B GIO DC V O TO

B Y T
TRNG I HC Y H NI

PHM TH XUN

Đánh giá sự đứt gãy ADN của tinh trùng ở nam giới
trong các cặp vợ chồng sảy thai, thai lu

KHểA LUN TT NGHIP BC S A KHOA
KHểA 2010 - 2016
Ngi hng dn khoa hc:
PGS.TS TRN C PHN

H NI - 2016


LỜI CẢM ƠN
Với tấm lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, tôi xin chân thành cảm ơn
Bộ môn Y sinh học - Di truyền, trường Đại học Y Hà Nội, PGS. TS Trần
Đức Phấn đã trực tiếp hướng dẫn tận tình, luôn quan tâm, động viên chia sẻ
những khó khăn giúp đỡ tôi trong quá trình nghiên cứu và học tập để hoàn
thành khóa luận tốt nghiệp này.
Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới TS. Đoàn Thị Kim Phượng, Bộ môn Y sinh
học - Di truyền trường Đại học Y Hà Nội đã tận tâm, nhiệt tình dạy bảo
và giúp đỡ tôi rất nhiều trong quá trình học tập và nghiên cứu đề tài.
Tôi xin chân thành cảm ơn thầy cô, các anh chị kĩ thuật viên trong Bộ
môn Y sinh học - Di truyền trường Đại học Y Hà Nội đã giúp đỡ và chỉ bảo
tận tình cho tôi trong thời gian học tập và nghiên cứu tại bộ môn.
Tôi xin trân trọng cảm ơn Ban giám hiệu, Phòng đào tạo, Thư viện và

các phòng ban trường Đại học Y Hà Nội đã giúp đỡ tạo điều kiện tốt nhất cho
tôi hoàn thành khóa luận này.
Cuối cùng tôi xin cảm ơn các thầy cô đã dìu dắt tôi từng bước trong 6
năm học tại ngôi trường này. Tôi xin chân thành cảm ơn gia đình và bạn bè
luôn bên cạnh ủng hộ làm chỗ dựa vững chắc và chia sẻ với tôi những khó
khăn trong cuộc sống và trong học tập.
Hà Nội ngày 20 tháng 5 năm 2016
Phạm Thị Xuân


MỤC LỤC
HÀ NỘI - 2016.................................................................................................1
LỜI CẢM ƠN..................................................................................................2
Với tấm lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, tôi xin chân thành cảm ơn Bộ
môn Y sinh học - Di truyền, trường Đại học Y Hà Nội, PGS. TS Trần
Đức Phấn đã trực tiếp hướng dẫn tận tình, luôn quan tâm, động viên chia
sẻ những khó khăn giúp đỡ tôi trong quá trình nghiên cứu và học tập để
hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này............................................................2
Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới TS. Đoàn Thị Kim Phượng, Bộ môn Y
sinh học - Di truyền trường Đại học Y Hà Nội đã tận tâm, nhiệt tình dạy
bảo và giúp đỡ tôi rất nhiều trong quá trình học tập và nghiên cứu đề tài.
...........................................................................................................................2
Tôi xin chân thành cảm ơn thầy cô, các anh chị kĩ thuật viên trong Bộ
môn Y sinh học - Di truyền trường Đại học Y Hà Nội đã giúp đỡ và chỉ
bảo tận tình cho tôi trong thời gian học tập và nghiên cứu tại bộ môn......2
Tôi xin trân trọng cảm ơn Ban giám hiệu, Phòng đào tạo, Thư viện và
các phòng ban trường Đại học Y Hà Nội đã giúp đỡ tạo điều kiện tốt nhất
cho tôi hoàn thành khóa luận này..................................................................2
Cuối cùng tôi xin cảm ơn các thầy cô đã dìu dắt tôi từng bước trong 6
năm học tại ngôi trường này. Tôi xin chân thành cảm ơn gia đình và bạn

bè luôn bên cạnh ủng hộ làm chỗ dựa vững chắc và chia sẻ với tôi những
khó khăn trong cuộc sống và trong học tập..................................................2
Hà Nội ngày 20 tháng 5 năm 2016........2
Phạm Thị Xuân...............................2
MỤC LỤC........................................................................................................3
ĐẶT VẤN ĐỀ..................................................................................................1


Chương 1..........................................................................................................3
TỔNG QUAN TÀI LIỆU...............................................................................3
1.1. Sảy thai, thai lưu....................................................................................................................3
1.1.1. Khái niệm về sảy thai, thai lưu......................................................................................3
1.1.2. Nguyên nhân ................................................................................................................4
1.1.3. Tình hình sảy thai, thai lưu............................................................................................6
1.2. Đứt gãy ADN của tinh trùng..................................................................................................7
1.2.1. Cấu trúc tinh trùng........................................................................................................7
1.2.2. Nguyên nhân và cơ chế đứt gãy ADN của tinh trùng.....................................................8
1.2.3. Ảnh hưởng của đứt gãy ADN của tinh trùng...............................................................10
1.3. Các phương pháp đánh giá đứt gãy ADN tinh trùng............................................................11
1.3.1. Phương pháp COMET .................................................................................................11
1.3.2. Phương pháp khảo sát cấu trúc chromatin tinh trùng (SCSA).....................................12
1.3.3. Phương pháp đánh dấu đứt gãy ADN bằng các dUTP (TUNEL)...................................12
1.3.4. Phương pháp khảo sát sự phân tán chất nhiễm sắc của tinh trùng (Halosperm test).13

