CHÀO MỪNG THẦY CÔ VÀ CÁC BẠN THAM
DỰ

CHUYÊN ĐỀ

QUY TRÌNH XÉT NGHIỆM BỆNH PHẨM ĐỜM TÌM VI KHUẨN
M. tuberculosis , P. aeruginosa,
S. aureus, Klebsiella pneumoniae

Trường ĐH Y- Dược Hải Phòng
Lớp: KTHY K5

Nhóm 2:
Phạm Quốc Huy
Phạm Thị Loan
Mai Thị Quỳnh

Hải Phòng, ngày 22 tháng 1 năm 2016


Đặt vấn đề

•
•

Đờm là các chất tiết ra từ hốc mũi tới phế nang và thải ra ngoài miệng. Đờm gồm
các dịch tiết của khí phế quản, phế nang, họng, các xoang hàm trán, các hốc mũi.
Đờm là hậu quả của nhiều nguyên nhân gây bệnh trên đường hô hấp.

Trong vi sinh việc xác định căn nguyên gây bệnh từ bệnh phẩm đờm rất có ý nghĩa
trong chẩn đoán và điều trị trên lâm sàng.

I. Chỉ định lấy bệnh phẩm đờm

•

Trong các trường hợp viêm đường hô hấp dưới
như viêm phổi, viêm phế quản
cấp, đợt cấp của viêm phế quản mạn, người bệnh nghi lao phổi…

•

Nên cho chỉ định lấy mẫu trong các trường hợp bệnh nhân có một trong các triệu
chứng sau: ho có máu hay ho nhiều, đau ngực, khó thở, có dấu hiệu đặc phổi như có
ran ẩm và rít; giảm tiếng rì rào phế nang; gõ đục khi khám phổi; phim phổi có thâm
nhiễm; có nang; có mủ.


II. Căn nguyên

1.

Gặp trong nhiễm trùng cộng đồng

S. pneumoniae
H. influenzae
S. aureus
M. tuberculosis
K. pneumoniae
M. catarrhalis

Nấm: Candida sp
Một số virus : Cúm, Á cúm…


II. Căn nguyên
2. Gặp trong nhiễm trùng bệnh viện
S. aureus
K. pneumoniae
P. aeruginosa
Các Enterobacteriaceae
Các trực khuẩn gram(-) dễ mọc khác


III. Quy trình xét nghiệm
1.Chuẩn bị dụng cụ, hóa chất
1.1 Dụng cụ


III. Quy trình xét nghiệm
1.Chuẩn bị dụng cụ, hóa chất
1.2 Hóa chất, sinh phẩm


III. Quy trình xét nghiệm

2. Lấy bệnh phẩm đờm
2.1 Nguyên tắc
- Vô trùng
- Lấy càng sớm càng tốt
- Lấy trước khi dùng kháng sinh

- Gửi bệnh phẩm càng sớm càng tốt


III. Quy trình xét nghiệm
2.2 Lấy bệnh phẩm
Yêu cầu bệnh nhân súc miệng bằng nước muối sinh lý hoặc đánh răng trước khi lấy bệnh
phẩm (không dùng chất có tính sát trùng)
-Ghi đầy đủ thông tin người bệnh, ngày giờ lấy mẫu.
-Hướng dẫn bệnh nhân cách khạc đờm.

•Với bệnh phẩm tìm AFB:

Lấy đờm tốt nhất vào buổi sáng sớm khi ngủ dậy hoặc người bệnh đến khám: 2 mẫu lấy cùn
ngày ( mẫu 2 cách mẫu 1 ít nhất 2 giờ)


III. Quy trình xét nghiệm
2.2 Lấy bệnh phẩm
Trường hợp bệnh nhân không khạc được đờm ( trẻ em) thì bệnh phẩm cần lấy có thể là: dịch hút từ
dạ dày hoặc hút đờm trên khí quản qua đường mũi.

2.3 Tiêu chuẩn chấp nhận và từ chối mẫu

•

Tiêu chuẩn chấp nhận:

- Lọ bệnh phẩm phải có dán nhãn, đủ thông tin người bệnh, ngày giờ lấy mẫu, người lấy mẫu
và gửi kèm phiếu yêu cầu xét nghiệm.


-

Mẫu đờm có nhày mủ không phải nước bọt, đủ số lượng từ 1 -3 ml.


III. Quy trình xét nghiệm
2.2 Tiêu chuẩn chấp nhận và từ chối

•

Tiêu chuẩn từ chối:

- Không đủ thông tin trên nhãn và phiếu xét nghiệm
- Số lượng và chất lượng đờm không đạt yêu cầu.
- Lọ đựng bệnh phẩm bị rò rỉ, vỡ, không có bệnh phẩm.
- Bệnh phẩm lấy trên 4h


3. Quy trình xét nghiệm

Bệnh phẩm đờm

Quan sát đại thể

PCR (nếu có điều kiện)

Quan sát vi thể

Ngày 1


Nhuộm gram

Nhuộm xanh methylen

Soi kính hiển vi

Soi kính hiển vi
Nuôi cấy tìm VSV

Không nuôi cấy/ lấy lại bệnh phẩm

gây bệnh

Thạch máu

Ngày 2

Thạch Chocolate

Ngày 4

Trả kết quả AFB

Thạch
Mac-Conkey

Nhuộm gram,Cấy định danh

Đọc kết quả định danh
Ngày 3


Nhuộm Ziehl-Neelsen

Làm kháng sinh đồ

Trả kết quả: tên vi khuẩn và kháng sinh đồ

Thạch Sabourau


IV. Tiêu chuẩn chẩn đoán
P. aeruginosa, S.aureus, M. tuberculosis, K. pneumoniae

1. Tụ cầu vàng (S. aureus)
•

Hình thể và tính chất bắt màu:
Cầu khuẩn xếp đám
hình chùm nho, nhỏ đều
bắt màu gram (+).

