BỘ Y TẾ
TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI

ĐẶNG THỊ LAN HƢƠNG
MSV : 1101236

NGHIÊN CỨU TINH CHẾ SAPONIN TỪ
DÂY THÌA CANH LÁ TO BẰNG NHỰA
MACROPOROUS D101

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ

HÀ NỘI – 2016


BỘ Y TẾ
TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI

ĐẶNG THỊ LAN HƢƠNG
MSV: 1101236

NGHIÊN CỨU TINH CHẾ SAPONIN TỪ
DÂY THÌA CANH LÁ TO BẰNG NHỰA
MACROPOROUS D101

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ
Người hướng dẫn:
PGS. NGƢT Trần Văn Ơn
Nơi thực hiện:
Bộ môn Thực vật
Trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội

HÀ NỘI - 2016


LỜI CẢM ƠN !
Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, trước tiên, em xin gửi lời cảm ơn chân
thành tới thầy giáo PGS.TS. Trần Văn Ơn, DS. Phạm Thị Linh Giang, TS. Trần
Văn Hân người đã trực tiếp hướng dẫn, chỉ bảo tận tình và giúp đỡ em hoàn thành
khóa luận này.
Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc toàn thể các thầy cô giáo, các anh chị kĩ thuật
viên, các bạn và các chị cùng làm trên bộ môn Thực vật đã tạo điều kiện thuận
lợi, giúp đỡ em hoàn thành khóa luận đúng thời hạn.
Em cũng xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo trƣờng Đại học Dƣợc Hà
Nội, những người đã dạy dỗ và chỉ bảo em tận tình trong suốt những tháng năm học
tập tại trường.
Cuối cùng, với lòng biết ơn vô hạn, em xin phép được gửi lời cảm ơn tới gia
đình, ngƣời thân, bạn bè đã động viên và hỗ trợ em trong suốt thời gian qua.
Do thời gian có hạn và trình độ bản thân còn hạn chế nên khóa luận không thể
tránh khỏi những thiếu sót. Vì vậy, em rất mong nhận được sự chỉ bảo tận tình của
các thầy cô và sự góp ý chân thành của bạn bè.
Em xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, tháng 04 năm 2016
Sinh viên:
Đặng Thị Lan Hƣơng


MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC BẢNG ..........................................................................................
DANH MỤC CÁC HÌNH ...........................................................................................
ĐẶT VẤN ĐỀ ............................................................................................................ 1

CHƢƠNG I. TỔNG QUAN ..................................................................................... 2
1.1. TỔNG QUAN VỀ LOÀI GYMNEMA LATIFOLIUM WALL. EX WIGHT ... 2
1.1.1. Đặc điểm thực vật và vị trí phân loại ........................................................... 2
1.1.3. Tác dụng sinh học ........................................................................................ 8
1.1.4. Các nghiên cứu phân lập acid gymnemic từ dây thìa canh ......................... 8
1.2. TỔNG QUAN VỀ PHƢƠNG PHÁP CHIẾT PHA RẮN ............................... 9
1.2.1. Nguyên tắc chiết pha rắn .............................................................................. 9
1.2.2. Vật liệu sử dụng ............................................................................................ 9
CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................... 13
2.1. ĐỐI TƢỢNG, NGUYÊN LIỆU, HOÁ CHẤT VÀ THIẾT BỊ NGHIÊN
CỨU .......................................................................................................................... 13
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu ................................................................................. 13
2.1.2. Nguyên liệu ................................................................................................. 13
2.1.3. Hoá chất, thiết bị, dụng cụ.......................................................................... 13
2.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU ............................................................................ 14
2.2.1. Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến khả năng hấp phụ hoạt chất trong
dịch chiết của hạt nhựa D101 ................................................................................... 14
2.2.2. Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình phản hấp phụ hoạt chất
trong dịch chiết của hạt nhựa D101 ......................................................................... 15
2.3.1. Phương pháp chiết xuất .............................................................................. 15
2.3.2. Phương pháp phân lập hoạt chất từ dịch chiết tổng sử dụng cột nhựa…..16
2.3.3. Phương pháp khảo sát quá trình hấp phụ acid gymnemic của hạt nhựa
D101 .......................................................................................................................... 17
2.3.4. Phương pháp khảo sát quá trình phản hấp phụ hoạt chất trong dịch chiết
của hạt nhựa D101 .................................................................................................... 18


2.3.5. Phương pháp bán định lượng gymnemagenin bằng HPTLC .................... 21
2.3.6. Phương pháp định tính saponin bằng sắc ký lớp mỏng .......................... 23
CHƢƠNG 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ............................ 25

3.1. ĐÁNH GIÁ PHƢƠNG PHÁP BÁN ĐỊNH LƢỢNG GYMNEMAGENIN
BẰNG HPTLC ........................................................................................................ 25
3.1.1. Độ đặc hiệu ................................................................................................. 25
3.1.2. Tính tuyến tính ........................................................................................... 25
3.1.3. Độ thích hợp của hệ thống ....................................................................... 26
3.2. KHẢO SÁT QUÁ TRÌNH HẤP PHỤ CỦA HẠT NHỰA D101 ................ 27
3.2.1. Tỷ lệ khối lượng hạt và thể tích dịch chiết.................................................. 27
3.2.2. Thời gian hấp phụ ....................................................................................... 29
3.3. KHẢO SÁT QUÁ TRÌNH PHẢN HẤP PHỤ HOẠT CHẤT TRONG
DỊCH CHIẾT CỦA HẠT NHỰA D101 ................................................................ 30
3.3.1. Dung môi phản hấp phụ ............................................................................. 30
3.3.2. Tỉ lệ chiều cao/đường kính khối hạt ........................................................... 32
3.3.3. Tốc độ và thể tích dung môi rửa giải .......................................................... 33
4.1. KẾT LUẬN ....................................................................................................... 39
4.2. KIẾN NGHỊ ...................................................................................................... 39
PHỤ LỤC ..................................................................... Error! Bookmark not defined.


