Chương 1. Tổng quan tài liệu

6

Nguyễn Tiến Dũng

CHƯƠNG 1.
TỔNG QUAN TÀI LIỆU

Nghiên cứu phân biệt loài phụ Salmonella gây bệnh với các loài phụ khác trong thực phẩm bằng kỹ thuật sinh học
phân tử - Luận án tiến sĩ, chuyên ngành Vi sinh, 2010


Chương 1. Tổng quan tài liệu

7

Nguyễn Tiến Dũng

1.1. Vị trí phân loại và cách gọi tên Salmonella
Salmonella là vi khuẩn hình que, di động, Gram âm (-) thuộc họ vi khuẩn
đường ruột Enterobacteriaccae, có mối quan hệ di truyền chặt chẻ với E. coli.
Salmonella được phát hiện và mô tả chi tiết lần đầu tiên vào năm 1880 bởi Eberth.
Năm 1884, Salmonella được nuôi cấy thành công bởi Gaffky. Vào cuối những năm
1940, Edward và Ewing bắt đầu nghiên cứu thiết lập phương pháp xác định và phân
biệt giống Salmonella với các loài khác trong họ Enterobacteriaccea. Cho đến nay,
mặt dù sự phân loại và danh pháp của Salmonella đã có nhiều thay đổi nhưng
phương pháp đã được mô tả bởi hai tác giả trên vẫn còn đang được sử dụng rất phổ
biến [2],[3].
Theo định nghĩa năm 1986 của Ewing, giống Salmonella được xếp vào họ vi
khuẩn đường ruột Enterobacteriaccae và thuộc tộc Salmonelleae [41], [74]. Đặc

điểm sinh hóa chung của giống này là có khả năng sinh H2S, phản ứng methyl red
dương tính, phản ứng lysine decarboxylase, ornithine decarboxylase và arginine
dehydrolase dương tính, không sinh indol, không có khả năng thủy phân urea, thử
nghiệm Voges – Proskauer âm tính, không có khả năng khử amin của phenylalanine
và tryptophane, không có khả năng sinh acid từ các nguồn carbon như sucrose,
adonitol, raffinose, α-methyl-glucoside. Các chủng thuộc các loài phụ (subspecies,
subsp.) I, II, IV và V không có khả năng sử dụng và tạo acid từ lactose nhưng các
chủng thuộc các loài phụ IIIa và IIIb có khả năng sử dụng và sinh acid từ nguồn
carbon này. Các chủng thuộc các loài phụ I, II và V có khả năng lên men và sinh
acid từ dulcitol nhưng các chủng thuộc IIIa, IIIb và IV không sử dụng được dulcitol
[41], [73], [74]. Minor và cộng sự bổ sung đặc điểm của loài phụ VI là không sử
dụng và không sinh acid từ inositol hay sorbitol, 22% có khả năng lên men đường
lactose, 67% lên men đường dulcitol. Tác giả này cho rằng loài phụ V khác biệt với
các dòng khác của Salmonella. Năm 1989, Reeves và cộng sự xếp loài phụ V thành
loài thứ hai của giống Salmonella với tên gọi là Salmonella bongori. Hiện nay
giống Salmonella được chia thành hai loài là S. enterica và S. bongori [41].

Nghiên cứu phân biệt loài phụ Salmonella gây bệnh với các loài phụ khác trong thực phẩm bằng kỹ thuật sinh học
phân tử - Luận án tiến sĩ, chuyên ngành Vi sinh, 2010


Chương 1. Tổng quan tài liệu

8

Nguyễn Tiến Dũng

Theo hệ thống phân loại như trên, cho đến nay nhiều quốc gia vẫn thống nhất
chia giống Salmonella thành hai loài và các loài phụ như sau [41]:
- S. enterica subsp. enterica (còn gọi là loài phụ S. enterica I hay 1)

- S. enterica subsp. salamae (còn gọi là loài phụ S. enterica II hay 2)
- S. enterica subsp. arizonae (còn gọi là loài phụ S. enterica IIIa hay 3a)
- S. enterica subsp. diarizonae (còn gọi là loài phụ S. enterica IIIb hay 3b)
- S. enterica subsp. houtenae (còn gọi là loài phụ S. enterica IV hay 4)
- S. enterica subsp. indica (còn gọi là loài phụ S. enterica VI hay 6)
- S. bogori.
Trên thực tế, các dòng Salmonella được gọi tên không theo tên của loài hay
loài phụ mà thông thường được gọi tên theo kiểu huyết thanh (serotype). Sự phân
bố các kiểu huyết thanh theo các loài hay loài phụ như sau [41], [46]:
- S. enterica subspecies enterica (I): 1379 serotypese
- S. enterica subsp. salamae (II): 466 kiểu huyết thanh
- S. enterica subsp. arizonae (IIIa): 93 kiểu huyết thanh
- S. enterica subsp. diarizonae (IIIb): 309 kiểu huyết thanh
- S. enterica subsp. houtenae (IV): 64 kiểu huyết thanh
- S. enterica subsp. indica (VI): 10 kiểu huyết thanh
- S. bongori (V): 18 kiểu huyết thanh
Các kiểu huyết thanh thuộc loài phụ S. enterica I thông thường được gọi theo
tên địa danh nơi phân lập, trong đó tên của kiểu huyết thanh được viết hoa và không
in nghiêng [41]. Ví dụ: S. enterica I có kiểu huyết thanh Typhimurium được gọi tên
là Salmonella Typhimurium. Từ năm 1984, các tên kiểu huyết thanh không cần phải
viết hoa nữa.
Trong luận án này tên của các dòng Salmonella được gọi theo một trong hai
cách như sau:
- Gọi theo loài phụ: ví dụ, Salmonella enterica I để chỉ cho loài phụ
Salmonella enterica subsp. enterica.

Nghiên cứu phân biệt loài phụ Salmonella gây bệnh với các loài phụ khác trong thực phẩm bằng kỹ thuật sinh học
phân tử - Luận án tiến sĩ, chuyên ngành Vi sinh, 2010



Chương 1. Tổng quan tài liệu

9

Nguyễn Tiến Dũng

- Gọi theo kiểu huyết thanh: ví dụ, Salmonella typhimurium là S. enterica I
có kiểu huyết thanh Typhimurium.
Một số kiểu huyết thanh không được đặc tên thì gọi tên theo công thức kháng
nguyên của chúng. Ví dụ: Salmonella enterica IIIb có kiểu huyết thanh 60:k:z được
viết như sau: Salmonella 60:k:z.
Các loài phụ của loài S. enterica được phân biệt dựa vào các đặc tính sinh
hóa như sau [41],[73],[74]:
- S. enterica I không lên men lactose, lên men dulcitol sinh acid, sử dụng
được tartrate nhưng không sử dụng được galacturonate.
- S. enterica II không lên men lactose, lên men dulcitol sinh acid, có khả
năng dử dụng malonate, galacturonate, tartrate và làm tan gelatin.
- S. enterica IIIa lên men lactose sinh acid, không lên men dulcitol và
inositol, có khả năng sử dụng malonate nhưng không có khả năng sử dụng
galacturonate.
- S. enterica IIIb không lên men lactose trong 24 giờ nuôi cấy nhưng lên men
được sau 24 giờ nuôi cấy, không sử dụng dulcitol và inositol, sử dụng được
malonate.
- S. enterica IV không lên men lactose, inositol và dulcitol, có thể sử dụng
được salicin, phản ứng dương tính với kali cyanua (KCN), âm tính với ONPG (o nitrophenyl--D-galactopyranoside).
- S. enterica VI không lên men inositol và sorbitol. Một số kiểu huyết thanh
trong nhóm này có thể lên men lactose và dulcitol, không sử dụng salicin, malonate,
tartrate, sorbitol, làm tan gelatin.
Trường hợp S. bongori (hay còn gọi là Salmonella V), loài này có đặc điểm
sinh hóa như sau: không lên men lactose, inositol nhưng lên men dulcitol, phản ứng

dương tính với kali cyanua (KCN) và ONPG.