Chương 2........................................................................................................15
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.................................15
2.1. Đối tượng nghiên cứu.........................................................................................................15
2.2. Địa điểm nghiên cứu...........................................................................................................15
2.3. Thời gian nghiên cứu...........................................................................................................15
2.4. Phương pháp nghiên cứu....................................................................................................15

2.4.1. Thiết kế nghiên cứu.....................................................................................................15
2.4.2. Cỡ mẫu và cách chọn cỡ mẫu......................................................................................15
2.4.3. Các biến số nghiên cứu................................................................................................16
2.4.4. Công cụ thu thập thông tin..........................................................................................16
2.5. Qui trình thực hiện Halosperm test.....................................................................................17
2.6. Cách đánh giá kết quả.........................................................................................................18
2.7. Đạo đức trong nghiên cứu...................................................................................................19

CHƯƠNG 3....................................................................................................20
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU...........................................................................20
3.1. Tỉ lệ đứt gãy ADN tinh trùng................................................................................................20


3.1.1. Tỉ lệ đứt gãy ADN tinh trùng chung trong các trường hợp sảy thai, thai lưu...............20
3.1.2. Tỉ lệ đứt gãy ADN tinh trùng riêng trong các nhóm sảy thai hoặc thai lưu..................21
3.1.3. Tỉ lệ đứt gãy ADN tinh trùng với số lần sảy thai...........................................................22
3.1.4. Tỉ lệ đứt gãy ADN tinh trùng và số lần thai lưu............................................................23
3.1.5. Tỉ lệ đứt gãy ADN tinh trùng và tuổi của bệnh nhân...................................................24
3.2. Kết quả nghiên cứu về mức độ đứt gãy ADN......................................................................25
3.2.1. Mức độ đứt gãy ADN tinh trùng và số lần sảy thai, thai lưu trong nhóm DFI 15-30%. 25
3.2.2. Mức độ đứt gãy ADN tinh trùng và số lần thai lưu trong nhóm DFI >30%..................26

Chương 4........................................................................................................27
BÀN LUẬN....................................................................................................27
4.1. Đánh giá tỉ lệ đứt gãy ADN tinh trùng ở bệnh nhân nam....................................................27
4.1.1. Tỉ lệ đứt gãy ADN tinh trùng........................................................................................27
4.1.2. Tỉ lệ đứt gãy ADN tinh trùng ở các trường hợp sảy thai..............................................29
4.1.3. Tỉ lệ đứt gãy ADN tinh trùng và số lần sảy thai............................................................29
4.1.4. Tỉ lệ đứt gãy ADN tinh trùng và thai lưu......................................................................30
4.1.5. Tỉ lệ đứt gãy ADN tinh trùng và số lần thai lưu............................................................31

4.1.6. Tỉ lệ đứt gãy ADN tinh trùng theo tuổi........................................................................32
4.2. Mức độ đứt gãy ADN tinh trùng trong các trường hợp sảy thai, thai lưu...........................33

KẾT LUẬN....................................................................................................36
KIẾN NGHỊ...................................................................................................37
TÀI LIỆU THAM KHẢO..............................................................................1


DANH MỤC BẢNG
Bảng 3.1. Tỷ lệ quầng nhiễm sắc thoái hóa trong nhóm DFI 15-30%......25
Bảng 3.2. Tỷ lệ quầng nhiễm sắc thoái hóa trong nhóm DFI >30%.........26


DANH MỤC BIỂU ĐỒ
Biểu đồ 3.1. Tỉ lệ đứt gãy ADN tinh trùng trong các trường hợp sảy thai,
thai lưu............................................................................................................20
Biểu đồ 3.2. Tỉ lệ đứt gãy ADN tinh trùng riêng trong từng nhóm sảy thai
hoặc thai lưu...................................................................................................21
Biểu đồ 3.3. Tỉ lệ đứt gãy ADN tinh trùng với số lần sảy thai...................22
Biểu đồ 3.4. Tỉ lệ đứt gãy ADN tinh trùng và số lần thai lưu....................23
Biểu đồ 3.5. Tỉ lệ đứt gãy ADN tinh trùng và tuổi bệnh nhân..................24


