản trong tủ lạnh ở 4 - 60C. Sau 2 - 3 tháng cấy


dạng: tròn, ovan, elíp, hình que [33].

truyền lại một lần.

Bề mặt bào tử xạ khuẩn có các dạng: Nhẵn ký hiệu là Sm (Smooth),

Để bảo quản lâu giống được giữ trong ống cát, trong parafin lỏng vô trùng giữ

dạng mụn cóc ký hiệu là Wa (Warty), dạng gai ký hiệu là Sp (Spiny) và dạng

lạnh sâu trong glycerin hoặc đông khô, bảo quản được 6 tháng đến 2 năm.

tóc ký hiệu là Ha (Hairy).

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên






-31-

-32-

2.2.4.2. Đặc điểm nuôi cấy

Hoạt tính enzym được xác định bằng giá trị D - d (mm). Sau khi nhuộm màu


Màu sắc khuẩn ty khí sinh, khuẩn ty cơ chất và sắc tố tan

đỏ Công gô (cơ chất CMC), axit tricloaxetic (cơ chất casein) và thuốc thử

Xạ khuẩn được nuôi cấy trên môi trường: Gause - I, Gause - II, ISP - 1, ISP

Lugol (cơ chất tinh bột). Vùng cơ chất bị phân giải không bắt màu ở xung

- 2, ISP - 3, ISP - 4, ISP - 5, ISP - 6, ISP - 7 ở nhiệt độ phòng. Sau 7, 14, 21 ngày

quanh lỗ thạch.

lấy ra quan sát màu sắc KTKS, KTCC và sắc tố tiết ra môi trường [33], [37].

Khả năng chịu muối

Sự hình thành sắc tố melanin

Cấy xạ khuẩn trên môi trường thạch nghiêng ISP - 1 có bổ sung thêm

Xạ khuẩn được nuôi cấy trên môi trường ISP - 6 ở nhiệt độ phòng. Bắt

NaCl với các nồng độ 0,5; 3; 7; 9; 11; 12 (%). Sau 7 - 10 ngày lấy ra quan sát

đầu quan sát màu của môi trường sau 24 giờ cho đến ngày thứ 14. Nếu sinh

sự sinh trưởng.

melanin, màu của môi trường sẽ chuyển từ màu vàng nhạt sang màu nâu đậm


Khả năng sử dụng các nguồn cacbon

cho đến màu đen [33].

Xạ khuẩn được nuôi cấy trên môi trường ISP - 9 có bổ sung 1% các

2.2.4.3. Đặc điểm sinh lý - sinh hóa

nguồn đường: Glucoza, maltoza, fructoza, lactoza, sacaroza....

Khả năng sinh enzym ngoại bào

Cách làm: Cân 1g đường, thanh trùng bằng đèn UV rồi bổ sung vào 100ml

- Chiết dịch enzym

môi trường ISP - 9 còn nóng. Lắc cho tan đường rồi đổ vào đĩa Petri và nuôi

Thu enzym từ môi trường lỏng: xạ khuẩn sau khi được nuôi trên môi trường

cấy xạ khuẩn ở nhiệt độ 28 -300C, sau 14 ngày quan sát sự sinh trưởng của

Gause II dịch thể sẽ được lọc bỏ sinh khối hoặc ly tâm ở 5000 vòng/ phút

các chủng và so sánh với đối chứng [33].

trong 15 phút, chiết dịch trong thì thu được enzym thô.

Trong đó môi trường có glucoza được coi là đối chứng dương (+) và môi


- Xác định hoạt tính các enzym ngoại bào bằng phương pháp khuếch tán trên

trường không có đường được coi là đối chứng âm (-).
- Nếu xạ khuẩn sinh trưởng mạnh bằng hoặc kém hơn đối chứng dương

thạch với một trong các nguồn cơ chất sau:
- Tinh bột tan (xác định hoạt tính amylaza)

một ít: có khả năng sử dụng loại đường đó. ký hiệu là (+).

- Cazein (xác định hoạt tính proteaza)

- Nếu xạ khuẩn sinh trưởng mạnh hơn đối chứng dương, ký hiệu là (++).

- CMC (xác định hoạt tính endoglucanaza).