Nghiên cứu phân biệt loài phụ Salmonella gây bệnh với các loài phụ khác trong thực phẩm bằng kỹ thuật sinh học
phân tử - Luận án tiến sĩ, chuyên ngành Vi sinh, 2010


Chương 1. Tổng quan tài liệu

10

Nguyễn Tiến Dũng

1.2. Đặc điểm sinh học và tính chất nuôi cấy
Salmonella có dạng hình que, kích thước khoảng 0,4 – 0,6 x 1,0 – 3,0µm, có
khả năng tăng trưởng cả trong điều kiện hiếu khí và kị khí, không có khả năng hình
thành bào tử, nhuộm Gram (-). Phần lớn Salmonella có khả năng di động nhờ lông
roi; một số ít các kiểu huyết thanh không di động như S. gallinarum và S. pullorum
[2],[73].
Salmonella có thể phát triển trong khoảng nhiệt độ từ 5,2 - 46,2oC và pH từ
3,7- 9,5, nhiệt độ tối ưu là 37C, pH tối ưu trong khoảng 6,8 - 7,2. Vi khuẩn này có
tính chịu nhiệt kém, bị tiêu diệt ở nhiệt độ 50C trong 1 giờ, 70C trong 15 phút,
100C trong 5 phút. Vi khuẩn này dễ dàng được nuôi cấy trên các môi trường thông
thường, phát triển thành các khuẩn lạc có đường kính trong khoảng 2 - 4mm, trơn
láng, bờ đều. Khi phát tiển trong môi trường lỏng, Salmonella cho canh khuẩn đục
đều, lắng cặn khi kéo dài thời gian nuôi cấy và trên bề mặt môi trường có lớp ván
mỏng [2],[3],[73].
Trên môi trường thạch XLD (Xylose Lysine Desoxycholate), khuẩn lạc
Salmonella điển hình có dạng trong suốt, hơi nhuốm đỏ, đôi khi có tâm đen, thường
có vùng đỏ hồng xung quanh (Hình 1.1). Trên môi trường thạch BPLS (Brilliant
Green Phenol red Lactose Sucrose), Salmonella có khuẩn lạc trong suốt, có vùng đỏ

hồng xung quanh, không có tâm đen. Trên môi trường BSA (Bismuth Sulphite
Agar), S. typhi có khuẩn lạc dẹt, khô, đen nhánh, môi trường xung quanh chuyển
thành màu nâu đen và thường có ánh kim bạc phớt trên bề mặt môi trường. Các
dạng Salmonella khác tạo khuẩn lạc xanh lá cây hoặc đen ướt, không có vùng nâu
đen bao quanh. Trên môi trường thạch MC (Mac Conkey Agar), Salmonella tạo
khuẩn lạc có dạng dẹt, trong, ở tâm hơi tím đỏ và làm biến đổi môi trường từ hồng
sang hơi vàng [47].

Nghiên cứu phân biệt loài phụ Salmonella gây bệnh với các loài phụ khác trong thực phẩm bằng kỹ thuật sinh học
phân tử - Luận án tiến sĩ, chuyên ngành Vi sinh, 2010


Chương 1. Tổng quan tài liệu

11

Nguyễn Tiến Dũng

Hình 1.1. Khuẩn lạc Salmonella trên môi trường XLD

1.3. Đặc điểm kháng nguyên
Salmonella có 3 loại kháng nguyên chính là: kháng nguyên H (hay kháng
nguyên lông, flagella); kháng nguyên Vi (hay kháng nguyên vỏ, capsul) và kháng
nguyên O (hay kháng nguyên màng tế bào, somatic membrane). Cấu trúc kháng
nguyên của Salmonella được sử dụng để xác định nguồn gốc các chủng gây nên các
triệu chứng lâm sàng từ các mẫu bệnh phẩm hay từ các nguồn phân lập khác. Kiểu
kháng nguyên được chia thành 9 nhóm từ A - I, mỗi nhóm gồm các kiểu kháng
nguyên được chia chi tiết hơn. Cho đến nay đã có 2339 kiểu kháng nguyên của
Salmonella đã được xác định [2],[3],[74].


- Kháng nguyên H
Kháng nguyên H là các kháng nguyên lông (tiên mao), có thể được biểu hiện
ở dạng một pha duy nhất hay hai pha (pha 1 và pha 2): kháng nguyên pha 1 có tính
đặc hiệu chỉ gắn với kháng thể tương ứng; kháng nguyên pha 2 không đặc hiệu, có
thể gắn với các kháng thể khác loại. Pha đặc hiệu của kháng nguyên H được dùng
làm tiêu chí bổ sung khi cần xác định các dòng Salmonella có cùng kiểu kháng
nguyên O.
- Kháng nguyên Vi
Kháng nguyên Vi là loại kháng nguyên vỏ, hiện diện trên vỏ polysaccharide
ở bên ngoài và thường kết hợp với tính gây độc chuyên biệt cho vật chủ.
- Kháng nguyên O
Kháng nguyên O là thành phần O-polysaccharide của phức hợp
lipopolysaccharide (LPS) của màng ngoài tế bào Salmonella. LPS gồm 3 thành
Nghiên cứu phân biệt loài phụ Salmonella gây bệnh với các loài phụ khác trong thực phẩm bằng kỹ thuật sinh học
phân tử - Luận án tiến sĩ, chuyên ngành Vi sinh, 2010


Chương 1. Tổng quan tài liệu

12

Nguyễn Tiến Dũng

phần: bên ngoài là màng O-polysaccharide, phần chính giữa (R) và một màng lipid
bên trong. LPS là nội độc tố được phóng thích khi tế bào bị ly giải, đóng vai trò
quan trọng trong sự gây bệnh của Salmonella. Cấu trúc lặp lại một cách tự nhiên
của các tiểu đơn vị đường ở chuỗi O-polysacchaside quyết định tính đặc hiệu của
kháng nguyên O và đặc tính gây bệnh của từng kiểu huyết thanh. Những chủng
Salmonella kháng nguyên O được gọi là thể nhám (rough) bởi chúng có khuẩn lạc
xù xì, bị mất hay giảm đặc tính gây bệnh so với dạng hoang dại thể trơn (smooth)

còn đầy đủ các chuổi trình tự O-polysaccharide [74].

1.4. Bệnh do Salmonella
Salmonella được coi là một trong những vi sinh vật gây bệnh rất nguy hiểm
cho người và động vật. Các bệnh do vi khuẩn này gây nên thường là sốt thương hàn,
nhiễm trùng máu, viêm ruột kết và nhiễm trung tâm. Viêm ruột kết là một trong
những bệnh phổ biến nhất gây ra bởi Salmonella. Các bệnh như nhiễm trùng máu và
xâm nhiễm trung tâm là những bệnh gây ra sau khi viêm ruột kết. Sốt thương hàn
được gây ra bởi S. typhi, S. paratyphi và một số kiểu huyết thanh khác [6],[9].
Salmonella hiện diện khắp nơi trong tự nhiên như trong nước, trong đất, trên
gia cầm, các động vật nuôi, động vật hoang dại, các loài côn trùng, cá, tôm, trong
thực phẩm… Tuy nhiên chỉ một số ít các chủng phân lập được xác định theo kiểu
huyết thanh [19],[74].
S. enterica I là đối tượng gây bệnh rất quan trọng cho người và động vật bậc
cao. Tất cả các kiểu huyết thanh được phân lập từ các mẫu bệnh phẩm của người
đều thuộc loài phụ này [9]. Đây là nhóm tiến hóa cao nhất của giống Salmonella, có
thể xâm nhiễm chuyên biệt vào các mô sâu và xuyên thủng hệ thống phòng vệ của
các động vật có hệ miễn dịch hoàn hảo.
Theo nghiên cứu tại Viện Vệ sinh phòng dịch Hà Nội [19],[29], các kiểu
huyết thanh S. typhi, S. typhimurium và S. enteritidis là những kiểu huyết thanh
thường xuyên được phân lập từ các bệnh nhân tại Việt Nam. Đây cũng là hai kiểu
huyết thanh gây bệnh thường xuyên được phân lập từ các nước phương Tây.
Nghiên cứu phân biệt loài phụ Salmonella gây bệnh với các loài phụ khác trong thực phẩm bằng kỹ thuật sinh học
phân tử - Luận án tiến sĩ, chuyên ngành Vi sinh, 2010


Chương 1. Tổng quan tài liệu

13


Nguyễn Tiến Dũng

Tại Mỹ, hằng năm có khoảng 40.000 trường hợp bị nhiễm bệnh do
Salmonella được báo cáo. Tuy nhiên con số này được cho là chỉ chiếm 1-5% số
lượng nhiễm bệnh thật sự và ước tính có khoảng 2-4 triệu trường hợp nhiễm bệnh
với chi phí điều trị bệnh vào khoảng 2 tỉ USD. Mặc khác, số người nhiễm bệnh
Salmonella ngày càng có xu hướng gia tăng kể từ sau chiến tranh thế giới thứ hai
đến nay. Có nhiều nguyên nhân gây nên hiện tượng gia tăng số lượng người nhiễm
bệnh Salmonella, trong số đó có các nguyên nhân là sự gia tăng số lượng người già
trên 60 tuổi, sự thay đổi trong canh tác nông nghiệp, phân phối thực phẩm và ngày
càng có nhiều người tiêu thụ thực phẩm tươi sống hay chỉ qua phương thức nấu nhẹ
trước khi ăn. Sự lan truyền của bệnh Salmonella cho người chủ yếu qua con đường
thực phẩm. Tuy nhiên sự lây nhiễm trực tiếp giữa người và người hay động vật cho
người đôi khi cũng diễn ra [19],[73].