1

ĐẶT VẤN ĐỀ

Trong mỗi gia đình con cái luôn là tài sản vô giá để duy trì hạnh phúc
gia đình và toàn xã hội. Nhưng ngày nay vấn đề sảy thai, thai lưu càng ngày
càng phổ biến, không còn là vấn đề xa lạ và nhận được rất nhiều sự quan tâm

mọi người. Sảy thai là tình trạng thai chết trong tử cung trước tuần thứ 22 của
thai kì, ước tính cứ 5 thai phụ thì có một người sảy thai. Thai chết lưu là tình
trạng thai bị chết mà còn lưu lại trong tử cung quá 48 giờ (theo Việt Nam),
theo WHO thì thai chết lưu là tất cả các trường hợp thai chết trong thời kì thai
nghén trước khi sổ thai ra ngoài tử cung.
Sảy thai, thai chết lưu gây nên những hậu quả nặng nề cho sức khỏe
người mẹ cũng như tình trạng rối loạn đông máu, nhiễm khuẩn nếu không
được xử trí kịp thời đúng đắn. Nó còn tác động sâu sắc đến tâm lý của các cặp
vợ chồng đặc biệt các trường hợp hiếm muộn.
Sảy thai, thai lưu hay các bất thường khác trong thai không chỉ có
nguyên nhân từ người mẹ mà có thể do nguyên nhân từ phía người nam giới.
Việc tìm ra nguyên nhân gây rối loạn vật chất di truyền của tinh trùng
ngày càng không quá khó khăn, nó đã giúp ích rất nhiều cho việc điều trị vô
sinh, điều trị các bất thường phôi thai.
Đứt gãy ADN của tinh trùng là một trong những rối loạn vật chất di
truyền dẫn tới giảm chức năng và chất lượng của tinh trùng do đó nó là
nguyên nhân giảm khả năng thụ tinh hoặc thai thai kém phát triển, dị tật bẩm
sinh, thai chết lưu hay nguy cơ sảy thai cao. Sự đứt gãy ADN của tinh trùng
cũng ảnh hưởng đến tỉ lệ thụ tinh và chất lượng phôi thai, làm giảm tỉ lệ thành
công của các biện pháp hỗ trợ sinh sản.
Câu hỏi đặt ra là: mức độ đứt gãy ADN ở tinh trùng có liên quan gì đến
việc sảy thai, thai lưu. Để trả lời câu hỏi trên, chúng tôi tiến hành nghiên cứu


2

đề tài “Đánh giá sự đứt gãy ADN của tinh trùng ở nam giới trong các cặp
vợ chồng sảy thai, thai lưu” nhằm mục tiêu sau:
1. Xác định tỉ lệ đứt gãy ADN tinh trùng trong các trường hợp sảy thai,
thai lưu.

2. Đánh giá mức độ đứt gãy ADN của tinh trùng ở các trường hợp sảy
thai, thai lưu.


3

Chương 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Sảy thai, thai lưu
1.1.1. Khái niệm về sảy thai, thai lưu
- Thai chết lưu: các khái niệm về thai chết lưu chưa thống nhất giữa các nước.
+ Ở Việt Nam: Thai chết lưu là tất cả các trường hợp thai bị chết mà còn
lưu lại trong tử cung trên 48 giờ .
+ Theo WHO: thai chết lưu bao gồm tất cả các trường hợp thai chết lưu
trong quá trình thai nghén trước khi sổ thai ra ngoài.
+ Chuẩn đoán thai chết lưu dựa vào hoạt động của tim thai. Thuật ngữ
trứng trống hay thai không có phôi dùng để mô tả túi thai mà không thấy cấu
trúc của thai. Chuẩn đoán thai lưu dễ dàng khi tuổi thai tương đối lớn. Tuy
nhiên trong giai đoạn sớm của thai kì, do phôi thai rất nhỏ nên đôi khi chuẩn
đoán thai lưu rất khó. Theo American College of Obstetricians and
Gynaecologist, 2009 ở giai đoạn sớm của thai kì, chuẩn đoán thai lưu khi :
• Không có hoạt động tim thai khi chiều dài đầu mông CRL >6mm.
• Không thấy hình ảnh phôi thai hoặc túi noãn hoàng khi đường kính túi
thai (GS) >20mm.
Trên thực tế chuẩn đoán thai ngừng tiến triển hoặc trứng trống khi
hai lần siêu âm ở hai thời điểm cách nhau 2 tuần vẫn không thấy phôi thai
và tim thai.
- Sảy thai là hiện tượng thai bị tống ra khỏi buồng tử cung trước tuổi thai có
thể sống được, tuổi đó được tính từ 22 tuần vô kinh hay trọng lượng thai <

500 gram . Có 2 loại sảy thai:
+ Sảy thai sớm là sảy thai trước 12 tuần loại này chiếm 15%.
+ Sảy thai muộn là sảy thai tính từ tuần 12 trở đi và trước tuần 28.


4

Ngày nay khái niệm sảy thai còn đang được xem xét lại vì bởi tuổi thai
sống và phát triển phụ thuộc vào khả năng nuôi dưỡng thai khi thai ra đời.
1.1.2. Nguyên nhân
Nguyên nhân do di truyền
 Nguyên nhân từ phía con.
- Rối loạn NST: là nguyên nhân chủ yếu của thai dưới 3 tháng tuổi bị chết.
Rối loạn NST có thể là do di truyền từ bố, mẹ hoặc có thể do đột biến trong
quá trình tạo noãn, tạo tinh trùng, thụ tinh và phát triển phôi. Tỉ lệ rối loạn
NST tăng lên rõ ràng theo tuổi mẹ, đặc biệt là mẹ trên 40 tuổi. Trước kia tuổi
mẹ là phương pháp sàng lọc đầu tiên để phát hiện các thai có bất thường NST.
Theo nghiên cứu của Ronald thì 25% thai chết lưu có bất thường NST trong
đó phổ biến nhất là Turner 45,X (23%), trisomy 21 (23%).
Theo tác giả Bauld R., nghiên cứu 153 trường hợp thai lưu thì có 7,2%
thai lưu có bất thường NST, tỉ lệ bất thường tăng theo tuổi mẹ. Tác giả thấy
rằng ở nhóm tuổi mẹ dưới 35 tuổi thì tỉ lệ bất thường NST thấp (5,1%- 7,8%),
trong khi đó tỉ lệ này ở nhóm tuổi mẹ trên 35 cao hơn hẳn (11%), đặc biệt
những bà mẹ trên 40 tuổi thì tỉ lệ thai lưu có bất thường NST cao gấp nhiều
lần (40%).
 Nguyên nhân từ phía bố mẹ.
- Bố mẹ hoặc cả hai mang bất thường cấu trúc nhiễm sắc thể có thể di
truyền như đảo đoạn, chuyển đoạn hay mất đoạn. Các đột biến có thể di
truyền cho thai gây thai chết lưu, sảy thai. Theo tác giả Nguyễn Văn Rực
khi phân tích NST của 350 cặp vợ chồng có tiền sử sảy thai, sảy thai liên

tiếp và sinh con bị dị tật thì có 24 cặp vợ chồng (chiếm tỉ lệ 6,86%) có biểu
hiện rối loạn NST trong đó 87,5% có rối loạn cấu trúc NST và 12,5% rối
loạn về số lượng NST [9].


5

- Bố mẹ đã mang gen bệnh nhưng ở trạng thái lặn nên đến đời con mới biểu
hiện gây sảy thai, thai chết lưu.
- Do đứt gãy ADN tinh trùng của bố.
Nguyên nhân không do di truyền
 Do thai:
- Thai dị dạng: não úng thủy, vô sọ, phù rau thai. Thai dị dạng chết lưu chiếm
khoảng 8,9% thai chết lưu trong tử cung.
- Bất đồng nhóm máu giữu mẹ và con do yếu tố Rh: Nếu mẹ có nhóm Rh-,
người bố có nhóm Rh+ khi mang thai lần đầu, thai nhi có Rh + cơ thể mẹ sẽ
phát sinh kháng thể kháng Rh gây hiện tượng tương kị giữa mẹ và con. Hậu
quả gây nên thai chết lưu tần suất cao trong những lần mang thai tiếp theo vì
mức độ kháng thể chống Rh của mẹ cao dần.
- Thai già tháng, đa thai.
 Nguyên nhân từ phía mẹ , ,
Chủ yếu là các nguyên nhân từ phía mẹ.
- Mẹ bị các bệnh lý mãn tính: viêm thận, suy gan, thiếu máu, lao phổi, bệnh
tim, huyết áp cao, bệnh tim dẫn đến thai thiếu máu…
- Mẹ bị các bệnh nội tiết: Basedow, thiểu năng giáp trạng, đái tháo đường...
- Nhiễm độc thai nghén từ thể nhẹ đến thể nặng.
- Mẹ bị các bệnh kí sinh trùng như sốt rét (đặc biệt là sốt rét ác tính làm cho
thai chết gần như 100%), nhiễm vi khuẩn (như giang mai…), nhiễm virus
(như viêm gan, quai bị, cúm, sởi…).
- Mẹ bị nhiễm độc mạn tính, hay cấp tính, nhiễm tia xạ đặc biệt trong thời

gian đầu mang thai.
- Một số yếu tố thuận lợi làm thai chết lưu là:
+ Tuổi của mẹ: Tỉ lệ thai chết lưu tăng cao ở những người mẹ trên 40 tuổi,
nguy cơ thai chết lưu gấp 5 lần nhóm phụ nữ trẻ. Theo một nghiên cứu của


6

Đan Mạch, tỉ lệ sảy thai nói chung là 11% trong khi đó tỉ lệ sảy thai ở phụ nữ
22 tuổi là 9% và tỉ lệ này là 84% ở những phụ nữ 48 tuổi .
+ Dinh dưỡng kém, lao động vất vả, đời sống khó khăn.
 Nguyên nhân từ phần phụ, tử cung
- Dây rốn: dây rốn thắt nút, dây rốn ngắn tuyệt đối, dây rốn quấn quanh cổ.
- Bánh rau: bánh rau xơ hóa, bánh rau bị bong.
- Nước ối: đa ối cấp tính hay mãn tính, thiểu ối.
- Tử cung: tử cung dị dang, tử cung nhi tính, tử cung kém phát triển…
1.1.3. Tình hình sảy thai, thai lưu
Tỉ lệ sảy thai đôi khi khó đánh giá vì có nhiều trường hợp sảy thai
diễn ra trước khi người phụ nữ biết mình mang thai, tỉ lệ này ước lượng từ
22- 75%.
Một nghiên cứu đánh giá tỉ lệ sảy thai chỉ ra rằng nguy cơ tích lũy sảy
thai từ tuần thứ 5 đến tuần thứ 20 của thai kì thay đổi từ 11% đến 22%, tính
đến tuần thứ 13 của thai kì nguy cơ sảy thai mỗi tuần giảm 2%, giảm 1%
trong tuần thứ 14 và giảm dần từ tuần thứ 14 đến 20 của thai kì.
Tại Anh, mỗi năm có đến hơn 50000 trường hợp sảy thai được phát
hiện . Tại Hoa Kì trung bình tỉ lệ thai chết lưu là khoảng 1 trong 160 trẻ được
sinh ra . Ở Úc tỉ lệ này khoảng 1 trong 200 trường hợp sinh.
Ở Việt Nam tỉ lệ thai chết lưu trong tử cung so với tổng số đẻ một năm
dao động theo các nghiên cứu khác nhau. Theo viện Bảo vệ bà mẹ và trẻ sơ
sinh tỉ lệ này là 1,5- 2%. Tại bệnh viện Từ Dũ tỉ lệ này là 1%

