B¸o c¸o thùc hµnh lý sinh
GVHD: Th.s §Æng ThÞ Thanh Hµ

Líp CTYK15C
Tæ : 11

Bài 1
XÁC ĐỊNH NĂNG LƯỢNG HOẠT HÓA CỦA QUÁ TRÌNH CO BÓP TIM
ẾCH TÁCH RỜI
MỤC TIÊU
Sau khi nghiên cứu bài thực hành này, sinh viên có thể:
1. Xác định được đối tượng nghiên cứu của động học;
2. Nắm vững năng lượng hoạt hóa của một phản ứng (một quá trình);
3. Mô tả mối liên quan giữa hằng số tốc độ của phản ứng với nhiệt độ;
4. Nắm vững bản chất của đại lượng Q10 và ý nghĩa của nó;
5. Thành thạo phương pháp cô lập tim ếch và tính năng lượng hoạt hóa của một quá
trình sinh học.

1.1.

LÝ THUYẾT
Động học nghiên cứu tốc độ của phản ứng (hay quá trình) và sự phụ thuộc của nó vào

các yếu tố như nhiệt độ, nồng độ và sự có mặt của chất xúc tác hoặc ức chế.
Để một phản ứng hóa học xảy ra thì các nguyên tử, phân tử của chất tham gia phải thay
đổi, sắp xếp lại cấu trúc của nó và hình thành nên một trật tự cấu trúc mới trong sản phẩm
của phản ứng. Muốn vậy, nguyên tử hoặc phân tử phải
có một năng lượng tối thiểu để vượt qua hàng rào
lực đẩy giữa các lớp vỏ điện tử để liên kết với
nhau, do đó năng lượng hoạt hóa là năng lượng
tối thiểu cần thiết để nguyên tử, phân tử có thể

tham gia vào phản ứng.
Theo Maxwell – Boltzmann, sự phân bố phân
tử theo năng lượng có dạng như trên hình 1. Giả
sử Ehh là năng lượng tối thiểu cần thiết để phân tử
của một chất có thể tham gia vào một loại phản
ứng thì ta thấy chỉ những phân tử nào có năng

Hình 1-1. Sự phân bố phân tử theo
năng lượng
E- năng lượng; Ehh – năng lượng hoạt hóa;
N – số phân tử; Ze – đường thẳng song
song với trục tung

lượng bằng hoặc lớn hơn Ehh (là những phân tử
có năng lượng
nằm bên phải đường thẳng Ze) là có khả năng tham gia vào phản ứng tạo thành sản phẩm.

1


B¸o c¸o thùc hµnh lý sinh
GVHD: Th.s §Æng ThÞ Thanh Hµ

Líp CTYK15C
Tæ : 11

Khi nhiệt độ thay đổi, làm thay đổi động năng do chuyển động nhiệt của các phân tử. Do
đó tổng năng lượng của các phân tử cũng thay đổi. Chẳng hạn khi nhiệt độ tăng lên (T 2 > T1)
thì năng lượng của các phân tử tăng lên, phân tử có năng lượng bằng hoặc lớn hơn Ehh sẽ
nhiều hơn, thể hiện ở đường cong phân bố Maxwell – Boltzmann dịch sang bên phải, do vậy

chúng có khả năng tham gia vào phản ứng nhiều
hơn làm cho tốc độ phản ứng tăng lên.

lnK

Mối liên quan giữa tốc độ và phản ứng và
nhiệt độ được biểu diễn qua phương trình
Arhenius.
trong đó: K – tốc độ của phản ứng;

�

Enh – năng lượng hoạt hóa; P – yếu tố

1

lập thể; R – hằng số khí; Z – hệ số va

Hình 1-2. Sự phụ thuộc của tốc độ phản
ứng vào nhiệt độ

chạm; T – nhiệt độ tuyệt đối.
Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc của lnK
2. Đồ thị

vào đại lượng

�

được thể hiện trên hình


này có ý nghĩa quan trọng, dựa vào nó chúng ta có thể xác định được giá trị năng lượng hoạt
hóa của một quá trình:

Năng lượng hoạt hóa còn có thể được
xác định thông qua một đại lượng khác, đại lượng Q10. Đại lượng Q10 hay còn được gọi là hệ số
Van’t Hoff. Đại lượng này là tỷ số giữa hai hằng số tốc độ của phản ứng ở điều kiện chênh lệch
nhau 10 độ Censius (10oC).

Trong đó: K1 – hằng số tốc độ của
phản ứng ở nhiệt độ ban đầu T1; K2 – hằng số tốc độ của phản ứng ở nhiệt độ T2 = T1 +10;

Đại lượng Q10 có nghĩa quan trọng. Nó cho biết hằng số tốc độ của phản ứng tăng hay giảm bao
nhiêu lần khi nhiệt độ thay đổi 10 oC. Biểu thức toán học thể hiện mối liên quan giữa năng
lượng hoạt hóa của quá trình đại lượng Q10 như sau:

Ehh = 0,46.T1.T2.lgQ10
2


B¸o c¸o thùc hµnh lý sinh
GVHD: Th.s §Æng ThÞ Thanh Hµ

Líp CTYK15C
Tæ : 11

Trong thực nghiệm chúng ta có thể xác định đại lượng Q 10 và do vậy việc tính giá trị năng
lượng hoạt hóa của một quá trình (nhất là quá trình sinh học) trở nên dễ dàng. Mục đích của
bài thực tập này là xác định năng lượng hoạt hóa của quá trình co bóp tim ếch tách rời.


1.2. THỰC HÀNH
1.2.1. Dụng cụ, hóa chất và vật liệu
− 1 kéo to
−
−
−
−
−
−
−
−

1 kéo con
1 chọc tủy
1 khay mổ
10 đinh ghim
4 cốc thủy tinh
4 canuyl
1 cuộn chỉ
2 khăn lau dùng để mổ

−
−
−
−
−
−
−
−
−


4 con ếch / nhóm
1 bàn xốp để ghim ếch
2 công tơ hút
3 bình tam giác có nút cao su dài hai lỗ
1 nồi cách thủy
1 khay (chậu) nước đá
2 nhiệt kế loại 0 – 50oC
1 lít dung dịch Ringer dùng cho động vật biến nhiệt
1 đồng hồ bấm giây