1.5. Đặc điểm di truyền liên quan đến tính gây bệnh của Salmonella
1.5.1. Đặc điểm bộ gen
Cấu trúc bộ gen DNA của S. typhimurium rất giống với E. coli, gồm một
phân tử DNA vòng có kích thước khoảng 4 x 106bp dài khoảng 1,4mm, mã hoá cho
khoảng 4800 gen [9,10]. Cho đến nay bộ gen của 2 kiểu huyết thanh S.
typhimurium và S. typhi đã được giải mã. Ngoài các vùng có trình tự tương đồng
cao với E. coli, ở Salmonella còn có sự hiện diện của các vùng gây bệnh PAI
(pathogenicity islands) mã hóa cho nhiều nhân tố gây độc của Salmonella. Các PAI
thường có hàm lượng GC rất khác so với phần còn lại của nhiễm sắc thể. Các gen
thuộc vùng này được hình thành từ quá trình tiến hóa của vi khuẩn này [9],[45].
Bowe và cộng sự đã phát hiện ra rằng có ít nhất 4% bộ gen của S. typhimurium cần
thiết cho quá trình xâm nhiễm, gây chết chuột và hầu hết các gen gây bệnh là cần
thiết cho giai đoạn đầu của quá trình xâm nhiễm. Số lượng lớn các gen gây bệnh
cho thấy rằng sự sống sót trong vật chủ cần có sự cân bằng tinh tế của nhiều gen
hoạt động một cách chính xác tại đúng thời điểm và trong môi trường thích hợp

[48],[51]
Nghiên cứu phân biệt loài phụ Salmonella gây bệnh với các loài phụ khác trong thực phẩm bằng kỹ thuật sinh học
phân tử - Luận án tiến sĩ, chuyên ngành Vi sinh, 2010


Chương 1. Tổng quan tài liệu

14

Nguyễn Tiến Dũng

1.5.2. Các cụm gây bệnh
Một số PAI hiện diện ở Salmonella đã được xác định cho đến nay [45],[48],
bao gồm:
- SPI-1 là cụm gen dài 40kb tại vị trí 63 phút trên DNA của Salmonella, có
vai trò trong sự xâm nhiễm của Salmonella vào các tế bào biểu mô và vô hiệu hóa
đại thực bào của vật chủ.
- SPI-2 là cụm gen dài 40kb tại vị trí 31 phút trong locus tRNA val, giúp
Salmonella xâm nhiễm và sống sót bên trong các đại thực bào. Các thể đột biến trên
SPI-2 có độc lực giảm rất nhiều, chúng không thể nhân lên trong các cơ quan như
gan, lách của vật chủ nhiễm bệnh, cũng như giảm khả năng vựợt qua mảng Peyer để
đi vào trong biểu mô ruột. Các nghiên cứu in vitro cũng cho thấy rằng các thể đột
biến SPI-2 bị giảm khả năng sống sót trong đại thực bào và khả năng nhân lên trong
các tế bào bạch cầu đơn nhân.
- SPI-3 là cụm gen được định vị tại locus 82 phút trên bộ gen, ngay sau salC,
một locus của tRNA. Cụm gen này mã hóa cho 10 khung đọc mở ORF (open
reading frame) và 6 đơn vị phiên mã trong đó có operon mgtCB (mã hóa cho protein
MgtC và protein MgtB vận chuyển Mg2+, có vai trò giúp Salmonella sống sót trong
đại thực bào) [11].
- SPI-4 dài 27kb tại vị trí 92 phút trên DNA bộ gen. Cụm gen này mã hóa

cho 18 protein được cho là có vai trò giúp Salmonella sống sót trong đại thực bào
vật chủ [57].
- SPI-5 được định vị tại locus tRNA ser ở vị trí 20 phút trên nhiễm sắc thể, mã
hóa cho các gen giúp Salmonella sống sót sót trong đại thực bào [57].
- SPI-6 định vị bên cạnh tRNAphe, giúp Salmonella tồn tại được trong đại
thực bào. Cụm gen này có hai khung đọc mở ORF rất giống các gen atsAB của
Klebsiella aerogenes mã hóa cho arylsulfatase. Ngoài ra còn có ORF mã hóa gen
stmR được cảm ứng khi Salmonella hiện diện trong đại thực bào, bốn ORF khác
liên quan đến khả năng sống sót được trong đại thực bào [45],[48].

Nghiên cứu phân biệt loài phụ Salmonella gây bệnh với các loài phụ khác trong thực phẩm bằng kỹ thuật sinh học
phân tử - Luận án tiến sĩ, chuyên ngành Vi sinh, 2010


Chương 1. Tổng quan tài liệu

15

Nguyễn Tiến Dũng

Các cụm SPI có đặc điểm chung là mang phần gen có liên quan về chức
năng với nhau và cần thiết cho các kiểu hình gây bệnh chuyên biệt được hình thành
từ quá trình tiến hóa theo hướng tăng cường tính gây bệnh ở Salmonella.
Salmonella được tiến hóa qua 3 giai đoạn (Hình 2.2) [9].
1.5.3. Các gen gây độc
- invA
Locus inv hiện diện ở cụm gen SPI-1 gồm các gen giúp Salmonella xâm
nhiễm được vào các tế bào biểu mô ruột. Một vài gen thuộc locus này được biểu
hiện và protein được tiết vào môi trường tương tác với biểu mô vật chủ. Gen hilA
(hyper invasive locus) mã hóa cho protein HilA có vai trò trong điều hòa sự phiên

mã cac gen inv thông qua tín hiệu hàm lượng ôxi thấp ở ruột. Gen invA là một thành
viên của locus inv, có vị trí tại 59 phút trên nhiễm sắc thể của Salmonella. Các đột
biến trên gen invA làm giảm 500 lần khả năng xâm nhiễm tế bào biểu mô của
Salmonella nhưng không ảnh hưỏng đến khả năng bám dính vào các tế bào này vào
màng nhầy. Gen invA được xác nhận là hiện diện trên hầu hết các chủng Salmonella
[25],[27],[63].
- iagAB
Gen iagA, còn gọi là gen hilA, mã hoá cho protein hoạt hóa sự phiên mã các
gen gây xâm nhiễm ở Salmonella, đồng thời có ảnh hưởng trực tiếp hoặc gián tiếp
đến sự biểu hiện của các gen phoPQ. Gen iagB, nằm liền kề ngay sau iagA, có chức
năng chưa được xác định. Các gen iagAB được chứng minh là chỉ hiện diện ở các
kiểu huyết thanh thuộc loài phụ S. enterica I [71],[72].
- Gen phoPQ
Gen pho PQ mã hóa cho 2 thành phần chức năng PhoP và PhoQ của hệ
thống điều hòa 2 thành phần (two components reguratory system) PhoP/PhoQ có
vai trò trong tính gây độc của Salmonella. Đột biến trên một trong 2 gen phoP hoặc
phoQ này đều làm tăng LD50 lên đến 104 lần và giảm khả năng sống sót cuả
Salmonella trong đại thực bào. Hệ thống PhoP/PhoQ có vai trò hoạt hóa các gen,

Nghiên cứu phân biệt loài phụ Salmonella gây bệnh với các loài phụ khác trong thực phẩm bằng kỹ thuật sinh học
phân tử - Luận án tiến sĩ, chuyên ngành Vi sinh, 2010