Theo các nghiên cứu mới gần đây tỉ lệ sảy thai trên lâm sàng chiếm 1520% trường hợp mang thai và thường xảy ra trước 13 tuần thai kì. Ở Việt
Nam theo thống kê của Nguyễn Thìn, Phạm Thanh Kỳ năm 1978 thì tỉ lệ sảy
thai là 10- 12% và tỉ lệ này ở các nước phát triển là 6- 10% .


7

Theo Trần Thị Lợi trong 6 tháng đầu năm 2004 có tới 280 trường hợp
sảy thai tự nhiên và 456 trường hợp thai lưu tại bệnh viên Từ Dũ.
1.2. Đứt gãy ADN của tinh trùng
1.2.1. Cấu trúc tinh trùng

Tinh trùng có cấu trúc gồm 3 phần: đầu, cổ, đuôi. Mỗi tinh trùng dài
0,05mm (World Health Organization (1999). WHO laboratory manual for the
examination of human semen and sperm - cervical mucus 4 th, Cambridge
University Press).
 Phần đầu:
Đầu tinh trùng chứa nhân và thể đầu (acrosome). Thể đầu chứa enzym
thủy phân và enzym phân hủy protein giúp cho tinh trùng xuyên vào trứng
cũng như cổ tử cung, đồng thời bài tiết acrosin giúp tinh trùng định hướng và
kích thích sự vận động của chúng trong cơ quan sinh dục nữ.
Nhân của tinh trùng chứa bộ NST (n=23), các sợi chromatin có dạng
chuỗi hạt,xếp đều đặn theo chiều dài sợi mảnh. Mỗi hạt là một nucleosome có
phần lõi gồm 8 phân tử protein histon, xung quanh được cuộn bởi ADN kép
nối giữa các nucleosom là đoạn ngắn ADN tự do. Bình thường các sợi
chromatin xoắn tối đa.
 Phần cổ: Rất ngắn giữ vững đầu giúp tinh trùng di chuyển.


8


 Phần đuôi:
Đuôi gồm 3 đoạn:
- Đoạn trung gian: Tiếp nối với đoạn cổ, chiều này khoảng 1μm, có bao
ti thể. Cổ và đoạn trung gian được định ranh giới với đuôi bởi vòng Zensen,
đây là nơi màng bào tương dày lên. Chiều dài của cổ và đoạn trung gian gấp
1,5 lần chiều dài đầu.
- Đoạn chính và đoạn cuối. Đoạn chính dài khoảng 45μm, thẳng, thon,
nhỏ hơn phần cổ, không cuộn. Đuôi có một sợi trục nằm ở trung tâm, vây
quanh bởi một bao sợi xơ và bọc ngoài bởi màng tế bào. Ở đoạn cuối, đuôi
vuốt nhỏ lại chỉ gồm dây trục ở giữa và bọc ngoài bởi màng tế bào.
1.2.2. Nguyên nhân và cơ chế đứt gãy ADN của tinh trùng
Có rất nhiều nguyên nhân gây đứt gãy ADN của tinh trùng, các nguyên
nhân này được chia thành 2 nhóm:
- Các yếu tố bên trong cơ thể:
+ Sự chết tế bào theo chương trình.
+ Sự thuần thục không thành công.
- Các yếu tố bên ngoài cơ thể:
+ Các bệnh truyền nhiễm bao gồm cả các bệnh lây qua đường tình dục.
+ Tuổi trên 45.
+ Rối loạn do tia X hay hóa trị liệu.
+ Hút thuốc lá, căng thẳng.
+ Sử dụng ma túy.
+ Giãn tĩnh mạch tinh.
+ Tăng nhiệt độ ở tinh hoàn.
+ Bị sốt cao.
+ Tác nhân oxy hóa.


