MỞ ĐẦU
Công nghệ sinh học được định nghĩa là “sự sản xuất hàng hóa và dịch vụ ở
quy mô công nghiệp nhờ việc sử dụng sinh vật, các hệ thống sinh học và các quá
trình sinh học”. Hơn một thế kỷ qua, công nghệ sinh học được chú trọng phát triển
tại hầu hết các quốc gia trên thế giới với nhiều thành tựu đáng kinh ngạc. Để thúc
đẩy sự phát triển công nghệ sinh học ở Việt Nam, các phòng thí nghiệm sinh học
ngày càng được trang bị máy móc hiện đại, nguồn nhân lực trình độ chuyên môn
tốt. Do đó, các chế phẩm sinh học phục vụ cho lĩnh vực nghiên cứu này đòi hỏi phải
đảm bảo chất lượng và độ chính xác cao. Một chế phẩm sinh học thường dùng trong
nghiên cứu sinh học là thang chuẩn ADN. Đây là công cụ hữu ích được sử dụng để
đánh giá kích thước và nồng độ các đoạn ADN. Tuy nhiên, thang chuẩn hiện nay
đều phải nhập khẩu với giá thành cao, thiếu tính chủ động trong nguồn cung cấp.
Nhược điểm này đã gây nhiều khó khăn trong quá trình triển khai nghiên cứu tại các
phòng thí nghiệm ở Việt Nam.
Một trong những mặt hàng thang chuẩn có nhu cầu sử dụng cao và thuận tiện
trong các phòng thí nghiệm sinh học phân tử là thang chuẩn ADN 100 bp, thường
gồm dải băng có kích thước từ 100 bp đến 3000 bp. Mặc dù sản phẩm này có nhu
cầu sử dụng lớn, nhưng lại phải nhập khẩu với giá thành cao, phụ thuộc thời gian
đặt hàng và vận chuyển đã phần nhiều ảnh hưởng tới tính chủ động trong các thí
nghiệm. Để khắc phục những khó khăn này chúng tôi thực hiện đề tài “Thiết Kế
Thang Chuẩn ADN”. Mục tiêu của đề tài là: thiết kế được thang chuẩn ADN 100 bp
đảm bảo chất lượng tốt, giá cả hợp lí, đáp ứng nhu cầu sử dụng cũng như phù hợp với điều
kiện các phòng thí nghiệm trong nước. Đề tài được thực hiện tại Phòng thí nghiệm
Sinh Y - Khoa Sinh học, Phòng Genomic thuộc Phòng thí nghiệm trọng điểm Công
nghệ Enzyme - Protein, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội.

1


CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. THANG CHUẨN ADN

1.1.1. Thang chuẩn ADN
o Định nghĩa thang chuẩn ADN
Thang chuẩn ADN được định nghĩa là một hỗn hợp các phân tử ADN có
kích thước khác nhau, được sử dụng trong điện di nhằm đánh giá kích thước và
nồng độ đoạn ADN chưa biết [26].
o Phân loại thang chuẩn ADN
Có nhiều cách gọi tên và phân chia các nhóm thang chuẩn ADN khác nhau như: dựa
trên bước nhảy của thang chuẩn (thang chuẩn ADN 5 bp, 10 bp, hay 50 bp,…); dựa vào kỹ
thuật sản xuất (thang chuẩn PCR, thang chuẩn tái tổ hợp,…) [1]. Tuy nhiên, phân biệt giữa
ADN ladder và ADN marker cho đến nay vẫn là cách phân chia thang chuẩn thông dụng và
thuận tiện nhất, dựa trên bản chất nguyên liệu ADN được sử dụng trong quá trình
sản xuất:
- ADN Ladder: Để tạo ra ADN ladder người ta thường sử dụng các enzyme
giới hạn có vị trí nhận biết đặc hiệu trên một phân tử ADN kích thước lớn, không có
nguồn gốc tự nhiên (ví dụ như các plasmid đã bị biến đổi bằng kỹ thuật di truyền,
đoạn ADN kích thước lớn). ADN ladder gồm các đoạn ADN có kích thước đặc
trưng, với bước nhảy mong muốn (Hình 1) [16].

Hình 1. Ảnh ADN ladder 500 bp (Takara) [45]; ADN ladder 200 bp (Fermentas) [33] và
ADN ladder 10 bp (Invitrogen) [35].

2


- ADN Marker: Cũng như ADN ladder, để sản xuất ADN marker người ta sử
dụng các enzyme cắt giới hạn có vị trí nhận biết đặc hiệu trên một phân tử ADN kích
thước lớn, nhưng phân tử ADN này có sẵn trong tự nhiên như: ADN genome của thực
khuẩn thể lambda, plasmid pBR322, hay ΦX174... (Hình 2) [16]. Thang chuẩn loại này
gồm các đoạn ADN có kích thước khác nhau với bước nhảy ngẫu nhiên.


Hình 2. ADN marker thương mại được tạo ra từ ΦX174; pBR322 và pUC19 [33].

1.1.2. Vai trò của thang chuẩn ADN trong nghiên cứu sinh học phân tử
Trong lĩnh vực nghiên cứu sinh học phân tử việc tiến hành xác định nồng độ
và kích thước các đoạn ADN luôn rất cần thiết trong các thí nghiệm như: sử dụng
kít tinh sạch, tách chiết ADN hay nhân dòng gen… Thông thường để xác định
chính xác kích thước và nồng độ ADN cần phải sử dụng đến phương pháp giải trình
tự và xác định nồng độ ADN bằng máy đo quang phổ. Cả hai phương pháp này đều
cần nhiều thời gian, thao tác thí nghiệm tương đối phức tạp, đặc biệt giá thành để
giải trình tự một mẫu ADN khá cao, lại không phải lúc nào cũng cần thiết. Cách
đơn giản, nhanh chóng để xác định nồng độ và kích thước đoạn ADN nghiên cứu là
so sánh với một đoạn ADN đã biết nồng độ và kích thước [24]. Để thực hiện mục
đích này kỹ thuật điện di đã được sử dụng một cách thường xuyên.