•

Nuôi cấy

-Trên thạch thường: khuẩn lạc dạng S
sắc tố màu vàng chanh.
-Trên thạch máu: Tạo khuẩn lạc dạng S
có tan máu β.



IV. Tiêu chuẩn chẩn đoán P. aeruginosa, S.aureus, M. tuberculosis, K.
pneumoniae

1. Tụ cầu vàng (S. aureus)
•

Tính chất sinh vật hóa học

Catalase (+)
Coagulase tự do (+)
Chapman : Manit (+)


2. Trực khuẩn mủ xanh (P. aeruginosa)

•

Hình thể, tính chất bắt màu:
Trực khuẩn bắt màu Gram âm, mảnh, thẳng hoặc hơi cong, hai đầu tròn, không
sinh nha bào.

•

Nuôi cấy:

-Trên thạch thường: Sinh sắc tố, có mùi thơm.
-Trên thạch máu: Khuẩn lạc có thể dạng S, M, R
tùy từng chủng và mức độ độc lực của vi khuẩn.



2. Trực khuẩn mủ xanh (P. aeruginosa)

•

Tính chất sinh vật hóa học

P. aeruginosa

G

L

H2S

Hơi

DĐ

Citrat

Ure

Indol

RM

VP

Oxidase


-

-

-

-

+

+

-

-

-

-

+


3. Klebsiella pneumoniae
Thường gây ra các bội nhiễm ở đường hô hấp.
Hình thể: trực khuẩn ngắn, gram âm, bắt màu đậm ở hai cực, vi khuẩn này có
nhiều hình thể, có khi như cầu khuẩn, có khi lại hình dài, có vỏ, không di động,
không sinh nha bào.
Nuôi cấy

-Thạch máu: khuẩn lạc dạng M, nhầy, quánh, dai.
-MC, DC: Lên men lactose, khuẩn lạc dạng M, bò lan , nhầy

•
•


3. Klebsiella pneumoniae

•

Tính chất sinh vật hóa học

G

L

H2S

Hơi

DĐ

Citrat

Ure

Indol

RM


VP

Manit

oxidase

+

+/_

-

+/_

-

+

-/+

-

-

+

+

-



4. Trực khuẩn lao(M. tuberculosis)
Trực khuẩn lao có thể sống 1 tháng trong đờm ẩm, trong sữa chúng sống được nhiều tuần.
Với kháng sinh và hóa trị liệu, chúng ngày càng kháng lại streptomycin, ethambutol,
rifampimicin.
Việt Nam là nước có tỷ lệ lao kháng thuốc ban đầu vẫn ở mức cao.


4. Trực khuẩn lao(M. tuberculosis)
4.1Nhuộm soi trực tiếp

• Nhuộm Ziehl – Neelsel:

Hình thể:
-AFB có hình que mảnh, hơi cong, bắt màu đỏ trên nền vi trường màu xanh.

-Đếm số lượng AFB và ghi kết quả như bảng sau:
Số lượng AFB

Kết quả

Phân loại

0 AFB/300 vi trường

Âm tính

1-9 AFB/100 vi trường


Dương tính

Ghi số lượng AFB cụ thể

10-99 AFB/100 vi trường

Dương tính

+

1-10AFB/1 vi trường

Dương tính

++

Dương tính

+++

Soi ít nhất 50 vi trường
>10AFB/10 vi trường
Soi ít nhất 20 trường


4. Trực khuẩn lao(M. tuberculosis)
4.1Nhuộm soi trực tiếp

• Nhuộm Ziehl – Neelsel:


Tiêu chuẩn vàng để chẩn đoán AFB


4. Trực khuẩn lao(M. tuberculosis)
4.1 Nhuộm soi trực tiếp

•

Nhuộm huỳnh quang:

Hình thể trực khuẩn mảnh, màu vàng phát quang trên nền tối, đứng riêng rẽ hoặc thành từng
đám.

Kỹ thuật này có độ nhạy cao hơn so với nhuộm Ziehl-Neelsen đối với những mẫu bệnh
phẩm ít vi khuẩn vì số lượng vi trường được nhiều hơn.


4.2 Nuôi cấy

•Trên môi trường đặc:
Lowein stein: Tạo khuẩn lạc dạng R, màu vàng hoặc màu kem bờ không đều, khuẩn lạc
khó tan trong nước (xù xì như súp lơ).

• Trên môi trường lỏng Souton: tạo váng, nhăn nheo, khó tan trong nước, lắng cặn.


4.2 Nuôi cấy

 Trực khuẩn lao phát triển rất chậm, thường 1-2 tháng mới tạo được khuẩn lạc trên môi trường,
do đó dùng trong nghiên cứu là chủ yếu, ít dùng trong định danh.


•

Tính chất sinh vật hóa học:

+ Phản ứng catalase dương tính

+ Phản ứng Niacin dương tính
Ống bên phải có catalase dương tính mạnh với cột bọt khí cao trên
45mm


4.3. Kỹ thuật sinh học phân tử
4.3.1. Kỹ thuật PCR(Polymerase Chain Reaction)
Nguyên lý: là kỹ thuật khuyếch đại ADN bằng cách tạo ra hàng triệu bản sao từ 1 chuỗi đích của
acid nucleic.
ADN polymerase là enzym sao chép ADN, nó có thể tái sao chép nhiều lần đoạn ADN nếu được
kích thích đặc hiệu. Xác định sự có mặt của BK thông qua sự khuếch đại
đoạn gen ADN đặc hiệu.