Chương 1. Tổng quan tài liệu

16

Nguyễn Tiến Dũng

trong đó sự hoạt hóa gen pag liên quan mật thiết đến sự sống sót của Salmonella

trong đại thực bào và tăng sức đề kháng của Salmonella đối với kháng sinh [23].
PhoQ là một protein cảm biến Mg2+ (Mg2+ sensor). Khi nồng độ Mg2+ đạt
mức mM thì, thông qua PhoP, protein này sẽ ức chế phiên mã 25 locus trong đó có
các gen giúp sự tăng trưởng của Salmonella. Ngoài Mg2+, Ca2+ và Mn2+ cũng được
cảm biến bởi PhoQ. Hệ thống PhoP/PhoQ không chỉ liên quan đến tính gây bệnh
của Salmonella mà còn liên quan đến các đặc điểm khác ở vi khuẩn này [36],[40].
- pmrAB
Các gen pmrA và pmrB mã hóa cho hai protein PmrA và PmrB thuộc hệ
thống điều hòa hai thành phần PmrA/PmrB hiện diện ở Salmonella và các vi khuẩn
gram âm khác, trong đó PmrA là protein điều hòa và PmrB là protein cảm biến
(sensor). PmrA/PmrB được chứng minh có liên quan đến khả năng kháng
polymyxin B của vi khuẩn. PmrA/PmrB chịu sự điều hòa bởi hệ thống PhoP/PhoQ.
PmrB cảm biến nồng độ cao của sắt nên có vai trò trong khả năng tăng trưởng của
Salmonella trong môi trường có nồng độ ion Fe2+ ở mức độc đối với tế bào [7].
- ssrAB
Gen ssrA mã hóa cho SsrA có vai trò cảm biến; gen ssrB mã hóa cho SsrB là
protein điều hòa của hệ thống điều hòa hai thành phần SsrA/SsrB. Hệ thống này
điều hòa sự hình thành các thành phần của hệ thống tiết loại III (type III sorting
system) có vai trò trong sự nhân lên của Salmonella trong đại thực bào và khả năng
truyền nhiễm khắp cơ thể chuột. Gen ssrAB nằm trong cụm gen SPI-2 và chịu sự
điều hòa ở mức phiên mã bởi một thành phần của hệ thống điều hòa hai thành phần
EnvZ/OmpR. Trong thể thực bào của đại thực bào, các chất có tính ôxi hóa mạnh là
nguyên nhân gây hư hỏng DNA, protein và làm chết tế bào vi khuẩn. Do đó, khả
năng sửa chữa các sai hỏng trên DNA và protein của vi khuẩn có quan hệ chặt chẽ
với tính gây bệnh của vi khuẩn. SsrA giúp vi khuẩn chống lại môt phần tổn thương
do bị ôxi hóa bằng cách ngăn sự tạo thành các protein bất bình thường có độc tính
cho tế bào vi khuẩn [12,18].

Nghiên cứu phân biệt loài phụ Salmonella gây bệnh với các loài phụ khác trong thực phẩm bằng kỹ thuật sinh học
phân tử - Luận án tiến sĩ, chuyên ngành Vi sinh, 2010



Chương 1. Tổng quan tài liệu

17

Nguyễn Tiến Dũng

- rpoS
Gen rpoS mã hóa cho nhân tố sigma RpoS có vai trò giúp các vi khuẩn thuộc
Enterobacteriaceae sống sót trong pha ổn định và thích nghi với các điều kiện thay
đổi đột ngột của môi trường. RpoS liên quan đến sự phiên mã của một họ gen gồm
50 gen. Ở S. typhimurium, RpoS điều khiển sự biểu hiện của các gen thuộc plasmid
gây độc spv, cần cho quá trình lan nhiễm của mầm bệnh khắp vật chủ. rpoS được
biểu hiện mạnh sau khi xảy ra quá trình thực bào cũng như khi vi khuẩn đi vào
trong các tế bào biểu mô. Hàm lượng RpoS tăng làm gia tăng sự biểu hiện của
protein điều hòa SpvR và làm tăng đáng kể sự phiên mã của các gen cấu trúc
spvABCD. Các thể đột biến trên rpoS có sự biểu hiện của spv giảm đồng thời độc
lực cũng suy giảm [54],[70].
- recD
Gen recD mã hóa cho một exonuclease V trong phức hợp enzyme RecBCD
có vai trò trong tái tổ hợp di truyền và sửa chữa các hư hỏng trên DNA. Để có thể
truyền nhiễm khắp cơ thể vật chủ, Salmonella phải sống sót và nhân lên được trong
các thực bào. Một trong các cơ chế giúp Salmonella tồn tại được trong thực bào là
khả năng sửa chữa sai hỏng trên DNA gây ra bởi các chất ôxi hóa mạnh do thực bào
tạo ra. Các thể đột biến mất chức năng của RecA và RecBC ở S. enterica sẽ bị mất
độc tính và có tính mẫn cảm cao với các chất ôxi hóa do thực bào tạo ra [32],[67].
- spvRABCD
Nhiều kiểu huyết thanh thuộc loài phụ S. enterica I có mang một plasmid lớn
với số lượng bản sao thấp chứa các gen gây bệnh có kích thước từ 50 đến 90kb và

có một vùng chung dài 7,8kb được gọi là spv. Vùng spv gồm 5 gen spvRABCD
được điều hòa phiên mã bởi nhân tố sigma RpoS. SpvR là protein điều hòa hoạt hóa
cần cho sự biểu hiện của các gen spv khác. SpvA là một protein 28kDa hiện diện
trên màng ngoài của Salmonella không liên quan đến độc lực của vi khuẩn này.
SpvB là một protein màng, kích thước 66kDa, hiện diện ở màng trong, có liên quan
đến độc lực của Salmonella. Các thể đột biến trên spvB không còn độc lực của
Salmonella. SpvB có hoạt tính ức chế sự polymer hóa của actin trong tế bào chủ và
Nghiên cứu phân biệt loài phụ Salmonella gây bệnh với các loài phụ khác trong thực phẩm bằng kỹ thuật sinh học
phân tử - Luận án tiến sĩ, chuyên ngành Vi sinh, 2010


Chương 1. Tổng quan tài liệu

18

Nguyễn Tiến Dũng

có thể liên quan đến khả năng ức chế sự kết hợp của thể thực bào và lysosome trong
quá trình thực bào. SpvC là một protein 28kDa hiện diện trong tế bào chất. SpvD có
kích thước 25kDa được tiết ra khỏi tế bào. Các thể đột biến trên spvD và spvC ở
Salmonella thể hiện kiểu hình mất độc lực [25],[54],[63]. Nói chung locus spv giúp
Salmonella tăng cường sự phân chia trong các tế bào biểu mô và có vai trò trong sự
lan nhiễm của Salmonella vào gan và lách.

1.6. Đặc điểm tiến hóa về tính gây bệnh
Bằng các phương pháp điện di emzym đa locus, phân tích trình tự bộ gen,
phân tích rRNA và lai DNA-DNA người ta đã xác định giống Salmonella gồm hai
nhánh tiến hóa với hai loài hoàn toàn khác biệt là S. enterica và S. bongori. Hai loài
này khác biệt nhau về cấu trúc di truyền các gen thông thường và các cụm gen gây
bệnh SPI. S. enterica chứa cụm gen gây bệnh SPI-2, không có ở S. bongori. SPI-2

có tỉ lệ C+G khoảng 40%, thấp hơn tỉ lệ C+G 52% trên toàn bộ gen của S. enterica.
Thí nghiệm trên chuột cho thấy việc gây đột biến trên vùng gen SPI-2 đã có tác
dụng làm yếu 10.000 lần tính gây bệnh của S. typhimurium [9].
Trong quá trình tiến hóa, S. enterica đã phân hoá thành các loài phụ khác
nhau. S. enterica I có phổ xâm nhiễm rộng rãi nhất, được tìm thấy trong tất cả các
loài động vật máu nóng. S. enterica II, IIIa, IIIb, IV, VI và VII chỉ xâm nhiễm được
vào trong các tế bào của động vật máu lạnh [48],[51].
1.6.1. Các bước tiến hóa về tính gây bệnh của giống Salmonella
Ba bước tiến hóa chính trong quá trình hình thành tính gây bệnh ở
Salmonella được minh họa trên Hình 1.2. [9],[51].
- Bước 1: tiến hóa theo hướng hình thành cụm gen SPI-1 là bước đầu tiên để
hình thành Salmonella phân biệt với E. coli và những vi khuẩn đường ruột khác có
quan hệ gần gũi với Salmonella. Sự xuất hiện của cụm gen SPI-1 đã hình thành
giống Salmonella trong họ vi khuẩn đường ruột Enterobacteriaceae.

Nghiên cứu phân biệt loài phụ Salmonella gây bệnh với các loài phụ khác trong thực phẩm bằng kỹ thuật sinh học
phân tử - Luận án tiến sĩ, chuyên ngành Vi sinh, 2010


Chng 1. Tng quan ti liu

19

Nguyn Tin Dng

- Bc 2: l bc tin húa trong ging Salmonella chia thnh 2 loi S.
enterica v S. bongori. Cỏc kiu huyt thanh trong S. enterica cú thờm 1 cm gen
gõy bnh SPI-2.
S. enterica I
P h a I I I : M ụ ỷ r o ọn g p h a ùm

v i t e ỏ b a ứo c h u ỷ ủ e ỏn c a ực
ủ o ọn g v a ọ t m a ựu n o ựn g

P h a I I : C o ự c a ực g e n c a n
t h i e ỏt c h o q u a ự t r ỡ n h x a õm
n h i e óm v a ứo c a ực m o õ s a õu
hụn

P h a I : C o ự c a ực g e n c a n
t h i e ỏt c h o q u a ự t r ỡ n h
x a õm n h i e óm ủ ử ụ ứn g
r u o ọt

S. enterica II,
IIIa, IIIb, IV, VI

S. bongori

Escherichia coli

Hỡnh 1.2. Quỏ trỡnh tin húa hỡnh thnh tớnh gõy bnh Salmonella.