- Nếu xạ khuẩn sinh trưởng bằng đối chứng âm hoặc không mọc: không

Chuẩn bị môi trường cơ chất - thạch gồm: 20g thạch + 2 - 10g cơ chất, pha
môi trường trong 1000 ml nước. Thanh trùng ở 1 atm trong 30 phút. Đổ môi

có khả năng sử dụng loại đường đó, ký hiệu là (-).
- Nếu xạ khuẩn sinh trưởng tốt hơn đối chứng âm một ít nhưng kém

trường vào các đĩa Petri sao cho bề dày lớp thạch khoảng 3 mm. Dùng khoan

hơn đối chứng dương nhiều, ký hiệu là (±).

nút chai đục lỗ (d = 10 mm) trên lớp thạch cách nhau 40 mm. Nhỏ 0,2 ml


2.2.5. Lên men tạo kháng sinh

0

dung dịch enzym cần thử và 0,2 ml nước làm đối chứng, để ở tủ lạnh 4 C
0

khoảng 4 giờ, sau đó đặt vào tủ ấm 30 C trong 24 giờ [23].

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên



2.2.5.1. Lựa chọn môi trường lên men thích hợp
Xạ khuẩn được lên men trên các môi trường cơ bản (theo Porter) là:

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




-33-

-34-

A - 4, A - 4H, A - 9, ISP - 4, Gause - I và Gause - II. Sau 96 giờ nuôi cấy trên

Hòa tan cặn tế bào trong 0,8 ml TE 25S, lắc đều bằng vontex. Bổ sung


máy lắc 220 vòng/ phút ở nhiệt độ phòng. Xác định HTKS trong dịch lên men

40 µl lysozym, ủ ở 370C trong 90 phút (nồng độ cuối cùng của lysozym là

(phương pháp đục lỗ) và sinh khối (phương pháp khoanh giấy lọc) để chọn ra

2mg/ ml).

môi trường cơ bản phù hợp cho những nghiên cứu tiếp theo [34].
2.2.5.2. Ảnh hưởng của nguồn cacbon

Bổ sung 10 µl protease K, mix đều, thêm 60 µl 10% SDS, đảo nhẹ, ủ
1giờ ở nhiệt độ 550C (nồng độ cuối cùng của protease K là 0,18mg/ml, SDS

Bổ sung nguồn cacbon (%): Tinh bột tan 1 và 2; glucoza - 1,5; lactoza 1,5; sacaroza - 1,5; rỉ đường - 1,5; vào hỗn hợp dung dịch muối (dung dịch

là 0,5%).
Bổ sung 150 µl NaCl 5M, mix đều. Sau đó bổ sung 130 µl CTAB, mix
đều, ủ 10 phút ở 550C.

muối A) đã bổ sung 0,2 % (NH4)2SO4.
Bổ sung giống và lên men trên máy lắc tròn với tốc độ 220 vòng/ phút.

Đặt ở nhiệt độ phòng 5 phút, chia đều ra 2 ống eppendorf mới. Sau đó bổ

Sau 96 giờ lên men xác định HTKS trong dịch lên men bằng phương pháp

sung vào mỗi ống 700 µl chlorofom/ isoamyl alcohol, mix đều 15 phút. Ly

đục lỗ thạch.


tâm 9000 vòng/phút trong 20 phút để tách pha.

2.2.5.3. Ảnh hưởng của nguồn Nitơ

Chuyển dịch pha trên sang các eppendorf mới và bổ sung 0,6V

Bổ sung nguồn Nitơ (%): Cao nấm men, bột đậu tương, (NH4)2SO4 và

isopropanol, đảo nhẹ. Đặt trong tủ - 200C trong 30 - 40 phút. Ly tâm 9000

KNO3 vào hỗn hợp dung dịch muối đã bổ sung thêm 1,5% glucoza. Sau đó bổ

vòng/phút, rửa tủa bằng etanol 70%. Hòa tan DNA trong 100 µl TE.

sung giống rồi lên men và thử HTKS bằng phương pháp đục lỗ.