1.2.2. Các bước tiến hành
1.2.2.1. Tách rời tim ếch
− Dùng kim chuyên dụng chọc tủy ếch, đặt ếch lên bàn mổ, dung ghim cố định bốn chi
ếch vào bàn mổ.
− Dùng kéo to mở rộng xoang ngực ếch, cẩn thận cắt bỏ màng bao tim sẽ thấy tim ếch
cùng hai động mạch: một rẽ sang trái, một rẽ sang phải từ động mạch chủ. Nhẹ nhàng lật tim
ếch lên sẽ thấy tĩnh mạch chủ phía dưới.
− Dùng kéo panh nhỏ, luồn sợi chỉ dài chừng 15-20cm xuống dưới hai động mạch và
tĩnh mạch chủ. Cẩn thận trong khi luồn chỉ qua tĩnh mạch vì thành tĩnh mạch rất mỏng nên dễ
bị rách.
− Thắt chặt tĩnh mạch chủ và động mạch phía phải của ếch. Nhẹ nhàng kéo sợi chỉ để nâng
động mạch trái lên, cắt vát một đường, tạo một lỗ nhỏ để luồn canuyl có chứa dung dịch Ringer
(dung dịch sinh lý máu lạnh) vào sâu trong tâm thất. Sự xuất hiện cột máu trong canuyl khi tim
co bóp đẩy lên chứng tỏ canuyl đã đưa vào đến tâm thất.
− Dùng ống hút rút bỏ máu trong canuyl, tiếp tục cho dung dịch Ringer vào canuyl để rửa
tim cho đến khi toàn bộ máu trong tim đã được thay thế hết bằng dung dịch Ringer.
− Thắt chặt chỉ, buộc động mạch trái vào canuyl rồi dung kéo con cắt rời tim ra khỏi lồng
ngực ếch, quả tim sau khi tách rời khỏi cơ thể mà vẫn đập, đẩy cột dung dịch sinh lý trong
canuyl lên xuống nhịp nhàng thì việc tách rời (hay cô lập) tim ếch mới đạt yêu cầu.

− Gắn canuyl có tim ếch và nhiệt kế vào hai lỗ nhỏ của nút bình tạo ẩm sao cho bầu thủy
ngân của nhiệt kế và mỏm tim ở một độ cao như nhau. Bình ẩm là bình tam giác thủy tinh có
chứa dung dịch sinh lý để tạo độ ẩm cho tim cô lập hoạt động tốt hơn. Nếu kỹ thuật tách tốt ta
3


B¸o c¸o thùc hµnh lý sinh
GVHD: Th.s §Æng ThÞ Thanh Hµ

Líp CTYK15C
Tæ : 11

có một quả tim cô lập đập nhịp nhàng tới 8 giờ liên tục.

1.2.2.2.

Xác định đại lượng Q10 và năng lượng hoạt động của quá trình co bóp tim
ếch tách rời

−

Chuẩn bị ba bình ẩm chứa khoảng 50ml dung dịch Ringer ở 3 nhiệt độ khác nhau.
Bình 1. Đặt ở nhiệt độ của phòng thí nghiệm.
Bình 2. Đặt trong máy điều nhiệt có nhiệt độ cao hơn nhiệt độ phòng 10oC.
Bình 3. Đặt vào chậu nước đá để hạ nhiệt độ xuống thấp hơn nhiệt độ phòng 10oC

−

Khi nhiệt độ đã ổn định, đặt tim ếch cô lập vào bình ẩm ở nhiệt độ phòng, đếm số nhịp
đập của tim trong thời gian 1 phút, đó chính là hằng số tốc độ của quá trình co bóp tim ếch

tách rời (KT) đếm ít nhất 5 lần để lấy giá trị trung bình.
Lưu ý: Có thể xác định hằng số tốc độ của quá trình bằng cách xác định thời gian mà tim

đập được 20 nhịp. Suy ra 60 giây đập được bao nhiêu nhịp. Làm như vậy có thể tiết kiệm được
thời gian hơn.
−

Tiến hành tương tự như trên ở nhiệt độ cao hơn và thấp hơn 10oC so với nhiệt độ phòng
để xác định được KT+10 và KT-10. Cần chú ý mỗi lần thay đổi nhiệt độ phải chờ 3 phút cho
tim thích ứng với điều kiện nhiệt độ mới trong bình ẩm.

−

Áp dụng công thức để tính đại lượng Q10 trong điều kiện tăng nhiệt độ :
Từ đó tính năng lượng hoạt hóa
của quá trình co bóp tim ếch
tách rời trong điều kiện này

là:

Ehh = 0,46.T1.T2.lgQ10
(T1, T2 chuyển thành nhiệt độ tuyệt đối)
Còn ở điều kiện giảm nhiệt độ thì:
và năng lượng hoạt hóa là:

Ehh = 0,46.T1.T2.lgQ'10

4



1.2.3. Kết quả thực hành

Sau 3 lần đo ta có được bảng giá trị tần số k như sau:
Nhiệt độ(0C)
Nhiệt độ phòng 320C
Nước dá 220 C
Nước ấm 42 0C

Lần 1(l/P)
43
45
47

Lần 2 (l/p)
46
38
48

Lần 3 (l/p)
42
35
43

Q10 trong điều kiện nhiệt độ phòng với nước đá:
Q10 = 43/39= 1.1025
Áp dụng công thức ta có năng lượng hoạt hóa:
Ehh = 0,46.T1.T2.Lg(Q10) = 0,46.(273+22).(273+32).Lg43/39 = 1755
Q10 trong điều kiện nhiệt độ thường tủ ấm :
Q10 = 46/43 = 1,06976
Áp dụng công thức ta có năng lượng hoạt hóa:

Ehh = 0,46.(273+42).(273+32).Lg46/43 = 1294 kcal.
I. KẾT LUẬN
1) Trong điều kiện nhiệt độ phòng với nước đá:
a. Tần số Q10 = 1.1025
b. Năng lượng hoạt hóa Ehh = 1755 kcal
2) Trong điều kiện nhiệt độ thường tủ ấm :
a. Tần số Q10 = 1,06976
b. Năng lượng hoạt hóa Ehh = 1755 kcal

Trung bình
43
39
46

kcal


Bài 2
TÍNH THẤM MỘT CHIỀU CỦA DA ẾCH
MỤC TIÊU
Sau khi nghiên cứu bài thực hành này, sinh viên có thể:

2.1.

1.

Nắm vững thế nào là tính thấm của tế bào mô;

2.


Nắm vững cơ sở của hiện tượng màng có tính thấm chọn lọc;

3.

Mô tả hai cơ chế vận chuyển vật chất qua màng tế bào;

4.

Giải thích được hiện tượng thấm một chiều của tế bào và mô;

5.

Nắm vững phương pháp dùng chất màu để nghiên cứu tính thấm;

LÝ THUYẾT
Là một hệ thống hở, tế bào sống luôn thực hiện quá trình thay đổi chất với môi

trường bên ngoài. Quá trình này chỉ có thể xảy ra nhờ khả năng màng tế bào và mô
cho thâm nhập hoặc thải hồi các chất khí, nước và các chất hòa tan đi qua. Khả năng
đó được gọi là tính thấm của tế bào và mô (tham khảo thêm về lý thuyết màng tế bào).
Tính thấm không những chỉ phụ thuộc vào cấu trúc đặc trưng của từng loại tế bào
và mô mà còn phụ thuộc rất nhiều vào trạng thái chức năng của chúng. Chính cấu trúc
đặc trưng và trạng thái chức năng của các loại tế bào và mô quy định tính thấm có
chọn lọc đối với các chất khác nhau từ môi trường vào tế bào. Một khi tế bào và mô
không còn khả năng hoạt động thực hiện các chức năng (tế bào bị chết) thì tính thấm
chọn lọc cũng không còn nữa, khi tính thấm của màng tế bào thay đổi, luồng vật chất
đi vào hoặc ra khỏi tế bào cũng thay đổi theo.
Ngày nay ngoài thực bào, uống bào (còn gọi là ẩm bào) có hai cơ chế vận chuyển
vật chất qua màng tế bào đã được làm sáng tỏ, đó là:


2.1.1. Cơ chế vận chuyển thụ động
Là cơ chế vận chuyển vật chất qua màng theo tổng các loại gradient, không tiêu
tốn năng lượng. Quá trình vận chuyển này diễn ra như một quá trình khuếch tán, tuân
theo định luật Fick:

Trong đó - tốc độ khuếch tán vật chất qua
- Tiết diện mà vật khuếch tán qua (cm 2) ;

màng (g/s); - gradient nồng độ (g/cm 3); S
D hệ số khuếch tán (g/cm2.s)


�

Dấu (–) trong công thức nêu lên ý nghĩa vật lý của quá trình là sau thời gian khuếch tán
(t) lượng vật chất đã bị giảm đi so với giá trị ban đầu. Tốc độ khuếch tán càng lớn thì nồng độ
chất ban đầu càng giảm nhanh.

2.1.2. Cơ chế vận chuyển tích cực
Là cơ chế vận chuyển vật chất qua màng ngược tổng gradient có tiêu phí năng lượng của
quá trình trao đổi chất. Cơ chế này gắn liền với hoạt động của các chất mang là các phân tử
lypoprotein trong thành phần cấu trúc màng. Hoạt động của một trong các protein chất mang
vận chuyển tích cực ion K+ và Na+ ngược gradient nồng độ của chúng là Na + - K+ - ATPaza đã
được nghiên cứu khá chi tiết và đươc mô tả như hoạt động của “bơm ion Na+ - K+”. Bằng cơ
chế này, tế bào và mô đã duy trì được gradient nồng độ các chất, nhờ đó mà chúng có khả
năng sinh công dồi dào trong quá trình sống.
Tốc độ cũng như chiều hướng thâm nhập của các chất vào tế bào và mô không chỉ phụ
thuộc vào tính thấm chọn lọc của màng mà còn phụ thuộc vào bản chất của các chất và vào
mức độ thay đổi tính chất hóa lí của các chất đó. Chẳng hạn, nếu có một chất nào đó khi đã
xâm nhập vào nội bào nó tham gia vào phản ứng hóa học thành một chất khác, hoặc nếu nó

chuyển từ trạng thái tự do sang trạng thái liên kết, thì khả năng khuyếch tán trở lại môi trường
ngoài của nó rất khó xảy ra. Ví dụ một axit yếu hoặc kiềm yếu ở ngoài môi trường chúng
không phân li nên dể dàng khuếch tán vào trong tế bào. Khi vào bên trong nội bào, do điều
kiện môi trường đã thay đổi nên chúng bị phân li thành các ion, dễ tham gia vào các liên kết
hóa học nên mất khả năng khuyếch tán ra ngoài, nên axít yếu và kiềm yếu chỉ có khả năng
thấm theo một chiều nhất định.
Da ếch là một đối tượng thuận lợi để quan
sát và nghiên cứu tính thấm một chiều đối với
một số chất (trong đó có xanh methylene, một
thuốc nhuộm có tính kiềm yếu). Da ếch bao gồm
biểu mô ở phía ngoài và mô liên kết ở bên trong.
Biểu mô được cấuu tạo từ 5 đến 8 lớp tế bào.
Ngoài cùng, phủ lên biểu mô là một màng cutin
mỏng có nguồn gốc từ dịch của các tuyến nhầy
và một lớp tế bào sừng. Tiếp theo là các lớp tế

Hình 2-1. Cấu tạo mô da ếch

bào biểu mô có dạng hình tròn, xếp hơi thưa tạo

1. Màng cutin; 2. Lớp tế bào sừng; 3. Các
lớp tế bào sinh trưởng biểu mô; 4. Lớp tế
bào màng nền; 5. Các sắc tố; 6. Lớp mô
liên kết

thành các khe gian bào. Trong cùng là lớp tế bào
có hình lăng trụ, nhân của chúng có hình ô van,


xếp xít nhau và



được gọi là tế bào màng nền. Tất cả các lớp tế bào này được gọi là lớp tế bào sinh trưởng,
chúng có khả năng phân chia mạnh để thay thế các tế bào biểu mô già. Dưới màng nền là lớp
mô liên kết. nơi định vị các sắc tố màu xanh đen. (Hình 2 – 1)
Biểu mô da ếch có khả năng hấp thụ cao, phản ứng acid yếu (có tính acid yếu), còn lớp
mô liên kết có khả năng hấp thụ yếu và phản ứng kiềm yếu. Với cấu trúc mô đặc trưng như
vậy, da ếch thấm một chiều từ mô liên kết ra biểu mô đối với một số thuốc nhuộm có tính
kiềm yếu như xanh methylene. Bởi vì ở lớp mô liên kết có tính kiềm yếu, các chất này không
bị phân li thành các ion. Chúng cũng không bị hấp thụ mạnh nên dể dàng khuyếch tán ra lớp
biểu mô. ở lớp biểu mô do có tính axít nên các chất bị phân li và bi hấp thụ mạnh do đó chúng
không có khả năng khuyếch tán theo chiều ngược lại.
Tính thấm một chiều của tế bào và mô không phải là bất biến mà cũng có thể bị thay đổi
tính chất hóa lý của môi trường.

2.2. THỰC HÀNH
2.2.1. Dụng cụ, hóa chất và vật liệu
− 1 kim chọc tủy
− 1 kéo to sắc

− 1 máy so màu để xác định mật độ
quang học của dung dịch

− 1 cuộn chỉ

− 100 ml cồn 96o

− 1 khay mổ hoặc bàn mổ

− 100ml dung dịch xanh methylen


− 4 ống thủy tinh hình trụ có chiều dài
7-8 cm
− 4 nắp đậy lá nhôm hoặc nhựa, ở giữa

0,1% trong dung dịch sinh lí
− 1000ml dung dịch sinh lí dung cho
động vật biến nhiết

được đục một lỗ có đường kính bằng

− 2 pipet loại 5 -10 ml và giá để pipet

đường kính ống thủy tinh

− 2 khăn lau dùng để mổ

− 6 cốc thủy tinh loại 100ml

− 2 con ếch/nhóm sinh viên.

2.2.2. Các bước tiến hành
2.2.2.1.

Chuẩn bị túi da ếch

Mỗi nhóm bắt hai con ếch, dung kim chọc tủy ếch cho ếch bất động. Cẩn thận lấy da của
bốn bắp chân ếch sao cho không bị thủng để làm các túi da ếch. Dùng hai chiếc, một để
nguyên, chiếc kia lộn ngược lại cho biểu mô vào trong rồi ngâm vào dung dịch sinh lý cho da
ếch giữ nguyên trạng thái sinh lý bình thường. hai chiếc còn lại làm như trên nhưng ngâm

trong cồn 90o với thời gian là 120 phút nhằm giết chết da ếch.