- Bc 3: l bc tin hoỏ trong quỏ trỡnh thớch nghi v gõy bnh cho vt
ch. S. enterica I tin hoỏ theo chiu hng tng cng kh nng thớch nghi v gõy
bnh cho cỏc ng vt mỏu núng. Mt s chng trong loi ph ny tin hoỏ theo
chiu hng thớch nghi chuyờn bit trong mt nhúm ký ch. S tin húa ny nhm
thớch nghi chuyờn bit vi mt h min dch c trng ca mt nhúm ký ch.
1.6.2. Tin hoỏ theo hng tng tớnh gõy bnh
Mc dự S. enterica cú 1.367 kiu huyt thanh khỏc nhau nhng ch cú mt s
ớt trong s ny gõy bnh cho cỏc ng vt cú vỳ bc cao v cú mc thớch nghi

Hỡnh
I: Mụ
hỡnh
hoỏ Nhng
ca quỏ trỡnh
y bnhthanh
ging
Cú ba
khỏc
nhau
trong
vttin
ch.
kiu gõhuyt
mtSalmonella.
tớnh c hiu
vtgiai
chon
nh S.
tin hoỏ t khớ tỏch khũi E.coli

Typhymurium, S. enteritidis thng xõm nhim v gõy bnh cho cỏc ng vt cũn
non nhiu hn i vi nhng ng vt trng thnh. iu ny cho thy chỳng kộm

Nghiờn cu phõn bit loi ph Salmonella gõy bnh vi cỏc loi ph khỏc trong thc phm bng k thut sinh hc
phõn t - Lun ỏn tin s, chuyờn ngnh Vi sinh, 2010


Chương 1. Tổng quan tài liệu


20

Nguyễn Tiến Dũng

thích ứng đối với những động vật có hệ miễn dịch hoàn chỉnh. Ngược lại các kiểu
huyết thanh đặc hiệu với vật chủ thì khả năng cao trong chọc thủng hệ thống phòng
vệ của động vật trưởng thành, có tính gây bệnh mạnh hơn và tỉ lệ gây tử vong rất
cao. Mặc dù có giả thuyết cho rằng các dòng vi khuẩn gây bệnh có tỉ lệ gây chết cao
ở động vật có xương sống thường tiến hóa theo hướng hình thành những dạng ít gây
bệnh để thích nghi tốt hơn trong tế bào chủ, tuy nhiên S. enterica lại tiến hóa theo
hướng hình thành những dòng có khả năng gây tử vong cao hơn. Ví dụ S. typhi có
tính đặc hiệu rất cao với người, gây bệnh sốt thương hàn với tỉ lệ gây tử vong từ 232%, S. typhimurium, S. enteritidis có tỉ lệ gây tử vong khoảng 0,5% [9].
Mô hình toán học của Anderson và Hay cho phép tiên đoán rằng nếu nhân tố
gây bệnh ở dòng Salmonella có tính gây bệnh ở mức độ cao được chuyển vào một
dòng vi khuẩn gây bệnh cho một vật chủ cụ thể thì sự tiến hoá sẽ theo hướng tăng
mức độ gây bệnh. Trong quá trình tiến hoá của các kiểu huyết thanh Salmonella
hướng vào người dường như có sự liên kết giữa tính gây bệnh cao và khả năng phát
triển thành bệnh mãn tính. Một cá thể mang bệnh mãn tính có khả năng truyền
nhiễm cho một số lớn các cá thể khác, qua đó gia tăng mức độ lan truyền và tạo áp
lực chọn lọc để tiến hóa thành các chủng có tính gây bệnh với độc lực cao như
trường hợp của các kiểu huyết thanh Salmonella gây thương hàn và phó thương hàn
ở người [33],[52].
1.6.3. Loài phụ S. entreica I tiến hóa theo hướng thích nghi với vật chủ là
người và động vật máu nóng
Các kiểu huyết thanh O thuộc 9 nhóm A, B, C1, C2, D, E1, E2, E3 và E4 của
Salmonella, theo hệ thống phân loại của Kauffmann White, là thuộc loài phụ S.
enterica I, theo hệ thống phân loại của Edwards và Ewing. Đây là các nhóm thường
xuyên được phân lập từ người và động vật máu nóng. Ngược lại các loài phụ S.
enterica II, IIIa, IIIb, IV, VI và S. bongori rất hiếm khi được phân lập từ người mà
chủ yếu được phân lập được từ các loài động vật máu lạnh và từ môi trường. Trên

95% các kiểu huyết thanh phân lập từ các mẫu bệnh phẩm thuộc loài phụ này. Báo
cáo năm 1991 của Trung tâm Nghiên cứu Thú y và Dinh dưỡng (CNEVA) của Pháp
Nghiên cứu phân biệt loài phụ Salmonella gây bệnh với các loài phụ khác trong thực phẩm bằng kỹ thuật sinh học
phân tử - Luận án tiến sĩ, chuyên ngành Vi sinh, 2010


Chương 1. Tổng quan tài liệu

21

Nguyễn Tiến Dũng

cho thấy loài phụ này chiếm 99,2% các chủng phân lập được từ động vật và người
[50].
Các thí nghiệm gây nhiễm S. enterica II hay III bằng đường miệng lên các
loài động vật như rắn, rùa hay thằn lằn cho thấy các loài phụ này chỉ gây các triệu
chứng bệnh liên quan đến đường ruột, không xâm nhiễm sâu hơn trong cơ thể vật
chủ. Ngược lại các kiểu huyết thanh thuộc S. enterica I tạo được khuẩn lạc tại các
mô đường ruột của các loài động vật máu nóng và có thể nhân lên bên trong tế bào
ở màng trong của hệ tuần hoàn, thích nghi được với hệ thống không chuyên biệt của
vật chủ. Sự thích nghi của một kiểu huyết thanh trong một vật chủ cụ thể đòi hỏi
Salmonella phải thích nghi với tế bào bạch cầu đơn nhân của vật chủ đó và các bạch
cầu đơn nhân là một rào chắn quan trọng kháng lại sự xâm nhiễm của các kiểu
huyết thanh gây bệnh. S. typhi có thể sống sót trong các đại thực bào của người
nhưng không thể sống trong các đại thực bào của chuột, ngược lại S. typhimurium
có thể sống sót trong các đại thực bào của chuột nhưng không thể sống trong các đại
thực bào của người trong các thí nghiệm nuôi cấy in vitro. Các nghiên cứu đã công
bố cho thấy khả năng gây bệnh của các kiểu huyết thanh Salmonella có mối liên hệ
trực tiếp với khả năng chống chịu lại các đại thực bào của vật chủ.
1.6.4. Tiến hóa của protein có vai trò bám dính có liên quan đến phổ vật chủ

Các kiểu huyết thanh của Salmonella bắt đầu sự xâm nhiễm bằng sự bám
dính vào màng nhầy thành ruột của vật chủ thông qua các cấu trúc protein được
hình thành từ protein đơn vị invH được mã hóa bởi gen tương ứng hiện diện ở cụm
gen SPI-1. Khi đột biến bất hoạt gen này thì sự bám dính và sự xâm nhiễm của thể
đột biến bị giảm. Ngược lại đột biến trên invA hay invE (có vai trò trong xâm
nhiễm) thì không ảnh hưởng đến sự bám dính của thể đột biến. Việc so sánh hiệu
quả quá trình gây bệnh của thể đột biến trên invH với các thể đột biến trên các gen
khác trên SPI-1 cho thấy tính quan trọng của sự bám dính trong quá trình xâm
nhiễm của Salmonella lên các vật chủ khác nhau [42].
Ngoài invH, Salmonella còn mang một số gen mã hóa cho các protein khác
có vai trò trong sự bám dính như Pef, Lpf, Fim, Arg. Sự đa dạng của các operon mã
Nghiên cứu phân biệt loài phụ Salmonella gây bệnh với các loài phụ khác trong thực phẩm bằng kỹ thuật sinh học
phân tử - Luận án tiến sĩ, chuyên ngành Vi sinh, 2010


Chương 1. Tổng quan tài liệu

22

Nguyễn Tiến Dũng

hoá cho các protein bám dính có vai trò làm tăng phổ vật chủ do các protein này có
thể thay thế lẫn nhau trong việc nhận ra tế bào biểu mô của vật chủ. Thí nghiệm
nuôi cấy mô ruột của chuột cho thấy các protein Pef, Lpf được mã hóa bởi pef và lpf
có vai trò trong việc gắn S. typhimurium vào lông nhung của thành ruột và các
mảng Peyer. Các nghiên cứu đã công bố cũng cho thấy protein bám dính đóng vai
trò chọn lọc để định hướng S. enterica tập trung lên bề mặt thành ruột của động vật,
một cơ chế quan trọng cho việc xác định phổ vật chủ. Các cấu trúc protein bám dính
được hình thành trên bề mặt tế bào của Salmonella và được nhận diện bởi các tế bào
biểu mô ruột của vật chủ. S. typhi nhận diện receptor là cấu trúc xơ nang để gắn lên

tế bào biểu mô ruột. Ngược lại, Salmonella typhimurium nhận diện một receptor
khác của tế bào biểu mô ruột. Sự khác biệt về protein bám dính và receptor quyết
định phổ vật chủ khác nhau giữa S. typhi và S. typhimurium. Sự trao đổi gen và sự
mất đoạn giúp tạo ra các dạng protein bám dính mới giúp Salmonella có phổ tế bảo
chủ mới trong quá trình tiến hóa của các kiểu huyết thanh S. enterica [5],[34].