3


Với mục đích phân tách các đoạn ADN trên gel agarose hoặc polyacrylamide,
thang chuẩn ADN đã trở thành một công cụ rất hữu ích để đánh giá chất lượng, kích
thước và nồng độ của mẫu ADN. Thang chuẩn thường chạy cùng một lúc trên gel
với các mẫu ADN, sự so sánh giữa các băng ADN mẫu với các băng ADN thang
chuẩn cho phép ước tính kích thước và nồng độ các đoạn ADN chưa biết [16]. Để
thang chuẩn có thể thực hiện vai trò quan trọng này thì mỗi băng trong thang chuẩn
ADN thương mại luôn được mô tả chính xác kích thước và nồng độ ADN tương
ứng với lượng thể tích [40].
1.1.3. Sản xuất thang chuẩn ADN
1.1.3.1. Cung ứng và sản xuất thang chuẩn ADN trên thế giới
Thị trường thang chuẩn ADN trên thế giới hiện có sự góp mặt của nhiều hãng
sản xuất và cung ứng danh tiếng như Fermentas - Đức [33]; Takara - Nhật Bản [46];
Invitrogen - Mỹ [35]… Kích thước những đoạn ADN trong các thí nghiệm là khác

nhau, chính vì thế mà thang chuẩn ADN bán trên thị trường cũng phân thành nhiều
loại, tùy thuộc số lượng băng, kích thước băng ở từng hãng sản xuất [38, 47].
Những khác biệt đó đã góp phần tạo ra một thị trường thang chuẩn đa dạng và
phong phú (Hình 3). Các thang chuẩn hiện có mặt trên thị trường thường gồm các
băng trong khoảng từ 5 bp đến 50.000 bp [43, 44].

4


Hình 3. Một số thang chuẩn ADN thương mại bán trên thị trường [33, 34].

1.1.3.2. Tiềm năng sản xuất thang chuẩn ADN tại Việt Nam
Sự phát triển của các phòng thí nghiệm sinh học phân tử tại Việt Nam góp
phần làm tăng nhu cầu sử dụng thang chuẩn ADN. Tuy nhiên, cho đến nay vẫn
chưa có một cơ sở trong nước nào đăng ký cung ứng sản phẩm này. Thang chuẩn
hiện vẫn phải nhập khẩu từ các hãng sản xuất lớn trên thế giới với giá thành cao,
phụ thuộc thời gian đóng gói và vận chuyển đã ảnh hưởng đến tính chủ động trong
các thí nghiệm và nguồn cung cấp.

5


Trong những năm gần đây, chúng tôi được biết Viện Vi sinh vật và Công nghệ
Sinh học - Đại học Quốc gia Hà Nội đã thực hiện đề tài thiết kế thang chuẩn [2, 6]. Tại
Phòng thí nghiệm Sinh Y, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học
Quốc gia Hà Nội cũng đã sản xuất thành công thang chuẩn ADN 4,6 kb với bước nhảy
500 bp và hiện đang trong quá trình dùng thử [1]. Tuy nhiên, các sản phẩm thang chuẩn
này vẫn chưa được thương mại hóa. Chính vì vậy, mặc dù cho đến nay thang chuẩn ở
Việt Nam có nhu cầu sử dụng rất lớn, nhưng vẫn chưa có sự góp mặt của một nhà sản
xuất trong nước.

1.1.3.3. Phương pháp sản xuất thang chuẩn ADN
Thang chuẩn ADN là một sản phẩm mang tính chất thương mại. Vì vậy, mặc
dù mặt hàng này được bán rất rộng rãi trên thị trường nhưng các kỹ thuật liên quan
đến thiết kế và sản xuất lại không được công bố. Do đó, rất khó để có được một tài
liệu tham khảo về quy trình sản xuất thang chuẩn ADN. Từ những tài liệu hiếm hoi
mà chúng tôi tổng hợp được cho thấy có bốn phương pháp chủ yếu được áp dụng để
thiết kế thang chuẩn ADN với những ưu và nhược điểm riêng [1, 2].
o Phương pháp hóa tổng hợp
Oligonucleotide là một polymer ngắn của acid nucleic, thông thường dài
khoảng 50 base trở xuống. Mặc dù các oligonucleotide có thể được tạo ra bằng cách
cắt liên kết của các phân tử dài, nhưng hiện nay chúng thường được tổng hợp với
trình tự đặc hiệu từ các nucleoside phosphoramidite [30]. Các oligonucleotide được
sử dụng trong nhiều nghiên cứu khác nhau của di truyền học phân tử, chẳng hạn
như: sử dụng làm mồi trong các phản ứng PCR; dùng làm mẫu dò trong các phương
pháp lai phân tử; trong nghiên cứu tạo đột biến điểm xác định vị trí hay giải mã
trình tự ADN... [5]. Phản ứng kéo dài chuỗi oligonucleotide diễn ra bằng việc gắn
thêm tiền chất nucleotide mới vào phía đầu 5’, như vậy ngược chiều với phản ứng
kéo dài chuỗi ADN sử dụng enzyme ADN polymerase [4].
Phương pháp tổng hợp hóa học sử dụng các thiết bị hiện đại, dễ thực hiện,
nhanh chóng tổng hợp được bất cứ một trình tự ADN ngắn nào với độ tinh sạch và

6


chính xác cao (thông thường đạt độ chính xác cao khi tiến hành tổng hợp các phân
tử ADN mạch đơn có độ dài tới 30 nucleotide [15]). Tuy nhiên, mặt hạn chế của
phương pháp này là khó có thể tổng hợp được trình tự dài hơn 100 nucleotide mà
đảm bảo được số lượng và chất lượng mong muốn. Máy móc và các hóa chất tổng
hợp có giá thành cao, thang chuẩn tạo ra phải qua bước tạo cặp bổ sung để chuyển
ADN sợi đơn thành dạng sợi kép. Do đó, phương pháp này thường áp dụng để tạo

thang chuẩn có kích thước nhỏ, như thang chuẩn 5 bp hay 10 bp với nhu cầu sử
dụng không cao (Hình 4) [1].