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU - TỪ VIẾT TẮT
HPTLC:

High performance thin layer chromatography (Sắc ký lớp mỏng hiệu

năng cao)
TLC:

Thin layer chromatography (Sắc ký lớp mỏng)

DTCLT:


Dây thìa canh lá to (Gymnema latifolium Wall. ex Wight)

DTCLN:

Dây thìa canh lá nhỏ (Gymnema sylvestre (Retz) R. Br. Ex Schult.)

GA:

Acid gymnemic

BV:

Bed volume (thể tích khối hạt)

v/v/v:

volume/volume/volume (thể tích/thể tích/ thể tích)


DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng

Tên bảng
Cấu trúc hoá học, tính chất vật lývà tác dụng hạ đường huyết

Trang
6

1.1


tương ứngcủa các acid gymnemic phân lập được từ DTCLN

1.2

Thông số vật lý của hạt nhựa hấp phụ D101

10

2.1

Các dãy nồng độ của dung dịch mẫu chuẩn

21

3.1

Giá trị Rf và diện tích pic của các vết sắc ký

26

Hiệu suất hấp phụ gymnemagenin bởi nhựa D101 ở mỗi khối

27

3.2

3.3

3.4


3.5

lượng hạt khác nhau
Hiệu suất hấp phụ gymnemagenin sau mỗi khoảng thời gian khác

29

nhau
Hiệu suất phản hấp phụ gymnemageninkhi sử dụng dung dịch rửa

30

giải ở các nồng độ cồn khác nhau
Hàm lượng phần trăm gymnemagenin trong cắn khi sử dụng các
cột có tỷ lệ chiều cao/đường kính khối hạt khác nhau

32


DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình

Tên hình

1.1 Đặc điểm hình thái Gymnema latifolium Wall. ex Wight
Cấu trúc khung gymnemagenin thu được khi kiềm hoá các aglycon
1.2

5


5

Gymnema sylvestre (Retz) R. Br. ex Schult.
Định tính gymnemagenin trong các phân đoạn ethyl acetat trong

1.5

4

Gymnema sylvestre (Retz) R. Br. ex Schult.
Cấu trúc phần phần đường của các acid gymnemic phân lập được từ

1.4

3

của acid gymnemic
Cấu trúc phần aglycon của các acid gymnemic phân lập được từ

1.3

Trang

7

mẫu Gymnema latifolium Wall. ex Wight

3.1 Kết quả chồng pic của mẫu thử, mẫu chuẩn và mẫu trắng


25

3.2 Mối liên hệ giữa nồng độ và diện tích pic

26

3.3

3.4

3.5

3.6

3.7

Mối liên hệ giữa khối lượng hạt/50 ml dịch chiết và hiệu suất hấp

28

phụ gymnemagenin (%Hhp)
Mối liên hệ giữa hiệu suất gymnemagenin hấp phụ (%Hhp) và thời

29

gian hấp phụ
Hiệu suất gymnemagenin phản hấp phụ (%Hphp) khỏi nhựa D101 khi

31


sử dụng dung dịch cồn ở các nồng độ khác nhau
Mối liên hệ giữa thể tích rửa giải và tổng diện tích pic khi rửa giải

33

với tốc độ 2BV/h
Mối liên hệ giữa thể tích rửa giải và tổng diện tích pic khi rửa giải
với tốc độ 4BV/h

34


1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Dây thìa canh lá nhỏ (Gymnema sylvestre (Retz.) R. Br. Ex Schult.) từ lâu đã
được biết đến rộng rãi với tác dụng hạ đường huyết và kiểm soát béo phì [29]. Giai
đoạn gần đây, một loài dây thìa canh khác là dây thìa canh lá to (Gymnema
latifolium Wall. ex Wight) đã được khẳng định có kết quả tốt hơn khi thử tác dụng
hạ đường huyết trên cùng một mô hình với dây thìa canh lá nhỏ (Gymnema
sylvestre (Retz) R. Br. Ex Schult.) [6].
Ở Việt Nam, dây thìa canh đã được thương mại hoá dưới nhiều dạng bào chế
như trà túi lọc, viên nang để hỗ trợ điều trị cho bệnh nhân đái tháo đường. Tuy
nhiên, các sản phẩm đều chỉ đi từ nguyên liệu ban đầu là dược liệu thô hoặc dịch
chiết tổng chưa qua tinh chế do chưa tìm thấy một quy trình phân lập phù hợp [2].
Gần đây, các loại nhựa macroporous được tập trung nghiên cứu trong việc tinh
chế dịch chiết thô trong cả quy mô phòng thí nghiệm lẫn quy mô công nghiệp [38],
vì tính đặc hiệu, hiệu suất cao, chi phí vận hành thấp, sử dụng ít dung môi độc hại
và dễ tái sử dụng [24], [40], [41]. Đặc biệt, tác giả Wu và cộng sự đã có nghiên cứu
cho kết quả hết sức khả quan khi phân lập tổng phân đoạn saponin trong DTCLN

(Gymnema sylvestre(Retz) R. Br. Ex Schult.) với một loại hạt macroprous phổ biến
là D101 [39].
Vì vậy, nhằm bước đầu xây dựng một phương pháp phân lập acid gymnemic
hiệu quả, kinh tế và có tính thực tiễn, đề tài: “Nghiên cứu tinh chế saponin từ dây
thìa canh lá to bằng nhựa macroporous D101” được tiến hành nghiên cứu với
mục tiêu: Khảo sát và lựa chọn một số điều kiện hấp phụ, phản hấp phụ acid
gymnemic từ dịch chiết tổng của dây thìa canh lá to (Gymnema latifolium Wall. ex
Wight) sử dụng nhựa macroporous D101.