1.7. Sự tương tác giữa Salmonella và vật chủ
1.7.1. Cấu tạo của hệ tiêu hóa của người và động vật máu nóng liên quan
đến quá trình xâm nhiễm của vi khuẩn
Các mầm bệnh xâm nhập qua đường thực phẩm nói chung, hay Salmonella
nói riêng, xâm nhiễm vào cơ thể vật chủ qua đường tiêu hóa. Hệ tiêu hóa là một hệ
thống bao gồm các cơ quan tiêu hóa, bắt đầu từ miệng và kết thúc ở hậu môn. Cùng
với các cơ quan này là hàng loạt các tuyến có chức năng tiết dịch tiêu hóa để tiêu
hóa thức ăn. Các cơ quan tiêu hóa bao gồm miệng, họng (hầu), thực quản, dạ dày,
ruột non, ruột già, trực tràng và hậu môn. Ruột non được chia ra làm 3 phần là tá
tràng, ruột chay, ruột hồi. Gan và lá lách không thuộc ống tiêu hóa nhưng có quan
hệ mật thiết với hệ này. Hệ tiêu hóa có dạng ống. Ống tiêu hóa bao gồm bốn lớp,
trong mỗi lớp có một loại mô chiếm ưu thế tạo nên chức năng chuyên biệt trong quá
trình tiêu hóa (Hình 1.3) [51]. Bốn lớp này tính từ trong ra ngoài gồm:

Nghiên cứu phân biệt loài phụ Salmonella gây bệnh với các loài phụ khác trong thực phẩm bằng kỹ thuật sinh học
phân tử - Luận án tiến sĩ, chuyên ngành Vi sinh, 2010


Chương 1. Tổng quan tài liệu

23

Nguyễn Tiến Dũng


Hình 1.3. Cấu tạo các lớp tạo nên ống tiêu hóa

- Lớp niêm mạc (mucusa)
Lớp niêm mạc bao gồm các lớp: (i) Lớp tế bào biểu mô tiếp xúc trực tiếp với
lồng ruột; (ii) Lớp lamina propria là một lớp mỏng gồm mô liên kết có hình khoanh,
mang nhiều mạch máu, các hạch bạch huyết có vai trò quan trọng trong việc bảo vệ
cơ thể; (iii) Lớp màng nhầy ngoài cùng, mỏng được cấu tạo bởi các tế bào cơ trơn.
- Lớp dưới niêm mạc (submucosa)
Lớp dưới niêm mạc tương đối mỏng, có các mô liên kết chứa các mạch bạch
huyết và mạch máu. Lớp dưới niêm mạc còn chứa các tuyến và mạng lưới thần kinh
điều khiển họat động của niêm mạc ruột.
- Lớp cơ trơn
Lớp cơ trơn gồm hai lớp mỏng: (i) Lớp trong bao gồm các cơ trơn sắp xếp
dạng tròn (cơ vòng); (ii) Lớp ngoài bao gồm các cơ sắp xếp song song theo chiều
dọc (cơ dọc). Sự kết hợp của hai dạng cơ này làm cho ống tiêu hóa có khả năng co
dãn một cách uyển chuyển để nén và đưa thức ăn vào trong lồng ruột. Giữa hai lớp
cơ này là mạng lưới thần kinh cơ ruột có vai trò rất quan trọng trong việc điều khiển
hoạt động của ống tiêu hóa.

Nghiên cứu phân biệt loài phụ Salmonella gây bệnh với các loài phụ khác trong thực phẩm bằng kỹ thuật sinh học
phân tử - Luận án tiến sĩ, chuyên ngành Vi sinh, 2010


Chương 1. Tổng quan tài liệu

24

Nguyễn Tiến Dũng

- Lớp áo vỏ (serosa)

Lớp áo vỏ là lớp ngoài cùng, có vai trò bao bọc và bảo vệ. Lớp này bao gồm
các mô liên kết hình khoanh được bao phủ bởi một lớp biểu mô hình vảy.
1.7.2. Sự tương tác giữa Salmonella và vật chủ
Khi Salmonella xâm nhập vào cơ thể sẽ gặp phải sự kháng cự của hệ thống
phòng vệ cơ thể. Mỗi bộ phận của hệ tiêu hóa vật chủ đều có những thành phần hóa
học, những đặc tính vật lý và hệ thống miễn dịch chống lại sự xâm nhập của tác
nhân xâm nhập. Để có thể gây bệnh, Salmonella phải thay đổi để phù hợp với môi
trường xung quanh và thích nghi với các tác nhân phòng vệ của vật chủ thông qua
việc phối hợp biểu hiện các gen. Cùng với những thay đổi để thích nghi với các tác
nhân phòng vệ của vật chủ, Salmonella phải hoạt hóa được cơ chế gây độc chuyên
biệt nhằm chống lại, lẫn tránh, thậm chí điều khiển một cách có hệ thống toàn bộ hệ
miễn dịch của cơ thể [33].
Quá trình xâm nhiễm của Salmonella được bắt đầu khi vật chủ tiêu thụ thức
ăn hay nước uống bị nhiễm khuẩn. Sau khi vượt qua được dạ dày, Salmonella
xuống tới ruột non. Sau khi đến phần cuối của ruột non, vi khuẩn phải thâm nhập
qua lớp niêm mạc trước khi gắn vào các tế bào biểu mô ruột. Quá trình gắn vào tế
bào biểu mô ruột được thực hiện nhờ các loại khuẩn mao trên tế bào vi khuẩn [35].
Những nghiên cứu ở mức hiển vi cho thấy các chủng Salmonella xâm chiếm
các tế bào biểu mô thông qua quá trình nhập bào. Một khoảng thời gian ngắn sau
khi vi khuẩn gắn vào lông tiếp xúc trên bề mặt tế bào biểu mô, bề mặt tế bào thay
đổi tạo nên các nang không bào bao quanh vi khuẩn. Các nang mang Salmonella
được đưa vào cơ thể thông qua quá trình nhập bào. Sự xâm nhập của vi khuẩn thông
qua quá trình nhập bào đòi hỏi phải có sự tổng hợp nhiều loại protein tế bào đồng
thời ngăn cản việc tái sắp xếp bộ khung tế bào làm ngăn cản sự di chuyển của
không bào mang Salmonella vào bên trong [51].
Ngoài việc xâm nhiễm vào tế bào biểu mô, các kiểu huyết thanh Salmonella
gây ra bệnh viêm ruột còn cảm ứng tế bào biểu mô tiết các tín hiệu làm di chuyển
các bạch cầu trung tính vào bên trong lớp lumen ruột. Các thí nghiệm trong mô hình
Nghiên cứu phân biệt loài phụ Salmonella gây bệnh với các loài phụ khác trong thực phẩm bằng kỹ thuật sinh học
phân tử - Luận án tiến sĩ, chuyên ngành Vi sinh, 2010



Chương 1. Tổng quan tài liệu

25

Nguyễn Tiến Dũng

nuôi cấy in vitro cho thấy sự hấp thu thêm bạch cầu trung tính xuyên qua bề mặt lớp
tế bào biểu mô để đi vào lumen cần phải có sự tổng hợp một số protein ở cả tế bào
vi khuẩn và tế bào biểu mô của vật chủ. Quá trình này có liên quan đến việc sản
xuất nhiều loại cytokines.
Kent và cộng sự đã gây nhiễm Salmonella vào khỉ nâu và theo dõi sự xâm
nhiễm vào tế bào biểu mô ở nhiều cơ quan vào những thời điểm khác nhau. Trong 4
ngày đầu, Salmonella xâm chiếm và phát triển trong ruột hồi, manh tràng, vùng
ngoại biên ruột kết, các nốt bạch huyết ở màng treo ruột, một số còn xâm chiếm
ruột chay, gan và lách. Salmonella tiếp tục tồn tại trong các nốt bạch huyết ở màng
treo ruột đến ngày thứ 7. Ở ruột kết, vào ngày thứ nhất và thứ 2, Salmonella xuyên
qua các nốt bạch huyết ở màng treo ruột để vào bên trong lớp niêm mạc. Vào ngày
thứ 4, Salmonella được quan sát thấy ở tế bào biểu mô và bên trong các đại thực
bào của phiến lamina propia. Vào ngày thứ 7, các Salmonella ở niêm mạc sẽ khuếch
tán ra bên ngoài các tê bào, lớp lamina propia mang nhiều tế bào bị viêm hơn [5].
1.7.3. Cơ chế phòng vệ của vật chủ đối với sự xâm nhập của mầm bệnh
Ống tiêu hóa là nơi luôn tiếp xúc với nhiều mầm bệnh. Mỗi nơi trong ống
tiêu hóa đều có cấu tạo đặc biệt, có các đặc tính sinh lý và sinh hóa phù hợp để ngăn
cản sự xâm nhiễm của các mầm bệnh. Những hàng rào ngăn cản sự xâm nhiễm của
mầm bệnh tại các cơ quan trong ống tiêu hóa được trình bày tóm tắt trên Bảng 1.1
[51],[74].
- Các mảnh vỡ tế bào biểu mô trong niêm mạc
Trong điều kiện bình thường, các tế bào biểu mô liên tục bị tróc ra và được

thay thế bằng các lớp tế bào biều mô mới. Khi những tế bào này bị tróc ra, những vi
sinh vật bám bên trên hay ở bên trong tế bào sẽ được bài tiết ra ngoài. Nếu quá trình
tróc ra bị cản trở, các mầm bệnh có thể tạo thành các ổ bệnh và xâm nhiễm qua
thành ruột.
- Lớp glycolax
Glycolax là một lớp glycoprotein và polysaccharide bao phủ trên bề mặt tế
bào biểu mô, là một lớp mỏng, có bề dày tương đương với kích thước vi khuẩn, có
vai trò như là một cái bẫy hóa học bắt lấy các vi sinh vật.
Nghiên cứu phân biệt loài phụ Salmonella gây bệnh với các loài phụ khác trong thực phẩm bằng kỹ thuật sinh học
phân tử - Luận án tiến sĩ, chuyên ngành Vi sinh, 2010


Chương 1. Tổng quan tài liệu

26

Nguyễn Tiến Dũng

Bảng 1.1. Sự phòng vệ của vật chủ chống lại sự xâm nhiễm của mầm bệnh

Cơ quan phòng vệ

Nhân tố phòng vệ

Dạ dày

Tính acid trong dạ dày
Tốc độ tiêu hoá thức ăn của dạ dày

Ruột non


Sự chuyển động của nhu động ruột
Hệ vi sinh vật đường ruột
Dịch nhầy
Sự tiết kháng thể
Các nhân tố di truyền kháng sự xâm nhiễm

Các nhân tố khác

Tình trạng dinh dưỡng
Lactoferin
Lysozyme

- Màng nhày
Màng nhày đóng vai trò như một rào cản vật lý, gây khó khăn cho vi khuẩn
tiếp cận với bề mặt tế bào biểu mô. Ngoài ra màng nhầy còn có tác dụng bao phủ
lấy vi khuẩn và loại bỏ chúng thông qua quá trình chuyển động của nhu động ruột.
- Môi truờng acid trong dạ dày
Bình thường pH trong dạ dày khoảng dưới 4. Lượng acid cao trong dạ dày sẽ
được đổ vào ruột non để tạo nên một gradient pH giúp cho cơ thể phòng tránh hầu
hết các vi sinh vật xâm nhập vào dạ dày, tá tràng, ruột chay và nửa trên của ruột hồi.
Độ acid cao của dạ dày sẽ tiêu diệt hầu hết các mầm bệnh trước khi đến ruột non.
Trên 99,9% vi khuẩn bị tiêu diệt sau 30 phút tiếp xúc với môi trường acid. Sự thay
đổi đặc tính acid của dạ dày do bệnh tật, phẩu thuật, thuốc và các hóa chất làm giảm
độ acid sẽ làm tăng khả năng sống sót của các mầm bệnh trong dạ dày, có thể gây ra
sự nhiễm khuẩn.
- Mật
Mật có vai trò hòa tan lipid và bất hoạt các vi sinh vật có màng bao lipid. Sự
tắc nghẽn mật do sỏi mật có thể làm cho các mầm bệnh phát triển và gây bệnh ngay


Nghiên cứu phân biệt loài phụ Salmonella gây bệnh với các loài phụ khác trong thực phẩm bằng kỹ thuật sinh học
phân tử - Luận án tiến sĩ, chuyên ngành Vi sinh, 2010


Chương 1. Tổng quan tài liệu

27

Nguyễn Tiến Dũng

tại phía dưới chỗ tắt nghẽn và trong ruột; muối mật bị tích luỹ phía trên chỗ tắt
nghẽn gây ra viêm và phá huỷ thành túi mật.
- Kháng thể IgA
Các IgA được vận chuyển xuyên qua các tế bào biểu mô vào lòng ruột sẽ
ngăn cản quá trình gắn và xâm nhiễm của vi khuẩn vào thành ruột.
- Sự di chuyển của ruột
Quá trình chuyển động liên tục của ruột giúp cho quá trình hấp thu chất dịch;
duy trì sự hiện diện các vi khuẩn đường ruột ở mức thích hợp, bảo vệ cơ thể khỏi
mầm bệnh bằng việc ngăn cản quá trình gắn của mầm bệnh vào các thụ quan trên bề
mặt tế bào biểu mô.
- Lớp Peyer
Lớp Peyer là nơi cư trú của các tế bào bạch huyết. Khi Salmonella xuyên qua
các tế bào M sẽ được các tế bào này xử lý để trình diện kháng nguyên ra bên ngoài
giúp cho các tế bào bạch huyết nhận biết sự xâm nhiễm của vi khuẩn. Ngoài ra, còn
có một số các bạch huyết cầu không chuyên biệt thường xuyên di chuyển qua lớp
Peyer. Thông thường có khoảng 1 - 2% các bạch huyết cầu tuần hoàn mỗi giờ tạo
nên một nguồn tế bào bạch huyết sẵn có nhằm tăng cường khả năng chống xâm
nhập của các vi khuẩn.
- Hệ vi sinh vật trong ruột
Khoảng 99,9% các vi sinh vật trong ống tiêu hóa là các loài kỵ khí thuộc các

giống Bacteroides, Prevotella, Clostridium, Peptostreptococcus. Ngoài ra, trong
ống tiêu hóa còn có sự hiện của các sinh vật hiếu khí thuộc các giống Escherichia,
Proteus, Pseudomonas. Các sinh vật này cạnh tranh về mặt dinh dưỡng và vị trí gắn
đặc hiệu của mầm bệnh từ đó ngăn cản sự xâm nhiễm mầm bệnh qua thành ruột.
Ngoài ra các vi khuẩn còn tại ra các acid béo mạch ngắn có tác dụng tiêu diệt
Salmonella.
Ngoài các cơ chế phòng vệ của cơ thể như trên, sức chống đỡ của cơ thể
trước sự xâm nhập của mầm bệnh còn phụ thuộc nhiều vào trạng thái sức khoẻ, tình
trạng dinh dưỡng, trạng thái tinh thần, hoàn cảnh tự nhiên, hoàn cảnh xã hội. Việc
Nghiên cứu phân biệt loài phụ Salmonella gây bệnh với các loài phụ khác trong thực phẩm bằng kỹ thuật sinh học
phân tử - Luận án tiến sĩ, chuyên ngành Vi sinh, 2010


Chương 1. Tổng quan tài liệu

28

Nguyễn Tiến Dũng

thiếu dinh dưỡng đặc biệt là vitamin, protein làm tăng nguy cơ mắc bệnh cũng như
tử vong [51].