Dùng chỉ buộc một đầu của những túi
da ếch đã chuẩn bị trên vào các ống thủy
tinh hình trụ, còn đầu kia buộc túm lại. cho
dung dịch sinh lý vào túi để kiểm tra xem
túi có bị rò rỉ không. Nếu không, đổ dung
dịch sinh lý đi rồi cho 5ml dung dịch xanh
methylen 0,1% vào và nhúng các túi này
vào các cốc đựng một lượng 100ml dung
dịch sinh lý bằng nhau.
Chú ý sao cho mức xanh methylen
trong túi cao bằng mức dung dịch sinh lí
trong cốc.

Hình 2-2. Mẫu túi da ếch; a. Ống thủy tinh
hình trụ; b. Túi da ếch được ngâm trong dung
dịch

2.2.2.2. Quan sát hiện tượng thấm của xanh methylen qua các túi ếch
Đặt các cốc có túi da ếch trên vao bình ổn nhiệt độ 22 oC trong 40 phút. Sau đó nhận xét
bằng mắt thường xem Xanh methylen khuyếch tán từ trong ra ngoài theo chiều nào: từ mô liên
kết ra biểu mô hay ngược lại từ biểu mô ra mô liên kết? Đồng thời so sánh với những túi đã
ngâm trong cồn xem có nhận xét gì, ghi các nhận xét vào vở và báo cáo kết quả với cán bộ
hướng dẫn thực hành.
2.2.2.3. Định lượng Xanh methylen đã thấm qua da ếch
− Dựng đồ thị chuẩn
Sau khi đặt các túi da ếch vào bình ổn nhiệt, trong khi chờ đợi kết quả, nhanh nhóng chuẩn
bị các dung dịch xanh methylen có các nồng độ: 0,002; 0,004; 0,006; 0,008; 0,01; 0,02% trong

dung dịch sinh lí. Dung máy so màu xác định mật độ quang học (D) của các dung dịch vừa pha.
Dựng đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc mật độ quang học vào nồng độ, ta có đồ thị chuẩn.
− Xác định lương xanh methylen đã thấm qua da
Sau 40 phút (hoặc lâu hơn nếu có thời gian) nhấc bỏ các túi da ếch ra khỏi các cốc, dung
đũa thủy tinh khuấy đều dung dịch trong cốc rồi đêm xác định mật độ quang học trên máy so
màu, Dựa vào đồ thị chuẩn xác định nồng độ xanh methylen đã thấm qua da ra ngoài.

2.2.3. Kết quả thực hành
Cặp chi ngâm trong cồn : thấy xanh metylen thấm ra bên ngoài.
Cặp chi ngâm trong dung dịch sinh lý : chi để nguyên thì thấm xanh metylen ra
ngoài. Còn chi lộn ngược thì không.
- Cặp chi ngâm trong cồn, cả chi lộn ngược và chi nguyên đều thấm xanh metylen ra
ngoài vì khi ngâm trong cồn các tế bào biểu mô và mô liên kết đều bị phá hủy nên xanh
metylen dễ dàng thấm qua hai lớp trên để râ bên ngoài.


-

Ở cặp chi ngâm trong dung dịch sinh lý:
+
Chi nguyên thấm ra ngoài.
+
Chi lộn ngược không thấm vì : lớp mô liên kết của ếch có tính kiềm yếu các
chất này không bị phân ly thành các ion, chúng cũng không bị hấp thu mạnh nên dễ dàng
khuyếch tán qua lớp biểu mô. Ở lớp biểu mô do có tính acid nên các chất bị phân ly và
hấp thụ mạnh do đó chúng không có khả năng khuyếch tán theo chiều ngược lại.
Giải thích: với cấu tạo của da ếch, lớp tế bào biểu mô ở ngoài là lớp có tính
hấp thụ cao và có tính axit yếu. Ngược lại, lớp mô liên kết có tính chất hấp
thụ yếu và kiềm kém. Với dung dịch kiềm yếu metylen nên lớp tế bào biểu
mô và lớp liên kết có tính hấp thụ khác nhau.Vì tế bào biểu mô có tính hấp

thụ cao và axit yếu sẽ hấp thụ mạnh dung dịch kiềm yếu metylen và đưa dung
dịch ra ngoài. Còn lớp mô liên kết có tính hấp thụ yếu và kiềm yếu nên không
hấp thụ tốt dung dịch metylen và lớp mô liên kết sẽ hấp thụ và giữ lại.
Như vậy: tính thấm của da ếch từ trong ra ngoài tế bào cao hơn tính thấm cao
hơn từ ngoài vào trong.


Bài 3
XÁC ĐỊNH ĐỘ BỀN CỦA MÀNG TẾ BÀO HỒNG CẦU
MỤC TIÊU
Sau khi nghiên cứu bài thực hành này, sinh viên có thể:
1. Phân biệt thế nào là môi trường ưu, nhược và đẳng trương.
2. Phản ứng của tế bào động vật và thực vật trong các loại môi trường đó.
3. Thành phần cấu trúc nào của màng tế bào hồng cầu giúp nó có thể thay đổi thể tích
trong một giới hạn nhất định.
4. Thế nào là độ bền của màng tế bào hồng cầu. Ý nghĩa.
5. Thành thạo phương pháp sử dụng dunh dịch nhược trương xác định độ bền của
màng tế bào hồng cầu.

3.1.

LÝ THUYẾT
Chúng ta biết màng tế bào có một

ý nghĩa đặc biệt quan trọng trong đời
sống của tế bào. U.B.Frank - một nhà
lý sinh nổi tiếng đã nói rằng: “Mọi
hoạt động sống đều diễn ra trên “sân
khấu” - màng”. Màng ở đây được hiểu
theo ý nghĩa rộng, gồm các loại màng

có mặt ở bên trong tế bào (màng nội

Hình 3-1. Tế bào hồng cầu người quan sát
qua kính hiển vi điện tử

bào) và màng sinh chất, màng bao
quanh tế bào.
Màng sinh chất giữ nhiệm vụ bảo vệ, trao đổi thông tin và vật chất giữa tế bào và
môi trường bên ngoài. Tế bào hồng cầu là một đối tượng điển hình để chúng ta
nghiên cứu cấu tạo, tính chất và chức năng của màng tế bào.
Trên hình 3-1 là hình ảnh chung về tế bào hồng cầu người quan sát qua kính hiển
vi điện tử. Tế bào có mặt lõm để tăng diện tích tiếp xúc với môi trường ngoài. Hồng
cầu trưởng thành là một loại tế bào không nhân. Cấu tạo màng tế bào hồng cầu, nhìn
chung giống như màng sinh chất của các loại tế bào khác, gồm các protein màng tế
bào – lớp lipid kép – protein khảm vào nhau (tham khảo về mô hình khảm động
màng sinh chất). Có một điểm khác biệt là ở bề mặt bên trong màng tế bào hồng cầu
tồn tại một mạng lưới vật chất có nguồn gốc là protein dạng
sợi và được gọi là spectrin. Spectrin


chiếm một tỉ lệ là 30% tổng số protein
của màng và là phức hợp của hai sợi
polypeptid có trọng lượng phân tử
khoảng 220.000 – 240.000Da (dalton)
(hình 3-2).
Cùng với một vài loại protein
khác, spectrin tham gia vào quá trình
biến đổi hình dạng của hồng cầu