9


Bốn cơ chế chính gây nên đứt gãy ADN của tinh trùng là quá trình tổ
hợp không hoàn chỉnh khi hình thành tinh trùng, bất thường trong quá trình
đóng gói chất nhiễm sắc của tinh trùng, lỗi trong quá trình sửa chữa của tế
bào và mất cân bằng oxy hóa.
Bất thường trong quá trình đóng gói chất nhiễm sắc của tinh trùng
Chất nhiễm sắc của tinh trùng là cấu trúc có tính tổ chức, cô đặc và nén
chặt cao giúp tinh trùng trở nên nhỏ gọn và bảo vệ bộ gen của người nam
trong suốt quá trình di chuyển trong đường sinh dục nữ để thụ tinh với noãn.
Chất nhiễm sắc của tinh trùng được đóng gói hoàn chỉnh khi 85% lượng
protein histamin được thay thế bằng protamine. Protamine có kích thước bằng
một nửa histon giúp cho đầu tinh trùng trở nên nhỏ gọn hơn. Đây là một quá
trình phức tạp gồm 3 giai đoạn. Đầu tiên là quá trình thay thế các histon
thường bằng các histon đặc hiệu của tinh hoàn . Sau đó các histon này sẽ
được thay thế bằng các protein chuyển tiếp và cuối cùng các protein chuyển
tiếp sẽ được thay thế bằng protamine.
Để quá trình thay thể protein diễn ra ADN phải được tháo xoắn, sửa
chữa, các chất ức chế hoạt động của enzym làm cản trở quá trình sửa sai và
gây nên đứt gãy ADN.
Quá trình tái tổ hợp không hoàn chỉnh trong giai đoạn hình thành tinh trùng
Các enzym có chức năng tạo đứt gãy mạch đôi ADN giúp cho hiện
tượng trao đổi chéo trong kì đầu giảm phân I, các đứt gãy này sẽ được kiểm
tra và cho phép sự phân chia tế bào, giai đoạn giảm phân I hoàn thành chỉ khi
ADN tế bào được sửa chữa hoàn toàn và những tế bào bất thường ADN được
loại bỏ. Do đó các yếu tố kiểm tra không hoạt động sẽ dẫn đến các tế bào có
bất thường di truyền vẫn tiếp tục phân chia và trưởng thành.


10


Sự chết tế bào theo chương trình
Trong quá trình sinh tinh sự chết tế bào theo chương trình diễn ra để
ngăn chặn việc sản sinh quá mức các tế bào mầm và phá hủy những tế bào
mầm bị tổn thương. Tuy nhiên quá trình này diễn ra không hoàn toàn, tinh
trùng bị đứt gãy ADN vẫn có thể thoát ra và tiếp tục trưởng thành .
Tác động của oxy hóa bất lợi
Mất cân bằng oxy hóa là nguyên nhân phổ biến gây đứt gãy ADN của
tinh trùng. Mất cân bằng phản ứng oxy hóa (ROS: Reaction oxygen species)
là sự mất cân bằng giữa việc hình thành các chất gây phản ứng oxy hóa với
việc điều hòa, hạn chế ROS của các chất chống oxy hóa. ROS là sản phẩm
chuyển hóa bình thường trong tế bào, có thể làm biến đổi hoặc mất các base,
gây trao đổi chéo đoạn ADN, bất thường NST, đứt gãy mạch đơn hoặc mạch
đôi ADN và đột biến gen. Bạch cầu và tinh trùng là 2 nguồn sản sinh ROS
trong tinh dịch. Bạch cầu sản xuất ROS là một trong các cơ chế tiêu diệt mầm
bệnh. Tinh trùng sản xuất ROS liên quan đến sự trưởng thành của tinh trùng.
Tinh tử trước khi phát triển thành tinh trùng phải loại bỏ các túi bào tương
thừa để trưởng thành về hình thái, ROS được tạo thành khi quá trình này diễn
ra. Do đó những tinh trùng dị dạng hoặc chưa hoàn toàn trưởng thành có
những túi bào tương thừa vùng cổ.
1.2.3. Ảnh hưởng của đứt gãy ADN của tinh trùng
Khi tinh trùng đứt gãy tại những vị trí chứa gen liên quan đến khả năng
sinh sản hay phát triển, làm tổ của phôi thì tỉ lệ để có được một đứa con là rất
thấp. Chỉ số đánh giá mức độ đứt gãy ADN của tinh trùng DFI càng cao thì
mức độ đứt gãy càng lớn. Tỉ lệ đứt gãy ADN tinh trùng càng cao thì khả năng
có con của họ sau các chu trình như hỗ trợ sinh sản như IUI, IVF, ICSI càng
thấp. Khả năng sinh sản của nam giới giảm nếu DFI>30%.