2.2.6.2. Khuếch đại gen rRNA - 16S bằng phản ứng PCR

2.2.6. Các phƣơng pháp sinh học phân tử trong phân lập gen 16S - rRNA

Nguyên tắc:

2.2.6.1. Tách chiết DNA của xạ khuẩn bằng đệm CTAB

PCR là phản ứng trùng hợp, cho phép khuếch đại một đoạn DNA cụ

Nguyên tắc:

thể lên hàng triệu lần nhờ sự xúc tác của DNA polymerase chịu nhiệt. Enzym


Phá vỡ thành tế bào của xạ khuẩn nhờ lyzozym. Loại bỏ protein khỏi

này có khả năng hoạt động ở nhiệt độ cao. Sự hoạt động của enzym được

DNA nhờ các enzym protease K. Phân tách các thành phần của tế bào sau khi

kiểm soát của một chu kỳ nhiệt xác định. Đoạn DNA được tổng hợp được

phá vỡ thành hai pha nhờ dung dịch đệm chlorofom: isoamyl alcohol (24:1):

giới hạn về mặt kích thước bởi một cặp mồi đặc hiệu.

pha trên chứa cặn tế bào, pha dưới chứa axit nucleic. Sau cùng, DNA được

Cặp mồi được sử dụng trong nghiên cứu có trình tự là:

tủa bằng ethanol tuyệt đối (đã được làm lạnh - 22), được làm khô và hòa tan

Trình tự mồi: Mồi xuôi 27

trong đệm TE [39].

Mồi ngược 1525

Tiến hành:

5' - agagtttgatcctggctcag - 3'
'


'

5 - aaaggaggtgatccagcc - 3

27- 47
1525 -1507

Tiến hành:

Lấy 1,5ml dịch nuôi cấy tế bào đem ly tâm tốc độ 3000 vòng/ phút trong
30 phút để thu cặn tế bào.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên



Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




-35-

-36-

Thành phần phản ứng
H2O
Buffer (10X)
dNTP (2,5mM)
Primer 1 (10pml)


- Nhuộm bản gel: Bản gel sau điện di được ngâm vào dung dịch thuốc

Chu kỳ nhiệt
3 phút

nhuộm EtBr nồng độ 2 g/ml trong khoảng 10 phút, lắc nhẹ trên máy lắc, sau

2,5µl 94 C

1 phút

đó soi gel trên đèn UV và chụp ảnh bằng máy chụp gel của hãng Bio - Rad.

2µl 640C

1 phút

2.2.7. Phương pháp xử lý số liệu

17,1µl 940C
0

0

1µl 72 C

Primer 2 (10pml)

1µl


ADN khuôn

1µl

Enzyme Taq

0,4µl

Tổng

25µl

0

4C

1 phút 30 giây
∞

Kết quả nghiên cứu được chúng tôi xử lý theo phương pháp thống kê
sinh học trên phần mềm Excel.

2.2.5.3. Phương pháp điện di trên gel agarose
Phương pháp điện di trên gel agrose được sử dụng để kiểm tra DNA
plasmid, kiểm tra các phân đoạn DNA được nhân bằng kỹ thuật PCR và kiểm
tra kết quả cắt giới hạn. Phương pháp này được chia làm một số bước như
sau:
- Chuẩn bị gel agarose: cân một lượng agarose tương ứng (tùy theo nồng
độ gel yêu cầu) vào trong dung dịch 100ml TAE 1X. Đun sôi bằng lò vi sóng,

để nguội xuống khoảng 500C rồi đổ dung dịch vào bản gel đã cài sẵn lược.
Sau khoảng 30 phút, đặt bản gel vào bể điện di và đổ dung dịch điện di TAE
ngập bản gel.
- Tra mẫu: lấy 1 - 2 g DNA pha loãng trong 16 l đệm TE, sau đó bổ
sung 4 l dye mầu. Một lượng DNA maker tương ứng cũng được tra vào bản
gel trước khi điện di.
- Điện di: Điện di tại hiệu điện thế không đổi 100V trong khoảng 20 - 30
phút. Quan sát sự di động của DNA từ cực âm sang cực dương thông qua dye
mầu.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên



Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




-37-

-38-

Chƣơng 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Phân lập và thuần khiết các chủng nấm gây bệnh trên chè
Từ các mẫu chè bị bệnh thu thập ở các khu vực khác nhau của tỉnh Thái
Nguyên, chúng tôi đã phân lập và thuần khiết được 3 chủng nấm được ký hiệu
Chủng CT - 1A


là CT - 1A, CT - 2E và CT - 5X.