2

CHƢƠNG I. TỔNG QUAN
1.1. TỔNG QUAN VỀ LOÀI GYMNEMA LATIFOLIUM WALL. EX WIGHT
1.1.1. Đặc điểm thực vật và vị trí phân loại
1.1.1.1. Vị trí phân loại
Theo hệ thống phân loại của Takhtajan công bố năm 2009 [33], DTCLT
(Gymnema latifolium Wall. ex Wight) có vị trí phân loại như sau:
Ngành Ngọc lan (Magnoliophyta)
Lớp Ngọc lan (Magnoliopsida)
Phân Lớp Bạc hà (Lamiidae)
Bộ Long đởm (Gentianales)
Họ Trúc đào (Apocynaceae)
Phân họ Thiên lý (Asclepiadoideae)
Chi Gymnema R.Br.
Loài Gymnema latifolium Wall. ex Wight
Ở Ấn Độ, DTCLT (Gymnema latifolium Wall. ex Wight) còn được biết đến
với các tên đồng nghĩa khác là Gymnema khandalense và Gymnema
Kollimalayanum [34].
Phân bố: Đảo Andaman và Nicobar, Bangladesh, Trung Quốc (Quảng

Đông, Quảng Tây, Vân Nam), Ấn Độ

(Arunachal

Pradesh, Assam, Kerala,

Maharashtra, Tamil Nadu), Myanmar, Thái Lan [34], Việt Nam (Cúc Phương, Hoà
Bình, Thái Nguyên) [9].
1.1.1.2. Đặc điểm thực vật
Dây leo, dài lên tới 7-10 m. Toàn thân có nhựa mủ màu vàng tươi. Thân non
đường kính 1-3 mm, phủ lông màu hung đỏ, dày đặc ở ngọn; thân bánh tẻ có lỗ bì
và lông thưa; thân già có bần hóa xốp có khía dọc; lóng thân từ 4-18 cm [5].
Lá đơn, nguyên, mọc đối; cuống lá 3-5 cm, phủ lông dày; phiến lá hình bầu
dục, dài 10-14 cm, rộng 5-8 cm; gốc lá tròn, có khi hơi lõm hoặc hơi lệch; mép lá
nguyên; ngọn lá nhọn; mặt trên xanh thẫm, phủ lông ráp; mặt dưới màu xanh hơi


3

vàng, phủ lông ráp. Lá non có lông dày, mềm; lá bánh tẻ ráp do lông cứng, nhiều
hơn ở mặt dưới lá, dày hơn ở phần gân lá; lá già có màu vàng đặc trưng [5].
Cụm hoa xim dạng đầu thành từng đôi ở mấu, có lông dày đặc. Một cụm mang
rất nhiều hoa, mùi thơm. Cuống cụm hoa 1-1,5 cm, cuống hoa 3-8 mm. Đài hình
trứng, phủ lông măng. Tràng hoa vàng, hình chuông, nhẵn ở mặt ngoài. Ống hoa
có 5 cặp gờ mang lông ở họng tràng, các thùy hình trứng, khoảng 1,2×1,2 mm,
phủ lông dày đặc hướng trục, ngắn hơn so với ống tràng [9].
Trụ nhị nhụy dạng hình trụ, phần phụ nhị dạng màng ngắn hơn so với đầu
núm nhụy. Khối phấn hình thuôn. Đầu núm nhụy hình nón, đỉnh phân đôi.
Quả đại hình mác nhọn, mũi cong, 4,5-5,5×1,5-2 cm, có lông dày đặc. Hạt
hình trứng thuôn, dài khoảng 1,1 cmx5 mm, mép dạng màng; mào lông dài 3 cm[9].


Hình 1.1. Đặc điểm hình thái Gymnema latifolium Wall. ex Wight [9]
(b) Dạng sống; (c) Cụm hoa; (d) Mặt trên lá; (e) Mặt dưới lá; (f) Cụm
hoa xim; (g) Lá bắc của cụm hoa; (h) Một hoa nguyên vẹn; (i) Đài; (j) Tràng;
(k) Trụ nhị nhụy; (l) Thể truyền phấn; (m) Bộ nhụy; (n) Quả


4

1.1.2. Thành phần hoá học
Cho đến nay, các nghiên cứu về thành phần hoá học vẫn đang tập trung vào
loài Gymnema sylvestre (Retz) R. Br. Ex Schult. (DTCLN). Theo đó, lá của
DTCLN có chứa triterpen saponin thuộc nhóm oleanan (acid gymnemic và
gymnema-saponin) và nhóm dammaran (gymnemaside) [32], [35].
Ngoài ra, trong dịch chiết nước và dịch chiết cồn của DTCLNcòn có flavon,
anthraquinon, hentri-acontane, phytin, resin, acid tartaric, acid formic, acid butyric,
lupeol, β-amyrin, stigmasterol [23], [36], α và β cholorphyl, inositol, d-quercitol,
alkaloid [10], [23].
Trong đó, thành phần tạo nên tác dụng chính được xác định là acid gymnemic,
đây là tên chung của các acid hữu cơ thuộc nhóm saponin triterpenoid khung olean
[11]. Về bản chất, acid gymnemic không phải là một chất tinh khiết mà là một hỗn
hợp các chất.
Trong hàng chục năm, nhiều các nghiên cứu đã được tiến hành để làm sáng tỏ
cấu trúc hoá học của hỗn hợp các chất đươc gọi là “acid gymnemic”. Về cơ bản, các
tác giả đều đưa ra kết luận chung rằng cấu thành của acid gymnemic cũng như các
glycoside thông thường đều gồm có phần đường và phần aglycon. Ngoài ra, khi tiến
hành kiềm hoá các aglycon sẽ thu được khung gymnemagenin và hỗn hợp các acid
[36],[ 37].