11


Nghiên cứu của Đặng Huệ Anh chỉ ra rằng nếu độ oxy hóa và tỉ lệ đứt
gãy ADN tinh trùng cao có thể làm giảm tỉ lệ thành công trong ICSC, tuy
nhiên tỉ lệ này lại đang được đánh giá chủ yếu bởi các chỉ số khác trong tinh
dịch đồ như hình dạng của tinh trùng, độ di động… ở hầu hết các trung tâm
hỗ trợ sinh sản tại Việt Nam. Điều đó lý giải tại sao bệnh nhân với kết quả
tinh dịch đồ tốt ở các chỉ số vẫn có khả năng vô sinh cao và tỉ lệ có thai khi
điều trị thấp. Một nghiên cứu chỉ ra rằng không trường hợp nào có thai khi sử
dụng mẫu tinh trùng có độ đứt gãy lớn hơn 30% . Khi DFI > 30%, cơ hội để
thụ tinh tự nhiên, thụ tinh nhân tạo (IVF) hoặc bơm tinh trùng vào buồng tử
cung (IUI) gần như bằng không, .
Theo Adeveno và cộng sự, tinh trùng di động tốt và có tỉ lệ bình thường
cao vẫn có khả năng đứt gãy cao .
Lead M và cộng sự đã nghiên cứu sự đứt gãy ADN của tinh trùng
trên 108 cặp vợ chồng có tiền sử sảy thai liên tiếp và thấy có 32/108 trường
hợp (chiếm 30%) tinh trùng của người đàn ông có mức độ đứt gãy cao
(DFI>15%). Đây có thể là một yếu tố góp phần vào hội chứng lâm sàng của
việc sảy thai liên tiếp.
1.3. Các phương pháp đánh giá đứt gãy ADN tinh trùng
1.3.1. Phương pháp COMET
 Nguyên tắc:
Comet test là để xác định tỷ lệ và mức độ đứt gãy ADN tinh trùng.
Hình ảnh tinh trùng bị đứt gãy ADN thu được dưới kính hiển vi huỳnh quang
có dạng giống hình sao chổi (comet), nên còn được gọi là phương pháp
Comet [48].
 Ưu điểm:
Độ nhạy cao.
 Nhược điểm:


12


Tốn nhiều thời gian cho việc phân tích kết quả hình ảnh, khó chuẩn hóa
qui trình.
1.3.2. Phương pháp khảo sát cấu trúc chromatin tinh trùng (SCSA)
 Nguyên tắc:
Dựa vào sự thay đổi màu sắc của acridin organge từ màu xanh khi liên
kết với ADN mạch đôi không bị biến tính sang màu đỏ khi liên kết với ADN
bị đứt gãy mạch đơn bằng máy đo dòng chảy tế bào [47].
 Ưu điểm:
Có thể định lượng tinh trùng bị đứt gãy ADN hoặc có chất nhiễm sắc
đóng gói chưa hoàn chỉnh.
Qui trình đã được chuẩn hóa rộng rãi.
 Nhược điểm:
Máy đo dòng tế bào và phần mềm đọc kết quả chuyên dụng đắt tiền.
1.3.3. Phương pháp đánh dấu đứt gãy ADN bằng các dUTP (TUNEL)
 Nguyên tắc:
Định lượng sự gắn kết của dUTP tại các mạch đôi hoặc mạch đơn ADN
bị đứt gãy trong phản ứng được xúc tác bởi enzym TdT (terminal
deoxynucleotidyl transferase) [49].
 Ưu điểm:
Xét nghiệm có độ nhạy cao với trường hợp đứt gãy ADN mạch đôi và
mạch đơn.
Cho kết quả tương đương với các phương pháp SCSA, COMET.
 Nhược điểm:
Cần trang thiết bị đắt tiền.
Độ đặc hiệu thấp.


13


1.3.4. Phương pháp khảo sát sự phân tán chất nhiễm sắc của tinh trùng
(Halosperm test)
Nguyên tắc, ưu điểm, nhược điểm của phương pháp
• Nguyên tắc:
Mẫu tinh dịch được cố định trên gel agarose và xử lý bằng dung dịch
acid và muối để loại bỏ màng tế bào và các protein nhân. Khi đó ADN của
tinh trùng không bị đứt gãy sẽ bung đều các sợi chromatin xung quanh lõi
nhân. ADN được nhuộm Giemsa sẽ tạo vầng halo xung quanh lõi nhân khi
quan sát dưới kính hiển vi quang học. ADN được nhuộm màu sẽ bắt thuốc
nhuộm ví dụ màu tím của Giemsa tạo thành quầng thuốc nhuộm gọi là “halo”
xung quanh lõi nhân. Ngược lại các tế bào có ADN bị đứt gãy sẽ không tạo
quầng sáng hoặc không có quầng thuốc nhuộm.
Ưu điểm:
- Giá thành rẻ.
- Thao tác đơn giản.
• Nhược điểm:
Kết quả mang tính chất chủ quan.
Chỉ định và mục đích làm xét nghiệm halosperm test
 Chỉ định:
• Các cặp vợ chồng có tiền sử sảy thai liên tiếp.
• Tất cả các cặp vợ chồng vô sinh không rõ nguyên nhân trong khoảng
•
•
•
•
•

thời gian > 1 năm.
Nam giới trên 40 tuổi.
Những người nam điều trị ung thư.

Nam giới tiếp xúc với các hóa chất độc hại.
Những người nam bị nhiễm trùng niệu sinh dục.
Những người nam với lối sống không lành mạnh: hút thuốc lá, béo phì,

ăn uống kém, ngồi làm việc trong thời gian kéo dài.
• Chất lượng phôi kém về chu kì hiến trứng thứ 2.
 Mục đích:
• Để xác định xem các cặp vợ chồng có thích hợp cho việc điều trị bằng IUI.


14

• Để đánh giá chất lượng của các mẫu tinh dịch từ người chồng hoặc
người cho.
• Để đánh giá hiệu quả của các can thiệp y tế trong hỗ trợ sinh sản hoặc
điều trị các bệnh truyền nhiễm.
• Để cung cấp câu trả lời về nguyên nhân cho các trường hợp vô sinh > 1
năm hoặc trong những trường hợp sảy thai liên tiếp.


15

Chương 2
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tượng nghiên cứu
 Tiêu chuẩn chọn đối tượng nghiên cứu
Những bệnh nhân trong các cặp vợ chồng có tiền sử sảy thai, thai lưu
với các tiêu chuẩn sau:
• Nam từ 18 tuổi trở lên.
• Xét nghiệm tinh dịch đồ tại bộ môn Y sinh học - Di truyền Trường

Đại Học Y Hà Nội với kết quả mật độ tinh trùng > 5 triệu/ml.
• Đồng ý tham gia nghiên cứu.
 Tiêu chuẩn loại trừ:
Không thỏa mãn các tiêu chuẩn trên.
2.2. Địa điểm nghiên cứu
Bộ môn Y sinh học - Di truyền trường Đại Học Y Hà Nội.
2.3. Thời gian nghiên cứu
Từ tháng 9 năm 2014 đến tháng 7 năm 2016.
2.4. Phương pháp nghiên cứu
2.4.1. Thiết kế nghiên cứu
Nghiên cứu mô tả cắt ngang.
2.4.2. Cỡ mẫu và cách chọn cỡ mẫu
Công thức tính cỡ mẫu:
n=


16

Trong đó: n: cỡ mẫu cần lấy:
d : Sai số ước lượng (với khoảng tin cậy 95%): 10%.
Z : Hệ số tin cậy với độ tin cậy 95% thì Z=1,96.
p: Tỉ lệ đứt gãy ADN tinh trùng của người chồng trong các cặp vợ
chồng có tiền sử sảy thai liên tiếp theo một nghiên cứu của một nhóm tác giả
Úc là 30%.
Theo công thức trên cỡ mẫu tính được là 81 trường hợp. Thực tế chúng
tôi đã phân tích 152 trường hợp.
2.4.3. Các biến số nghiên cứu
• Các biến số về tỉ lệ đứt gãy ADN tinh trùng:
- DFI < 15%: Tỉ lệ đứt gãy ADN tinh trùng thấp.
- DFI 15 – 30%: Tỉ lệ đứt gãy ADN tinh trùng trung bình.

- DFI >30%: Tỉ lệ đứt gãy ADN tinh trùng cao.
• Các biến số về mức độ đứt gãy ADN tinh trùng:
- Quầng nhiễm sắc nhỏ.
- Quầng nhiễm sắc thoái hóa.
- Không có quầng nhiễm sắc.
• Biến số về bản thân bệnh nhân:
- Tuổi.
2.4.4. Công cụ thu thập thông tin
Sử dụng các bệnh án đã được xây dựng và khai thác các thông tin có
liên quan.


17

2.5. Qui trình thực hiện Halosperm test
Tinh dịch đã được pha loãng, 5- 10 triệu tinh trùng/ml
Đun thạch agarose đến khi tan chảy
Cho 25µl tinh dịch đã pha loãng vào thạch agarose, trộn đều. Nhỏ 18µl lên
lam kính, đặt lamen lên sau đó để tiêu bản trong tủ lạnh trong 5 phút.
Pha dung dịch DA:80µl DA trong 10 ml nước cất
Đặt tiêu bản ngập trong dung dịch trong 7 phút
Cho tiêu bản ngập trong dung dịch Lysis trong 25 phút
Cho tiêu bản ngập trong nước cất 5 phút
Cho tiêu bản ngập trong cồn 70˚, 90˚, 100˚, mỗi lần trong 2 phút, để
tiêu bản khô tự nhiên.
Pha dung dịch Giemsa:Pha 5ml nước + 1ml Giemsa. Nhỏ Giemsa nhuộm tiêu
bản trong 10 phút. Rửa tiêu bản nhẹ nhàng trong nước


18


2.6. Cách đánh giá kết quả.
Quầng Halo của tinh trùng:

- Chú thích:
1: Tinh trùng có quầng halo lớn.
2: Tinh trùng có quầng halo trung bình.
3: Tinh trùng có quầng halo nhỏ.
4: Tinh trùng không có halo.
5: Tinh trùng thoái hóa.
- Cách đánh giá quầng halo:
• Tinh trùng có quầng halo lớn: Kích thước của quầng halo ≥ đường kính
ngang của nhân.
• Tinh trùng có quầng halo vừa: 1/3 đường kính ngang của nhân < kích
thước quầng halo < đường kính ngang của nhân.
• Tinh trùng có quầng Halo nhỏ: Kích thước quầng halo ≤ 1/3 đường
kính ngang của nhân
• Tinh trùng không có quầng halo.
• Tinh trùng thoái hóa: Tinh trùng có nhân bắt màu kém, không đều.