1.8. Triệu chứng bệnh do Salmonella
Những biểu hiện bệnh ở vật chủ khi Salmonella xâm nhiễm thường là viêm
ruột kết, nhiễm trùng máu và sốt thương hàn. Mỗi kiễu huyết thanh khác nhau
thường gây ra các triệu chứng bệnh khác nhau. Mặt khác, nhiều kiểu huyết thanh
khác nhau lại có biểu hiện bệnh giống nhau. Sau khi xâm nhiễm vào cơ thể người
và động vật, thời gian ủ bệnh thường khoảng 6 - 48 giờ, sau đó gây nên các triệu
chứng như nhức đầu, chóng mặt, tiêu chảy và ói mửa. Khi tiêu chảy có thể có sự
xuất huyết, phân có mủ nhầy và chứa các mảnh niêm mạc ruột. Ngoài ra còn có các

triệu chứng khác như sốt, khó chịu và thường hay bị chuột rút. Các triệu chứng trên
thường khỏi sau một tuần. Vi khuẩn Salmonella có thể tồn tại trong phân khoảng 20
tuần đối với trẻ dưới 5 tuổi và khoảng 8 tuần đối với người lớn [2].
Sự biểu hiện bệnh thường rất nguy hiểm ở trẻ em và người già trên 50 tuổi.
Kent và cộng sự cho rằng có rất ít trường hợp gây bệnh viêm ruột cấp tính gây ra
bởi Salmonella. Quan điểm này cho đến nay vẫn được thừa nhận và đã được chứng
minh là đúng đắn. Một số báo cáo khác cho rằng ruột già là nơi vi khuẩn Salmonella
bám vào đầu tiên chứ không phải là ruột non. Để tạo ra những biểu hiện bệnh ở vật
chủ, Salmonella cần phải sử dụng nhiều nhân tố khác nhau bao gồm các nhân tố
bám dính và xâm nhiễm vào trong tế bào, phức hợp lipopolisaccharide để tránh sự
tấn công của thực bào, các nhân tố giúp vi khuẩn phân chia bên trong tế bào chủ và
độc tố. Sau khi xâm nhiễm vào đường ruột, vi khuẩn xâm chiếm tế bào ruột hồi,
xâm nhập vào bên trong tế bào biểu mô ruột, tăng trưởng bên trong tế bào biểu mô
và hoá kén bên trong tế bào lympho [19].
Salmonella xâm nhiễm vào vật chủ qua thành ruột và vượt qua sự tấn công
của các thực bào. Một số kiểu huyết thanh có khả năng tập trung bám trên thành
ruột, di chuyển vào trong các lớp biểu mô và sống trong các đại thực bào. Các tế
bào Salmonella này có thể được dẫn đến các cơ quan khác như tụy và gan nhờ hệ
Nghiên cứu phân biệt loài phụ Salmonella gây bệnh với các loài phụ khác trong thực phẩm bằng kỹ thuật sinh học
phân tử - Luận án tiến sĩ, chuyên ngành Vi sinh, 2010


Chương 1. Tổng quan tài liệu

29

Nguyễn Tiến Dũng

bạch huyết. Sự nhân lên của vi khuẩn trong các mô này gây nên các triệu chứng lâm
sàng. Một số kiểu huyết thanh khác có thể gây sốc cho vật chủ bởi độc tố của

chúng. Tuy nhiên các triệu chứng bệnh đường ruột gây ra do Salmonella chỉ xuất
hiện khi có xâm nhập của vi khuẩn vào các tế bào thành ruột. Ví dụ các chủng S.
enteritidis có khả năng sản xuất một số độc tố, nhưng triệu chứng tiêu chảy chỉ xuất
hiện khi có sự hủy hoại các tế bào biểu mô ruột bởi sự xâm nhiễm của vi khuẩn
[51].
Tiêu chảy là một biểu hiện phổ biến khi bị nhiễm Salmonella. Giannella và
cộng sự đã cho thấy rằng bước xâm nhiễm của Salmonella vào nhu động ruột không
gây nên bệnh tiêu chảy; triệu chứng lâm sàng chỉ xuất hiện khi có sự tiết của các
protein thuộc locus SPI-I. Khi đột biến trên sopB mã hoá cho SopB, là protein cần
thiết cho hoạt động của SPI-I, thì thể đột biến bị suy giảm đáng kể khả năng gây
tiêu chảy [69]. Một số nghiên cứu khác cho thấy rằng hoạt tính của độc tố tế bào và
độc tố đường ruột do Salmonella tiết ra có liên quan đến triệu chứng tiêu chảy. Theo
Giannella và cộng sự, prostaglandine được tiết từ các mô ruột bị xâm nhiễm
Salmonella trong tế bào bạch cầu đa nhân (PMNs) đã hoạt hóa adenylate cyclase
trong các tế bào ruột, gây nên sự ức chế tính thấm của Na+ và gia tăng sự tiết của Cl[45].

1.9. Ý nghĩa của việc phân biệt loài phụ S. enterica I với Salmonella spp. trong
thực phẩm và thủy sản
Trong các yêu cầu về vi sinh đối với thực phẩm, Salmonella là một chỉ tiêu
phân tích đặc biệt nhạy cảm, do tính chất gây bệnh của một số kiểu huyết thanh
Salmonella đồng thời là một chỉ tiêu chỉ thị mức độ an toàn vệ sinh thực phẩm. Tiêu
chuẩn của các nước đều xếp Salmonella vào nhóm không được phép có mặt trong
thực phẩm, không phân biệt loài, loài phụ hay chủng đó có gây bệnh hay không
(Bảng 1.2) [1]. Trong thực tế, các phòng phân tích vi sinh thực phẩm chỉ thực hiện
các xét nghiệm để phát hiện xem mẫu thực phẩm có chứa Salmonella spp. hay
không, không làm các xét nghiệm phân biệt loài, loài phụ hay định chủng. Đây là
Nghiên cứu phân biệt loài phụ Salmonella gây bệnh với các loài phụ khác trong thực phẩm bằng kỹ thuật sinh học
phân tử - Luận án tiến sĩ, chuyên ngành Vi sinh, 2010



Chương 1. Tổng quan tài liệu

30

Nguyễn Tiến Dũng

một rào cản rất lớn cho các nhà sản xuất và xuất khẩu thực phẩm nói chung và xuất
khẩu thủy sản nói riêng. Chỉ tính riêng năm 2008, lượng sản phẩm thủy sản của Việt
Nam không đạt tiêu chuẩn xuất khẩu là 14.240 tấn, chiến 1,9% tổng sản lượng thủy
sản xuất khẩu. Trong đó lượng hàng bị nhiễm Salmonella là 4.560 tấn, chiếm 32%
(Nguồn: Cục Quản lý Chất lượng nông lâm sản và thủy sản - 2008).
Bảng 1.2. Các yêu cầu về Salmonella trong các qui định an toàn vệ sinh thực phẩm
của một số nước [75]
TT Tổ chức/ nước Qui định về Salmonella trong thực phẩm
1.
Ủy ban Codex Không có Vi sinh vật hay độc tố ảnh
hưởng đến sức khỏe người tiêu dùng
2.
Hoa Kỳ
Không có Salmonella spp trong thủy sản
3.
EU
Không có Salmonella spp trong 25g
4.
Pháp
Không có Salmonella spp trong 25g
5.
Italia
Không có Salmonella spp trong 25g
6.

Úc
Không có Salmonella spp trong 25g
7.
Canada
Không có Salmonella spp trong 50g
8.
Việt Nam
Không có Salmonella spp trong 25g

Tài tiệu tham chiếu
Codex stand.190-1995
Codex stand.191-1995
Luật thực phẩm 1997
98/83/EEC (2003)
Tiêu chuẩn quốc gia
Tiêu chuẩn quốc gia
Tiêu chuẩn quốc gia
Tiêu chuẩn quốc gia
46/2007/QĐ-BYT

EU và Mỹ là hai thị trường nhập khẩu lớn của thủy sản Việt Nam, nhưng đây
cũng là hai thị trường có yêu cầu về chất lượng rất nghiêm ngặt. Đối với thị trường
EU, khi một lô hàng của một doanh nghiệp bị phát hiện có nhiễm Salmonella, nước
thành viên của EU sẽ trả lại lô hàng và thông báo khẩn cấp bằng hệ thống thông báo
nhanh với các nước thành viên khác, Uỷ Ban EU và các cửa khẩu để đình chỉ nhập
khẩu các lô hàng tiếp theo của doanh nghiệp này vào thị trường EU. Lệnh cấm đó
chỉ được bãi bỏ khi cơ quan có thẩm quyền của Việt Nam kiểm tra và khắc phục
hoàn toàn nguyên nhân gây nhiễm và 15 mẫu hàng tiếp theo được phòng kiểm
nghiệm quốc gia của EU kiểm tra và xác nhận không có vi sinh vật gây bệnh [75].
Đối với thị trường Mỹ, khi phát hiện lô hàng bị nhiễm Salmonella, FDA sẽ

đưa tên doanh nghiệp sản suất vào danh sách cảnh báo tự động và thực hiện chế độ
kiểm tra nghiệm ngặt với số lượng mẫu tăng gấp đôi đối với 5 lô hàng cùng loại tiếp
theo của doanh nghiệp này. Nếu tất cả 5 lô đều đạt chất lượng thì tên của doanh
nghiệp mới được đưa ra khỏi danh sách cảnh báo. Điều này thật sự gây khó khăn rất
lớn cho hoạt động sản suất kinh doanh của các doanh nghiệp.
Nghiên cứu phân biệt loài phụ Salmonella gây bệnh với các loài phụ khác trong thực phẩm bằng kỹ thuật sinh học
phân tử - Luận án tiến sĩ, chuyên ngành Vi sinh, 2010