BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC
----------

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
Đề tài: NGHIÊN CỨU SỰ BIỂU HIỆN MIRACULIN TÁI TỔ HỢP Ở
MỘT SỐ DÕNG RỄ TƠ THUỐC LÁ CHUYỂN GEN

Giáo viên hƣớng dẫn

:

Ts. Phạm Bích Ngọc

Sinh viên thực hiện

:

Nguyễn Thị Hồng Hảo

Lớp

:

CNSH-11-03

HÀ NỘI - 2015


Khóa luận tốt nghiệp

Viện Đại học Mở Hà Nội

LỜI CẢM ƠN
Trước hết, em xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc nhất tới TS. Phạm
Bích Ngọc-Phòng Công nghệ Tế bào Thực vật, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn
lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, người đã hướng dẫn, giúp đỡ và chỉ bảo em
tận tình, chu đáo để em có thể hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này.
Em xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến Ths. La Việt Hồng-trường Đại học
Sư phạm Hà Nội 2, đã trực tiếp hướng dẫn em những thao tác kỹ thuật cũng như
giúp đỡ em trong suốt quá trình thực tập tại phòng thí nghiệm.
Em cũng xin gửi lời cảm ơn tới tập thể cán bộ Phòng Công nghệ Tế bào Thực
vật, Viện Công nghệ Sinh học đã giúp đỡ em suốt thời gian thực nghiệm.
Em xin gửi những lời cảm ơn sâu sắc đến quý thầy cô, giảng viên khoa Công
nghệ Sinh học-Viện Đại học Mở Hà Nội, những người đã đặt nền móng, giúp em
trau dồi những kiến thức khoa học cho em trong suốt bốn năm học vừa qua, để từ
đó em có thể học tập, nghiên cứu và đạt được kết quả như ngày hôm nay.
Cuối cùng, em xin bày tỏ lòng biết ơn vô cùng đến gia đình, người thân và bạn
bè đã luôn ở bên giúp đỡ và động viên em trong quá trình học tập và hoàn thành
khóa luận này.
Trong quá trình nghiên cứu đề tài, mặc dù bản thân em đã có nhiều cố gắng
xong không thể tránh được những sai sót, nên em rất mong nhận được những góp ý
của quý thầy- cô cũng như các bạn trong cùng lĩnh vực chuyên ngành.
Một lần nữa, cho phép em được cảm ơn tất cả những sự giúp đỡ tận tình và quý
báu trên.
Hà Nội, tháng 5 năm 2015
Sinh viên

Nguyễn Thị Hồng Hảo


Khoa Công nghệ Sinh học

i

Nguyễn Thị Hồng Hảo 11-03


Khóa luận tốt nghiệp

Viện Đại học Mở Hà Nội

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VIẾT TẮT
cDNA

complement Deoxyribonucleic Axit

CTAB

Cetyltrimethyl Ammonium Bromide

DNA

Deoxyribonucleic Axit

EDTA

Ethylen Diamine Tetraacetic Axit

ELISA


Enzyme Linked Immunosorbent Assay

MIR

Miraculin

MS

Môi trƣờng cơ bản theo Murashige và Skoong(1962)

OD

Optical Density

PCR

Polymerase Chain Reaction

PBST

Phosphate Buffer Saline Tween

RNase

Ribonuclease

SDS

Sodium docecyl Sulfate


SDS-PAGE

Sodium docecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis

TBST

Tris-buffered Saline

WT

Wild type

Khoa Công nghệ Sinh học

ii

Nguyễn Thị Hồng Hảo 11-03


Khóa luận tốt nghiệp

Viện Đại học Mở Hà Nội

DANH MỤC HÌNH ẢNH
Hình 1.1: Cây thần kỳ (Richadella dulcifica)
Hình 1.2: Miraculin tự nhiên đƣợc tích lũy trong quả cây thần kỳ.
Hình 1.3: Mô hình cấu trúc 3D của protein miraculin dạng dimer đồng hình
Hình 1.4: (A) Hình thái rễ tơ cây bắp cải trên môi trƣờng đặc, (B) Rễ tơ thuốc lá
phát triển trên môi trƣờng đặc không chất điều hòa sinh trƣởng sau 2 tuần
Hình 1.5: Cấu trúc Ri plasmd

Hình 1.6: Nuôi cấy rễ tơ G.glabra
Hình 2.1: Chu kỳnhiệtchạyphảnứng PCR
Hình 3.1: Quá trình tạo và chọn lọc dòng rễ tơ đƣợc chuyển gen miraculin
Hình 3.2: Kết quả điện di sản phẩm PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu
Mir_BamHI_F/Mir_SacI_R trên gel agarose 0,8% (w/v)
Hình 3.3: Kết quả lai western blot kiểm tra sự biểu hiện của protein miraculin trong
các dòng rễ tơ
Hình 3.4: Một số giai đoạn nuôi lỏng rễ tơ thuốc lá biểu hiện protein tái tổ hợp
miraculin. A: Rễ tơ trên môi trƣờng đặc 21 ngày tuổi: B, C, D: Rễ tơ trên
môi trƣờng lỏng 2 tuần tuổi, 4 tuần tuổi và 6 tuần tuổi.
Hình 3.5: Động thái tích lũy sinh khối tƣơi của một số dòng rễ tơ
Hình 3.6: Động thái tích lũy sinh khối khô của một số dòng rễ tơ
Hình 3.7: Biểu đồ sinh trƣởng theo chiều dài của một số dòng rễ tơ
Hình 3.8: Chỉ tiêu đánh giá chiều dài một số dòng rễ tơ thuốc lá chuyển gen

Khoa Công nghệ Sinh học

iii

Nguyễn Thị Hồng Hảo 11-03


Khóa luận tốt nghiệp

Viện Đại học Mở Hà Nội

DANH MỤC BẢNG
Bảng 2.1: Các thiết bị dùng trong thí nghiệm
Bảng 2.2: H a chất pha đệm rửa
Bảng 2.3: H a chất pha đệm chiết

Bảng 2.4: Thành phần phản ứng PCR khuếch đại gen
Bảng 2.5: Chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR khuếch đại gen
Bảng 2.6: Thành phần và cách pha dung dịch PBST
Bảng 2.7: Thành phần gel điện di protein SDS-PAGE
Bảng 2.8: thành phần đệm biến tính protein
Bảng 2.9: Thành phần và cách pha Blotting solution 1X
Bảng 2.10: Thành phần và hàm lƣợng của dung dịch TBS 1X
Bảng 3.1: Kết quả tạo và chọn lọc các dòng rễ tơ đƣợc chuyển gen miraculin
Bảng 3.2: Động thái tích lũy sinh khối tƣơi của một số dòng rễ tơ (g)
Bảng3.3: Động thái tích lũy sinh khối khô của một số dòng rễ tơ (g)