Hình 3-2. Mạng lưới spectrin ở bề mặt bên


thông qua việc co ngắn hay duỗi dài

trong màng tế bào hồng cầu của cừu

dạng sợi của mình. Bằng cách đó tế
bào
hồng cầu có thể biến đổi hình dạng giúp nó đi qua được các mao mạch nhỏ li ti, ở
khắp cơ thể. Đặc biệt là ở lách, những tế bào hồng cầu đã già hoặc bị thoái hóa chức
năng, khả năng đàn hồi co giãn các sợi spectrin kém, không có khả năng đi qua mao
mạch kiểm soát của cơ quan màng và bị lách tiêu hủy.
Ở trạng thái sinh lý bình thường, màng hồng cầu khá bền vững. Thể tích của tế
bào thường không thay đổi và được điều tiết bởi tỉ lệ lượng các chất hòa tan bên
trong và bên ngoài tế bào. Chúng ta biết, lượng các ion của các muối hòa tan bên
trong tế bào là một hằng số ổn định. Do đó thể tích tế bào phụ thuộc vào lượng ion
của môi trường bên ngoài. Chúng ta biết có ba loại môi trường: môi trường ưu
trương, môi trường đẳng trương, môi trường nhược trương.
Màng tế bào hồng cầu bền trong môi trường đẳng trương. Trong môi trường ưu
trương, tế bào nhăn nhúm lại do chịu tác động của áp suất thẩm thấu từ bên ngoài
vào. Còn trong môi trường nhược trương thì tế bào trương phồng lên và màng của
nó bị bung ra do chịu tác động của một lực gây ra bởi áp suất thẩm thấu từ bên trong
làm cho lượng nước trong tế bào ngày càng tăng cao và cuối cùng giải phóng các
chất từ nội bào ra bên ngoài. Độ bền của màng hồng cầu chính là nồng độ dung dịch
muối trong môi trường nhược trương, tại đó không xảy ra hiện tượng tế bào hồng

Hình 3-3. Phản ứng của tế bào hồng cầu trong các môi trường khác nhau


cầu
bị huyết tiêu.

Trong bài thực tập này, chúng ta tìm hiểu phản ứng khác nhau của tế bào động
vật (hồng cầu) và thực vật khi tiếp xúc với ba môi trường nêu trên và xác định độ bền
của màng hồng cầu.

3.2. THỰC HÀNH
3.2.1. Dụng cụ, hóa chất và vật liệu
− 10 ống nghiệm loại 10ml

− 250 ml dung dịch sinh lý máu nóng pH = 7,4

− 1 máy so màu

− 3 pipet loại 5 ml

− 250 ml dung dịch NaCl 2%

− Tế bào hồng cầu động vật máu nóng

− 500 ml nước cất

− 1 pipetman 100 µl , giấy thấm, khăn lau.

3.2.2. Các bước tiến hành
3.2.2.1. Lấy mẫu tế bào hồng cầu
Dùng citrat natri hoặc heparin để lấy máu chống đông. Rửa tế bào hồng cầu bằng
cách quay li tâm (1200 vòng/phút trong 5 phút) máu chống đông trong dung dịch sinh
lý PBS 90/00 (có pH
= 7,4) ba lần.
Lưu ý: Trước khi li tâm dùng ống hút sục nhẹ nhàng cho hồng cầu phân bố đều
trong dung dịch, tránh bị vỡ. Sau lần li tâm thứ ba, phân tán đều hồng cầu trong dung

dịch PBS nói trên sao cho có mật độ là 5.106 tế bào/ml.

3.2.2.2. Xác định độ bền của màng tế bào hồng cầu
Chuẩn bị 10 ống li tâm, đánh số từ 0 đến 10. Pha vào mỗi ống nghiệm 5ml dung
dịch muối NaCl tương ứng với các nồng độ 0; 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5; 0,6; 0,7; 0,8;
0,9%, sau đó thêm vào
mỗi ống nghiệm 500 µl dịch hồng cầu đã chuẩn bị trên. Để các ống nghiệm vào tủ ấm
370C
trong 15 phút rồi li tâm 3000 vòng/phút. Sau khi li tâm, quan sát màu của dịch. Màu
đỏ là màu của huyết sắc tố thoát ra sau khi màng tế bào hồng cầu bị vỡ. Nồng độ thấp
nhất của các ống không có màu đỏ là giới hạn bền của màng tế bào hồng cầu.


3.2.3. Kết quả thực hành
Lấy 10 ống nghiệm đánh số thứ tự từ 0 đến 9, sau đó cho vào các ống nghiệm lần
lượt theo bảng sau:
STT
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
H20
10ml 9ml
8ml

7ml
6ml
5ml
4ml
3ml
2ml
1ml
Nacl
0
1ml
2ml
3ml
4ml
5ml
6ml
7ml
8ml
9ml
Nhỏ vào mỗi ống 2 giọt tế bào hồng cầu, đảo nhẹ. Để yên trong tủ ở 37 0C
khoảng 30 phút.
Sau đó bỏ vào máy ly tâm 5 phút, tốc độ quay 3.000 vòng/phút.
Sau khi ly tâm xong, lấy ra quan sát và đánh giá kết quả.
I.
KẾT QUẢ:
- Từ ống nghiệm 0 - > 5 : tế bào hồng cầu bị vỡ ( từ màu đỏ đậm dần dần chuyển
sang màu đỏ nhạt)
- Từ ống nghiệm 6 - > 9 : tế bào hồng cầu không bị vỡ nên lắng xuống dưới đáy
ống nghiệm.
 Vậy độ bền của màng tế bào hồng cầu là 0,6%.
II.

GIẢI THÍCH:
 Ống số 0 -> 5 : tế bào hồng cầu bị vỡ là do chênh lệch nồng độ ở bên ngoài và
bên trong nên tế bào hút nước từ bên ngoài vào tế bào nhiều và nhanh làm cho độ đàn
hồi của màng tế bào giảm ( vượt quá giới hạn đàn hồi của màng) làm cho màng tế bào
hồng cầu bị vỡ.
 Ống số 6 -> 9 tế bào hồng cầu vỡ ít và không nị vỡ là do : chênh lệch nồng độ
bên ngoài với bên trong ít nên tế bào hút nước và trong chậm làm cho độ đàn hồi của
màng tế bào vẫn trong giới hạn cho phép, kết quả tế bào hồng cầu không bị vỡ và lắng
xuống đáy ống nghiệm.


Bài 4
ĐỊNH LƯỢNG PROTEIN HUYẾT THANH BẰNG KHÚC XẠ KẾ
MỤC TIÊU
Sau khi nghiên cứu bài thực hành này, sinh viên có thể:
1. Nắm vững bản chất hiện tượng khúc xạ ánh sáng;
2. Phân biệt các khái niệm chiết suất tương đối và chiết suất tuyệt đối;
3. Trình bày nguyên lý hoạt động của khúc xạ kế ABBE;
4. Thành thạo phương pháp xác định protein tổng số, anbumin và globulin của huyết
thanh động vật máu nóng.