Hình 1.2. Cấu trúc khung gymnemgagenin thu đƣợc

khi kiềm hoá các aglycon của acid gymnemic
Trong một nghiên cứu gần nhất và đầy đủ nhất, từ dịch chiết nóng lá cây
DTCLN, Yoshikawa và cộng sự đã phân lập và xác định được cấu trúc hoá học của


5

18 gymnemic acid (đánh số từ I ,đến XVIII), thêm vào đó là môt loạt các nghiên
cứu về một số tính chất vật lý như khối lượng phân tử, nhiệt độ nóng chảy và các
tác dụng dược lý đã được tác giả Giovanni Di Fabio và cộng sự tổng hợp lại trong
tài liệu “Triterpenoids from Gymnema sylvestre and Their Pharmacological
Activities” (2014). Các kết quả được mô tả trong các hình 1.3, hình 1.4 và bảng 1.1.

Tig = Tigloyl

Mba = 2-methylbutyroyl

Bz

Hình 1.3. Cấu trúc phần aglycon trong phân tử acid gymnemic [19]

Hình 1.4. Cấu trúc phần đƣờng trong phân tử acid gymnemic [19]


6

Bảng 1.1. Cấu trúc hoá học, tính chất vật lý và tác dụng hạ đƣờng huyết tƣơng
ứngcủa các acid gymnemic phân lập đƣợc từ DTCLN [19]
Khôi


Tên

R1

GA

R2

R3

R4

R5

R6

lƣợng
phân tử

Nhiệt độ

TD*

nóng chảy

I

GlcA

H


OH

OAc

OH

OTig

806,97

211–212

1

II

GlcA

H

OH

OAc

OH

OMba

808,99


212–213

1

III

GlcA

H

OH

OH

OH

OMba

766,95

218–219

0,5

IV

GlcA

H


OH

OH

OH

OTig

764,94

210–221

0,25

V

GlcA

H

OH

OH

OTig OTig

847,04

202–203


0,5

VI

A

H

OH

OH

OH

OTig

927,08

225–226

0,5

VII

GlcA

H

OH


OH

H

OH

666,84

222–223

(-)

VIII

B

H

OH

OH

OH

OMba

927,08

218–220


(-)

IX

B

H

OH

OH

OH

OTig

925,06

222–224

(-)

X

GlcA

H

OH


OAc

OH

OH

724,86

210–212

0,5

XI

GlcA

H

OH

OTig

OH

OTig

874,04

190–192


1

XII

A

H

OH

OAc

OH

OTig

968,50

209–211

1

XIII

GlcA

H

OH


OMba OH

OH

766,95

185–187

0,5

XIV

GlcA

H

OH

OTig

OH

OH

764,94

194–196

0,5


XV

GlcA

H

OH

OH

OTig OMba

849,06

/

1

XVI

GlcA

H

Tig

OH

OTig OH


847,04

203–205

1

XVII

GlcA

H

OH

OH

OH

OBz

786,94

211–213

1

XVIII GlcA

H


OH

OBz

OH

OH

786,94

201–203

1

Ghi chú: TD*: tác dụng hạ đường huyết×tác dụng hạ đường huyết cuả acid
gymnemic I; (-): không phát hiện được.


7

Cho đến nay, rất ít các tài liệu nào trên thế giới công bố về các hợp chất
được phân lập từ Gymnema latifolium Wall. Ex Wight. (DTCLT), chỉ có một số
nghiên cứu ở Việt Nam tập trung vào loài này và đưa ra một số kết quả như sau:
Bằng các phản ứng hóa học định tính, trong dược liệu lá cây DTCLT xác định
được sự có mặt của các nhóm chất: saponin, flavonoid, coumarin, tanin, chất béo,
đường khử, acid amin, acid hữu cơ. Trong đó, saponin và flavonoid là 2 nhóm chất
chính của dược liệu [3], [5], [8]. Hàm lượng saponin trung bình trong dược liệu là:
5,60% ± 0,11 [5].
Dịch chiết DTCLT sau khi thuỷ phân bằng acid và kiềm cho thấy có pic tương

ứng với pic của chất chuẩn gymnemagenin trên sắc ký đồ sau khi triển khai bằng kỹ
thuật sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao (HPTLC) (Hình 1.5) [9].

Hình 1.5. Định tính gymnemagenin trong các phân đoạn
ethyl acetat trong mẫu Gymnema latifolium Wall. ex Wight [9]
Tác giả Nguyễn Thị Thu Hiền đã tiến hành bán định lượng hàm lượng
gymnemagenin trong 5 mẫu dịch chiết thủy phân của DTCLT được thu hái ở các
địa phương khác nhau bằng phương pháp HPTLC, kết quả hàm lượng
gymnemagenin trong các mẫu dao động từ 0,048% đến 0,163%, trong đó cao nhất
là mẫu thu hái ở Hoà Bình với hàm lượng 0,163% [4]. Vào năm 2014, tác giả Trần
Thị Oanh đã phân lập được 2 acid gymnemiclà acid gymnemic I và acid gymnemic
IV trong dịch chiết ethanol 96% bằng phương pháp HPLC [5].