Khoa Công nghệ Sinh học

iv

Nguyễn Thị Hồng Hảo 11-03


Khóa luận tốt nghiệp

Viện Đại học Mở Hà Nội

CÔNG THỨC MÔI TRƢỜNG
Môi trƣờng MS đặc
 MS cơ Bản
 Saccaroza:
 Agar:

30g/l
9g/l


 pH= 5,8
Môi trƣờng MS lỏng
 MS cơ Bản
 Saccaroza:

30g/l

 pH= 5,8

Khoa Công nghệ Sinh học

v

Nguyễn Thị Hồng Hảo 11-03


Khóa luận tốt nghiệp

Viện Đại học Mở Hà Nội

MỤC LỤC
MỞ ĐẦU .....................................................................................................................4
1. Lý do chọn đề tài .....................................................................................................4
2. Mục đích và nội dung nghiên cứu ...........................................................................5
2.1. Mục đích nghiên cứu ............................................................................................5
2.2. Nội dung nghiên cứu ............................................................................................5
3. Ý nghĩa lý luận và thực tiễn ....................................................................................5
3.1. Ý nghĩa lý luận .....................................................................................................5
3.2. Ý nghĩa thực tiễn ..................................................................................................5

NỘI DUNG .................................................................................................................6
CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU .....................................................................6
1.1. ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA CÂY THẦN KỲ VÀ MIRACULIN ..................6
1.1.1. Đặc điểm sinh học của cây thần kỳ ...................................................................6
1.1.2. Miraculin: tính chất và đặc điểm phân tử .........................................................7
1.1.2.1. Cấu trúc của miraculin ...................................................................................8
1.1.2.2. Tính chất tạo cảm giác ngọt của miraculin ....................................................9
1.2. NGUỒN GỐC, ĐẶC ĐIỂM SINH TRƢỞNG VÀ ƢU ĐIỂM CỦA HỆ
THỐNG NUÔI CẤY RỄ TƠ THỰC VẬT ..............................................................10
1.2.1. Nguồn gốc của rễ tơ thực vật ..........................................................................10
1.2.2. Đặc điểm sinh trƣởng và ƣu điểm của rễ tơ thực vật ......................................10
1.2.3. Phƣơng pháp đánh giá sinh trƣởng của rễ tơ thực vật ....................................11
1.3. KỸ THUẬT CHUYỂN GEN THÔNG QUA AGROBACTERIUM
RHIZOGENES VÀ ỨNG DỤNG .............................................................................11
1.3.1. Giới thiệu vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes ..............................................12
1.3.2. Hệ vector nhị thể .............................................................................................14

Khoa Công nghệ Sinh học

1

Nguyễn Thị Hồng Hảo 11-03


Khóa luận tốt nghiệp

Viện Đại học Mở Hà Nội

1.3.3. Một số nghiên cứu ứng dụng hệ thống nuôi cấy rễ tơ trong công nghệ sinh
học thực vật ...............................................................................................................15

1.4. MỘT SỐ NGHIÊN CỨU TRONG NƢỚC VÀ NƢỚC NGOÀI LIÊN QUAN
ĐẾN MIRACULIN ...................................................................................................16
1.4.1. Tình hình nghiên cứu miraculin trên thế giới .................................................16
1.4.2. Tình hình nghiên cứu miraculinở Việt Nam ...................................................17
CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................18
2.1. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU ...............................................................................18
2.1.1. Vật liệu ............................................................................................................18
2.1.2. H a chất và thiết bị thí nghiệm .......................................................................18
2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU......................................................................19
2.2.1. Kiểm tra sự c mặt của gen miraculintrong dòng rễ tơ bằng kỹ thuật PCR
(Polymerase Chain Reaction) ....................................................................................19
2.2.2. Đánh giá mức độ biểu hiện protein tái tổ hợp miraculin trong một số dòng rễ
tơ chuyển gen miraculin bằng lai miễn dịch Western Blot .......................................23
2.2.3. Phƣơng pháp đánh giá chỉ tiêu sinh trƣởng ....................................................26
2.2.4. Phƣơng pháp phân tích số liệu ........................................................................27
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU .................................................................28
3.1. KIỂM TRA SỰ CÓ MẶT CỦA GEN MIRACULIN TRONG DÕNG RỄ TƠ
BẰNG KỸ THUẬT PCR..........................................................................................28
3.2. ĐÁNH GIÁ MỨC ĐỘ BIỂU HIỆN CỦA PROTEIN TÁI TỔ HỢP
MIRACULIN BẰNG LAI MIỄN DỊCH WESTERN BLOT ...................................30
3.3. KHẢO SÁT ĐỘNG THÁI SINH TRƢỞNG CỦA MỘT SỐ DÕNG RỄ TƠ
BIỂU HIỆN PROTEIN TÁI TỔ HỢP MIRACULIN ..............................................31
3.3.1. Động thái tích lũy sinh khối tƣơi của một số dòng rễ tơ .................................32
3.3.2. Động thái tích lũy sinh khối khô của một số dòng rễ tơ .................................34

Khoa Công nghệ Sinh học

2

Nguyễn Thị Hồng Hảo 11-03



Khóa luận tốt nghiệp

Viện Đại học Mở Hà Nội

3.3.3. Đánh giá sinh trƣởng chiều dài của một số dòng rễ tơ ...................................35
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ...................................................................................37
1. Kết luận .................................................................................................................37
2. Kiến nghị ...............................................................................................................37
TÀI LIỆU THAM KHẢO .........................................................................................38

Khoa Công nghệ Sinh học

3

Nguyễn Thị Hồng Hảo 11-03


Khóa luận tốt nghiệp

Viện Đại học Mở Hà Nội

MỞ ĐẦU
1. Lý do chọn đề tài
Trong những năm gần đây tỷ lệ ngƣời mắc bệnh béo phì và bệnh tiểu đƣờng đã
tăng mạnh ở nhiều nƣớc trên thế giới, bao gồm cả Việt Nam. Những kết quả thực
nghiệm cho thấy bệnh béo phì là một trong những yếu tố nguy cơ gây ra bệnh đái
tháo đƣờng type 2, rối loạn chuyển h a lipid, tăng huyết áp, ung thƣ đƣờng tiêu
h a… Với những bệnh nhân này, không nên sử dụng thực phẩm và đồ uống chứa