Hình 4. Ảnh ADN ladder 5 bp (Fermentas) điện di trên agarose 5% và gel polyacrylamide 10% [33].

o Phương pháp áp dụng kỹ thuật PCR
Một phương pháp nhân dòng gen in vitro đơn giản, hiệu quả, được sử dụng phổ
biến hiện nay ở hầu hết các phòng thí nghiệm sinh học phân tử là phản ứng chuỗi
trùng hợp - PCR (polymerase chain reaction). Kỹ thuật này được Kary Mullis tìm ra
vào năm 1983, nhờ đó việc khuếch đại một đoạn ADN mong muốn đã trở nên dễ dàng,
nhanh chóng và chính xác hơn [8]. Kỹ thuật này còn được sử dụng để phát hiện một
trình tự nucleotide đặc hiệu trong một mẫu sinh học, thu nhận số lượng lớn một đoạn
ADN đích cho quá trình nhân dòng, hoặc các phân đoạn kết thúc dideoxynucleotide

7


trong phương pháp giải trình tự, hay lắp ráp một gen tổng hợp. Một phản ứng PCR đặc
trưng bao gồm nhiều chu kỳ, mỗi chu kỳ gồm ba bước [15]:
- Bước biến tính: ADN khuôn dạng sợi đôi được biến tính bằng nhiệt độ để
tách thành hai sợi đơn [3].
- Bước hồi tính: Nhiệt độ của hỗn hợp phản ứng sẽ được làm nguội dần
xuống, cho phép các mồi liên kết bắt cặp bổ sung với hai sợi đơn ADN khuôn.
- Bước tổng hợp: Nhiệt độ hỗn hợp phản ứng sẽ được tăng lên đến nhiệt độ
tối ưu cho sự hoạt động của enzyme ADN polymerase. Quá trình tổng hợp ADN sẽ
được diễn ra theo chiều từ 3’ đến 5’ (Hình 5) [4, 8].

Hình 5. Kéo dài mồi bởi Taq ADN polymerase. Mồi được gắn vào trình tự bổ sung trên sợi
khuôn và Taq ADN polymerase kéo dài mồi bằng cách gắn chính xác các deoxynucleotide
(dNTP) theo nguyên tắc bắt cặp bổ sung với sợi ADN khuôn, quá trình tổng hợp diễn ra

theo chiều 3’ - 5’.

Các ADN polymerase bền nhiệt sử dụng trong phản ứng PCR được tách
chiết từ một số loại vi khuẩn chịu nhiệt như Sulfolobus solfataricus, Bacillus
steriotherphilus, Pyrococus fumaricus. Tuy nhiên loại enzyme sử dụng phổ biến
nhất hiện nay là Taq ADN polymerase được tách chiết từ một loại vi khuẩn suối
nước nóng Thermus aquaticus [8, 23].
Các mồi được thiết kế phải tuân thủ một số nguyên tắc sau: (1) Có tỷ lệ GC
chiếm từ 40 - 75%, khoảng cách giữa hai mồi thường không dài quá 3 kb, các mồi

8


không được tạo cấu trúc bậc hai do liên kết giữa các nucleotide ngay trong một mồi [3].
Nhiệt độ gắn mồi (Tm) cũng đóng vai trò quan trọng trong phản ứng PCR.
Dựa trên trình tự đã biết của một phân tử ADN kích thước lớn, các cặp mồi
khác nhau đã được thiết kế tùy thuộc kích thước băng, số lượng băng và bước nhảy
giữa các băng ADN trong thang chuẩn sản xuất. Thông qua phản ứng PCR hay
Multiplex PCR sử dụng các cặp mồi này sẽ khuếch đại các đoạn ADN kích thước
mong muốn. Các đoạn ADN sẽ được tinh sạch và phối trộn theo tỷ lệ nồng độ nhất
định tạo thang chuẩn ADN. Loại thang chuẩn này có kích thước băng và bước nhảy
mong muốn, phương pháp thực hiện đơn giản, dễ ứng dụng trong điều kiện của
nhiều phòng thí nghiệm. Tuy nhiên, mặt hạn chế của phương pháp này là các hóa
chất đi kèm có giá thành cao, các băng thang chuẩn thường không rõ nét [1, 7].
o Phương pháp sử dụng các enzyme cắt giới hạn
Các endonuclease hay các enzyme cắt giới hạn là những phần của hệ thống
cải biến giới hạn (restriction modification - RM được sử dụng bởi vi khuẩn và có
thể ở một số sinh vật nhân sơ khác để bảo vệ chúng khỏi ADN ngoại lai) [27]. Các
enzyme này nhận biết những trình tự đặc hiệu trong phân tử ADN và cắt đối xứng
liên kết phosphodieste của mỗi sợi tại các vị trí nhận biết. Đồng thời đóng vai trò

quan trọng trong việc bảo vệ các tế bào vi khuẩn chống lại sự xâm nhiễm của virus
(bacteriophage) [13, 15]. Dựa vào cấu tạo và nhu cầu cofactor mà các enzyme cắt
giới hạn có thể được phân chia thành ba loại khác nhau là type I, II và III [32, 39].
Trong đó, những enzyme có vị trí cắt tại trình tự nhận biết đặc hiệu gọi là enzyme
cắt giới hạn type II. Đây là nhóm enzyme cắt giới hạn được sử dụng phổ biến nhất
trong các nghiên cứu về sinh học phân tử [18].
Các enzyme cắt giới hạn type II đóng vai trò quan trọng trong quy trình nhân
dòng gen. Khi một mẫu ADN được xử lý với một trong những enzyme này ở một
điều kiện, thành phần phản ứng không đổi sẽ luôn tạo ra cùng một tổ hợp các đoạn
ADN trong những lần cắt khác nhau. Do đó, enzyme cắt giới hạn type II trở thành
một công cụ hữu hiệu trong sản xuất thang chuẩn ADN [15]. Thang chuẩn loại này
chủ yếu sử dụng các phân tử ADN kích thước lớn có sẵn trong tự nhiên, thao tác

9


đơn giản dễ thực hiện, giá thành rẻ. Tuy nhiên chính việc sử dụng các phân tử ADN
có sẵn trong tự nhiên lại trở thành một nhược điểm lớn của phương pháp này, vì vị
trí nhận biết của enzyme cắt giới hạn là ngẫu nhiên, nên các băng của thang chuẩn
loại này có bước nhảy không xác định [16].
o Kỹ thuật ADN tái tổ hợp
ADN tái tổ hợp là phân tử ADN được tạo thành từ hai hay nhiều trình tự ADN
của các loài sinh vật khác nhau. Trong kỹ thuật di truyền, ADN tái tổ hợp thường được
tạo ra từ việc gắn những đoạn ADN có nguồn gốc khác nhau vào trong vector tách
dòng. Những vector tái tổ hợp sau đó thường được biến nạp vào Escherichia Coli. Một
thí nghiệm tái tổ hợp ADN cơ bản thường tuân thủ theo bốn bước sau [15]:
Bước 1: Đoạn ADN chèn mong muốn sẽ được xử lý bằng enzyme cắt giới
hạn, tạo đầu tận cùng 3’ và 5’ phù hợp.
Bước 2: Vector tách dòng cũng được xử lý bằng enzyme cắt giới hạn tương
ứng với đoạn ADN chèn.