5.1.
5.1.1. Những khái niệm cơ bản

LÝ THUYẾT

Khúc xạ kế là một thiết bị quang học gồm nhiều thấu kính và lăng kính dùng
để đo chiết suất dựa vào hiện tượng khúc xạ ánh sáng của tia sáng khi truyền từ môi
trường này sang môi trường khác.
Khúc xạ là hiện tượng tia sáng

bị đổi hướng đột ngột ở mặt phân
cách giữa hai môi trường mà nó
truyền qua. Thực nghiệm đã chứng tỏ
rằng:
1. Tia khúc xạ nằm trong mặt
phẳng tới và ở bên kia pháp
tuyến so với tia tới.
2. Tỷ số giữa sin góc tới (sin α ) với sin góc
khúc xạ ( sinβ ) của hai môi
trường cho trước là một hằng số.
Hình 5-1. Đường đi của tia sáng qua hai môi
trường

− Nếu n21 > 1 thì góc khúc xạ nhỏ hơn góc tới ( β < α ). Ta nói môi trường 2
chiết quang hơn môi trường 1.
− Nếu n21 < 1 thì góc khúc xạ lớn hơn góc tới ( β > α ). Ta nói môi trường 2
kém chiết
quang hơn môi trường 1.


− Nếu α = 0 thì β = 0 ; khi đó tia sáng chiếu vuông góc với mặt phân cách

giữa hai môi trường và sẽ truyền thẳng. Nếu tia sáng đi từ môi trường chiết
quang lớn sang môi trường chiết quang nhỏ thì góc tới sẽ nhỏ hơn góc khúc
xạ (hình 5-1). Khi góc tới tăng dần thì sẽ đến lúc góc khúc xạ bằng 900 và
tia khúc xạ sẽ trượt trên bề mặt phân cách giữa hai môi trường. Góc tới ứng
với trường hợp đó được gọi là góc giới hạn toàn phần (kí hiệu λ ). Hiện
tượng tia sáng bị gãy khúc truyền trở lại môi trường cũ khi góc tới lớn hơn
góc giới hạn toàn phần được gọi là phản xạ toàn phần. Khi α = λ ta có biểu
thức n21 = sinλ

Trong thực nghiệm người ta phân biệt chiết suất tương đối và chiết suất
tuyệt đối của môi trường.
Chiết suất tuyệt đối của một môi trường là chiết suất của nó đối với chân
không, được xác định bằng tỉ số vận tốc ánh sáng trong chân không (c) và vận
tốc ánh sáng trong môi trường nghiên cứu (vx):
Trong đó: chiết xuất tuyệt đối
của môi trường x đang xét; c vận tốc ánh sáng trong chân
không; - vận tốc ánh sáng trong môi trường x.
Chiết suất tuyệt đối của một môi trường trong suốt cho biết vận tốc truyền
ánh sáng trong môi trường đó nhỏ hơn vận tốc truyền ánh sáng trong chân không
bao nhiêu lần.
Chiết suất tương đối của môi trường 2 với môi trường 1 bằng tỉ số chiết
suất tuyệt đối của hai môi trường đó:

�2
Đó là biểu thức liên hệ giữa chiết suất tương đối và chiết suất tuyệt đối của hai
môi trường có ánh sáng truyền qua.


5.1.2. Nguyên lý hoạt động của khúc xạ kế ABBE
Nguyên lý hoạt động của khúc xạ kế nhìn chung dựa trên hiện tượng phản xạ toàn
phần của tia sáng khi truyền qua môi trường. Khi xác định được góc giới hạn toàn
phần sẽ dễ dàng xác định được chiết suất.
Trong các dịch sinh vật như huyết thanh, dịch mô… chiết suất chủ yếu phụ thuộc
vào lượng protein chứa trong đó. Vì vậy chiết suất của huyết thanh phản ánh khá chính xác
hàm lượng của protein chứa trong nó. Cho nên phương pháp khúc xạ kế được dùng khá phổ
biến để định lượng protein tổng số và các loại protein thành phần của huyết thanh. Trên
hình 5-2 là cấu tạo của
khúc xạ kế ABBE, còn hình 5-3 cho biết rõ đường đi của tia sáng qua các bộ phận của khúc xạ
kế và dung dịch nghiên cứu.

Hình 5-2. Cấu tạo ngoài của khúc xạ kế
ABBE
Thị kính tiêu điểm;
Bộ phận bổ chính độ nét ranh giới hai pha tối sáng ;
Trống điều chỉnh độ nét ranh giới tối sáng;
Buồng chứa lăng kính và thang đo chiết suất cùng hệ điều nhiệt;
Trống xoay lăng kính đo và thang đo vòng;
Kính đọc kết quả;
Vít điều chỉnh cơ học;
Bộ phận gắn nhiệt kế.

Hình 5-3. Đường đi của tia sáng trong khúc xạ kế


5.1.3. Cách sử dụng khúc xạ kế ABBE
− Đặt khúc xạ kế vào vị trí dễ thao tác.
− Dùng ống cao su lắp các mấu của hệ điều nhiệt để dẫn nước ấm vào làm ổn nhiệt buồng
đo.
− Dùng nước cất hai lần và vít chỉnh cơ học (7) để chỉnh khúc xạ kế về vị trí “0” ban đầu:
nước có hệ số n = 1,3330; hàm lượng chất khô 0%.
Các bước tiến hành như sau:
+ Nhẹ nhàng vặn ốc khóa, mở buồng đo, sẽ tách hai lăng kính: lăng kính đo và lăng kính
chiếu ánh sáng ra.
+ Hạ lăng kính chiếu sáng xuống, để ở vị trí nằm ngang. Dùng pipet nhỏ 2-3 giọt nước
cất lên lăng kính.
+ Nâng lăng kính chiếu sáng lên vị trí cũ, vặn ép chặt hai lăng kính để dàn mỏng giọt
nước trên hai mặt lăng kính.
+ Dùng gương chiếu sáng toàn bộ lăng kính.
+ Xoay trống (5) để chỉnh đường ranh giới giữa hai pha tối – sáng quan sát được ở thị
kính (1). Dùng trống (3) và (2) để điều chỉnh độ nét của đường ranh giới. Xoay trống (5) để

đưa đường ranh giới này về giữa vạch chữ thập trong hiển vi trường.
+ Qua thị kính (6) có hai bảng chia độ, bảng bên trái chỉ hệ số khúc xạ, bảng bên phải
chỉ hàm lượng khô của chất tính theo %. Như vậy đối với nước cất 2 lần, có hàm lượng chất
khô là 0%; ứng với hệ số chiết suất ở bảng bên trái là 1,3330. Đó chính là vị trí “0” ban đầu.
+ Nếu bảng đo ở vị trí “0” ban đầu mà đường ranh giới vẫn lệch khỏi giữa dấu chữ thập
thì phải dùng vít chỉnh cơ học (7) để đưa nó về vị trí cần thiết (lưu ý làm việc này dưới sự
giám sát của cán bộ hướng dẫn).
− Mở buồng đo, lau sạch nước cất ở trên bề mặt lăng kính, nhỏ 2- 3 giọt dung dịch
nghiên cứu lên mặt lăng kính để xác định hệ số chiết suất n của chúng.

5.2. THỰC HÀNH
5.2.1. Dụng cụ, hóa chất và vật liệu
− 1 máy khúc xạ kế Abbe

− 5 pipet loại 2ml

− 1 máy li tâm

− 150 ml (NH4)2SO4 bão hòa

− 1 cân đĩa

− 10 ml huyết thanh nguyên chất của

− 1 bếp điện
− 1 cốc thủy tinh chứa 200 ml chịu nhiệt

động vật máu nóng
−


150 ml dung dịch acid acetic 0,04 N


− 4 ống li tâm

− 150 ml nước cất hai lần

− 2 cốc thủy tinh 50 → 100ml

− Bông, gạc mềm thấm nước để lau
kính

− 2 công tơ hút
−

1 bút dạ viết trên kính

5.2.2. Các bước tiến hành
5.2.2.1. Xác định protein tổng số trong huyết thanh nguyên chất
− Sau khi đã chỉnh khúc xạ kế về vị trí “0”, nhỏ 2- 3 giọt huyết thanh nguyên lên bề mặt
lăng kính. Vặn chặt hai lăng kính bằng ốc khóa.
− Quan sát qua thị kính, dùng trống xoay (3) đưa đường ranh giới sáng – tối về giữa
vạch chữ thập. Nhìn vào thang đo ghi lại chiết suất của huyết thanh nguyên (kí hiệu n6).
− Dựa vào bảng đã cho (phụ lục I) xác định thành phần (%) của protein có trong huyết
thanh.

5.2.2.2. Định lượng albumin và globulin trong huyết thanh
Để định lượng được anbumin và globulin là hai tiểu thành phần chính của protein trong
huyết thanh ta làm như sau:
Bước 1: Chuẩn bị năm ống ly tâm sạch, có trọng lượng bằng nhau, đánh số từ 1 đến 5.

Ống số 1. Cho 1 ml huyết thanh + 1 ml acid acetic 0,04 N lắc đều, đun cách thủy 5 phút,
lấy ra để nguội, sau đó đem ly tâm 3000 vòng/phút trong 10 phút. Dịch trong thu được sau ly
tâm không chứa protein vì acid acetic đã làm chúng kết tủa hết.
Ống số 2. Cho 1 ml huyết thanh + 1 ml (NH4)2SO4 bão hòa, lắc đều sẽ thấy có tủa. Đem
ly tâm 3000 vòng/phút trong 30 phút. Dịch trong thu được sau ly tâm có chứa albumin vì
globulin đã bị (NH4)2SO4 kết tủa hết.
Lưu ý:
+ Nên cùng ly tâm ống 1 và 2 để tiết kiệm thời gian.
+ Trọng lượng hai ống phải bằng nhau và đặt đối xứng nhau.
+ Chỉ lấy dịch trong sau ly tâm để đo chiết suất.
Ống số 3. Cho 1 ml acid acetic 0,04 N + 1 ml nước cất lắc đều sẽ được dung dịch acid
acetic 0,02 N.
Ống số 4. Cho 1 ml (NH4)2SO4 bão hòa + 1 ml nước cất lắc đều, sẽ được dung dịch
(NH4)2SO4 nửa bão hòa.
Ống số 5. Cho 2 ml nước cất tinh khiết.


Bước 2: Dùng khúc xạ kế đo chiết suất của các dịch trong suốt ở năm ống nghiệm trên. Cần
đo nhiều lần để lấy giá trị trung bình.
Chiết suất dịch trong ống số 1 là n1
Chiết suất dịch trong ống số 2 là n2
Chiết suất dịch trong ống số 3 là n3
Chiết suất dịch trong ống số 4 là n4
Chiết suất dịch trong ống số 5 là n5
Bước 3: Định lượng albumin theo công thức sau:

A(%) =

2(n 2 − n 4 ) − 2 ( n1 − n 3 )
0, 00177


(5.4)

0,00177 là chiết suất của dung dịch albumin 1%.
Bước 4: Định lượng globulin theo công thức sau:

G (%) =

n 6 −[n 5 + 2 ( n 2 − n 4 ) ]
0, 00229

(5.5)

0,00229 là chiết suất của dung dịch globulin 1%.
Bước 5. Tính hệ số K: hệ số tương quan albumin/globulin thường có giá trị ổn định ở các cơ
thể có trạng thái sinh lý bình thường, nó dao động trong khoảng 1,2 – 2,0 và được xác định:

K=

A(%)
G(%)

(5.6)


5.2.3. Kết quả thực hành
Kết quả các thí nghiệm lập thành bảng 1 và 2:
STT
1
CH3COOH 0,04%


2

1ml

(NH4)2SO4 BÃO HÒA

3

Nước Cất

6

1ml
1ml

1ml

5

1ml
1ml

Huyết Thanh

4

1ml

2ml


1ml

2ml

Cho các chất vào từng ống nghiệm theo bảng trên
+ Ống 1: Cho các chất trên vào và chưng cách thủy trong vòng 5 phút, sau đó để nguội
đem ly tâm trong vòng 10 phút, tốc độ 3000 vòng/phút.
+ Ống 2:Cho các chất trên vào, lắc nhẹ sẽ xuất hiện kết tủa. Đem li tâm 30 phút, tốc độ
3000 vòng/ phút.
Đo và tính kết quả
I. KẾT QUẢ
Bảng 1:
STT

Giá trị cần đo

CHIẾT

Lần 1

Lần 2

Giá trị trung bình

Lần 3

1

N1


1,36

1,36

1,36

1,36

2

N2

1,40

1,40

1,40

1,40

3

N3

1,363

1,362

1,363


1,362

4

N4

1,40

1,40

1,40

1,40

5

N5

1,365

1,365

1,363

1,363

6

N6


1,372

1,373

1,373

1,374

STT

Bảng 2
Chỉ tiêu nghiên cứu

Giá trị trung bình ± ∆

2

Anbumin

1,47%

3

Globulin

1,2%

4


Hệ số K

1,225


Bài 5
TÍNH CHẤT QUANG HỌC CỦA PHÂN TỬ HEMOGLOBIN
MỤC TIÊU
Sau khi nghiên cứu bài thực hành này, sinh viên có thể:
1. Mô tả cấu trúc của phân tử hemoglobin và chức năng của nó;
2. Nắm vững các dạng cơ bản và các dẫn xuất của oxyhemoglobin;
3. Giải thích được vì sao các dẫn xuất của phân tử hemoglobin khác nhau thì tính
chất quang học của chúng khác nhau;
4. Thành thạo phương pháp đo mật độ quang học để xác định nồng độ của

chất

nghiên cứu

6.1.

LÝ THUYẾT
Phân tử hemoglobin là thành phần cơ bản của tế bào hồng cầu. Trong một tế bào hồng

cầu có khoảng 200 triệu phân tử hemoglobin. Mỗi phân tử hemoglobin chứa chừng 9000
nguyên tử các loại như H, C, N, Fe, S, O… Trọng lượng phân tử hemoglobin rất lớn (chừng
66.000 – 68.800 Da).
Phân tử hemoglobin được cấu tạo từ hai thành phần chính, đó là protein globin và nhóm
chức HEM. HEM được cấu thành từ bốn vòng pyrol gắn với một nguyên tử sắt (Fe) ở trung
tâm. Chính nguyên tử sắt này thực hiện chức năng vận chuyển oxy từ hồng cầu tới các mô, tế

bào. Globin là các loại protein có cấu trúc phức tạp gồm bốn chuỗi polypeptid: hai chuỗi
thuộc nhóm α - polypeptid và hai chuỗi kia thuộc nhóm β - polypeptid. Mỗi chuỗi gắn với
một nhóm HEM.
Phân tử hemoglobin được kí hiệu là Hb; khi nó liên kết với phân tử oxy thì được gọi là
oxyhemoglobin (HbO2). Có bốn dạng oxyhemoglobin. Chúng được tạo thành như sau:

Hb4 + O2 = Hb4O2
Hb4O2 + O2 = Hb4O4
Hb4O4 + O2 = Hb4O6
Hb4O6 + O2 = Hb4O8
Các phản ứng trên là thuận nghịch. Khi liên kết với phân tử oxy, phản ứng của chuỗi α
và β - polypeptid có khác nhau. Chuỗi β - polypeptid co cuộn lại khi liên kết với phân tử oxy,
và duỗi ra khi oxy tách ra khỏi chúng. Trong khi đó chuỗi α - polypeptid không thay đổi cấu


hình kể cả khi ở trạng thái liên kết với oxy cũng như ở trạng thái tự do. Có lẽ sự biến đổi cấu
hình của β - polypeptid ảnh hưởng đến tính chất quang học của các dẫn suất của phân tử
hemoglobin.
Trong bốn dạng oxyhemoglobin trên thì dạng thứ tư dễ gắn và dễ tách phân tử oxy ra
khỏi Hb. Nó là dạng bão hòa oxy, đảm bảo cho quá trình hô hấp xảy ra dễ dàng.
Ngoài oxyhemoglobin, methemoglobin (metHb) là dạng dẫn xuất khác của Hemoglobin.
Vì một lý do nào đó, nguyên tử sắt trong nhóm HEM của Hb bị thay đổi hóa trị (từ hóa trị 2
thành hóa trị 3) thì Hb đó được gọi là metHb. MetHb không có khả năng tách oxy ra khỏi
phân tử của nó. Nên nếu trong máu chứa một lượng lớn metHb thì quá trình trao đổi khí sẽ
không diễn ra, cơ thể bị thiếu oxy trầm trọng.
Phổ hấp thụ của các dẫn suất Hb khác nhau có dạng khác nhau. Phổ hấp thụ đặc trưng
của HbO2 có hai vạch sẫm, hẹp trong vùng ánh sáng vàng – lục, còn Hb có một vạch sẫm
nhưng rộng hơn cũng trong vùng ánh sáng trên. Điều đó cho thấy mật độ quang học phản ánh
đặc trưng của dẫn suất Hb. Trong bài thực hành này chúng ta sẽ tiến hành tìm hiểu tính chất
quang học của Hb và các dẫn suất của nó nhờ vào quang phổ kế.


6.2. THỰC HÀNH
6.2.1. Dụng cụ, hóa chất và vật liệu
−

01 máy quang phổ kế

−

500 ml dung dịch sinh lý PBS pH = 7,2

−

01 máy li tâm

−

10ml heparin

−

01 cân đĩa

−

10ml dung dịch ferixyanua kali K3[Fe(CN)6]

−

04 ống li tâm 3 ml


−

05 pipet các loại 1 ml – 5 ml

−

10g

tinh

thể

bão hòa
−

hòa

hemoglobin

chuẩn

100 ml dung dịch detionit natri Na2S2O3 bão

−

05 chuột nhắt trắng (hoặc máu gà lợn …)

6.2.2. Các bước tiến hành
6.2.2.1. Dựng đồ thị chuẩn

− Lấy Hb tinh thể để pha 10 dung dịch có nồng độ chuẩn trong khoảng mà nồng độ của
Hb dung dịch nghiên cứu có thể thay đổi (tùy thuộc vào hồng cầu loại động vật nào dùng làm
thí nghiệm).
− Đo mật độ quang học (D) của các dung dịch Hb chuẩn đã pha trên ở bước sóng 400
nm. Kết quả được ghi vào bảng để dựng đồ thị chuẩn. Trên trục tung đặt các gái trị mật độ
quang học, trên trục hoành đặt các giá trị nồng độ tương ứng.


6.2.2.2 Thu nhận các dẫn suất của hemoglobin
Thu nhận HbO2
− Tráng heparin vào thành ống nghiệm để chống đông máu.
− Lấy máu vào ống ly tâm.
− Ly tâm 1500 vòng/phút trong 5 phút để loại bỏ huyết tương, lấy hồng cầu.
− Rửa hồng cầu bằng dung dịch PBS ba lần bằng cách ly tâm 1500 vòng/phút trong 5
phút.
− Làm huyết tiêu hồng cầu bằng cách cho nước cất vào, lắc nhẹ đều rồi li tâm
3000v/phút trong 5 phút loại bỏ màng hồng cầu, dịch màu đỏ tươi trong suốt là dung dịch
oxyhemoglobin (HbO2) (nếu đặc có thể pha loãng với nước)
Thu nhận methêmoglobin (metHb)
− Cho 3 ml dung dịch HbO 2 mới thu được trên vào ống nghiệm ly tâm, cho thêm 1 – 2
giọt dung dịch ferixyanua kali bão hòa vào ống nghiệm, lắc đều nhẹ tay được dung dịch có
màu xanh thẩm, đó là metHb
Thu nhận hemoglobin
− Cho 3 ml dung dịch HbO 2 trên vào ống nghiệm, cho thêm 1 – 2 giọt dung dịch detionit
natri Na2S2O3 bão hòa vào, lắc đều nhẹ tay được dung dịch Hb có màu nâu sẫm.

6.2.2.2. Đo mật độ quang học các dẫn suất trên bằng quang phổ kế ở bước sóng 540
nm
− Dựa vào mật độ quang học đo được và đường cong đồ thị chuẩn xác định nồng độ của
các dẫn suất trên

Lưu ý:
Các thí nghiệm cần tiến hành ngay sau khi thu được HbO 2 vì nếu để lâu nó sẽ bị oxy hóa
thành metHb.
Cần cho vào cuvét đựng dịch đối chứng kiểm tra một lượng tương đương K3[Fe(CN)6]
nếu do mật độ quang học của metHb và Na2S2O3 nếu đo mật độ quang học của Hb