nhiều chất béo, đƣờng... Những chất ngọt nhân tạo nhƣ saccarin, aspartame,
cyclamate…đã đƣợc sử dụng từ lâu trên toàn thế giới nhƣ các chất làm ngọt ít năng
lƣợng để cải thiện bữa ăn, đồ uống cho bệnh nhân bị bệnh liên quan đến việc sử
dụng đƣờng, ví dụ nhƣ tiểu đƣờng, hyperlipemia, sâu răng, béo phì… Tuy nhiên,
các chất ngọt nhân tạo này c các tác dụng khi sử dụng nhiều nhƣ vấn đề tâm lý, rối
loạn tâm thần, ung thƣ bàng quang, suy tim và khối u não (Kant,2005) .
Vì vậy, các nhà khoa học đã tìm ra các protein c vị ngọt an toàn và thân thiện
với con ngƣời hơn thay thế các chất ngọt nhân tạo. Do các loại protein này đƣợc
chiết từ tự nhiên và c năng lƣợng hấp thu thấp nên đƣợc sử dụng trong thức ăn cho
bệnh nhân bị bệnh liên quan đến việc tiêu thụ các loại đƣờng nhƣ đái tháo đƣờng,
béo phì… Cho đến nay c bảy loại protein c vị ngọt (sweet protein) và protein thay
đổi tạo vị ngọt (taste-modifying protein) đang đƣợc sử dụng bao gồm Brazzein,
Thaumatin, Monelin, Curculin, Mabinlin, Miraculin và Pentadin. Trong đ điển
hình nhất là Miraculin-một loại protein thay đổi vị ngọt còn ít đƣợc nghiên cứu.
Miraculin đƣợc tách chiết từ quả của cây Richadella dulcifica, đây là một loại
cây bụi ở vùng nhiệt đới Tây Phi, thuộc họ Hồng xiêm (saponaceae), và tên thƣờng
gọi là cây thần kỳ (Micracle fruit), khi nhai phần thịt quả thần kỳ sau đ ăn vị chua
chẳng hạn nhƣ chanh, lúc đ chanh sẽ c vị ngọt. Loại quả này đƣợc ngƣời dân
Châu Phi dùng cách đây hàng trăm năm, hơn nữa sử dụng Miraculin sẽ tích lũy
năng lƣợng hấp thu thấp, do đ rất tốt cho cải thiện bữa ăn của bệnh nhân tiểu
đƣờng, béo phì. Mặc dù c tính chất ƣu thế nhƣ vậy, xong sản lƣợng lại bị hạn chế
do cây thần kỳ sinh trƣởng chậm, quả nhỏ không thích hợp cho việc sản xuất với số
lƣợng lớn.
Khoa Công nghệ Sinh học

4

Nguyễn Thị Hồng Hảo 11-03



Khóa luận tốt nghiệp

Viện Đại học Mở Hà Nội

Kỹ thuật di truyền thực vật nhƣ một giải pháp để khắc phục vấn đề này, kỹ thuật
này cho phép biểu hiện các gen khác nhau trong các loài thực vật, nhờ đ c thể sản
xuất đƣợc protein tái tổ hợp mong muốn. C nhiều hệ thống thực vật để sản xuất
protein tái tổ hợp, đặc biệt là hệ thống rễ tơ chuyển gen đã đƣợc sử dụng rất rộng rãi
ở nhiều nƣớc trên thế giới để sản xuất ra các protein tái tổ hợp khác nhau.
Chính vì vậy, chúng tôi thực hiện đề tài:“Nghiên cứu sự biểu hiện miraculintái
tổ hợp ở một số dòng rễ tơ thuốc lá chuyển gen”

2. Mục đích và nội dung nghiên cứu
2.1. Mục đích nghiên cứu
Đánh giá sự biểu hiện của miraculintái tổ hợp ở một số dòng rễ tơ thuốc lá
chuyển gen.
2.2. Nội dung nghiên cứu
-

Kiểm tra sự c mặt của gen miraculintrong một số dòng rễ tơ chuyển gen
bằng kỹ thuật PCR.

-

Đánh giá mức độ biểu hiện miraculintrong một số dòng rễ tơ chuyển gen
miraculin bằng lai miễn dịch Western Blot.

- Đánh giá động thái sinh trƣởng của một số dòng rễ tơ chuyển gen.
3. Ý nghĩa lý luận và thực tiễn
3.1. Ý nghĩa lý luận

Cung cấp tƣ liệu khoa học về quá trình biểu hiện protein tái tổ hợp trong hệ thống rễ
tơ thuốc lá.

3.2. Ý nghĩa thực tiễn
Kết quả đề tài cung cấp một số dòng rễ tơ thuốc lá biểu hiện miraculin tái tổ hợp ở
mức cao, là nguyên liệu cho sản xuất miraculin tái tổ hợp bằng hệ thống bioreactor.

Khoa Công nghệ Sinh học

5

Nguyễn Thị Hồng Hảo 11-03


Khóa luận tốt nghiệp

Viện Đại học Mở Hà Nội

NỘI DUNG
CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA CÂY THẦN KỲ VÀ MIRACULIN
1.1.1. Đặc điểm sinh học của cây thần kỳ
Miraculin đƣợc tách chiết từ quả của cây Richadella dulcifica, đây là loại cây
bụi ở vùng nhiệt đới Tây Phi, thuộc họ Hồng xiêm (saponaceae), và tên thƣờng gọi
là cây thần kỳ (Miracle fruit), hoặc Synsepalum dulcificum, quả ngọt (sweet berry)
( Trong điều kiện tự nhiên, cây c thể đạt
chiều cao 6,1m còn trong điều kiện nhân tạo thì cây chỉ đạt chiều cao khoảng 3m.
Loại cây này sinh trƣởng tốt nhất ở đất c pH thấp từ 4,5-5,8. C thể sinh trƣởng
trong điều kiện từ lạnh giá đến dƣới b ng râm c độ ẩm tƣơng đối cao (wikipedia).
Cây thần kỳ c quả màu đỏ, khi nhai phần thịt quả thần kỳ sau đ các thức ăn

c vị chua chẳng hạn nhƣ chanh, lúc đ chanh sẽ c vị ngọt mà không còn vị chua,
chính vì thế mà cây này c tên gọi “thần kỳ”. Loại quả này đƣợc ngƣời dân châu
phi dùng cách đây hàng trăm năm, hơn nữa theo cácnghiên cứu cho thấy sử dụng
Miraculintrong quả này sẽ tích lũy năng lƣợng hấp thu thấp, do đ rất tốt cho việc
cải thiện bữa ăn của bệnh nhân tiểu đƣờng, béo phì (Sun HJ et al., 2006a).

Hình 1.1: Cây thần kỳ (Richadella dulcifica)

Khoa Công nghệ Sinh học

6

Nguyễn Thị Hồng Hảo 11-03


Khóa luận tốt nghiệp

Viện Đại học Mở Hà Nội

Bản chất của miraculin là không ngọt, nhƣng n c tính chất là tạo cảm giác
ngọt (taste-modifying activity) và c khả năng chuyển từ vị chua thành cảm giác
ngọt. Sau khi ăn quả thần kỳ, vị chanh chua sẽ ngọt nhƣ vị cam. Tên gọi “quả thần
kỳ” đƣợc bắt nguồn từ tính chất đặc trƣng và hấp dẫn này (Kurihara và Beidler,
1968). Miraculin đƣợc tích lũy chỉ ở quả của cây thần kỳ và n đƣợc tạo ra sau 6
tuần sau khi hoa đƣợc thụ phấn, hay khi màu sắc của quả chuyển từ xanh lá cây
sang màu cam, và đƣợc tích lũy nhiều nhất khi quả ở trạng thái đỏ hoàn toàn (Hình
1.2).

Hình 1.2:Miraculintự nhiên đƣợc tích lũy trong quả cây thần kỳ
Protein miraculinđược chiết theo mô tả của Hirai et al (2010a) sau khi đã loại bỏ vỏ và hạt. Nồng

độ được đánh giá bằng ELISA (Kim et al, 2010b), (a) mức độ tích lũy được phát hiện bằng phân tích Western
Blot như mô tả của Sun et al (2007), (b) Quả cây thần kỳ ở giai đoạn đang phát triển và chín được thể hiện ở
ảnh phía dưới, (c) Đường kẻ trên đồ thị thể hiện sai số chuẩn của ba lần nhắc lại

1.1.2. Miraculin: tính chất và đặc điểm phân tử
Các protein c vị ngọt đang đƣợc sử dụng để thay thế các chất ngọt nhân tạo.
Do các loại protein này không c hại vì đƣợc tách chiết từ thiên nhiên và c năng
lƣợng hấp thu thấp nên đƣợc sử dụng trong thức ăn cho các bệnh nhân bị bệnh liên
quan đến việc sử dụng các loại đƣờng nhƣ đái tháo đƣờng, béo phì… (Sun HJ et al.,
2006a). Cho đến nay c bảy loại protein c vị ngọt (sweet protein) và protein thay
Khoa Công nghệ Sinh học

7

Nguyễn Thị Hồng Hảo 11-03


Khóa luận tốt nghiệp

Viện Đại học Mở Hà Nội

đổi tạo vị ngọt (taste-modifying protein) đang đƣợc sử dụng bao gồm Brazzein,
Thaumatin, Monelin, Curculin, Mabinlin, Miraculinvà Pentadin (Kant R., 2005).
Trong đ điển hình nhất là Miraculin-một loại protein thay đổi tạo vị ngọt còn ít
đƣợc nghiên cứu.
1.1.2.1. Cấu trúc của miraculin
Miraculinlà một glycoprotein chứa 191 axit amin, hai chuỗi đƣờng liên kết với
chuỗi peptide tại (Asparagine):Asn-42 và Asn-186. Khối lƣợng phân tử của chuỗi
đơn peptide đƣợc tính toán dựa trên trình tự axit amin và hàm lƣợng hydrocacbon
(13,9%) là khoảng 24,6kDa (Theerasilp và Kurihara, 1988; Theerasilp et al. 1989).

Trình tự nucleotide mã h a cho 220 axit amin, gồm trình tự tín hiệu 29 axit amin
(Masuda et al, 1995). Kết quả này cho thấy protein miraculintự nhiên ở dạng hoàn
thiện là kết quả của quá trình cải biến sau dịch mã ở đầu N.
Dạng miraculintự nhiên tinh khiết là tetramer, dịch chiết thô dạng chƣa khử và
chƣa biến tính của miraculinlà dimer (Igeta et al, 1991). Cả hai dạng tetramer và
dimer tự nhiên của miraculinđều c tác dụng tạo cảm giác ngọt (Igeta et al, 1991),
tuy nhiên dạng monomer lại không c tính chất này (Ito et al, 2007). Vì vậy, quá
trình dimer h a thông qua việc tạo một liên kết cộng h a trị ở vị trí Cys-138 là cần
thiết để miraculinc tính chất tạo cảm giác ngọt ở pH axit (Hình 1.3).

Hình 1.3:Mô hình cấu trúc 3D của protein miraculindạng dimer đồng hình
Đuôi His được đánh dấu màu xanh. Hình ovan (màu đen) chỉ vị trí của liên kết disulphide giữa hai
chuỗi (C138-C138). Mô hình phân tử của dimer miraculinkhông thể hiện thành phần đường, theo
tác giả, các chuỗi đường ở các góc của protein dimer, và chúng không tham gia hoạt động tạo cảm
giác ngọt (Paladino et al, 2008)

Khoa Công nghệ Sinh học

8

Nguyễn Thị Hồng Hảo 11-03


Khóa luận tốt nghiệp

Viện Đại học Mở Hà Nội

1.1.2.2. Tính chất tạo cảm giác ngọt của miraculin
Miraculin c khả năng tạo ra cảm giác ngọt từ các loại axit khác nhau nhƣ axit
clohydric (HCl), axit oxalic, axit lactic, axit formic, axit axetic và axit citric. Tác

dụng tạo cảm giác ngọt của miraculin phụ thuộc vào độ chua và độ pH của axit
(Kurihara và Beidler, 1969). Tác dụng tạo cảm giác ngọt của dung dịch miraculin
đạt mức tối đa sau khi ngậm dung dịch miraculin trong miệng khoảng 3 phút
(Kurihara và Beidler, 1969). Để c thể tạo ra cảm giác ngọt tối đa, cần nồng độ của
miraculinlà từ 4.10-7M và độ ngọt tƣơng đƣơng với độ ngọt của dung dịch sucrose
0,4M. Tác dụng tạo cảm giác ngọt kéo dài khoảng 1 giờ sau khi sử dụng, tùy thuộc
vào nồng độ của dung dịch miraculin .
Trƣớc đây các mẫu phân lập đƣợc chƣa hoàn toàn tinh sạch do đ việc xác định
cấu trúc chủ yếu của miraclin chƣa đƣợc hoàn chỉnh. Đến năm 1988, Theerasilp và
Kurihara đã thiết kế ra một phƣơng pháp mới để thu đƣợc miraculinở dạng rất tinh
khiết và đã xác định đƣợc: Miraculin c bản chất là glycoprotein, khối lƣợng phân
tử khoảng 28 kDa trong khi các thông báo trƣớc đ đã cho rằng trọng lƣợng n dao
động 40 kDa tới 48 kDa. Miraculinc chứa khoảng 13,9% carbohydrate (Theerasilp
và Kurihara, 1988).
Phân tử miraculingồm một chuỗi polypeptide đơn với 191 acid amin. Trọng
lƣợng phân tử của miraculin dựa trên trình tự axit amin và hàm lƣợng
carbonhydrate là 24,6 kDa (Hirai T et al., 2010), c năm loại cấu trúc của chuỗi
oligosarcharid ở hai vị trí glycosyl hoá là Asn-42 và Asn-186 (Hiwasa-Tanase K et
al., 2011). Miraculinc bảy phân tử Cys còn lại, chúng hình thành ba chuỗi tƣơng
tác qua cầu disulfide ở Cys-47-Cys-92, Cys-148-Cys-159 và Cys-152-Cys-155, và
một chuỗi tƣơng tác qua cầu disulfide ở Cys-138 (Igeta H., 1991). Dimer đồng hình
(homodimer) miraculinc liên kết hoá trị ở Cys-138, c hoạt động thay đổi vị giác
(taste -modifying activity) ở pH axit (Hình 1.3).

Khoa Công nghệ Sinh học

9

Nguyễn Thị Hồng Hảo 11-03



Khóa luận tốt nghiệp

Viện Đại học Mở Hà Nội

1.2. NGUỒN GỐC, ĐẶC ĐIỂM SINH TRƢỞNG VÀ ƢU ĐIỂM CỦA
HỆ THỐNG NUÔI CẤY RỄ TƠ THỰC VẬT
1.2.1. Nguồn gốc của rễ tơ thực vật
Rễ tơ (Hairy root) là một bệnh ở thực vật c

nguyên nhân bởi vi khuẩn

Agrobacterium Rhizogenes, làm tăng lên nhanh ch ng hệ rễ, đặc biệt là số lƣợng
rễ tơ bắt nguồn từ vị trí bị nhiễmgây bởi Agrobacterium rhizogenes.
Agrobacterium rhizogenesthuộc vi khuẩn đất thuộc nh m Gram âm.Khi vi
khuẩn xâm nhiễm vào thực vật, đoạn T-DNA giữa vùng TR và TL của plamid Ri
của vi khuẩn sẽ đƣợc chuyển sang và dung hợp vào genom của cây chủ. Quá trình
biến nạp này tạo ra một sản phẩm c giá trị đ là rễ tơ, rễ tơ đƣợc hình thành ở
chính (hoặc gần) vị trí mà vi khuẩn xâm nhiễm. Ngoài ra, các opine đƣợc tạo ra để
cung cấp thức ăn cho vi khuẩn (Chilton et al, 1982).
1.2.2. Đặc điểm sinh trƣởng và ƣu điểm của rễ tơ thực vật
Rễ tơ sinh trƣởng rất nhanh và phân nhánh mạnh, c thể sinh trƣởng tốt trên
môi trƣờng không c chất điều hòa sinh trƣởng. Tốc độ sinh trƣởng trung bình của
rễ tơ dao động trong khoảng từ 0,1-2,0 khối lƣợng khô/lít/ngày (Hình 1.4).

Hình 1.4: (A) Hình thái rễ tơ cây bắp cải trên môi trƣờng đặc, (B) Rễ tơ thuốc lá phát triển
trên môi trƣờng đặc không chất điều hòa sinh trƣởng sau 2 tuần

Nuôi cấy rễ tơ với ƣu thế dễ dàng nuôi cấy, môi trƣờng nuôi cấy đơn giản, rẻ
tiền, dễ dàng sản xuất một lƣợng sinh khối lớn trong khoảng thời gian ngắn và quan

trọng hơn cả tế bào thực vật không mang các mầm bệnh cho ngƣời, đƣợc xem là
Khoa Công nghệ Sinh học

10

Nguyễn Thị Hồng Hảo 11-03


Khóa luận tốt nghiệp

Viện Đại học Mở Hà Nội

một trong những xu hƣớng hiện nay đƣợc sử dụng để biểu hiện các dƣợc phẩm sinh
học tái tổ hợp. Đặc biệt, rễ tơ c thể sinh trƣởng, phát triển tốt trên môi trƣờng
không cần bổ sung các chất điều hoà sinh trƣởng vì thế loại bỏ đƣợc dƣ lƣợng của
các chất này trong sản phẩm tạo ra. Hơn nữa, các rễ tơ c thể đƣợc nuôi cấy tạo sinh
khối liên tục, điều này c ý nghĩa trong dây chuyền sản xuất các chất thứ cấp hay
các dƣợc phẩm sinh học tái tổ hợp.
1.2.3. Phƣơng pháp đánh giá sinh trƣởng của rễ tơ thực vật
Nuôi cấy trên môi trường đặc: mặc dù sinh trƣởng của rễ tơ trên môi trƣờng đặc
đủ cho hầu hết các nghiên cứu, xong để sản xuất các hợp chất thứ cấp cũng nhƣ để
nghiên cứu các con đƣờng sinh h a hoặc ảnh hƣởng của các thành phần bổ sung vào
môi trƣờng nuôi cấy rễ tơ, nuôi cấy rễ tơ trong môi trƣờng lỏng với lƣợng lớn
thƣờng đƣợc sử dụng.
Nuôi cấy trên môi trường lỏng: c thể sử dụng bình tam giác đã khử trùng để
chứa môi trƣờng nuôi cấy lỏng, bổ sung vào đ một lƣợng nhỏ rễ tơ cần nuôi cấy,
sau đ đặt lên máy lắc nhẹ. Một vấn đề rất quan trọng trong nuôi cấy lỏng rễ tơ đ
là phải bổ sung kháng sinh diệt khuẩn vào môi trƣờng để nhằm loại bỏ vi khuẩn
A.rhizogenes còn s t lại. Điều kiện nuôi cấy c thể là trong tối hoặc ngoài sáng.
Ngoài ra, để nghiên cứu động thái sinh trƣởng của các dòng rễ tơ dƣới ảnh

hƣởng của yếu tố nghiên cứu nào đ , c thể sử dụng các chỉ tiêu nhƣ khối lƣợng
tƣơi, khối lƣợng khô hoặc phân tích hình ảnh.

1.3. KỸ THUẬT CHUYỂN GEN THÔNG QUA AGROBACTERIUM
RHIZOGENES VÀ ỨNG DỤNG
A. rhizogenes và A. tumefaciens là vật trung gian chuyển gen vào thực vật
đƣợc sử dụng từ khá lâu trên thế giới cũng nhƣ ở nƣớc ta. Với vai trò quan trọng
cúa n trong việc chuyển gen vào thực vật chúng đã đƣợc các nhà khoa học nghiên
cứu khá cụ thể và chi tiết. Trên cơ sở những hiểu biết của các nhà khoa học đi trƣớc
về Agrobacterium chúng tôi đã sử dụng A.rhizogenes, do chúng c thể tạo ra
nhanh ch ng một lƣợng lớn rễ tơ chuyển gen, do đ rất đơn giản và nhanh ch ng
đánh giá hiệu quả của cấu trúc chuyển gen cũng nhƣ mức độ biểu hiện của gen
quan tâm.
Khoa Công nghệ Sinh học

11

Nguyễn Thị Hồng Hảo 11-03


Khóa luận tốt nghiệp

Viện Đại học Mở Hà Nội

1.3.1. Giới thiệu vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes
Agrobacterium Rhizogenes thuộc họ Agrobacterium, c

chứa plasmid Ri

(inducing root), Ri-plasmid là phân tử DNA mạch vòng, sợi kép, c trọng lƣợng

phân tử lớn, từ 200-800 Kb, gồm 2 vùng chính là T-DNA và Vir (virulence) và
khi tế bào thực vật bị thƣơng sẽ tiết ra các polyphenol hấp dẫn các vi khuẩn[32],
tại đây Agrobacterium Rhizogenes chuyển đoạn T-DNA (transfer DNA)từ Riplasmid vào hệ gen của tế bào vật chủ. Các gen rol thuộc biên trái T-DNA sẽ
đƣợc biểu hiện và hình thành rễ tơ. Sự cảm ứng rễ tơ đƣợc chứng minh ở nhiều
cơ quan thực vật khác nhau nhƣ lá, cơ quan dự trữ và lá mầm cây non và mô
thân.
Agrobacterium thuộc họ Rhizobiaceae, chi Agrobacterium c 4 loài chính:
Agrobacterium

tumefaciens,

Agrobacterium

rhizogens,

Agrobacterium

radiobacter, Agrobacterium rubi. Trong đ A. tunefaciens và A. rhizogenes là
hai loài đƣợc nghiên cứu nhiều nhất. Chúng là vi khuẩn gây ra bệnh khối u
(crown gall) và bệnh rễ tơ (hairy root) ở các vị trí tổn thƣơng của thực vật hai lá
mầm.
Tác nhân gây bệnh của hai loài vi khuẩn trên đã đƣợc xác định là do sự c
mặt của Ti (Tumour inducing) ở A. tumefaciens và Ri (root-inducing) ở A.
Rhizogenes(Chilton M.D et al., 1982). Khi tế bào thực vật bị thƣơng, sẽ tiết ra
các polyphenol hấp dẫn các vi khuẩn, tại đây n chuyển đoạn T-DNA (transfer
DNA) từ Ti-plasmid hay Ri-plasmid vào hệ gen của tế bào vật chủ. Nhìn chung,
cơ chế của quá trình xâm nhiễm và cơ chế phân tử của quá trình vận chuyển TDNA vào tế bào vật chủ của hai loài vi khuẩn này đƣợc chứng minh là tƣơng tự
nhau (Sevon N.A, 2002). Tuy nhiên, sự hình thành khối u ở vi khuẩn A.
tumefaciens do gen mã h a sinh tổng hợp auxin quy định. Trong khi đ các gen
mã h a sinh tổng hợp auxin ở vi khuẩn A. rhizogenes c vai trò rất nhỏ trong quá

trình hình thành rễ tơ ở thực vật (Christey M.C, 2001), (Sevon N.A, 2002).
Giống nhƣ Ti-plasmid, Ri-plasmid là phân tử DNA mạch vòng, sợi kép,
c trọng lƣợng phân tử lớn, từ 200 -800 kb, gồm hai vùng chính là T-DNA và
Vir (virulence). Dựa vào khả năng sinh tổng hợp các opine ở rễ tơ-nguồn cacbon

Khoa Công nghệ Sinh học

12

Nguyễn Thị Hồng Hảo 11-03


Khóa luận tốt nghiệp

Viện Đại học Mở Hà Nội

và nito cho vi khuẩn. Ri-plasmid đƣợc chia làm hai nh m chính: agropine và
mannopine và một số nh m phụ đƣợc tìm thấy và phân loại sau này nhƣ:
cucumopine và mikimopine. Trong đ

các chủng thuộc nh m agropine (A4,

15834, LBA9402, 1855) đƣợc chứng minh là độc hơn so với các chủng thuộc
nh m mannopine (8196, TR7, TR101) và các chủng này đƣợc sử dụng chủ yếu
trong các nghiên cứu tạo rễ tơ ở thực vật (Lê Duy Thành), (Sevon N.A, 2002).
T-DNA ở Ri-plasmid của nh m agropine bao gồm hai vùng chính là vùng
biên trái TL-DNA và biên phải TR-DNA. Hai vùng này đều c kích thƣớc khoảng
15 -20 kb và đƣợc xen kẽ bởi một đoạn DNA, đoạn DNA này sẽ không đƣợc
chuyển vào hệ gen của tế bào vật chủ. Vùng TR-DNA mang các gen mã h a tổng
hợp DNA (tms1 và tms2), vùng T L-DNA bao gồm 18 khung đọc (ORFs) trong

đ c bốn locus 10, 11, 12 và 15 mã h a cho rol A, B, C và D (root locus). Các
Ri-plasmid của các chủng A.rhizogenes thuộc nh m mannopine, cucumopine và
mikimopine chứa vùng T-DNA đơn, c cấu trúc giống nhƣ vùng T L-DNA của
các chủng thuộc nh m agropine nhƣng khuyết gen rolD (Britton, 2008),

(Christey M.C, 2001).

Hình 1.5: Cấu trúc Ri plasmid

Các gen rolA, rolB and rolC đ ng vai trò quan trọng trong quá trình cảm
ứng tạo rễ tơ ở mô tế bào thực vật. Sự biểu hiện đồng thời của ba gen này gây
nên kiểu hình rễ tơ ở mô tế bào thực vật bị xâm nhiễm. Các rễ tơ c đặc điểm

Khoa Công nghệ Sinh học

13

Nguyễn Thị Hồng Hảo 11-03


Khóa luận tốt nghiệp

Viện Đại học Mở Hà Nội

sinh trƣởng, phát triển mạnh hơn rất nhiều so với rễ bình thƣờng. Trong 3 gen
rol trên, gen rolB đ ng vai trò quan trọng hơn cả, khi gen rolB đƣợc biểu hiện,
mô tế bào thực vật đ cảm ứng tạo kiểu hình rễ tơ, trong khi đ khi bất hoạt gen
rolB không tạo đƣợc kiểu hình rễ tơ (Britton, 2008).
1.3.2. Hệ vector nhị thể
Kích thƣớc lớn của Ri-plasmid và Ti-plasmid gây nhiều kh khăn trong

quá trình chuyển gen thông qua Agrobacterium và trong các thao tác sử dụng để
thiết kế gen vào các vector này. Mặt khác các enzyme giới hạn c thể cắt DNA
của Ti-plasmid ở nhiều chỗ khác nhau, trong khi công nghệ gen lại cần những vị
trí cắt duy nhất cho hoạt động của một số enzyme giới hạn. Mặt khác, ở
A.tumefaciens, một số gen mã h a sinh tổng hợp auxin đƣợc sử dụng làm chỉ thị
chọn lọc c tính trội nhƣng lại cản trở quá trình tái sinh bình thƣờng ở thực vật.
Với các lí do trên đây, các nhà khoa học đ cải tiến Ti-plasmid thành một hệ
vector nhị thể gồm c vector chuyển gen (mang cấu trúc T-DNA) và vector bổ
trợ (mang các gen Vir) đảm nhiệm chức năng vận chuyển T-DNA vào tế bào
thực vật (Nguyễn Đức Thành, 2003).
Vector chuyển gen trong hệ vector nhị thể ở A.tumefaciens c thể sử dụng
để chuyển gen thông qua A.rhizogenes. Khi nhiễm A.rhizogenes với thực vật sẽ
làm chuyển T-DNA từ vector chuyển gen cùng với T-DNA của A.rhizogenes vào
genome thực vật (Nguyễn Ánh Hồng , 2000).
Sự tái sinh thành cây chuyển gen thông qua vi khuẩn A.rhizogenes c thể
xảy ra thông qua sự phát triển phôi soma hoặc sự phát sinh cơ quan từ rễ. Tuy
nhiên, thực vật tái sinh từ lông rễ thƣờng bị biến đổi hình thái: lá bị gấp nếp, hệ
thống rễ ăn nghiêng, sinh trƣởng cằn cỗi và khả năng sinh sản kém.

Khoa Công nghệ Sinh học

14

Nguyễn Thị Hồng Hảo 11-03


Khóa luận tốt nghiệp

Viện Đại học Mở Hà Nội


1.3.3. Một số nghiên cứu ứng dụng hệ thống nuôi cấy rễ tơ trong công nghệ
sinh học thực vật
Một trong những hƣớng đi của công nghệ sinh học hiện nay để sản xuất các
sản phẩm tái tổ hợp một cách nhanh ch ng và sản lƣợng cao đ là nuôi cấy rễ tơ
in vitro.
Nuôi cấy rễ tơ với ƣu thế dễ dàng nuôi cấy, môi trƣờng nuôi cấy đơn giản, rẻ
tiền, dễ dàng sản xuất một lƣợng sinh khối lớn trong khoảng thời gian ngắn và
quan trọng hơn cả là tế bào thực vật không mang các mầm bệnh cho ngƣời, đƣợc
xem là một trong những xu hƣớng hiện nay đƣợc sử dụng để biểu hiện các dƣợc
phẩm sinh học tái tổ hợp (Nguyễn Huy Hoàng, 2010). Đặc biệt, rễ tơ c thể sinh
trƣởng và phát triển tốt trên môi trƣờng không cần bổ sung chất điều hòa sinh
trƣởng vì thế loại bỏ đƣợc dƣ lƣợng của các chất này tạo ra trong sản phẩm tạo
ra. Hơn nữa, rễ tơ c thể đƣợc nuôi cấy tạo sinh khối liên tục. Điều này c ý
nghĩa trong dây truyền sản xuất các chất thứ cấp hay các dƣợc phẩm sinh học tái
tổ hợp.
Khi so sánh với thực vật chuyển gen, nuôi cấy mô tế bào thực vật c ƣu điểm
lớn trong công tác sản xuất các dƣợc phẩm sinh học tái tổ hợp là không đòi hỏi
diện tích canh tác, không chịu ảnh hƣởng của khí hậu, mùa vụ, sản phẩm thu
đƣợc không mang các yếu tố độc hại từ thuốc trừ sâu, thuốc diệt cỏ và rút ngắn
đƣợc rất nhiều thời gian trong trồng trọt. Đặc biệt hơn cả ở hệ thống nuôi cấy
lỏng các mô tế bào thực vật việc biểu hiện dƣợc phẩm sinh học tái tổ hợp ra
ngoài môi trƣờng nuôi cấy giúp làm đơn giản hơn rất nhiều trong quá trình tinh
sạch các dƣợc phẩm sinh học này (Lê Trần Bình, 1997).
Cho tới nay, đã c nhiều nghiên cứu sản xuất thành công các protein tái tổ
hợp hay các dƣợc phẩm sinh học tái tổ hợp từ hệ thống nuôi rễ tơ nhƣ SEAP
(Human Secreted Alkaline Phosphatase), protein huỳnh quang kết hợp với
protein ricin B (GFP-ricin B), fungal phytase, và đặc biệt hơn cả là các kháng thể
và các chuỗi nặng, chuỗi nhẹ của kháng thể (Nguyễn Huy Hoàng, 2010) .

Khoa Công nghệ Sinh học


15

Nguyễn Thị Hồng Hảo 11-03


Khóa luận tốt nghiệp

Viện Đại học Mở Hà Nội

Hình 1.6: Nuôi cấy rễ tơ G.glabra
a: Nuôi cấy rễ tơ bằng hệ thống bioreactor-b, c: Thu hoạch sinh khối rễ sau 30 ngày nuôi cấy
(Nguồn:o/content/vol11/issue2/full/6/f4.jpg&imgrefurl)

Thêm vào đ , rễ đƣợc biến nạp c mức phân h a cao và c thể là nguồn sản
xuất ổn định các hợp chất thứ cấp, trong khi các hệ thống nuôi cấy tế bào thực vật
khác c tiềm năng di truyền và h a sinh không ổn định và thƣờng tổng hợp mức độ
rất thấp các hợp chất thứ cấp (Rhodes et al, 1990; Merkli et al, 1997;
Kittipongpatana et al, 1998). Quan trọng nhất là A.rhizogenes c thể chuyển TDNA từ vector nhị thể và cho phép các gen ngoại lai biểu hiện trên thực vật đƣợc
chuyển gen. Đặc tính này đƣợc sử dụng để sản xuất cây chuyển gen (Tepfer et al,
1984; Christey et al,1997).

1.4. MỘT SỐ NGHIÊN CỨU TRONG NƢỚC VÀ NƢỚC NGOÀI LIÊN
QUAN ĐẾN MIRACULIN
1.4.1. Tình hình nghiên cứu miraculin trên thế giới
Miraculincủa cây Thần Kỳ là chất tạo cảm giác ngọt tự nhiên đã đƣợc ngƣời
Châu Phi dùng từ rất lâu đời, các nhà nghiên cứu nhận thấy rằng miraculin
không tạo ra nhiều năng lƣợng, do đ nhiều nhà sản xuất kỳ vọng n sẽ đƣợc
ứng dụng rộng rãi để điều trị cho các bệnh nhân cần sử dụng chất tạo ngọt tổng
hợp và tránh dùng saccarozơ nhƣ bệnh tiểu đƣờng, bệnh béo phì...

Miraculin là một protein hòa tan dễ dàng và tƣơng đối ổn định nhiệt, đ là
một tiềm năng chất ngọt trong thực phẩm c tính axit.

Khoa Công nghệ Sinh học

16

Nguyễn Thị Hồng Hảo 11-03


Khóa luận tốt nghiệp

Viện Đại học Mở Hà Nội

Nhật Bản là nƣớc tập trung vào sản xuất protein miraculin bằng kỹ thuật di
truyền.
Năm 1988, Theerasilp và Kurihara đã hoàn thành việc tách chiết, tinh sạch
và phân tích đặc tính của protein miraculin tự nhiên trong quả Thần kỳ.
Năm 1989, Theerasilp và cộng sự đã xác định đƣợc trình tự axit amin và đặc
tính cấu trúc của protein miraculin.
Năm 1991, Jamura và cộng sự đã xác định cấu trúc tiểu đơn vị disulfua của
protein miraculin .
Năm 1995, Yutaka và cộng sự đã nhân bản trình tự cDNA mã h a protein
miraculin .
Năm 2006, Sun và cộng sự đã tạo cây rau diếp đƣợc chuyển gen biểu hiện
protein miraculin.
Năm 2010, Kim và cộng sự đã tạo đƣợc cây cà chua chuyển gen mang gen
miraculin. Miraculin c cùng một hoạt tính sinh học nhƣ miraculin ở cây bản địa,
chất này đƣợc tạo ra trong lá và quả cà chua biến đổi gen.
Năm 2011, Hirai T và cộng sự đã tạo ra cây cà chua mang chuyển gen mang

trình tự kết thúc terminator của gen HSP 18.2 từ Arabidopsis thaliana đem lại
mức tích lũy protein miraculin cao.
1.4.2. Tình hình nghiên cứu miraculinở Việt Nam
Cây Thần kỳ từ Đài Loan đƣợc du nhập vào Việt Nam khoảng 5 năm trƣớc.
C thể n i rằng đây là giống mới, quý và đang còn rất hiếm ở nƣớc ta nên những
nghiên cứu khoa học trên giống cây này còn rất hạn chế. Viện Sinh học Nhiệt
đới Thành phố Hồ Chí Minh đã phân tích thành phần h a học trong thịt quả cây
Thần Kỳ cho thấy c chứa tinh dầu, carotenoid, phytosterol, axitbéo, flavonoid,
polyphenol, axit hữu cơ, saponin steroid, đƣờng khử, hợp chất uronic. Hoạt chất
miraculin trong trái cây Thần Kỳ đƣợc chiết trong dung dịch muối loãng (NaCl
0,5M) và qua tinh chế bằng phƣơng pháp sắc ký trao đổi ion thu đƣợc hoạt chất
c độ tinh sạch cao và đƣợc ghi nhận là c khả năng biến đổi vị chua của axit
citric trở nên ngọt tƣơng đƣơng với độ ngọt của saccarozơ 0,4M. Tuy nhiên,
chƣa c nghiên cứu nào về việc biểu hiện gen miraculin tái tổ hợp trong vi khuẩn
cũng nhƣ cây trồng (Trần Thế Danh, 2010).

Khoa Công nghệ Sinh học

17

Nguyễn Thị Hồng Hảo 11-03


Khóa luận tốt nghiệp

Viện Đại học Mở Hà Nội

CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU
2.1.1. Vật liệu

Các dòng rễ tơ thuốc lá K326-HSP từ 1 đến 9, K326 -35S từ 1 đến 7 và K326
-WT (wild type) đƣợc nuôi cấy in vitro trên môi trƣờng đặc do phòng Công nghệ tế
bào thực vật -Viện Công nghệ sinh học cung cấp.
- HSP: Các dòng rễ tơ đƣợc chuyển cấu trúc cassette HSP-promoter:Mir:HSPterminator. Trong đ

HSP-promoter và HSP-terminator là promoter và

terminator của gen HSP 18.2 (Heat Shock Protein gene) đƣợc phân lập từ cây
Arabidopsis thaliana.
- 35S: Các dòng rễ tơ đƣợc chuyển cấu trúc cassette 35S-promoter:Mir:NOSterminator. Trong đ 35S-promoter đƣợc phân lập từ virus khảm súp lơ
(Cauliflower mosaic virus) c kích thƣớc khoảng 600 bp.
2.1.2. Hóa chất và thiết bị thí nghiệm
2.1.2.1. Hóa chất
-

Các môi trường nuôi cấy: Môi trƣờng nuôi cấy thực vật MS đặc và MS lỏng.

-

Kháng sinh: Kanamycine, Cefotaxim.

-

Mồi: cặp mồi đặc hiệu Mir_BamHI_F/Mir_SacI_R

-

Hóa chất tách chiết và điện di DNA: Các h a chất của các hãng Sigma,
Merck,... nhƣ CTAB, Tris base, NaCl, EDTA, Chloroform, Isoamyalcohol,
Isopropanol, Sodium thiosunfate, Agarose, Ethidium bromide, -Mercapto

ethanol, SDS.

-

Hóa chất tách chiết protein và Western Blot: PBS-T,Brad ford,
ComassieBlue kit, Tris-HCl, Glycerol, Acrylamid, SDS, APS, TEMED,
dH2O, Protein running buffer, Đệm biến tính.

Khoa Công nghệ Sinh học

18

Nguyễn Thị Hồng Hảo 11-03


Khóa luận tốt nghiệp

Viện Đại học Mở Hà Nội

2.1.2.2.Thiết bị thí nghiệm
Trong quá trình nghiên cứu chúng tôi sử dụng các trang thiết bị do viện Công
nghệ Sinh học cung cấp.
Bảng 2.1: Các thiết bị dùng trong thí nghiệm

Máy

li

tâm


Bể ổn nhiệt (Memmert)

Bình tam giác

Pipetman các loại (Gilson)

Cối chày sứ

Bộ điện di DNA

ống

(Eppendorf, Đức)
Máy đo pH (Hanna,
Thụy Sỹ)
Máy soi gel Hoefer

fancol

và

eppendorf
Máy

PCR

Bộ điện di Protein

Tủ tối


Máy lai màng protein (Thermo

Máy siêu âm

(Eppendorf, Đức)
Cân phân tích (10-4g)

Scientific Pierce)
Cân điện tử (10-2g)

Box cấy

Máy Vortex (Rotolab

Tủ lắc nuôi cấy

OSI)
Tủ lạnh sâu (Sanyo,

Đĩa petri

Nhật)

2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.1. Kiểm tra sự có mặt của gen miraculin trong dòng rễ tơ bằng kỹ thuật
PCR (Polymerase Chain Reaction)
2.2.1.1. Phương pháp tách chiết DNA tổng số
Tách chiết và tinh sạch DNA các mẫu rễ tơ thuốc lá theo phƣơng pháp CTAB
của Doyle và cộng sự c cải tiến (Doyle và cộng sự, 1987).
a. H a chất


Khoa Công nghệ Sinh học

19

Nguyễn Thị Hồng Hảo 11-03