Bước 3: Thực hiện phản ứng nối đoạn ADN đích vào vector tách dòng tạo
vector tái tổ hợp. Vector tái tổ hợp sau đó được biến nạp vào tế bào chủ và nuôi cấy
trong điều kiện thích hợp để nhân lên số lượng lớn.
Bước 4: Chọn lọc các tế bào vi khuẩn nhận vector tái tổ hợp.
Vector tái tổ hợp sẽ được cắt bằng enzyme cắt giới hạn để tạo ra thang
chuẩn. Thang chuẩn loại này có giá thành rẻ, đơn giản, dễ thực hiện, thời gian bảo
quản lâu, lại có thể chủ động được kích thước của các băng trong thang chuẩn. Đây
là phương pháp được áp dụng nhiều nhất trong sản xuất thang chuẩn tại các trung
tâm sản xuất chế phẩm sinh học lớn hiện nay [6].
Cũng chính từ những ưu điểm của phương pháp ADN tái tổ hợp có thể khắc
phục những nhược điểm của phương pháp PCR, chúng tôi đã kết hợp hai phương
pháp này một cách linh hoạt trong nghiên cứu của mình với mục tiêu thiết kế thang
chuẩn ADN 100 bp.

10


1.1.3.4. Những thuận lợi và khó khăn trong sản xuất thang chuẩn ADN
bước nhảy nhỏ
o Thuận lợi
Thang chuẩn 5 bp đến không quá 200 bp là những thang chuẩn ADN bước
nhảy nhỏ, với dải băng ADN phổ biến trong khoảng từ 5 bp đến 4000 bp dễ dàng sử
dụng trong nhiều mục đích thí nghiệm khác nhau như: nghiên cứu các đoạn ADN
kích thước bé (ADN satellite,...); kiểm tra sản phẩm phản ứng PCR; kiểm tra sản
phẩm phản ứng cắt ADN bằng enzyme giới hạn; kiểm tra kích thước đoạn chèn
trong nhân dòng;... [33]. Để có được một con số thống kê cụ thể về mức độ tiêu thụ
các sản phẩm này của những công ty sản xuất là rất khó khăn, có thể do đây là
thông tin nội bộ nên đã không được công bố rộng rãi. Tuy nhiên, nhìn vào thị
trường giá cả phong phú của nhóm thang chuẩn này có thể thấy đây là bộ sản phẩm
được nhiều công ty đầu tư sản xuất, cung ứng với tiềm năng kinh tế cao [43, 44].

o Khó khăn
Sản xuất thang chuẩn bước nhảy nhỏ hầu hết áp dụng phương pháp hóa tổng
hợp cho các đoạn ADN có kích thước không quá 100 bp [4] và phương pháp PCR
cho các đoạn ADN kích thước lớn hơn [7, 24]. Các đoạn ADN kích thước mong
muốn sau khi được tổng hợp, phải trải qua bước tinh sạch, xác định nồng độ và phối
trộn theo tỷ lệ xác định để tạo thang chuẩn hoàn chỉnh. Như vậy, việc sản xuất bộ
thang chuẩn này không chỉ gặp nhiều khó khăn trong thao tác thí nghiệm, qua nhiều
công đoạn, mà còn đòi hỏi hóa chất, trang thiết bị hiện đại có giá thành cao. Giá bán
các loại thang chuẩn này vì thế cũng cao hơn (Bảng 1).
Bảng 1. Giá thành thang chuẩn ADN bước nhảy nhỏ năm 2011 của một số hãng sản xuất,
chưa bao gồm thuế nhập khẩu tham khảo trên website: www.uoftmedstore.com.

Hãng sản xuất
Fermentas - Đức
Invitrogen - Mỹ
Takara - Nhật Bản

ADN ladder
5 bp
10 bp
20 bp
10 bp
25 bp
20 bp

Số đường chạy
100
100
100


11

Giá thành
152,96 $
135,85 $
128,25 $
173,80 $
163,90 $
21,00 ¥


Nghiên cứu thiết kế thang chuẩn bước nhảy nhỏ gặp khá nhiều khó khăn trong
lựa chọn phương pháp sản xuất, các bước thí nghiệm, chi phí sản phẩm. Đây là một bài
toán khó cho các nhà sản xuất khi muốn thương mại hóa bộ sản phẩm này.
1.2. THANG CHUẨN 100 bp
1.2.1. Thị trường ADN ladder 100 bp
ADN ladder 100 bp thường gồm dải băng có kích thước từ 100 bp đến 3000 bp,
được sản xuất và cung ứng bởi nhiều hãng sản xuất danh tiếng trên thế giới như:
Fermentas - Đức; Takara - Nhật Bản; Invitrogen - Mỹ; New England Biolab - Anh;
Roche - Thụy Sỹ; Promega - Mỹ. ADN ladder 100 bp của từng hãng sản xuất lại có
số lượng băng và giá thành sản phẩm khác nhau (Hình 6 A, Bảng 2). Một số hãng
thương mại còn kết hợp sử dụng ADN ladder 100 bp với loại thang chuẩn ADN
khác (ADN ladder 500 bp; High Range ADN ladder,…), nhằm tăng dải kích thước
băng ADN cũng như tăng tính ứng dụng của loại sản phẩm này (Hình 6 B) [33, 36].
Chính những điều đó đã góp phần tạo ra một thị trường thang chuẩn 100 bp đa dạng
và phong phú, đáp ứng mọi nhu cầu của người sử dụng [41, 42].
Bảng 2. Giá thành ADN ladder 100 bp năm 2010 của một số hãng thương mại chưa bao
gồm thuế nhập khẩu, tham khảo trên webside: www.lablife.org.

Hãng sản xuất

Fermentas - Đức
Invitrogen - Mỹ
New England Biolabs - Anh
Promega - Thụy Sỹ
Roche - Mỹ

Số đường
chạy điện di
100
100
100
100
100

12

Giá bán sản phẩm
chưa bao gồm thuế
62 $
198 $
53 $
148 €
218 $


Hình 6. (A): ADN ladder 100 bp của một số hãng sản xuất thương mại [41]; (B): Ảnh
ADN ladder 100 bp kết hợp với ADN ladder 500 bp (Fermentas) [33].

1.2.2. Sản xuất ADN ladder 100 bp
ADN ladder 100 bp thương mại hiện bán trên thị trường thường gồm dải băng

kích thước rộng, bước nhảy giữa hai băng kế tiếp là 100 bp giúp thang chuẩn ADN loại
này được sử dụng rộng rãi trong nhiều nghiên cứu khác nhau. ADN ladder 100 bp
được đầu tư, sản xuất và cung ứng bởi nhiều hãng sản xuất trên thế giới [37, 47]. Từ
những tài liệu mà chúng tôi có được cho thấy hầu hết thang chuẩn loại này được sản
xuất nhờ áp dụng kỹ thuật PCR [7], Multiplex PCR [24], kỹ thuật ADN tái tổ hợp [17].
Giá thành ADN ladder 100 bp thương mại tương đối cao [7, 24].
Tại phòng thí nghiệm của chúng tôi thang chuẩn ADN 100 bp có nhu cầu sử
dụng hàng ngày. Chúng tôi đặt mua thang chuẩn từ nước ngoài nên không chủ động
được nguồn cung cấp, phụ thuộc thời gian vận chuyển, giá thành cao do phải chịu
thêm thuế nhập khẩu và chi phí vận chuyển. Xuất phát từ nhu cầu sử dụng và những
khó khăn khi đặt hàng chúng tôi tiến hành đề tài “Thiết kế thang chuẩn ADN”
bước nhảy 100 bp.

13


CHƯƠNG 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. NGUYÊN LIỆU
2.1.1. Hệ Vector
1. Vector pJET1.2 là vector tách dòng sản phẩm PCR, nằm trong bộ kit
“CloneJETTM PCR Cloning Kit” của hãng Fermentas - Đức [12] (Phụ lục 01).
2. Vector pGEX-4T-1-Bre là vector pGEX-4T-1 (Phụ lục 02) mang đoạn
ADN kích thước 114 bp, được cung cấp bởi Phòng thí nghiệm Sinh Y, Khoa Sinh
học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội.
3. Vector pJET1.2-8×100 là vector pJET1.2 mang các đoạn ADN kích thước
100 bp tự nối.
2.1.2. Các cặp mồi cho phản ứng PCR
Cặp mồi Bre-F1/Bre-R1 được thiết kế để nhân bản đoạn ADN kích thước
108 bp từ đoạn ADN 114 bp trong vector pGEX-4T-1-Bre.
Cặp mồi pJET1.2-F/pJET1.2-R thiết kế dựa trên trình tự của vector pJET1.2,

cung cấp theo “CloneJETTM PCR Cloning Kit” [12].
Cặp mồi pJET-800-F/pJET-800-R được thiết kế để khuếch đại đoạn ADN
kích thước 1000 bp từ vector pJET1.2-8×100.
Các mồi được cung cấp bởi hãng Bioneer - Hàn Quốc và IDT - Mỹ. Trình tự
các cặp mồi được thể hiện trong Bảng 3.
Bảng 3. Trình tự các cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu.

Cặp mồi
Bre-F1
Bre-R1
pJET1.2-F
pJET1.2-R
pJET-800-F
pJET-800-R

Trình tự (5’-3’)
ccg gaa ttc atg atc gag ggt agg aag ctt aaa aat ttt g
ccg gaa ttc aca ctg gcc act gag ttt gc
Trong đó: gaa ttc là vị trí cắt của enzyme giới hạn EcoRI
cga ctc act ata ggg aga gcg gc
aag aac atc gat ttt cca tgg cag
aac act tgt gcc tga aca cca tat c
gaa aat ctt gag aga ata aaa gaa gaa cat cg

14


2.1.3. Chủng vi sinh vật
o Chủng E.coli DH5α
Chủng E.coli DH5α được tạo ra từ chủng E.coli DH5 bởi Doug Hanahan vào

năm 1985. Chủng vi khuẩn này được sử dụng phổ biến trong kỹ thuật ADN tái tổ
hợp do nó mang một vài đặc điểm đặc trưng sau [25]:
- Đột biến bất hoạt gen mã cho endonuclease nội bào, giúp bảo vệ plasmid.
- Đột biến loại bỏ gen mã cho enzyme EcoKI sẽ bảo vệ các vị trí cắt của enzyme
này trên phân tử ADN khi chúng không được methyl hóa.
- Mang gen Δ(lacZ)M15 mã cho thụ thể nhận alpha (alpha acceptor) cần thiết
cho quá trình sàng lọc xanh - trắng trên nhiều hệ vector.
Chủng E.coli DH5α được chúng tôi sử dụng trong biến nạp vector pJET1.2-8×100.
o Chủng E.coli BL21(DE3)
Chủng E.coli BL21 (DE3) được cải biến từ chủng E.coli tự nhiên và sử dụng
làm vật chủ biểu hiện thông dụng với hầu hết các promoter (như lac, tac,…). Chủng
vi khuẩn này mang hai đặc điểm cơ bản [31]:
- Đột biến gen mã cho protease ngoài màng tế bào, giúp bảo vệ các protein
được biểu hiện khỏi sự phân giải protein.
- Loại bỏ gen mã cho protease lon một enzyme làm giảm sút protein vi khuẩn
và ức chế sự phân chia tế bào cho tới khi quá trình sửa chữa nhiễm sắc thể được
hoàn thành.
Nghiên cứu của chúng tôi sử dụng nguyên liệu ban đầu là chủng E.coli BL21 (DE3)
mang vector pGEX-4T-1-Bre.
2.1.4. Hóa chất và trang thiết bị
o Hóa chất
- Taq ADN polymerase (Fermentas - Đức);
- dNTP mix 2 mM (Sigma - Mỹ, Takara - Nhật Bản);
- Các enzyme cắt giới hạn (Fermentas - Đức, New England Biolabs - Anh);

15


- Môi trường nuôi cấy vi khuẩn Lubertini broth (LB) gồm các thành phần:
1% trypton; 0,5% cao nấm men ; 0,5% NaCl; 1,2% agar (môi trường đặc) [23];

- Các kit tách dòng gen của Fermentas - Đức [12, 14], tinh sạch sản phẩm
PCR và tinh sạch ADN của Bioneer - Hàn Quốc [9, 10], tinh sạch plasmid và ADN
của Qiagen - Đức [19, 20];
- Thang chuẩn 100 bp và 1 kb của Takara - Nhật Bản, Fermentas - Đức,
New England Biolabs - Anh;
- Các hóa chất khác đều đạt độ tinh sạch cao dùng trong nghiên cứu sinh học phân
tử.
o Trang thiết bị
Các thiết bị và máy móc phục vụ cho nghiên cứu thuộc Phòng thí nghiệm
Sinh Y - Khoa Sinh học; Phòng Genomic thuộc Phòng thí nghiệm trọng điểm
Công nghệ Enzyme - Protein, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc
gia Hà Nội.

16


2.2. SƠ ĐỒ THÍ NGHIỆM
Toàn bộ quá trình nghiên cứu được tóm tắt trong Hình 7.

Hình 7. Sơ đồ nghiên cứu thiết kế thang chuẩn ADN SY - 100.

2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3.1. Phương pháp tách chiết plasmid từ vi khuẩn
Plasmid tách chiết từ tế bào vi khuẩn theo hai phương pháp:
o Tách chiết plasmid sử dụng môi trường kiềm có SDS [21]
+ 1,5 ml dịch vi khuẩn bão hòa được đem ly tâm 8000 vòng/phút ở 4 0C trong
10 phút, thu cặn, để khô
+ Thêm 100 µl dung dịch I (50 mM Tris-HCl, pH 8, glucose 50 mM, 10 mM
EDTA pH 8), vortex tan cặn, ủ nhiệt độ phòng 10 phút
+ Thêm 200 µl dung dịch II (0,2 N NaOH, 1% SDS), đảo đều, ủ đá 3 phút

+ Thêm 150 µl dung dịch III (3 M potassium acetate, pH 5), đảo đều, ủ đá 5 phút

17


+ Ly tâm 13000 vòng/phút ở 40C trong 20 phút, thu dịch trong
+ Bổ sung 1 thể tích Phenol : Chloroform : Isoamyl (25 : 24 : 1), vortex đều
+ Ly tâm 13000 vòng/phút ở nhiệt độ phòng trong 5 phút, thu dịch pha trên
+ Bổ sung thêm 0,6 lần thể tích Isopropanol, ủ nhiệt độ phòng 20 phút
+ Ly tâm 13000 vòng/phút ở 40C trong 20 phút, thu tủa
+ Để khô tủa hoàn toàn, hòa với nước khử trùng hoặc TE 1X, pH 8
Mẫu plasmid được bảo quản ở -200C.
o Tinh sạch plasmid sử dụng Kit của Qiagen [19]
Plasmid sử dụng làm khuôn cho phản ứng PCR được tinh sạch bằng
QIAprep Spin Miniprep Kit với quy trình được hướng dẫn cụ thể trong “QIAprep®
Miniprep Handbook” [19].
2.3.2. Kỹ thuật nối các đoạn ADN
Một phản ứng nối các đoạn ADN thường diễn ra trong tổng thể tích từ 10 - 20 µl ở
40C đến 370C, sử dụng enzyme T4 ADN ligase, dung dịch đệm chứa Mg 2+ và ATP [11, 14].
T4 ADN ligase tham gia xúc tác hình thành liên kết phosphodiester giữa các đầu tận cùng
(có thể là đầu bằng hoặc đầu so le) của các đoạn ADN [11].
Trong nghiên cứu của chúng tôi, đoạn ADN kích thước 108 bp khuếch đại từ phản
ứng PCR sử dụng cặp mồi Bre-F1/R1 sẽ được cắt hoàn toàn với EcoRI (GˇAA TTC) tạo
đầu so le. Sản phẩm phản ứng cắt là các đoạn 100 bp sẽ tham gia phản ứng tự nối diễn ra ở
140C qua đêm. Các bước làm được chúng tôi tuân thủ theo quy trình phản ứng nối tham
khảo trong “CloneJETTM PCR Cloning Kit” [12], “Gene JETTM PCR Cloning Kit
procedure” [14] và “FastDigest® & Conventional Restriction Enzymes” [13].
2.3.3. Biến nạp theo phương pháp sốc nhiệt
Vector pJET1.2 mang đoạn chèn được biến nạp vào tế bào E.coli DH5α theo
phương pháp sốc nhiệt. Tế bào khả biến DH5α đã được xử lý với CaCl 2 giúp màng

tế bào trở nên xốp hơn làm tăng khả năng tiếp nhận ADN. Biến nạp theo phương
pháp sốc nhiệt gồm các bước sau:

18


o Tạo tế bào khả biến [21]
Tất cả các bước ly tâm trong quy trình làm tế bào khả biến được thực hiện ở
6000 vòng/phút, 40C trong 20 phút.
-

Nuôi 50 ml dung dịch tế bào E.coli DH5α trong môi trường LB lỏng tại

370C, lắc 200 vòng/phút, tới khi dung dịch tế bào có giá trị mật độ quang (Optical
Density - OD) ở bước sóng 600 nm nằm trong khoảng từ 0,4 - 0,6
-

Ủ mẫu trên đá khoảng 30 phút

-

Ly tâm thu cặn tế bào

-

Hòa cặn trong 15 ml dịch chứa MgCl2 80 mM và CaCl2 20 mM cho đến khi

tạo dịch đồng nhất. Ly tâm thu cặn tế bào
-


Hòa tan cặn trong CaCl2 100 mM tạo dịch đồng nhất, sao cho mật độ tế bào

có giá trị OD 600 bằng 1
-

Ủ mẫu ở 40C qua đêm

-

Bổ sung glycerol 100% đến nồng độ 15%

-

Chia hỗn hợp tế bào khả biến vào các ống eppendorf 1,5 ml, bảo quản ở -800C.
o Biến nạp [15, 21]:

-

Lấy tế bào khả biến từ -800C để cùng hỗn hợp nối ADN trên đá 5 phút

-

Bổ sung 5 µl sản phẩm nối vào ống tế bào khả biến, búng nhẹ, ủ trên đá 20 phút

-

Sốc nhiệt tại 420C trong 90 giây, để ngay lại trên đá 2 phút

-


Bổ sung 1 ml LB lỏng, ủ 370C trong 20 phút, sau đó lắc 200 vòng/phút ở

370C trong 30 phút
-

Ly tâm hỗn hợp 6000 vòng/phút ở nhiệt độ phòng trong 5 phút, giữ lại 100 µl

dịch và cặn
-

Hòa cặn tạo dịch đồng nhất trong 100 µl còn lại, đem trải trên đĩa thạch LB

có kháng sinh
-

Nuôi cấy vi khuẩn ở điều kiện vô trùng, 370C qua đêm.

19


2.3.4. Phản ứng PCR
Trong nghiên cứu của chúng tôi, có ba cặp mồi được sử dụng cho các mục
đích thí nghiệm khác nhau:
-

Phản ứng PCR sử dụng cặp mồi Bre-F1/R1 khuếch đại đoạn 108 bp dựa trên

trình tự đoạn 114 bp trong vector pGEX-4T-1-Bre.
-


Phản ứng PCR sử dụng cặp mồi pJET1.2-F/R và khuôn là vector tái tổ hợp

pJET1.2-8×100.
-

Phản ứng PCR sử dụng cặp mồi pJET-800-F/R với khuôn là vector

pJET1.2-8×100 khuếch đại đoạn 1000 bp được cắt không hoàn toàn bằng HpaII
tạo thang chuẩn 100 bp.
Thành phần và điều kiện thực hiện các phản ứng PCR thay đổi theo từng cặp
mồi (Bảng 4).
Bảng 4. Thành phần và điều kiện cho phản ứng PCR.

Thành phần phản ứng
H2O
Đệm Taq ADN polymerase 10X
dNTP mix (2 mM mỗi loại)
Taq ADN polymerase (1 u/µl )
Mồi xuôi: Bre-F1
pJET1.2-F
pJET-800-F
Mồi ngược: Bre-R1
pJET1.2-R
pJET-800-R
ADN

Điều kiện
- Biến tính 940C, 5 phút ở giai đoạn đầu
- Chu kỳ lặp lại
oBiến tính: 940C, 30 giây

oGắn mồi:
680C, 75 giây (với cặp mồi Bre-F1/R1);
600C, 30 giây (với cặp mồi pJET1.2-F/R);
660C, 30 giây (với cặp mồi pJET-800-F/R)
oTổng hợp: 720C, 45 - 60 giây
- Tổng hợp 720C, 5 - 7 phút ở giai đoạn sau
cùng

2.3.5. Xác định nồng độ ADN bằng máy đo quang phổ
Nồng độ và độ tinh sạch của ADN trong các thí nghiệm được xác định bằng
quang phổ kế, với độ hấp thụ ở bước sóng 260 nm (là độ hấp thụ của ADN) và 280 nm
(là độ hấp thụ của protein). Nồng độ ADN được tính theo công thức:
[ADN ] = A260 × n × 50 (µg/ml)

20


Trong đó:
A260
: độ hấp thụ của ADN ở bước sóng 260 nm
n
: số lần pha loãng mẫu
50 µg/ml : nồng độ ADN sợi đôi ứng với A260 = 1
ADN đạt độ tinh sạch khi tỷ lệ A260/A280 nằm trong khoảng 1,8 đến 2,0.
2.3.6. Phản ứng cắt ADN sử dụng enzyme cắt giới hạn
Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng hai enzyme cắt giới hạn là EcoRI
(GˇAA TTC) và HpaII (CˇCGG) (Fermentas).
- Sản phẩm PCR sử dụng cặp mồi Bre-F1/R1 có kích thước 108 bp sẽ được
cắt hoàn toàn bằng enzyme EcoRI (GˇAA TTC) tạo đầu dính.
- Vector pJET1.2-8×100 mang đoạn ADN kích thước mong muốn sẽ được

cắt không hoàn toàn bằng enzyme EcoRI (GˇAA TTC) kiểm tra vị trí cắt.
- Sản phẩm PCR kích thước 1000 bp được cắt không hoàn toàn bằng enzyme
HpaII (CˇCGG) tạo thang chuẩn ADN SY - 100.
2.3.7. Tinh sạch sản phẩm phản ứng PCR
Tùy mục đích trong từng thí nghiệm mà sản phẩm PCR của chúng tôi được
tinh sạch theo hai cách khác nhau.
- Sản phẩm PCR sử dụng khuôn là sản phẩm tự nối các đoạn 100 bp sẽ được
điện di lượng lớn trên gel agarose. Sử dụng bộ kit của Bioneer với các bước tiến
hành được hướng dẫn cụ thể trong “AccuPrep® Gel Purification Kit” [9] để tinh
sạch ADN.
- Sản phẩm phản ứng PCR kích thước 1000 bp và các đoạn ADN của thang
chuẩn tạo ra trong phản ứng cắt không hoàn toàn sẽ được loại muối, dimer nhờ bộ
kít tinh sạch sản phẩm PCR của Qiagen. Các bước tiến hành và những lưu ý quan
trọng được hướng dẫn chi tiết trong “QIAquick® PCR Purification Kit (50)” [20].

2.3.8. Kỹ thuật điện di

21


Điện di (electrophoresis) áp dụng trong sinh học phân tử là kỹ thuật để phân
tách các phân tử ADN, ARN hay protein dựa trên các đặc điểm vật lý của chúng
như kích thước, hình dạng hay điểm đẳng điện (isoelectric point) [29]. Kỹ thuật
điện di sử dụng:
- Một dung dịch đệm (buffer) để dẫn điện và tạo điện trường đều.
- Một bản gel đóng vai trò là thể nền để phân tách các phân tử. Có hai loại gel
được sử dụng phổ biến trong kỹ thuật điện di ADN là gel agarose và polyacrylamide.
Gel cấu tạo bởi các chuỗi cao phân tử (polymer) được liên kết chéo với nhau tạo thành
một hệ thống mạng lưới với kích thước các mắt lưới tùy thuộc vào nồng độ chất cao
phân tử (agarose, polyacrylamide) và phản ứng tạo liên kết chéo [29].

- Các chất nhuộm khác nhau (ethidium bromide, bạc, đồng vị phóng xạ,…)
để phát hiện vị trí các phân tử ADN trên gel sau khi điện di [3, 28].
Do điện tích âm của khung phosphate (phosphate backbone), các đoạn ADN
dịch chuyển từ điện cực âm sang cực dương (qua các lỗ gel trong phương pháp điện
di trên gel). Các đoạn ADN kích thước nhỏ có thể dễ dàng di chuyển qua các lỗ gel
vì vậy dịch chuyển tới cực dương nhanh hơn các đoạn ADN kích thước lớn [16].

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

22


3.1. KHUẾCH ĐẠI VÀ TẠO ĐOẠN ADN CÓ KÍCH THƯỚC 100 bp
3.1.1. Khuếch đại đoạn ADN bằng phản ứng PCR sử dụng cặp mồi
Bre-F1/R1
Phân tích trình tự đoạn ADN kích thước 114 bp trong vector pGEX-4T-1-Bre
(Phòng thí nghiệm Sinh Y, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại
học Quốc gia Hà Nội), chúng tôi nhận thấy đoạn 114 bp mang một vị trí cắt của
enzyme giới hạn EcoRI (GˇAA TTC) tại nucleotide thứ ba tính từ đầu 5’ của đoạn
chèn. Sử dụng phần mềm thiết kế mồi FastPCR và trình tự đoạn ADN kích thước
114 bp trong vector pGEX-4T-1-Bre, chúng tôi thiết kế cặp mồi Bre-F1/R1 mang vị trí
nhận biết của EcoRI ở đầu 5’ (Hình 8). Sản phẩm phản ứng PCR sử dụng plasmid
pGEX-4T-1-Bre làm khuôn với mồi Bre-F1/R1 là đoạn ADN kích thước 108 bp với
hai đầu có vị trí của enzyme EcoRI. Do đó, đoạn 108 bp sau khi được cắt hoàn toàn
bằng EcoRI sẽ thu được một đoạn ADN kích thước 100 bp.

Hình 8. Sơ đồ minh họa thiết kế cặp mồi Bre-F1/R1 dựa trên trình tự đoạn 114 bp trong
vector pGEX-4T-1-Bre.

o Phản ứng PCR khuếch đại đoạn ADN kích thước 108 bp

Phản ứng PCR sử dụng cặp mồi Bre-F1/R1 khuếch đại đoạn 108 bp trong
plasmid pGEX-4T-1-Bre được thực hiện ở một số nhiệt độ gắn mồi khác nhau, qua
đó chúng tôi đã xác định điều kiện và thành phần phản ứng tối ưu như sau:

Thành phần phản ứng

Thể tích

23

Điều kiện


H2O
Đệm Taq ADN polymerase 10X
dNTP mix (2 mM mỗi loại)
Taq ADN polymerase (1 u/µl )
Bre-F1 (10 µM)
Bre-R1 (10 µM)
ADN
Tổng thể tích

(µl)
10,0
1,5
1,0
0,5
0,5
0,5
1,0

15,0

- Biến tính 940C trong 5 phút ở giai
đoạn đầu
- Chu trình được lặp lại 30 lần
o Biến tính 940C trong 30 giây
o Gắn mồi 680C trong 75 giây
- Tổng hợp 720C trong 7 phút ở giai
đoạn sau cùng

Sản phẩm PCR được điện di kiểm tra trên agarose 2%. Kết quả điện di cho
thấy chúng tôi đã khuếch đại thành công đoạn 108 bp (Hình 9).

Hình 9. Điện di sản phẩm PCR đoạn 108 bp trên agarose 2%. 1: ADN Ladder 100 bp; 2: Sản
phẩm PCR kích thước 108 bp.

Băng điện di sản phẩm PCR sáng rõ chứng tỏ:
- Cặp mồi Bre-F1/R1 được thiết kế có tính đặc hiệu cao.
- Đã khuếch đại thành công lượng lớn đoạn ADN kích thước 108 bp.
3.1.2. Tạo đoạn 100 bp bằng phản ứng cắt với EcoRI
Để thu được lượng lớn đoạn ADN kích thước 100 bp, đoạn ADN kích thước
108 bp được cắt hoàn toàn bằng enzyme EcoRI. Phản ứng gồm thành phần như sau:

24


Đệm 10X
ADN
EcoRI 10 u/µl
Thêm nước để có tổng thể tích


2,0 µl
7,0 µl
1,0 µl
20,0 µl

Phản ứng cắt diễn ra ở 370C trong 2 giờ. Kết thúc phản ứng cắt, chúng tôi thu
được lượng lớn các đoạn ADN kích thước 100 bp với hai đầu là vị trí cắt của EcoRI.
3.2. TẠO VECTOR TÁI TỔ HỢP
3.2.1. Phản ứng tự nối các đoạn 100 bp
Lượng lớn đoạn ADN kích thước 100 bp được sử dụng cho phản ứng tự nối
nhằm thu được đoạn ADN kích thước lớn, mang các vị trí cắt của enzyme EcoRI
cách đều 100 bp. Phản ứng tự nối các đoạn 100 bp diễn ra ở 14 0C qua đêm với
thành phần phản ứng gồm:
Đệm 10X
ADN
T4 ADN ligase 5 u/µl
Thêm nước để có tổng thể tích

1,5 µl
3,0 µl
1,0 µl
15,0 µl

3.2.2. Khuếch đại sản phẩm tự nối các đoạn 100 bp
Sản phẩm phản ứng tự nối các đoạn ADN kích thước 100 bp được làm
khuôn cho phản ứng PCR sử dụng cặp mồi Bre-F1/R1. Bước thí nghiệm này giúp
chúng tôi thu được đoạn ADN kích thước phù hợp để chuyển vào vector pJET1.2
(Fermentas) theo bộ kit “CloneJETTM PCR Cloning Kit” [12]. Thành phần phản ứng
PCR sử dụng khuôn là sản phẩm của phản ứng tự nối sử dụng cặp mồi Bre-F1/R1:


Thành phần phản ứng
H2O
Đệm Taq ADN polymerase 10X

Thể tích
Điều kiện
(µl)
10,0
- Biến tính 940C trong 5 phút ở giai
1,5
đoạn đầu

25