8

1.1.3. Tác dụng sinh học
1.1.3.1. Tác dụng hạ đường huyết
Theo tác giả Trần Văn Ơn, Phùng Thanh Hương và cộng sự (2011), dịch chiết
lá DTCLT ở Việt Nam có tác dụng hạ đường huyết trên cá thể chuột bình thường
(24,07%) cao nhất sau 4 giờ, kéo dài đến 5 giờ và trên chuột gây tăng đường huyết
bởi Streptozotocin (36,31%) sau 10 ngày cho uống dịch chiết. Liều dùng thích hơp
lá dây thìa canh là cắn toàn phần được pha thành hỗn dịch trong nước cất với tỉ lệ
1:1, với liều 0,5ml/25g, tương ứng với 10g lá khô/kg thể trọng [6]. Kết quả thử
nghiệm cho thấy tác dụng hạ đường huyết của dịch chiết lá DTCLT mạnh hơn
DTCLN.
Ngoài các công bố trên, hiện nay trên thế giới cũng như ở Việt Nam chưa có
một công bố chính thức nào về tác dụng sinh học của DTCLT.
1.1.3.2. Tác dụng kháng khuẩn
Các nhà khoa học nhận thấy Gymnema kollimalayanum A. Ramachandran &

M. B. Wiswan (tên gọi khác của Gymnema latifolium Wall. Ex Wight) có tác dụng
kháng khuẩn trên cả chủng gram âm(Klebsiella pneumonia, Proteus vulgaris,
Salmonella

paratyphi,

Shigella

boydi,

S.

brunci,

S.

dysentriae,

Vibrio

parahaemolyticus, Yersiniaenterocolitica, Escherichia coli) và gram dương
(Cornybacterium

diptheriae,

Enterococus

faccalis,

Staphylococcus


aureus,

Streptococci pneumonia, Bacillus subtilis) [12], [16], [28].
1.1.4. Các nghiên cứu phân lập acid gymnemic từ dây thìa canh
Cho đến nay, các nghiên cứu phân lập acid gymnemic chủ yếu đều tiến hành
trên loài DTCLN. Trong đó phương pháp phổ biến được dùng trong rất nhiều
nghiên cứu để chiết xuất saponin triterpenoid mà thành phần chính là acid
gymnemic là phương pháp tạo tủa GS4 [14], [45], [44].
Ở Việt Nam, vào năm 2010, tác giả Nguyễn Hương Giang đã tối ưu hoá quy
trình tạo tủa GS4 từ DTCLN và quy trình thu được là như sau: Dịch chiết bằng
EtOH 60% sau khi được loại nhựa bằng dung môi thích hợp, nhỏ từ từ H2SO4 5%
vào cao 1:2 cho tới pH=3, vừa nhỏ vừa khuấy đều, dung dịch sẽ tạo tủa (GS3), ly


9

tâm thu tủa. Tủa tạo thành tiếp tục hoà tan trong dung dịch KOH 0,1M tới pH=11.
Nhỏ từ từ H2SO4 5% cho tới pH=3, vừa nhỏ vừa khuấy đều, dung dịch sẽ tạo tủa
(GS4), ly tâm thu và sấy tủa đến khối lượng không đổi [2].
Phương pháp này sử dụng dung dịch acid và base khó áp dụng vào trong quy
mô công nghiệp.
1.2. TỔNG QUAN VỀ PHƢƠNG PHÁP CHIẾT PHA RẮN
1.2.1. Nguyên tắc chiết pha rắn
Chiết pha rắn (Solid Phase Extraction – SPE) là một kỹ thuật chiết tách dựa
trên nguyên tắc chung của kỹ thuật sắc ký, trong đó pha động là pha lỏng và pha
tĩnh là các hạt rắn. Trong rất nhiều các phương pháp dùng để tách và làm giàu các
hoạt chất thiên nhiên (chiết lỏng-lỏng, chiết pha rắn, kết tủa, cộng kết, sắc ký,...),
chiết pha rắn có các ưu điểm vượt trội so với các phương pháp khác như độ chọn
lọc, hệ số làm giàu cao, sử dụng ít dung môi, thao tác đơn giản, dễ tự động hoá và rẻ

tiền.
Theo bản chất tương tác với chất phân tích, các loại hạtsử dụng trong kĩ thuật
chiết pha rắn được phân loại thành các loại như: hạt hấp phụ (tương tác phân cực –
phân cực, liên kết hydro, tương tác lưỡng cực – lưỡng cực), hạt trao đổi ion (lực
tĩnh điện), hạt rây phân tử (lọc chất phân tích theo kích thước phân tử).
1.2.2. Vật liệu sử dụng
1.2.2.1. Tổng quan về hạt hấp phụ macroporous
a. Định nghĩa và phân loại
Hạt hấp phụ macroporous là hạt polymer hình cầu, màu trắng, có cấu trúc xốp
với các lỗ xốp tương đối rộng (đường kính lỗ xốp >50 Å) [30] có thể cho các phân
tử lớn đi qua; hấp phụ nhờ lực liên kết tự do Vander Waals hoặc liên kết hydro [22].
Nhựa hấp phụ có thể được chia làm hai loại chính: Không phân cực và phân
cực. Trong đó hạt phân cực có thể được chia nhỏ hơn thành phân cực yếu, phân cực
trung bình và phân cực mạnh [18].
b. Đặc điểm hạt hấp phụ macroporous


10

Vì bản chất là hạt hấp phụ nên ba đặc tính quan trọng đặc trưng cho khả năng
hấp phụ của các hạt macroporous là tổng diện tích bề mặt (bề mặt bên trong và
ngoài), đường kính lỗ xốp và độ phân cực bề mặt. Diện tích bề mặt hạt khô thường
nằm trong khoảng từ 100 đến 1000

/g, đường kính lỗ xốp khoảng từ 100 đến 300

Å.
Độ phân cực của hạt thường được rải đều từ không phân cực, phân cực yếu,
trung bình và mạnh tuỳ theo monomer được sử dụng trong quá trình polymer hoá
hoặc các xử lý hoá học sau quá trình polymer hoá.

Đường kính lỗ xốp và diện tích bề mặt được quyết định bởi cấu trúc hình học
hạt, cấu trúc này được kiểm soát dựa vào thành phần các chất hoá học sử dụng trong
hỗn hợp đem polymer hoá (ngoài các monomer để tổng hợp polymer, để tạo ra các
lỗ xốp nhà sản xuất còn thêm các chất gọi là porogens, có thể trộn lẫn với hỗn hợp
monomer, không hoà tan polymer, có khả năng bay hơi ở những điều kiện nhất định
sau khi kết thúc quá trình polymer hoá để lại những lỗ hổng trong cấu trúc polymer)
[13], [25], [27].
Một số loại hạt macroporousphổ biến trên thị trường và các đặc tính cơ bản
của chúng đã được tóm tắt và thống kê trong phần phụ lục (Bảng PL1).
1.2.2.2. Tổng quan về hạt nhựa macroporous D101
a. Thông số vật lý
Bảng 1.2. Thông số vật lý của hạt nhựa hấp phụ D101*
Hình dạng

Hạt hình cầu, màu trắng đục

Độ phân cực

Không phân cực

Độ ẩm (%)

65%-75%

Trọng lƣợng riêng bão hoà

1,05-1,10g/mL

Trọng lƣợng biểu kiến bão hoà 0,65-0,75g/mL
Diện tích bề mặt


480-520m2/g

Đƣờng kính lỗ xốp trung bình

9-10nm


11

Khoảng đƣờng kính hạt nhựa

0,3-1,25mm

*Số liệu do nhà sản xuất nhựa Liji Tech Co.,Ltd cung cấp.
b. Cơ chế hấp phụ
Nhựa D101 là hạt hấp phụ pha đảo, bản chất là polyme SDVB (styrene
divinylbenzene) không phân cực, sẽ tạo liên kết Vanderwaals với các saponin phân
cực yếu trong dịch chiết tổng của DTCLT đã qua xử lý, nên có khả năng hấp phụ
phân tử saponin.
Ngoài ra, tỉ lệ tối ưu giữa đường kính lỗ xốp của hạt nhựa macroporous với
đường kính phân tử hấp phụ là trong khoảng từ 2 đến 6 [30]. Nếu đường kính lỗ
xốp quá nhỏ thì quá trình chất hấp phụ đi vào trong lỗ xốp rất khó, tuy nhiên, nếu
đường kính lỗ xốp quá lớn thì thì chất hấp phụ dễ dàng đi ra khỏi bề mặt hấp phụ.
Thêm vào đó, đường kính lỗ xốp lớn sẽ làm giảm diện tích bề mặt hấp phụ nên làm
giảm dung lượng hấp phụ. Đường kính phân tử flavonoid và glycosid thường nằm
trong khoảng từ 1nm đến 2nm [30], trong khi đó đường kính lỗ xốp trung bình của
D101 là khoảng 10 nm, do vậy nên có khả năng hạt D101 có dung lượng hấp phụ
saponin cao.
c. Ứng dụng trong tách chiết saponin

Trong hai thập kỷ gần đây, hạt nhựa macroporous được nghiên cứu phát triển
và sử dụng rất rộng rãi. Các ứng dụng chủ yếu của hạt nhưa này là: lọc đường, hấp
phụ dầu khí [15], xử lý nước [17], tách và làm giàu các hoạt chất thiên nhiên, tinh
chế các sản phẩm sinh học [30].
Trong đó, hạt nhựa D101 được ứng dụng để tách phân đoạn cho một loạt các
nhóm chất thiên nhiên như saponin, flavon, alkaloid, chất màu [30].Wang Hong và
cộng sự đã sử dụng nhựa D101, và một số nhựa macroporous khác như DA20111,
D3520, AB8,…để nghiên cứu và tối ưu hoá việc tách và tinh chế saponin toàn phần
từ Sơn thù du (Cornus officinalis). Kết quả thu được hàm lượng saponin toàn phần
là 2,49%, cao hơn so với phương pháp tách chiết bằng dung môi hữu cơ là 2,19%.
Nghiên cứu còn chứng minh nhựa hấp phụ còn cho hiệu quả tốt trong việc loại bỏ
đường hoà tan trong nước và các tạp chất khác [21].


12

Vào năm 2015, Rui-Bing Feng và các cộng sự đã sử dụng hạt D101 để tách
tổng phân đoạn saponin triterpenoid trong cây Khổ đinh trà (Ilex latifolia Thunb.),
sau đó đem các phân đoạn sau rửa giảithử tác dụng sinh học. Sau khi hấp phụ hết
dịch chiết tổng qua cột D101 và rửa giải lần lượt ra các phân đoạn nước, EtOH
45%, EtOH 75% và EtOH 96%; đã xác định sự có mặt của các saponin triterpenoid
ở phân đoạn EtOH 75% [20].
Trong một nghiên cứu khác tiến hành phân lập tổng saponin từ cây Giảo cổ
lam (Gynostemma pentaphyllum), sau khi phân lập bằng hạt D101, hàm lượng phần
trăm của tổng saponin/cắn tăng từ 26,2% lên đến 83% [26].
Gần với loài mà chúng ta đang tiến hành nghiên cứu nhất, năm 2006, một
nhóm nghiên cứu thuộc trường đại học Jiangsu Trung Quốc đã nghiên cứu việc tinh
chế tổng saponin triterpenoid trong DTCLN bằng hạt nhựa hấp phụ. Nhóm tác giả
đã nghiên cứu dung lượng hấp phụ saponin của các hạt D101, NKA và AB-8 và sau
đó là các thông số ảnh hưởng đến quá trình tinh chế. Kết quả cho thấy hạt D101 có

dung lượng hấp phụ cao nhất trong các hạt, là 93,90 mg/g, thời gian đạt cân bằng
hấp phụ là sau 8 giờ, nồng độ dịch hấp phụ tối ưu là 7,73 g/l với dung môi rửa giải
là EtOH 50%. Độ tinh khiết của saponin sau tinh chế là 56,10% với tỉ lệ giải hấp
phụ là 83,83% [39].
Nhìn chung, phương pháp tách chiết dung môi thông thường có chi phí cao,
quá trình phức tạp, đăc biệt là việc sử dụng chiết xuất bằng dung môi hữu cơ rất khó
áp dụng trong sản xuất thực tế. Quy trình sử dụng nước – ethanol và nhựa hấp phụ
không chỉ đơn giản, tiết kiệm mà sản lượng sản phẩm và chất lượng còn được cải
thiện đáng kể [21]. Và qua nhiều nghiên cứu đã chứng minh, hạt D101 có thể ứng
dụng tốt để phân lập saponin trong các dịch chiết dược liệu.


13

CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. ĐỐI TƢỢNG, NGUYÊN LIỆU, HOÁ CHẤT VÀ THIẾT BỊ NGHIÊN
CỨU
2.1.1. Đối tƣợng nghiên cứu
Mẫu dây thìa canh lá to (Gymnema latifolium Wall. ex Wight) được thu hái
Thái Nguyên, đã được giám định tên khoa học và lưu giữ mẫu tại bộ môn Thực vật
– Trường Đại học Dược Hà Nội.
2.1.2. Nguyên liệu
Hạt nhựa hấp phụ D101 nguồn gốc từ Trung Quốc.
2.1.3. Hoá chất, thiết bị, dụng cụ
2.1.3.1. Hoá chất
 Ethanol 96% (Trung Quốc).
 Methanol (Merck).
 HCl (Trung Quốc).
 KOH (Thái Lan).
 Acid formic (Trung Quốc)

 Toluen (Merck).
 Ethyl acetat.
 Gymnemagenin chuẩn (96,5%, Merck).
 Chloroform (Trung Quốc).
 Vanillin (Trung Quốc).
 Acid sulfuric đặc (Trung Quốc).
2.1.3.2. Thiết bị, dụng cụ
Máy móc
 Máy siêu âm Ultrasonic LC60H (Đức): Công suất P= 400W,tần số f = 35
kHz.
 Tủ sấy Memmert (Đức).
 Cân kỹ thuật điện tử Sartorius BP 20015 (Đức).
 Cân phân tích Mettler Toledo AB204-S ( Thụy Sỹ).


14

 Máy cất quay chân không Büchi B-490 và R-220 (Thụy Sỹ).
 Máy Linomat 5.0.
 Máy Camag Reprostar 3.
 Phần mềm winCATS.
 Phần mềm Video Scan.
 Máy khuấy từ Heidolph MR3001 (Đức).
 Máy ly tâm Eppendorf 5114r.
Dụng cụ
 Bình cầu 500 ml.
 Cốc thủy tinh loại 100 ml, 250 ml, 500 ml, 1000 ml.
 Bình định mức 10 ml, 50 ml.
 Pipet 1 ml, 2 ml, 5 ml, 10 ml.
 Ống đong 25 ml, 50 ml, 100 ml, 1000 ml.

 Giấy lọc.
 Cột 4,5x50 cm, 1,8x30 cm, 2,2x30 cm.
 Phễu thuỷ tinh.
2.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
2.2.1. Khảo sát một số yếu tố ảnh hƣởng đến khả năng hấp phụ hoạt chất trong
dịch chiết của hạt nhựa D101
2.2.1.1.Khảo sát tỷ lệ khối lượng hạt và thể tích dịch chiết
Khảo sát hiệu suất hấp phụ acid gymnemic từ dịch chiết đã qua xử lý (đánh
giá thông qua chất đánh dấu gymnemagenin) khi hấp phụ cùng một thể tích dịch
chiết với các khối lượng hạt khác nhau.
2.2.1.2. Khảo sát thời gian hấp phụ
Khảo sát hiệu suất hấp phụ acid gymnemic từ dịch chiết đã qua xử lý (đánh
giá thông qua chất đánh dấu gymnemagenin) khi ngâm hạt D101 với dịch hấp phụ
sau các khoảng thời gian khác nhau.


15

2.2.2. Khảo sát một số yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình phản hấp phụ hoạt
chất trong dịch chiết của hạt nhựa D101
2.2.2.1. Khảo sát dung môi phản hấp phụ
Khảo sát hiệu suất phản hấp phụ acid gymnemic từ dịch chiết đã qua xử lý
(đánh giá thông qua chất đánh dấu gymnemagenin) khi lần lượt tiến hành phản hấp
phụ bằng các dung môi có độ phân cực khác nhau từ EtOH và nước.
2.2.2.2. Khảo sát tỉ lệ chiều cao/đường kính cột
Khảo sát hàm lượng phần trăm acid gymnemic/cắn (đánh giá thông qua chất
đánh dấu gymnemagenin) sau khi phân lập bằng cột có các tỉ lệ chiều cao/đường
kính khối hạt khác nhau.
2.2.2.3. Khảo sát tốc độ và thể tích dung môi rửa giải
Khảo sát thể tích dung môi rửa giải lấy được hết chất khi tiến hành rửa giải với

2 tốc độ rửa giải 2BV/h (tương đương 120 ml/h) và 4BV/h (tương đương 240 ml/h).
2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3.1. Phƣơng pháp chiết xuất
Tham khảo theo tài liệu [2], bột dược liệu DTCLT được chiết xuất bằng
phương pháp ngâm ở nhiệt độ phòng được tiến hành cụ thể theo các bước như sau:
2.3.1.1. Chuẩn bị nguyên liệu
Dược liệu DTCLT được cắt nhỏ, sấy khô ở nhiệt độ 60˚C đến hàm ẩm < 10%,
xay tới bột thô và bảo quản trong túi ni lông kín.
2.3.1.2. Chiết dược liệu
Cân một lượng xác định bột dược liệu, thấm ẩm bằng EtOH 60% trong 2 giờ
cho dược liệu trương nở hoàn toàn rồi nạp vào thiết bị chiết.
Lót một lớp bông thấm nước lên trên ống thoát dịch chiết để bột dược liệu
không gây tắc bình và lẫn vào dịch chiết. Sau đó đặt giấy lọc đã cắt vừa vặn vào đáy
bình. Cho bột dược liệu đã được thấm ẩm vào bình, vừa cho vừa san đều và nén
nhẹ. Đổ từ từ dung môi EtOH 60% vào bình chiết cho tới khi dịch chiết bắt đầu
chảy ra thì khoá lại. Tiếp tục bổ sung dung môi cho đến khi ngập bề mặt dược liệu
khoảng 3-4 cm (600 ml đối với 100g dược liệu). Ngâm trong 24 giờ. Hết thời gian


16

ngâm, mở khoá thu lấy dịch chiết. Bổ sung dung môi và tiến hành chiết ngâm thêm
2 lần với cùng lượng dung môi và thời gian tương tự. Gộp các dịch chiết thu được
dịch chiết EtOH 60%.
2.3.2. Phƣơng pháp phân lập hoạt chất từ dịch chiết tổng sử dụng cột nhựa
D101
2.3.2.1. Phương pháp xử lý dịch chiết dược liệu
- Dịch chiết EtOH 60% được cô cất quay chân không ở nhiệt độ 60˚C, sau đó
cô cách thuỷ dịch chiết trong tủ hút cho đến cắn.
- Phân tán cắn của dịch chiết EtOH 60% trong nước cất với tỉ lệ 5 ml nước

cất/1g dược liệu, lọc qua giấy lọc thu được dịch chiết sau xử lý (có nồng độ
gymnemagenin khoảng 0,2 mg/ml).
2.3.2.2. Phương pháp chạy cột
- Chuẩn bị nhựa hấp phụ D101: Ngâm nhựa D101 trong 2 bed volume (BV)
EtOH 96% trong 24 giờ, sau khi trương nở hoàn toàn, rửa lại hạt nhựa với một lượt
cồn. Cuối cùng rửa với nước cất cho đến khi hết mùi cồn. Bảo quản hạt trong nước
cất [31]. Công thức tính BV:
BV (ml) = L x π x r2
Trong đó: + L: Chiều cao khối hạt (cm).
+ r: bán kính khối hạt (cm).
- Chuẩn bị cột: Cột thuỷ tinh có khoá và nút mài, đường kính và chiều dài xác
định, rửa sạch, sấy khô, cố định trên giá theo chiều thẳng đứng, lót một lớp bông
thuỷ tinh ở đáy cột.
- Hấp phụ: Ngâm một lượng xác định hạt D101 trong một lượng xác định dịch
hấp phụ trong một khoảng thời gian xác định tuỳ theo từng nghiên cứu cụ thể.
- Nhồi cột: Rót từ từ dịch hấp phụ ngâm nhựa lên cột, vừa rót vừa gõ nhẹ để
đuổi hết bọt khí.
- Phản hấp phụ: Rửa cột bằng các dung môi phản hấp phụ và tốc độ dòng
khác nhau tuỳ theo nghiên cứu.


17

2.3.3. Phƣơng pháp khảo sát quá trình hấp phụ acid gymnemic của hạt nhựa
D101
2.3.3.1. Khảo sát tỷ lệ khối lượng hạt và thể tích dịch chiết
Tiến hành:
- Chiết 100g bột dược liệu theo mục 2.3.1.2 và xử lý theo mục 2.3.2.1.
- Cân lần lượt 0 g, 0,5 g, 1 g, 2 g, 3 g, 4 g, 5 g, 10 g, 20 g hạt nhựa đã xử lý
theo mục 2.2.4.2 cho vào cốc có mỏ 100 ml.

- Hút chính xác 50 ml dịch chiết sau xử lý cho vào mỗi cốc trên, đậy kín,
ngâm trong 24 giờ, thỉnh thoảng lắc đều.
- Sau 24 giờ lọc dịch chiết trong mỗi cốc, hút chính xác 40 ml dịch lọc, cô đến
cắn và tiến hành bán định lượng theo phương pháp HPTLC nêu ở mục 2.3.5.
Đánh giá kết quả: Đánh giá dựa trên thông số hiệu suất hấp phụ
gymnemagenin (%Hhp). Từ đó rút ra được lượng hạt tối thiểu cần để hấp phụ lượng
lớn nhất acid gymnemic trong một thể tích dịch chiết có nồng độ xác định (khoảng
0,2 mg/ml). Công thức tính:
Khối lượng gymnemagenin hấp phụ (Ghp):
Ghp = GT – GS = CT x fT – CS x fS (1)
Trong đó
- GT, CT, fT : Lần lượt tương ứng với khối lượng (mg), nồng độ (mg/mL)
gymnemagenin và hệ số pha loãng của dung dịch trước khi hấp phụ.
- GS, CS, fS : Lần lượt tương ứng với khối lượng (mg), nồng độ (mg/mL)
gymnemagenin và hệ số pha loãng của dịchlọc còn lại sau khi hấp phụ.
Hiệu suất hấp phụ (%Hhp):
%Hhp = Ghp /GT x 100% (2)
Trong đó:
- Ghp: khối lượng Gymnemagenin được hấp phụ (mg), được tính theo (1).
- GT : khối lượng gymnemagenin trước khi hấp phụ (mg).
2.3.3.2. Khảo sát thời gian hấp phụ
Tiến hành: