Viện Đại học mở Hà nội

Khóa luận tốt nghiệp

MỤC LỤC
PHẦN I. TỔNG QUAN...........................................................................................................................8
PHẦN II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP................................................................................................26
PHẦN III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN....................................................................................................34
PHẦN IV. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ.....................................................................................................40

Chu Thị Thảo

1


Viện Đại học mở Hà nội

Khóa luận tốt nghiệp

DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Cấu trúc của α-glucosidase [47]..........................................................................................14
Hình 1.2. Cơ chế tác dụng của AGIs trong điều trị bệnh tiểu đường [43]..........................................16
Hình 1.3. Cơ chế làm chậm quá trình hình thành glucose.................................................................17
Hình 1.4. Cấu tạo của valiolamine và voglibose.................................................................................19
Hình 1.5 Cấu trúc hóa học của một số thành phần có trong cây salacia.[43].....................................20
Hình 1.6. Cấu tạo của acarbose.........................................................................................................22
Hình 1.7. Đậu đen..............................................................................................................................24
Hình 3.1. Kết quả khảo sát khả năng sinh tổng hợp chất ức chế amylase từ canh trường nuôi cây của
các chủng Bacillus subtilis M1, BKH, DT2 được chiết trong dung môi là nước cất (A) và cồn 80o (B)
sau 5 ngày lên men. 1: mẫu M1, 2: mẫu BKH, 3: mẫu DT2, Mẫu ở giữa là mẫu kiểm chứng.............35
Hình 3.2. Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của nguồn nguyên liệu ban đầu đến khả năng sinh chất ức

chế α-amylase....................................................................................................................................36
Hình 3.3. Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của nguồn nguyên liệu ban đầu đến khả năng sinh chất ức
chế glucoamylase..............................................................................................................................36
Hình 3.4. Biểu đồ so sánh khả năng sinh chất ức chế α-amylase khi lên men mẫu đậu Đ1 bởi 3
chủng Bacillus subtilis M1, BKH, ĐT2.................................................................................................37
Hình 3.5. Biểu đồ so sánh khả năng sinh chất ức chế AMG khi lên men mẫu đậu Đ1 bởi 3 chủng
Bacillus subtilis M1, BKH, ĐT2............................................................................................................38
Hình 3.6. Biểu đồ ảnh hưởng của thời gian lên men đến khả năng ức chế amylase của sản phẩm lên
men từ mẫu đậu Đ1...........................................................................................................................39
Hình P-1: Phương trình đường chuẩn glucose...................................................................................47

Chu Thị Thảo

2


Viện Đại học mở Hà nội

Khóa luận tốt nghiệp

DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1. Các Chalcones tổng hợp hóa học và hoạt tính kìm hãm α – glucosidase của chúng..........19
Bảng 3.1 Một số tính chất của nguyên liệu........................................................................................34
Bảng P-1: Kết quả xây dựng đường chuẩn glucose............................................................................46
Bảng P-2. Kết quả ảnh hưởng của nguồn nguyên liệu ban đầu đến khả năng sinh chất ức chế αamylase..............................................................................................................................................47
Bảng P-3. Kết quả ảnh hưởng của nguồn nguyên liệu ban đầu đến khả năng sinh chất ức chế AMG
...........................................................................................................................................................47
Bảng P-4. Kết quả so sánh khả năng sinh chất ức chế α-amylase khi sử dụng 3 chủng Bacillus subtilis
M1, BKH, ĐT2 sau 5 ngày lên men.....................................................................................................48
Bảng P-5: Kết quả so sánh khả năng sinh chất ức chế AMG khi sử dụng 3 chủng Bacillus subtilis M1,

BKH, ĐT2 sau 5 ngày lên men............................................................................................................48
Báng P-6: Kết quả so sánh khả năng sinh chất ức chế α-amylase khi sử dụng 3 chủng Bacillus subtilis
sau 7 ngày lên men............................................................................................................................49
Bảng P-7: Kết quả so sánh khả năng sinh chất ức chế AMG khi sử dụng 3 chủng Bacillus subtilis sau 7
ngày lên men.....................................................................................................................................49
Bảng P-8: Ảnh hưởng của thời gian lên men đến khả năng ức chế α-amylase của sản phẩm lên men
từ mẫu đậu Đ1...................................................................................................................................49
Bảng P-9: Ảnh hưởng của thời gian lên men đến khả năng ức chế AMG của sản phẩm lên men từ
mẫu đậu Đ1.......................................................................................................................................50

Chu Thị Thảo

3


Viện Đại học mở Hà nội

Khóa luận tốt nghiệp

LỜI CẢM ƠN
Trước hết, em xin chân thành gửi lời cảm ơn sâu sắc đến TS. Lê Thanh
Hà – Bộ môn Công nghệ Sinh học – Viện Công nghệ Sinh học – Thực phẩm,
Đại học Bách Khoa Hà Nội đã hết lòng giúp đỡ, hưỡng dẫn và chỉ dạy tận tình
cho em trong suốt quá trình em làm luận văn tốt nghiệp.
Em xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo, cán bộ nghiên cứu, nghiên
cứu sinh, học viên và các bạn sinh viên phòng thí nghiệm đã nhiệt tình giúp đỡ,
tạo điều kiện thuận lợi cho em trong quá trình học tập và thực hiện luận văn.
Em cũng xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới các thầy cô giáo trong
Viện Đại học Mở Hà Nội nói chung và các thầy cô trong Khoa Công nghệ Sinh
học nói riêng đã tận tình giảng dạy,truyền đạt cho em những kiến thức, những

kinh nghiệm quý báu suốt 4 năm học tập và rèn luyện tại Viện Đại học Mở Hà
Nội.
Cuối cùng, em xin được gửi lời cảm ơn chân thành tới gia đình, bạn bè
đã động viên, chăm sóc, đóng góp ý kiến và giúp đỡ trong quá trình học tập,
nghiên cứu và hoàn thành luận văn tốt nghiệp.

Hà Nội, ngày … tháng … năm 2012
Sinh viên

Chu thị thảo

Chu Thị Thảo

4


Viện Đại học mở Hà nội

Khóa luận tốt nghiệp

LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu luận văn tốt nghiệp của
tôi. Các kết quả nghiên cứu trong khóa luận này hoàn toàn trung thực, các số
liệu tính toán được là hoàn toàn chính xác và chưa được công bố trong bất kỳ
các công trình nghiên cứu nào.

Chu Thị Thảo

5



Viện Đại học mở Hà nội

Khóa luận tốt nghiệp

ĐẶT VẤN ĐỀ
Hiện nay, cùng với sự phát triển của nền kinh tế, đời sống của người dân
ngày càng được cải thiện. Tuy nhiên cùng với sự thay đổi về lối sống,chế độ ăn
uống nhiều chất béo, giảm chất xơ cùng với sự ô nhiễm môi trường ngày càng
tăng đã khiến người dân phải đối mặt nhiều hơn với các bệnh mang tính xã hội
và cộng đồng như tiểu đường, tim mạch, ung thư…Trong đó đái tháo đường là
một trong những bệnh hiểm nghèo chiếm vị trí thứ 3 chỉ sau tim mạch và ung
thư [1,3]. Tại Việt Nam, có khoảng 4,5 triệu người mắc bệnh tiểu đường trong
đó có tới 65% người phát hiện bệnh muộn.Hơn nữa bệnh tiểu đường còn là
nguyên nhân chính của nhiều bệnh hiểm nghèo, điển hình là bệnh tim mạch
vành, tai biến mạch máu não, mù mắt, suy thận liệt dương, hoại thư..Vì vậy
bệnh tiểu đường được xếp vào là một trong những bệnh trọng điểm phòng và
chữa trị các bệnh mãn tính [1]
Tính đến thời điểm hiện tại, có tới 150 triệu người mắc bệnh tiểu đường
trên toàn thế giới. Con số này sẽ tăng lên 220 triệu người vào năm 2010, và
con số này dự báo sẽ tăng xấp xỉ 300 triệu người vào năm 2025. Trong đó tiểu
đường tuyp 2 chiếm trên 90% số người mắc bệnh.[25]
Ngày nay, y học đã có rất nhiều phương pháp và các loại thuốc đặc hiệu
để điều trị bệnh tiểu đường như: tiêm insulin; dùng các loại thuốc nhóm
Biguanides; Sulphonylurea, Glinidines, Thiazolidinediones, chất ức chế αglucosidase (alpha glucosidase inhibitors- AGIs) [14]. Một loạt AGIs được sử
dụng để điều trị bệnh tiểu đường như: voblibose, acarbose, miglitol. Tuy nhiên
các loại thuốc này có nhược điểm là gây tác dụng phụ cho người dùng như:
đầy bụng, tiêu chảy, buồn nôn, chướng bụng và đau, ngứa, phát ban, rối loạn
chức năng gan [46].
Touchi là sản phẩm được tạo ra đậu tương lên men truyền thống. Nhiều

nghiên cứu đã chứng minh rằng touchi có thể ức chế hoạt động của enzyme α-

Chu Thị Thảo

6


Viện Đại học mở Hà nội

Khóa luận tốt nghiệp

glucosidase [15, 16, 17, 19, 30]. Khi con người ăn các thực phẩm có nguồn gốc
là cacbohydrate để tạo ra maltose và sucrose (disaccharides), Maltose và
sucrose sẽ bị thủy phân bởi glucosidase thành các monosaccharides (glucose
và fructose) để sau đó tuần hoàn khắp cơ thể. Với khả năng ức chế hoạt tính αglucosidase, chất chiết touchi sẽ làm giảm tỷ lệ tiêu hóa và hấp thụ maltose và
sucrose trong ruột non để glucose trong máu sẽ không tăng đột ngột. Ngày nay,
chất chiết touchi đã trở thành một loại thực phẩm chức năng được sự dụng
rộng rãi ở các nước như Nhật Bản, Trung Quốc, Hàn Quốc…cho phòng chống
và hỗ trợ điều trị bệnh tiểu đường.[ [11,15] Ở nước ta, những nghiên cứu về
tổng hợp các AGIs và đặc biệt là từ đậu đen lên men bằng nấm men, vi khuẩn
vẫn còn hạn chế. Trong khi đó, các chế phẩm có khả năng kìm hãm
glucosidase dùng cho người bị bệnh tiểu đường đều là ngoại nhập với giá
thành cao.
Trước tình hình trên, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: ‛‛ Nghiên cứu
điều kiện lên men đậu đen bằng Bacillus subtilis để thu được hoạt chất kìm
hãm α- glucosidase ”
Nội dung đề tài gồm 5 phần:
- Tuyển chọn loại đậu đen khi lên men bằng Bacillus subtilis cho hoạt
tính kìm hãm α- glucosidase cao
-Tuyển chọn chủng Bacillus subtilis lên men cho hoạt tính kìm hãm αglucosidase cao

-Lựa chọn thời gian lên men đậu đen khi lên men bằng Bacillus
subtilis cho hoạt tính kìm hãm α- glucosidase cao

Chu Thị Thảo

7


Viện Đại học mở Hà nội

Khóa luận tốt nghiệp

PHẦN I. TỔNG QUAN
1.1. Bệnh tiểu đường và các phương pháp điều trị
Bệnh tiểu đường (hay còn gọi là bệnh đái tháo đường) là một bệnh do
rối loạn chuyển hóa carbohydrate khi insulin của tuyến tụy bị thiếu hay giảm
tác động trong cơ thể, biểu hiện bằng mức đường trong máu cao hơn 7mmol/l.
Glucose từ ruột đi vào máu tồi từ máu đi vào tế bào. Insulin là hormone có
chức năng vận chuyển đường vào bên trong tế bào để trở thành năng lượng.
Khi thiếu insulin, đường không được vận chuyển vào bên trong tế bào mà bị
thải ra ngoài theo đường nước tiểu, khi ấy con người cảm thấy mệt mỏi, khát
nước và giảm cân. Insulin điều hòa lượng đường trong máu ở mức bình
thường. Nếu tụy tạng không tạo ra được insulin hay cơ thể không sử dụng
được insulin, đường sẽ không vào được bên trong tế bào, là nguyên nhân chính
của nhiều bệnh hiểm nghèo như: tao biến mạch máu não, mù mắt, suy thận, liệt
dương, hoại thư…Bệnh tiểu đường có tốc độ gia tăng rất nhanh trên thế giới
nói chung và ở Việt Nam nói riêng. Theo tổ chức WHO, năm 1985 trên thế
giới ước tính có khoảng 30 triệu người mắc bệnh tiểu đường. Sau 10 năm (năm
1995) con số này lên đến 110 triệu người. Năm 2000 có trên 180 triệu người và
con số này dự báo sẽ tăng xấp xỉ 330 triệu người, chiếm tỉ lệ 5,4% dân số toàn

cầu vào năm 2030, trong đó chủ yếu là đái tháo đường tuýp 2 chiếm tỉ lệ 8595%.[34]
Việt Nam là nước đang phát triển,bệnh tiểu đường cũng tăng lên nhanh
chóng theo thời gian. Theo số liệu điều tra quốc gia năm 2002-2003, tỷ lệ mắc
bệnh trong cả nước là 2,7%, chủ yếu tập trung ở độ tuổi lao động 30-64 tuổi
(chiếm tỉ lệ 10,5%) và chiếm tỉ lệ cao ở vùng đô thị và khu công nghiệp
(4,4%), đặc biệt là ở các thành phố lớn. Hiện nay, tỷ lệ bệnh tiểu đường được
xếp thứ ba sau u bướu, tim mạch.[1]

Chu Thị Thảo

8


Viện Đại học mở Hà nội

Khóa luận tốt nghiệp

Cùng với sự gia tăng tỉ lệ mắc bệnh là chi phí dành cho việc quản lý,
chăm sóc và điều thị bệnh tiểu đường cũng tăng theo. Hiện nay chi phí dành
cho bệnh nhân tiểu đường khoảng 153-286 tỷ USD/năm và dự kiến đến năm
2025 con số này sẽ lên tới 213-396 tỷ USD, chiếm 7-13% ngân sách y tế thế
giới [2].Gánh nặng kinh tế đặt ra là rất lớn, đặc biệt là ở các nước đang phát
triển, kinh tế còn gặp nhiều khó khăn, điều kiện chăm sóc sức khỏe còn hạn
chế.
Bệnh nhân tiểu đường được chia thành 2 nhóm
-Tiểu đường tuýp 1: Do tế bào bê-ta bị phá hủy, gây nên sự thiếu hụt
insulin tuyệt đối cho cơ thể (nồng độ insulin giảm thấp hoặc mất hoàn toàn).
Đái tháo đường tuýp 1 chiếm tỷ lệ khoảng 5-10% bệnh dái tháo đường thế
giới. Đái tháo đường tuýp 1 phụ thuộc nhiều vào yếu tố gen (di truyền) và
thường được phát hiện trước 40 tuổi. Đa số các trường hợp được chuẩn đoán

mắc bệnh đái tháo đường là những người có thể trạng gày, tuy nhiên người béo
cũng không loại trừ. Người mắc bệnh đái tháo đường tuýp 1 sẽ có đời sống phụ
thuộc insulin hoàn toàn.
-Tiểu đường tuýp 2 hay còn gọi là tiểu đường không lệ thuộc insulin:
chiếm tỷ lệ chủ yếu của bệnh tiểu đường. Chiếm tỷ lệ khoảng 90% đái tháo
đường trên thế giới. Nguyên nhân do kháng insulin ở cơ quan đích kèm theo
suy giảm chức năng tế bào bê-ta hoặc do suy giảm chức năng tế bào bê-ta kèm
theo kháng insulin ở cơ quan đích. Đái tháo đường tuýp 2 không phụ thuộc
nhiều vào yếu tố di truyền, và thường được phát hiện vào sau 40 tuổi. Người
mắc bệnh tiểu đường tuýp 2 thường có thể trạng béo. Có thể điều trị bệnh bằng
cách thay đổi thói quen ăn uống, kết hợp dùng thuốc để kiểm soat đường
huyết. Tuy nhiên nếu quá trình nay thực hiện không tốt thì bệnh nhân cũng sẽ
phải điều trị bằng cách dùng insulin. [39]
Đối với người bị bệnh tiểu đường khi xét nghiệm đường máu lúc đói
nồng độ đường máu lúc đói nồng độ đường có giad trị ≥7,8mmol/l; nhưng thời

Chu Thị Thảo

9


Viện Đại học mở Hà nội

Khóa luận tốt nghiệp

gian gần đây tổ chức y tế thế giới đã đưa ra khuyến cáo chỉ số đường trong
máu ≥ 7mmol/l thì đã được chuẩn đoán là đái tháo đường. Bởi vì, khi lượng
đường trong máu ≥ 7mmol/l thì người bệnh sẽ có nguy cơ mắc bệnh tim mạch
và những nguy cơ khác có thể dẫn đến tử vong nếu không có sự can thiệp kịp
thời.[39]

Mặc dù biến chứng của bệnh tiểu đường diễn biến từ từ trong khoảng
thời gian dài nhưng cuối cùng có thể gây ra tàn phế và thậm chí đe dọa tính
mạng. Một số biến chứng quan trọng bao gồm:[3,5]
• Biến chứng tim và mạch máu: tiểu đường làm tăng nguy cơ bị bệnh
tim mạch, bao gồm bệnh mạch vành với cơn đau thắt ngực, nhồi máu cơ tim,
tai biến mạch máu não, xơ vữa động mạch và tăng huyết áp.
• Biến chứng thần kinh: đường huyết tăng cao có thể gây tôn thương
thành mạch máu nhỏ (mao mạch) nuôi dưỡng những sợi thần kinh, đặc biệt ở
chân. Tổn thương này gây ra các triệu chứng: châm chích như kiến bò, tê chân,
nóng rát hay đau thường bắt đầu từ các ngón chân,ngón tay và lan dần lên. Nếu
đường huyết không được kiểm soát tốt có thể gây mất tất cả cảm giác ở chi và
làm tăng nguy cơ bị nhiễm trùng chân, đoạn chi
• Biến chứng thận: thận chứa hàng triệu búi mạch máu nhỏ có chức
năng lọc chất thải ra khỏi cơ thể. Bệnh tiểu đường có thể làm tổn thương
những hệ thống này. Cuối cùng có thể dẫn tới suy thận hay bệnh thận giai đoạn
cuối không thể phục hồi được, khi đó phải chạy thận nhân tạo hay ghép thận.
• Biến chứng mắt: tiểu đường có thể gây tổn thương mạch máu ở võng
mạc (bệnh võng mạc do tiểu đường) dẫn tới giảm thị lực. Tiểu đường cũng có
thể làm tăng nguy cơ bị bệnh ly khác như đục thủy tinh thể và glaucoma.
• Biến chứng chân: tiểu đường gây tổn thương thần kinh ở chân và
giảm cung cấp máu tới các chi. Nếu không được điều trị kịp thời, các vết
thương hay nốt phồng sẽ bị nhiễm trùng. Đối với những tổn thương trần trọng

Chu Thị Thảo

10


Viện Đại học mở Hà nội


Khóa luận tốt nghiệp

có thể phải cắt bỏ ngón chân, bàn chân hay cả chân để cứu tính mạng bệnh
nhân.
• Tổn thương những sợi dây thần kinh kiểm soát việc tiêu hóa có thể
gây buồn nôn, tiêu chảy hay táo bón. Đối với đàn ông có thể gây rới loạn
cương dương.
• Tổn thương ở da và ở miệng: tiểu đường có thể làm cho da dễ bị
nhiễm trùng hay nhiễm nấm. Ngoài ra còn rất dễ mắc bệnh viêm lợi.
• Loãng xương: tiểu đường có thể làm tăng nguy cơ bị loãng xương,
gãy xương.
• Bệnh Alzheimer: tiểu dường có thể làm tăng nguy cơ bị bệnh
Alzheimer và chứng mất trí nhớ. Đường huyết không được kiểm soát tốt sẽ
làm tăng nguy cơ bị bệnh này và làm tắc nghẽn mạch máu tới não và gây đột
quỵ.
Hiện nay, có rất nhiều phương pháp và các loại thuốc đặc hiệu để điều
trị và hỗ trợ điều trị bệnh tiểu đường như: tiêm insulin, dùng các loai thuốc
nhóm Biguanide, nhóm Sulfonilurea, nhóm Thiazolidinedione,…Và một trong
những biện pháp đó là sử dụng thuốc có chứa chất ức chế α-glucosidase như
Acarbose, Glucobay,Miglitol…[39]. Tuy nhiên các loại thuốc này lại có nhược
điểm gây ra các tác dụng phụ cho người dùng như: đầy bụng, tiêu chảy, buồn
nôn, bụng trướng và đau, ngứa, ngoại ban,chức năng gan bất thường…[40].
Nên những năm gần đây, các chất ức chế α-glucosidase sản xuất từ các nguồn
gốc tự nhiên được đặc biệt quan tâm vì chúng không gây độc hại, độ an toàn
cao. Tuy nhiên,các chất ức chế α- glucosidase từ vi sinh vật được chú trọng
hơn cả vì chúng có ưu việt: an toàn, có thể sản xuất trên quy mô công nghiệp,
không phụ thuộc vào mùa vụ, địa điểm.

Chu Thị Thảo


11


Viện Đại học mở Hà nội

Khóa luận tốt nghiệp

1.2. Tổng quan về enzyme Alpha glucosidase
1.2.1.Giới thiệu về α-glucosidase
Alpha- glucosidase (EC 3.2.1.20) là một enzyme thủy phân thuộc nhóm
glucosidase (α-,β- và α-1,3-glucosidase). Là một trong những enzyme quan
trọng nhất trong hệ thống phân cắt cacbonhydrat. Chúng xúc tác thủy phân liên
kết α-glucosid từ đầu không khử phân tử cơ chất thành glucose, do đó nhờ tác
dụng của α-glucosidase mà phân tử cơ chất bị chuyển hóa hoàn toàn thành
glucose. Alpha- glucosidase có trong bề mặt màng tế bào ruột ở động vất có
vú. Ngoài ra, nhiều loài vi sinh vật cũng tiết ra α-glucosidase trong quá trình
sinh trưởng và phát triển của chúng. Cấu trúc cũng như đậc tính xúc tác của
các α-glucosidase phụ thuộc vào nguồn thu nhận.
Các α-glucosidase quan trọng có thể kể đén hệ thống α-amylase, các loại
enzyme chứa trong ruột non động vật có vú
Glucoamylase
Glucoamylase là enzyme ngoại xâm (exoenzym), nó thủy phân
polysaccharide từ đầu không khử để tạo thành glucose. Enzyme này được tìn
thấy ở thành tế bào ruột non của động vật có vú. Khi thủy phân tinh bột cùng
với glucose còn có thể tạo thành các α-oligosaccharide. Ngoài ra, enzyme này
còn có khả năng thủy phân các liên kết α-1,2 và α-1,3 glucosid
Glucoamylase có khả năng thủy phân hoàn toàn tinh bột, glycogen,
amylopectin, dextrin, panose, isomatose, maltose.
Hầu hết glucoamylase thể hiện hoạt lực tối đa ở vùng pH 3,5-5,5. So
với α-amylase, glucoamylase bền đối với acid cao hơn, nhưng lại kém bền hơn

dưới tác dụng của rượu etylic, aceton.
Khả năng thủy phân mạnh mẽ các liên kết α-1,4 lẫn α-1,6 glucosid và
thậm chí cả liên kết α-1,3 glucosid của glucoamylase để tạo thành đường
glucose đã đưa enzyme này lên vị trí hàng đầu về hiệu lực thủy phân tinh bột

Chu Thị Thảo

12


Viện Đại học mở Hà nội

Khóa luận tốt nghiệp

α-amylase
enzyme này xúc tác thủy phân liên kết α1-4 glucosid nằm bên trong
phân tử cơ chất (tinh bột, glycogen) và được gọi là enzyme nội phân
(endoamylase). Dưới tác dụng của α-amylase , amyloza sẽ bị phân hủy thành
23% glucose và 87% maltose. Với amylopectin, do α-amylase không phân cắt
được liên kết α1-6 glucosid ở mạch nhánh của amylopectin nên sau một thời
gian lâu thì sản phẩm sẽ là 72% maltose, 19% glucose, dextrin thấp phân tử và
8% izomaltose .
α-amylase là một metaloenzym. Mỗi phân tử α-amylase đều có chứa 130 nguyên tử gam/mol Ca, nhưng không ít hơn 1-6 nguyên tử gam/mol Ca
tham gia vào sự hình thành và ổn định cấu trúc bậc 3 của ezyme, duy trì hoạt
động của enzyme.
α-amylase của vi sinh vật có những đặc tính rất đặc trưng về cơ chế tác
dụng, khả năng chuyển hóa tinh bột và khả năng chịu nhiệt. Khả năng chịu
nhiệt của các loại α-amylase từ các nguồn khác nhau là khác nhau. Nhiệt độ tối
thích của α-amylase nấm mốc là 50 oC, vi khuẩn là 70-75 oC. Khả năng bền
nhiệt của các enzyme amylase là do sự hiện diện của ion Ca +2 trong phân tử

enzyme và làm bền cấu trúc bậc ba của nó.
β-amylase
β-amylase xúc tác thủy phân các liên kết α1-4 glucosid trong tinh bột,
glycogen và olysaccharit đồng loại, phân cắt tuần tựng gốc maltoza một từ đầu
không khử của mạch
β-amylase là enzyme ngoại xâm (exoenzym), chỉ tác dụng lên hồ tinh
bột mà không tác dụng lên tinh bột sống. Nếu cho cả α-amylase và β-amylase
cùng đồng thời tác dụng lên tinh bột thì tinh bột bị thủy phân tới 95%
pH tối thích trong dung dịch tinh bột thuần khiết của β-amylase là 4,6
còn trong dung dịch nấy (không sôi) là 5,6. β-amylase kém bèn nhiệt ở nhiệt

Chu Thị Thảo

13


Viện Đại học mở Hà nội

Khóa luận tốt nghiệp

độ cao, bị vô hoạt hoàn toàn ở 70oC. Nhiệt độ tối ưu trong dung dịch tinh bột
thuần khiết là 40-50oC, còn trong dung dịch tinh bột nấu là 60-65 oC. βamylase không tồn tại trong nấm mốc, có chủ yếu trong malt
Các chế phẩm α-glucosidase trên thị trường (do Sigma Medical Co, Mỹ
cung cấp) có nhiều nguồn gốc khác nhau như: từ vi khuẩn (Bacillus
stearothermophilus…),từ nấm men (Saccharomyces cerevisiae) hoang dại hay
tái tổ hợp, từ thực vật (gạo, lúa mạch, kê…), từ ruột non động vật (chuột, thỏ,
lợn…) [47]
Các tên gọi khác của α-glucosidase là maltase, glucoinvertase,
glucosidosucrase, maltase-glucoamylase, lysosomalalpha-glucosidase, α-Dglucosideglucohydrolase [47]. α-glucosidase có khối lượng khoảng 125kDa,
gồm nhiều đơn phân alpha glucose liên kết với nhau [25]


Hình 1.1. Cấu trúc của α-glucosidase [47]
1.2.2. Tính chất của α- glucosidase
Alpha glucosidase hoạt động ở pH tối ưu từ 4-4,5. Enzyme này có khả
năng phân cắt các liên kết α-1,4, α-1,3 và α-1,2 D-glucozit ở đầu không khử
của các di-, oligo-, polysaccharide và giải phóng ra D-glucose có thể hấp thu
trực tiếp vào máu [24,47].
α- glucosidase thủy phân đường maltose, đường sucrose và không thủy
phân được tinh bột

Chu Thị Thảo

14


Viện Đại học mở Hà nội

Khóa luận tốt nghiệp

Phản ứng thủy phân của α-glucosidase:

Maltose + H2O

α-glucosidase

2α-D-glucosidase [35]

Phản ứng thủy phân α-glucosidase xảy ra với sự duy trì của các hóa chất
lập thể tại trung tâm hoạt động [21]. Sự duy trì và tái tạo enzyme là nhờ hai
nhóm acid carboxylic ở trung tâm hoạt động và sử dụng cơ chế đổi chỗ với

chất trung gian là enzyme β-blucosyl. Cả hai bước trong quá trình là sự chuyển
hóa trạng thái với sức bền của các liên kết ion giữa oxy và cacbon.[22]. Một
carboxylic ở trung tâm hoạt động sẽ hoạt động như chất xúc tác ưu nhân, gây
ảnh hưởng đến sự hình thành các liên kết cộng hóa trị trung gian, trong khi một
acid carboxylic khác có vai trò của một chất xúc tác acid ở trong bước đầu tiên
và là cơ sở xúc tác cho bước thứ hai ( thủy phân chất trung gian là enzyme βglucosyl ).[23]
Alpha-glucosidase có hai họ lớn đặc trưng lớn đó là: GH13 và GH31 và
hai họ nhỏ là GH4 và GH97 theo hệ thống phân loại CAZY của các loại
enzyme thủy phân glucozit. [28]

Chu Thị Thảo

15


Viện Đại học mở Hà nội

Khóa luận tốt nghiệp

1.3. Chất ức chế α-glucosidase (alpha glucosidase inhibitors:
AGIs )
1.3.1. Cơ chế tác dụng của AGIs trong điều trị bệnh tiểu đường tuýp 2

Hình 1.2. Cơ chế tác dụng của AGIs trong điều trị bệnh tiểu đường [43]
Tinh bột hoặc đường (sucrose) có thành phần quan trọng là
carbonhydrate và là một cấu tử gồm kết hợp của hai hoặc nhiều loại đường
(glucose hoặc fructose). Trong cơ thể chúng ta hầu như không thể hấp thu trực
tiếp được các loại carbonhydrate đó.Vì vậy các loại carbonhydrate đó (di,
oligo, poly saccharide) đó phải được thủy phân hoàn toàn bởi các loại enzyme
tiêu hóa để các saccharide được thủy phân thành các dạng mà cơ thể có thể hấp

thu được.[43]
Trước hết, tinh bột bị enzyme amylase trong nước bọt chuyển hóa thành
maltose (sự kết hợp của hai phân tử glucose). Đường sucrose và maltose sẽ bị
một loại enzyme có tên là α-glucosidase thủy phân các saccharide thành các
D-glucose mà cơ thể hấp thu được ở niêm mạc ruột. Các chất ức chế enzyme

Chu Thị Thảo

16


Viện Đại học mở Hà nội

Khóa luận tốt nghiệp

có tính ức chế hoạt động của α-glucosidase. Nói cách khác,nhờ sự hiện diện
của các chất ức chế thì glucose và fructose khó được sản xuất từ maltose và
sucrose tại ruột và dạ dày. Do đó sự hấp thu cacbonhydrate qua niêm mạc ruột
là rất nhỏ. Việc này có tác dụng kiềm chế tăng lượng đường trong máu và
lượng đường được giữ ở mức thấp.[43]
Các chất kìm hãm này có tác dụng cản trở quá trình chuyển hóa từ các
loại di, oligo, poly saccharide thành glucose. Do đó làm giảm lượng đường
trong máu mà không hề gây phản xạ tăng tiết insulin.
Alpha-glucosidase có trung tâm hoạt động chứa nhóm acid carboxylic.
AGIs là chất ức chế cạnh tranh (như Acarboce), nó gắn vào trung tâm hoạt
động của α-glucosidase làm giảm hoạt lực enzyme, ngăn chặn không cho αglucosidase thủy phân các loại di, oligo và poly saccharide thành D-glucose, để
điều hòa lượng đường trong máu [21].

Hình 1.3. Cơ chế làm chậm quá trình hình thành glucose
Đối với người bị bệnh tiểu đường việc sử dụng các chất kìm hãm

enzyme α-glucosidase trong màng tế bào ruột non giúp cho sự phân hủy các
hợp chất cacbonhydrate bị ngăn chặn và vì thế lượng đường được hấp thu sẽ
giảm đi đồng thời quá trình hấp thụ này cũng được kéo dài. Nhờ đó giúp hạ

Chu Thị Thảo

17


Viện Đại học mở Hà nội

Khóa luận tốt nghiệp

đường huyết trong máu cũng như trong huyết tương. Cơ chế làm chậm quá
trình tạo thành glucose nhờ acarbose như hình 1.3.
Đối với người bị bệnh tiểu đường, các chất kìm hãm này thường được sử
dụng trước bữa ăn chính và với liều lượng tăng dần. Ngày nay, đã có nhiều
nghiên cứu chiết xuất các chất kìm hãm α-glucosidase từ thực vật cũng như vi
sinh vật trong tự nhiên nhằm giảm các tác động không mong muốn khi sử
dụng.
1.3.2 Phân loại AGIs
1.3.2.1. AGIs tổng hợp hóa học
Các AGIs tổng hợp hóa học đã được các nhà khoa học nghiên cứu nhiều
trên thế giới. Nó được tổng hợp theo phương pháp hóa học dựa trên cấu trúc
của các AGIs tự nhiên.
Năm 1986, dihydroacabose đã được tổng hợp cho thấy khả năng kìm
hãm alpha – glucosidase tương tự như acabose (1 Pseudotetrasacharid có khả
năng kìm hãm α- glucosidase cao).[26]
Năm 2005, Woo Duck Seo và cộng sự đã tổng hợp được 20 cấu trúc có
khả năng kìm hãm α glucosidase dựa vào cấu trúc hóa học của Chalcones

( chất kìm hãm α-glucosidase từ một số loại lá ăn được ở Hàn Quốc ) [33].
Các tác giả công bố rằng các cầu trúc từ 13 -20 cho khả năng kìm hãm αglucosidase rất mạnh, được thể hiện ở bảng 1.1.

Chu Thị Thảo

18


Viện Đại học mở Hà nội

Khóa luận tốt nghiệp

Bảng 1.1. Các Chalcones tổng hợp hóa học và hoạt tính kìm hãm α –
glucosidase của chúng
Hợp
chất

R1

R2

IC50,(Ki,Μm) αglucosidase

13

3-H

4- Hydroxyl

>200


14

3-H

3,4- Dihydroxyl

>200

15

4-H

4- Hydroxyl

41,0

16

4-H

3,4- Dihydroxyl

62,1

17

3-ρ-Tosyl

4- Hydroxyl


12,4(7,38)

18

3-ρ-Tosyl

3,4- Dihydroxyl

15,6(9,25)

19

4-ρ-Tosyl

4- Hydroxyl

0,98(0,58)

20

4-ρ-Tosyl

3,4- Dihydroxyl

0,40(0,24)

Voglibose là dẫn xuất chứa nito vủa valiolamine được tổng hợp để làm
tăng khả năng kìm hãm α – glucosidase. Chất này có khả năng kìm hãm
maltase và sucrase với IC50 lần lượt là 0.015μM và 0.0046 μM [20]


Voglibose

Valiolamine

Hình 1.4. Cấu tạo của valiolamine và voglibose
Ngoài ra, một số chất hóa học cũng đã được ghi nhận có khả năng kìm
hãm α – glucosidase như: sulfonamide, các dẫn xuất của xanthone và deoxy
salacious. Tuy nhiên, các chất này đã gây ra một số tác dụng phụ như rối loạn
chức năng gan và các triệu chứng về đau dạ dày cho người sử dụng[38]. Vì vậy

Chu Thị Thảo

19


Viện Đại học mở Hà nội

Khóa luận tốt nghiệp

gần đây, việc tổng hợp AGIs theo con đường tự nhiên được quan tâm nhiều
hơn do các đặc tính ưu việt mà nó đem lại như giá thành thấp,tính an toàn cao.
1.3.2.2. AGIs tổng hợp tự nhiên
Đây là các AGIs thu được nhờ quá trình chiết xuất từ các loại thực vật,
động vật, một số loại thực phẩm và từ sự lên men bởi các vi sinh vật.
• Sản xuất AGIs từ thực vật
AGIs có thể được thu thập từ nhiều phần khác nhau khác nhau của thực
vật. Đây là nguồn thu nhận α – glucosidase phong phú và đa dạng nhất.
Năm 1998,các nhà khoa học Nhật Bản đã tìm ra hai chất salacinol và
kotalanol có khả năng kìm hãm α – glucosidase từ dịch chiết của rễ và lá cây

salacia riticulata( một loại cây bụi theo thuộc họ Clelastraceae đã được người
Ân Độ và Sri Lanka sử dụng như một loại thuốc dân gian từ lâu đời [36]

Hình 1.5 Cấu trúc hóa học của một số thành phần có trong cây salacia.[43]
Salacinol có khả năng kìm hãm maltase, sucrase và isomaltase ở chuột
với giá trị IC50 lần lượt là 3,2; 0,84; 0,59μg/μl. Các nghiên cứu thử nghiệm trên
chuột cho thấy salacinol có khả năng kìm hãm sự tăng nồng độ đường trong
máu mạnh hơn acarbose. Trong khi đó, kotalanol có khả năng kìm hãm sucrose
mạnh hơn salacinol và acarbose [36]

Chu Thị Thảo

20


Viện Đại học mở Hà nội

Khóa luận tốt nghiệp

Một vài nghiên cứu đã đánh giá AGIs được chiết suất từ loại cây này có
ảnh hưởng đối với cơ thể con người trong việc kiểm soát lượng đường trong
máu và các kết quả nghiên cứu ban đầu cho thấy rất khả quan. Tại Nhật Bản,
salaccia oblonga đã được bán như một thực phẩm chức năng và nó cũng được
biết đến ở Mỹ với tên gọi Saptrangi hay Ponkoranti.
Kim, Y.M và cộng sự (2004) đã chiết suất từ 1400 loại thực vật bằng
ethanol 70% nhằm tìm ra một loại thuốc chữa bệnh tiểu đường tiềm năng [69].
Trong số các chát chiết nêu trên, chất chiết từ vỏ cây thông densiflora cho thấy
hoạt tính kìm hãm α – glucosidase từ ruột non lợn cao nhất với IC 50 đạt
155μg/ml.
Ngoài ra,thực tế còn có rất nhiều loài thực vật chứ chất kìm hãm α –

glucosidase đã được các nhà khoa học nghiên cứu và công nhận. tuy nhiên ,
việc sản xuất các chất AGIs từ thực vật với quy mô lớn là rất tốn kém và không
hề đơn giản.
• Sản xuất AGIs từ động vật
Năm 2009, các nhà khoa học Việt Nam và Hàn Quốc đã khám phá ra
khả năng kìm hãm α – glucosidase của các hợp chất chiết xuất từ Stichopus
japonicas ( hải sâm) [27]. Nghiên cứu cho thấy nếu chiết hải sâm bằng hexan ở
nồng độ 10μg/ml thì kết quả đạt được là cao nhất với khả năng kìm hãm α –
glucosidase từ nấm lên men là 98%. Trong khi đó nếu chiết bằng methanol với
nồng độ 0,5 mg/ml thì khả năng kìm hãm α – glucosidase từ nấm men là 68%.
Từ dịch chiết của hải sâm, các nhà khoa học đã thu được ba loại AIGs (1,2,3)
có khả năng kìm hãm α – glucosidase của Saccharomyces cerevisiae với giá
trị IC50 lần lượt là 1,22; 0,17; 0,36 μg/ml và α – glucosidase của Bacillus
stearothemophilus với trị giá IC50 lần lượt là 2,49; 0,24; 0,21 μg/ml. Từ những
kết quả trên, tác giả đã kết luận rằng AGIs của S. japonicus có tiềm năng như
thực phẩm chức năng tự nhiên và các hợp chất này có thể được sử dụng để

Chu Thị Thảo

21


Viện Đại học mở Hà nội

Khóa luận tốt nghiệp

ngăn ngừa bệnh tiểu đường do khả năng kìm hãm α – glucosidase của chúng
cao.
• Sản xuất AGIs từ vi sinh vật
Ngày nay, việc nghiên cứu sản xuất AGIs từ vi sinh vật đã và đang thu

hút được nhiều sự quan tâm của các nhà khoa học và các nhà sản xuất vì an
toàn khi sử dụng , ít có tác dụng phụ đối với cơ thể sống, dễ sản xuất trên quy
mô lớn. Một số vi sinh vật đã được nghi nhận là rất thích hợp cho việc nghiên
cứu khả năng sinh tổng hợp AGIs như : aspergillus orzryzae, streptomyces,
actinoplanes, penecillium, flavobacterium saccharophilium, bacilus subtilis,
…. [18,20,39,37,38].
Acarbose ( pseudotettrasaccharide được tách chiết từ dịch lên men loài
Actinoplanes SE50 ) là AGIs được tìm ra đầu tiên trên thế giới với giá trị
IC50=0,5Μm [56]. Chất này có tác dụng kìm hãm cạnh tranh α – glucosidase ở
niêm mạc ruột, làm chậm quá trình thủy phân các di-, dio-, poly-saccharide
thành monosaccharide là dạng có thể hấp thu được. Acarabose không làm tăng
tiết insulin, không gây giảm glucose máu lúc đói khi dùng trị liệu ở người.

Hình 1.6. Cấu tạo của acarbose
Sau acarbose, năm 1984, kameda, Y. và cộng sự đã tìm ra valiolamine –
AGIs từ loại vi khuẩn Streptomyces hygrooscopicus có khả năng kìm hãm
maltase và sucrase với giá trị IC50 là 2,2Μm và 0,049Μm [20].

Chu Thị Thảo

22


Viện Đại học mở Hà nội

Khóa luận tốt nghiệp

Năm 2000, các nhà khoa học Hàn Quốc đã phát hiện cyclo (Dehydroala
– L – leu ), một AGIs từ dịch chiết của Penicillium sp. F 70614 có khả năng
kìm hãm α – glucosidase của nấm men và ucar ruột non lơn với giá trị IC 50 là

30 và 50 μg/ml [40]. Tuy nhiên, cyclo không có khả năng kìm hãm với β –
glucosidase, α – glucosidase có nguồn gốc từ Aspergillus, β – glucosidase từ
Escherichia coli và α – mannosidase từ đậu ván.
Sau đó, Kwon, Y . I và cộng sự đã công bố CKD-711 và CKD-711 là
AGIs mới thu được từ dịch lên men của Streptomyces sp.CK 4416 – một loài
vi khuẩn được phân lập từ đất rừng của đảo Jeju [37]. CKD -711 và CKD –
711a đã được tinh chế bằng Dowex 50W-2X và cột sắc ký Sephadex G-10 .
Khả năng kìm hãm α – glucosidase của hai chất này đã được nghiên cứu và so
sánh với acarbose. Bên cạnh đó, khả năng kìm hãm các enzyme kể trên của
CKD-711A kém hơn so với CKD-711. Thử nghiệm việc giảm 50% đường
huyết sau ăn với đói tượng thí nghiệm là chuột, các tác giả đã bổ sung CKD711 vào các bữa ăn có chứa tinh bột và sucrose. Kết quả cho thấy lượng CKD711 cần bổ sung để kìm hãm maltase và sucrase tương ứng là 3,07 mg/kg và
1,15 mg/kg, trong khi lượng acarbose chỉ phải sử dụng tương ứng là 1,94
mg/kg và 1,15/kg.

1.4. Tổng quan về đậu đen
Đậu đen tên khoa học là Vigna cylindrica, là loài cây phân họ đậu, mọc
hằng năm, toàn thân không lông. Trong đậu đen có chứa nhiều vitamin A, B,
C, PP, protit, gluxit, lipit, muối khoáng. Hàm lượng axit amin cần thiết trong
đậu đen rất cao gồm: lysin, methionin, tryptophan, alanin, valin,…do đó đậu
đen được xem như một loại thuốc bổ. Ngoài ra, còn một nhóm chất rất quan
trọng

tạo màu sắc đỏ tím cho lớp vỏ ngoài của đậu đen được gọi là

anthocyanidin, đây là nhóm chất có tác dụng kháng oxy hóa tế bào cao, giúp

Chu Thị Thảo

23



Viện Đại học mở Hà nội

Khóa luận tốt nghiệp

tăng cường sức đề kháng cho cơ thể, chống ung thư, kéo dài tuổi thọ, chống
lão hóa tế bào

Hình 1.7. Đậu đen
Tác dụng của đậu đen
Đậu đen vừa là thực phẩm vừa là vị thuốc quý, có tác dụng trừ thấp,
giải độc, bổ thận, bổ huyết, bồi bổ cơ thể, làm đẹp nhan sắc….Theo y dược học
hiện đại, đậu đen có chứa albumin, sinh tố A, B, C, PP, protid, glucid, lipid,
muối khoáng. Hàm lượng acid amin cần thiết trong đậu đen rất cao gồm lysin,
methionin, tryptophan, phenylalanin, alanin, valin, leucin... Theo đông y, đậu
đen tính hơi ôn, vị ngọt, quy kinh thận, có tác dụng trừ thấp, giải độc, bổ thận,
bổ huyết, chữa được cước khí, bồi bổ cơ thể, làm đẹp nhan sắc...
Nhiều tổ chức y tế công cộng bao gồm cả Hiệp hội Tiểu đường, Hiệp hội
Tim mạch, và Hiệp hội Ung thư của Mỹ đều nói về các loại đậu, trong đó có
đậu đen, như là một nhóm thực phẩm chính giúp ngăn ngừa bệnh và bảo vệ sức
khỏe. Trong số tất cả các nhóm thực phẩm thường được sử dụng trên toàn thế
giới, không một nhóm nào lại có sự kết hợp tuyệt vời giữa protein và chất xơ
hơn cây họ đậu, đặc biệt là đậu đen. Chỉ với một cốc đậu đen (tương ứng với
172g) cũng đã cung cấp cho chúng ta tới 15 gram chất xơ (chiếm hơn một nửa
nhu cầu chất xơ trung bình mỗi ngày cho một người lớn) và 15 gram protein
(gần bằng một phần ba nhu cầu protein hàng ngày, tương đương với 56,7 gam
thịt gà hay cá hồi). Và chúng ta sẽ không thể tìm thấy sự kết hợp này trong các
loại trái cây, rau quả, ngũ cốc, thịt, các sản phẩm sữa, đồ hải sản hoặc các loại

Chu Thị Thảo


24


Viện Đại học mở Hà nội

Khóa luận tốt nghiệp

hạt khác. Chính sự kết hợp đó đã giải thích tại sao đậu đen lại mang đến cho
chúng ta nhiều lợi ích đối với đường tiêu hóa, hệ thống kiểm soát lượng đường
trong máu, và hệ tim mạch như vậy.

Chu Thị Thảo

25