Chủng CT - 2E

Các chủng nấm phân lập được đều có đặc điểm chung là: các sợi nấm
đều không có màu sắc, sợi nấm có vách ngăn (hình 3.1). Mỗi chủng nấm được
phân lập từ một mẫu chè có biểu hiện bệnh khác nhau. Kết quả được trình
bày trên bảng 3.1.
Bảng 3.1. Đặc điểm một số mẫu chè làm nguồn phân lập các chủng nấm
Ký hiệu chủng

Nguồn phân

nấm

lập

CT - 1A

CT - 2E

CT - 5X

Lá chè non

Lá chè non

Lá chè non

Biểu hiện bệnh

Chủng CT - 5X
Trên bề mặt lá và mép lá có nhiều

Hình 3.1. Ba chủng nấm phân lập từ các mẫu chè bị bệnh

đốm nâu

3.2. Phân lập và tuyển chọn xạ khuẩn

Vết bệnh có màu nâu sẫm, lúc đầu

3.2.1. Hoạt tính kháng nấm của các chủng xạ khuẩn

chỉ có chấm nhỏ màu đen, sau đó lan

Từ các mẫu đất lấy ở độ sâu 5 - 10 cm tại các địa điểm khác nhau thuộc

ra khắp lá.

tỉnh Thái Nguyên, chúng tôi đã phân lập và thuần khiết được 80 chủng xạ

Các lá bị xoăn, trên mặt lá có thể bị

khuẩn thuộc chi Streptomyces. Sau khi thử HTKS theo phương pháp khuếch

nhăn.

tán trên thạch với 3 chủng nấm CT - 1A, CT - 2E, CT - 5X, chúng tôi đã
tuyển chọn sơ bộ được 30 chủng trong tổng số 80 chủng xạ khuẩn có hoạt tính


Sau khi được tinh sạch, 3 chủng nấm trên được giữ trong ống thạch

kháng nấm ở các mức độ khác nhau, chiếm tỷ lệ 37,5%. So sánh với tỷ lệ

nghiêng trên môi trường Czapek và được sử dụng làm VSV kiểm định để

chủng xạ khuẩn kháng nấm gây bệnh đạo ôn đã công bố trước đây cùa Lê

tuyển chọn xạ khuẩn sau này.

Gia Hy và cộng sự [18], tỷ lệ chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng nấm gây
bệnh trên chè của chúng tôi có phần cao hơn.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên



Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




-39-

-40-

Bảng 3.2. Xạ khuẩn có hoạt tính kháng nấm theo nhóm màu
Nhóm màu
xạ khuẩn


Kết quả trên bảng 3.2 cho thấy: số lượng chủng có hoạt tính nhiều nhất

Các chủng có

Tỷ lệ chủng có

là nhóm trắng chiếm 36,7%, sau đó là nhóm xám - 26,7%, nhóm xanh -

HTKN

HTKN so với tổng

25,3%, nhóm hồng - 6,7% và ít nhất là các nhóm nâu và lục đều chiếm 3,3%.

Số lượng Tỷ lệ(%)

số (%)

Kết quả này của chúng tôi cũng phù hợp với những nghiên cứu của một số tác
giả trước đây [14],[18].

Trắng (Allbus)

11

36,7

13,7

Xám (Griseus)


8

26,7

10,0

Xanh (Azeureus)

7

23,3

8,6

xạ khuẩn với 3 chủng nấm gây bệnh trên chè có sự khác nhau (bảng 3.3).

Hồng (Roseus)

2

6,7

2,6

Bảng 3. 3. Tính đối kháng của xạ khuẩn với 3 chủng nấm gây bệnh trên chè

Nâu (Chromogenes)

1


3,3

1,3

Lục (Viridis)

1

3,3

1,3

Tổng cộng

30

100

37,5

Tỷ lệ các chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng nấm phân chia theo nhóm màu
của Shirling và Gottlieb [37]. Kết quả được thể hiện trên bảng 3.2 và hình 3.2.

Đồng thời chúng tôi cũng nhận thấy khả năng đối kháng của các chủng

3 chủng nấm gây bệnh chè

Chủng XK


Kháng cả

có HTKN

CT - 1A

CT - 2E

CT - 5X

Số lượng

9

16

13

4

Tỷ lệ (%)

30

53

43

13,3


3 chủng

Trong tổng số 30 chủng có hoạt tính kháng nấm, số chủng kháng nấm
CT - 2E là cao nhất, có 16 chủng (chiếm 53% ), tiếp theo là số chủng kháng
nấm CT - 5X, có 13 chủng (chiếm 43%) và ít nhất là chủng kháng nấm CT - 1A
có 9 chủng (chiếm 30%).

Hình 3. 2. Tỷ lệ các chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng nấm theo nhóm màu

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên



Hình 3.3. Tỷ lệ các chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng nấm

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên