NGHIÊN CỨU TẠO CÁC DÒNG TẾ BÀO LAI SINH KHÁNG THỂ
ĐƠN DÒNG KHÁNG ĐẶC HIỆU FOLLICLE STIMULATING
HORMONE (FSH)
Đỗ Thị Thảo1, Nguyễn Thị Trang1, Nguyễn Thị Nga1, Nguyễn Thị Cúc1, Đỗ Thị Phương1,
Nguyễn Bá Mùi2, Phạm Kim Đăng2
1

Viện Công Nghệ Sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam

2

Khoa Chăn nuôi & Nuôi trồng thủy sản, Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội

TÓM TẮT
Việc định lượng chính xác Follicle Stimulating Hormone (FSH) có thể giúp phát hiện sớm các rối
loạn sinh sản của gia súc. Có nhiều phương pháp định lượng FSH nhưng trên thực tế việc sử dụng phương
pháp hóa miễn dịch, đặc biệt sử dụng kháng thể đơn dòng mang tính khả thi hơn so với các giải pháp khác
cả về khả năng áp dụng và độ đặc hiệu. Trong nghiên cứu này, 02 dòng tế bào lai Mo_FSH1 và Mo_FSH8
sinh kháng thể đơn dòng đặc hiệu với FSH đã được tạo ra sau khi lai giữa tế bào lympho B của lách chuột
mẫn cảm với kháng nguyên FSH gắn albumin với tế bào myeloma SP2/0-Ag14. Nồng độ kháng nguyên
gây miễn dịch tốt nhất là 250 µg/con/lần. Sau khi kiểm tra tính đặc hiệu trên các kháng nguyên
glycoprotein khác nhau, dòng Mo_FSH8 được lựa chọn để nhân nuôi lượng lớn và gây báng trên chuột. Từ
7 chuột có báng trên tổng số 10 chuột thí nghiệm, đã thu được 38 ml dịch báng. Tiếp đó, 72,04 mg kháng
thể đơn dòng được tinh sạch từ số dịch báng trên và cất giữ ở -80 0C để phục vụ nghiên cứu tạo kit định
lượng FSH.
Từ khoá: Enzyme Linked Immuno Absorbent Assay (ELISA), Hybridomas, monoclonal antibody, myeloma,
, Follicle Stimulating Hormone, glycoprotein.

1

MỞ ĐẦU
Được sản sinh từ thùy trước tuyến yên, FSH (Follicle Stimulating Hormone) hay
còn gọi là kích noãn tố là hormone sinh dục có bản chất glycoprotein. Đúng như tên gọi
của nó ở gia súc cái nó có chức năng kích thích sự phát triển, sự thành thục của các noãn
nang, đặc biết kích thích sự phát triển lớp tế bào hạt qua đó tăng cường tổng hợp
estrogenes. Cùng với LH, hormone này được tiết theo một qui luật và mang tính chu kỳ..
Nồng độ FSH bắt đầu gia tăng trong vòng 5 - 14 ngày sau khi bò đẻ, lúc bắt đầu xuất hiện
sóng nang đầu tiên sau khi sinh. Do đó, việc định lượng FSH và LH sẽ có ý nghĩa rất lớn
trong việc chẩn đoán các trường hợp rối loạn sinh sản ở gia súc như hiên tượng không
xuất hiện chu kỳ tính, chậm sinh, vô sinh hoặc thiểu năng cơ quan sinh dục làm cơ sở cho
những can thiệp nhằm nâng cao năng suất sinh sản cũng như hiệu quả kinh tế trong chăn
nuôi. Trên thực tế, ở Việt Nam đã có những nghiên cứu cho biết việc định lượng FSH kết
hợp với khám buồng trứng giúp chẩn đoán nguyên nhân gây rối loạn quá trình sinh sản ở
bò sữa (Đào Thị Thúy Hồng, 2009).
Công nghệ sản xuất kháng thể đơn dòng phát triển mạnh mẽ trong những năm gần
đây đã và đang đóng vai trò vô cùng quan trọng trong khoa học cũng như thực tiễn. Một
trong số những ứng dụng của nó là để chẩn đoán nhanh và chính xác một số bệnh của
người cũng như vật nuôi nhờ vào tính đặc hiệu và độ nhạy rất cao của kháng thể đơn
dòng (Brich, Lennox, 1995; Celis et al., 1994; Kohler, Misltein, 1975; Me, Speir, 1996).
Hiện nay, rất nhiều Hãng trên thế giới đã và đang sử dụng kháng thể đơn dòng kháng
FSH trong các kit hóa miễn dịch phục vụ việc định tính và định lượng hormone này,
chẳng hạn như FSH ELISA kit (PHOENIX PHARMCEUTICAL); Follicle Stimulating
Hormone ELISA KIT (Antibody, USA) v.v... mang lại hiệu quả quan trọng trong chăn
nuôi. Trong khi đó, ở Việt Nam việc ứng dụng vào thực tế gặp rất nhiều khó khăn do phải
nhập kít, giá thành cao, bị động nên mới chỉ ứng dụng trong một số nghiên cứu mà chưa
được ứng dụng trong thực tiễn sản xuất (Lê Văn Thọ và Lê Xuân Cương, 1979). Chính vì
vậy, việc chủ động nghiên cứu tạo các dòng tế bào lai sản sinh kháng thể đơn dòng kháng
đặc hiệu FSH cung cấp cho việc chế tạo kit ELISA định lượng hay que thử nhanh FSH
phục vụ chăn nuôi nói chung và chăn nuôi bò nói riêng là rất cần thiết.
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Phương pháp nuôi cấy tế bào Sp2/0-Ag14 in vitro

2


Tế bào Sp2/0-Ag14 do GS. J. M. Pezzuto thuộc trường Đại học Hawaii, Hoa Kỳ
cung cấp. Tế bào được nuôi cấy trong môi trường RPMI-1640 có bổ sung 10% FBS, 1%
PSF, 10% Sodium pyruvat (GIBCO).
Phương pháp gây miễn dịch
Chuột BALB/c được gây miễn dịch với kháng nguyên FSH Albumin (Sigma).
Kháng nguyên được tiêm dưới da của chuột ở các nồng độ 100 µg/con/lần;
250µg/con/lần và 500 µg/con/lần được trộn đều với tá dược CFA (Completed Freund’s
adjuvant, Sigma) theo tỉ lệ 1:1 cho lần tiêm đầu và với tá dược IFA (Incompleted
Freund’s adjuvant, Sigma) theo tỉ lệ 1:1 cho lần tiêm nhắc lại (Celis A et al., 1994). Lần
tiêm nhắc lại được thực hiện vào 3-4 tuần sau lần tiêm đầu. Lần tiêm cuối cùng cho chuột
được thực hiện 3 ngày trước khi lấy tế bào lympho B.
Phương pháp lai tế bào và tách dòng
Thu tế bào lympho B từ lách chuột đã được gây miễn dịch đem lai với tế bào
Sp2/0-Ag14 với tỉ lệ 1:20 trong điều kiện tác động của polyethylene glycol. Tế bào lai
được pha trong môi trường có bổ sung HAT và chia vào các phiến 96 giếng. Sau 5 ngày
được thay bằng môi trường có bổ sung 10% HT. Sau 7 ngày, 100 µl dịch nổi được thu từ
mỗi giếng nuôi tế bào được kiểm tra sự có mặt của kháng thể kháng đặc hiệu FSH bằng
phương pháp ELISA. Dịch nổi nào có giá trị OD cao tức là có kháng thể kháng FSH
tương ứng với sự xuất hiện của tế bào lai có khả năng sản xuất kháng thể kháng FSH.
Thu nhận tế bào lai hybridomas từ các giếng có hoạt tính mạnh cấy chuyển sang phiến 24
giếng để tiếp tục nuôi cấy và tách dòng. Sau quá trình tách dòng, lựa chọn các giếng có
một dòng tế bào, có sinh kháng thể kháng FSH để nhân nuôi lượng lớn, từ đó tinh sạch và
kiểm tra hiệu giá của kháng thể đơn dòng thu được.
Phương pháp ELISA để kiểm tra sự có mặt của kháng thể kháng đặc hiệu FSH
Phương pháp ELISA được thực hiện theo Liddell và Cryer (1993). Kháng nguyên

được pha trong Carbonate coating buffer (100 µl/giếng) và ủ bản 1 giờ ở 37 oC. Rửa bản
bằng Washing buffer. Tiếp tục bổ sung 100 µl dịch nổi cần kiểm tra vào từng giếng, ủ
1giờ ở 37oC. Goat-Antimouse IgG conjugate HRP được sử dụng để kiểm tra sự có mặt
của kháng thể kháng FSH. Thêm 100 µl/giếng cơ chất TMB và ủ 1 giờ ở 37oC. Đọc kết
quả ELISA ở bước sóng 450nm.
Bố trí thí nghiệm
Tiến hành gây miễn dịch cho 06 chuột BALB/c với kháng nguyên (FSH gắn
albumin). Trong đó, 6 chuột được chia làm 3 lô thí nghiệm: lô 1; 2; lô 3 và được tiêm
kháng nguyên ở các liều tương ứng là 10, 50, 250 µg/con/lần. Sau quá trình gây miễn
3


dịch, máu từ hốc mắt của 6 chuột được thu lại và tách huyết thanh. Các mẫu huyết thanh
này được sử dụng cho phản ứng ELISA để kiểm tra khả năng đáp ứng miễn dịch của các
lô thí nghiệm.
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
1. Gây miễn dịch cho chuột
Kết quả kiểm tra khả năng đáp ứng miễn dịch cho thấy, chuột ở lô 1 được gây
miễn ở liều 10 µg/con/lần cho đáp ứng miễn dịch thấp nhất và ở lô 3 với liều kháng
nguyên 250 µg/con/lần cho đáp ứng cao nhất thể hiện qua giá trị OD cao nhất trong phản
ứng ELISA (Hình 1).
Như vậy, với quy trình gây miễn dịch như trên và sử dụng liều kháng nguyên
FSH gắn albumin ở mức 250 µg/con/lần để gây miễn dịch cho chuột là phù hợp. Dựa vào
kết quả này, ở lô số 3 được lựa chọn để thu tế bào lympho B phục vụ cho quá trình lai tạo
tế bào sau này.

Hình 1. Hoạt độ kháng thể từ kháng huyết thanh của chuột được gây miễn dịch

Lai tạo và chọn dòng tế bào hybrid sản xuất kháng thể đơn dòng kháng đặc hiệu FSH
Sau quá trình dung hợp tế bào (trên 288 giếng) rồi sàng lọc bằng môi trường chọn

lọc HAT và HT, 196 giếng có xuất hiện tế bào lai. Như vậy, hiệu quả lai (fusion
efficiency) đạt 68,06% (196/288). Có thể nói hiệu quả lai trong nghiên cứu này là tương
đối cao và cũng phù hợp với các nghiên cứu trước đây của Đỗ Thị Thảo và công sự
( 2008, 2010);cũng như nghiên cứu của Fatima YUCEL (1999).

4


Đế chọn ra được giếng có tế bào lai sinh kháng thể mong muốn, phương pháp
ELISA được sử dụng nhằm kiểm tra sự có mặt của kháng thể kháng FSH trong dịch nổi
thu được ở các giếng. Kết quả cho thấy có 68/196 giếng (đạt 34,69 %) dương tính. Trên
cơ sở đó, giếng có giá trị OD cao nhất được lựa chọn để thu nhận, làm sạch dòng bằng
phương pháp pha loãng tới hạn và chọn lọc bằng phương pháp ELISA.
Mười hai dòng tế bào lai sinh kháng thể đơn dòng kháng FSH tốt nhất được kí
hiệu Mo_FSH1 đến Mo_FSH12 tương ứng với 12 giếng có giá trị OD cao nhất nằm trong
khoảng từ 1,48 đến 2,93 đã được lựa chọn. Như vậy, tỉ lệ số dòng tế bào sinh kháng thể có
tính đặc hiệu với kháng nguyên FSH /số dòng tế bào sinh kháng thể dương tính với kháng
nguyên FSH là: 2/69. Tỉ lệ này cũng phù hợp với kết quả nghiên cứu của Fatima YUCEL

(1999).
Các dòng nói trên được nhân nuôi ở cấp độ lớn hơn, trong quá trình nhân nuôi, 8
dòng tế bào lai Mo_FSH1, Mo_FSH2, Mo_FSH5, Mo_FSH6, Mo_FSH8, Mo_FSH9,
Mo_FSH10, Mo_FSH11 đã thể hiện khả năng sinh kháng thể với hiệu suất tốt hơn hẳn 6
dòng còn lại. Chính vì vậy, 08 dòng này đã được lựa chọn nhân nuôi để thu kháng thể
đơn dòng nhằm tiếp tục quá trình sàng lọc khi kiểm tra tính đặc hiệu trên các kháng
nguyên khác nhau.

Hình 2. Cụm tế bào lai (clone) dòng Mo_FSH8 đang phát triển, độ phóng đại
10×20 và 10×10


5


Đánh giá tính đặc hiệu và hiệu giá kháng thể của 8 dòng tế bào đã được chọn
Để đáp ứng được yêu cầu của thực tiễn cần phải có dòng tế bào sinh kháng thể
tốt, các kháng thể đơn dòng thu được phải có tính đặc hiệu và độ nhạy cao, do vậy 8 dòng
tế bào được kiểm tra hiệu giá kháng thể và tính đặc hiệu của kháng thể đơn dòng với các
hormon glycoprotein khác có cấu trúc gần giống với FSH là: Luteinizing hormone (LH),
human chorionic gonadotropin (HCG), Thyroid-stimulating hormone (TSH). Kết quả cho
thấy: .dòng tế bào Mo_FSH1 và Mo_FSH8 có độ đặc hiệu cao khi có phản ứng dương
tính với FSH và âm tính với tất cả các kháng nguyên còn lại. Đồng thời, hiệu giá kháng
thể đơn dòng của 2 dòng này tương đối tốt (2500 với dòng Mo_FSH1 và 3000 với dòng
Mo_FSH8). Từ kết quả nghiên cứu ở trên, 2 dòng tế bào lai được chúng tôi tiến hành
nhân nuôi in vitro để thu số lượng lớn nhằm tạo nguồn tế bào để tạo báng cho chuột và để
lưu giữ bảo quản trong nitrogen lỏng.
Bảng 1. Tính đặc hiệu và hiệu giá kháng thể của 8 dòng tế bào sinh kháng thể đơn dòng kháng
FSH

STT

Dòng TB

FSH

LH

HCG

TSH


Hiệu giá

1

Mo_FSH1

+

-

-

-

2500

2

Mo_FSH2

+

+

-

-

1000


3

Mo_FSH5

+

-

-

+

3000

4

Mo_FSH6

+

+

-

-

2000

5


Mo_FSH8

+

-

-

-

3000

6

Mo_FSH9

+

+

-

-

2000

7

Mo_FSH10


+

-

+

+

1000

8

Mo_FSH11

+

-

+

+

1000

Ghi chú: (+) có kết quả dương tính với giá trị OD≥ 0,5 trong phản ứng ELISA; (-) là kết quả âm tính với giá trị OD
≤ 0,5 trong phản ứng ELISA.

Gây báng thực nghiệm trên chuột bằng dòng tế bào lai Mo_FSH8
Có thể nói, kháng thể đơn dòng thu được từ dịch nổi nuôi cấy thường rất tinh
sạch, tuy nhiên, hàm lượng của chúng là rất thấp và nếu sử dụng để sản xuất các kit chẩn

đoán thì không khả thi do giá thành rất cao. Trong khi đó, nếu sử dụng tế bào lai để gây
báng trên chuột thì lượng kháng thể đơn dòng thu được thường cao gấp 100 – 1000 lần so
với trong dịch nổi nuôi cấy. Do đó, từ kết quả nghiên cứu in vitro, 10 chuột thí nghiệm

6


dòng BALB/c được tiến hành gây báng bằng tế bào lai Mo_FSH8 (theo Liddel và Cryer,
1993). Kết quả cho thấy có 7 chuột xuất hiện báng và thu được 38 ml dịch báng tương
ứng với lượng kháng thể thu được là 72,01 mg. Từ đó tính được hàm lượng kháng thể trên 1
ml dịch báng trong nghiên cứu này là: 1,895 mg/ml. Tuy giá trị này vẫn thấp hơn so với công
bố của Tonti K và cộng sự với kết quả đạt được là: 2,5 mg kháng thể/ml dịch báng và 20µg
kháng thể/ml dịch nuôi cấy tế bào và nhóm nghiên cứu của Noppavan Janejai et al với kết
quả mà họ đạt được là: 2 mg kháng thể/ml dịch báng nhưng có thể thấy hàm lượng kháng thể
thu được từ dịch báng trong nghiên cứu này cho kết quả rất khả quan. (Tonti K et al., 1981;

Noppavan Janejai et al., 1998)
Lượng dịch báng thu được đã trải qua các bước tinh sạch, thu nhận và bảo quản
kháng thể đơn dòng trong tủ lạnh sâu –80 0C để tiến tới nghiên cứu, hoàn thiện quy trình
gắn với chất nhũ vàng (Colloid Gold) nhằm ứng dụng trong việc tạo các kit ELISA hoặc
EIA định lượng FSH sau này.
KẾT LUẬN
Nghiên cứu đã thành công khi tạo được các dòng tế bào lai sinh kháng thể đơn
dòng kháng đặc hiệu FSH. Liều gây miễn dịch cho chuột tôt nhất với kháng nguyên FSHalbumin là 250 µg/con/lần. Sau quá trình lai và tách dòng, 2 dòng tế bào lai Mo_FSH1 và
Mo_FSH8 sản sinh kháng thể đơn dòng kháng FSH chất lượng cao đã được lựa chọn. Từ
đó, dòng Mo_FSH8 được lựa chọn để gây báng cho chuột và thu được 38 ml dịch báng
tương ứng với lượng kháng thể đơn dòng thu được là 72,01 mg. Lượng kháng thể đơn dòng

này đã được thu nhận và bảo quản trong tủ lạnh sâu -80 oC để phục vụ cho việc tạo kit
định lượng FSH sau này.

Lời cảm ơn: Chúng tôi xin chân thành cảm ơn GS. J.M Pezzuto, trường đại học Hawaii,
Hoa Kỳ đã giúp đỡ chúng tôi thực hiện công trình nghiên cứu này.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Đào Thị Thúy Hồng (2009) Xác định hàm lượng một số hormone sinh sản bằng
phương pháp miễn dịch enzym (ENZYM LINKED IMMUNO SORBENT
ASSAY) để chẩn đoán, điều trị hiện tượng rối loạn quá trình thụ tinh ở bò sữa do
nguyên nhân bệnh lý buồng trứng, Luận văn thạc sỹ Nông nghiệp, Đại học Nông
nghiệp.
2. Lê Văn Thọ, Lê Xuân Cương (1979) Kích dục tố ứng dụng trong chăn nuôi NXB

Nông nghiệp, Hà Nội.
7


3. Đỗ Thị Thảo, Đỗ Thị Phương, Đỗ Khắc Hiếu, Hà Thị Thu, Đinh Thương Vân,

Đinh Duy Kháng, Lê Trần Bình (2008) Tạo dòng tế bào lai sản xuất kháng thể
đơn dòng kháng protein vỏ VP28 của virus gây bệnh đốm trắng trên tôm sú, Tạp
chí Công nghệ Sinh học, 6(2): 203 – 208.
4. Đ. T. Thảo, N. T. Cúc, N. T. Nga, N. T. Trang, Đ. T. Phương. (2010) Nghiên cứu

tạo dòng tế bào lai sinh kháng thể đơn dòng kháng alpha-fetoprotein (AFP) để hỗ
trợ chẩn đoán sớm ung thư tế bào gan ở người, Y học Việt Nam, 372: 90-94.
5. Birch J R, Lennox E S (1995) Monoclonal antibodies: principles and

applications, John Wiley & Sons.
6. Celis A, Dejgaard Kurt, Julio E Celis (1994) Production of mouse monoclonal

antibodies, Cell Biol, 2: 269 – 275.
7. Fatima YUCEL (1999) Production of Monoclonal antibody specific for

progesterone, Tr. J. of Boilogy, 23: 393-399.
8. Kohler G, Milstein C (1975) Continuous cultures of fused cells secreting antibody

of predefinied sepcificity, Nature, 256 (5517): 495-497.
9. Liddell E J, Cryer A (1991) A practical guide to monoclonal antibodies, John

Wiley & Sons.
10. Me C, Speir R E (1996) Monoclonal antibodies in biotechnology theoretical and

practical, Aspects Cambridge, 92 – 98.
11. Noppavan Janejai, Jaranee Pheungphosop, Wanpen Boonwanich, Wiyada

Charoensiriwatana (1998) A Plot study for the production of monoclonal
antibody by bioreactor, Bull. Dept. Med. Scl, 40(3): 239-246.
12. Tontti K, Stenman U H, Sutinen M L, Selander R K, Schröder J (1981)
Characterization of a monoclonal antibody to human alpha-fetoprotein and its use in
affinity chromatography, Journal of Immunological Methods, 46(3)

SUMMARY

STUDYING ON CREATION OF HYBRIDOMAS PRODUCING
MONOCLONAL ANTIBODY SPECIFIC FOR FOLLICLE
STIMULATING HORMONE
Do Thi Thao1, INguyen Thi Trang1, Nguyen Thi Nga1, Nguyen Thi Cuc1, Do Thi Phuong1,
Nguyen Ba Mui2, Pham Kim Dang2

8


1


Institute of Biotechnology, Vietnam Academy of Science and Technology

2Faculty of Animal sciences & Aquaculture, Hanoi University of Agriculture i
Follicle Stimulating Hormone (FSH) quantitation could be helpful as indicator of
reproductive disease in cattle. To quantity the amount of serum FSH, using monoclonal
antibody is highly feasible. In this study, 2 clones of hybridomas named as Mo_FSH1
and Mo_FSH8 which were able to produce very specific monoclonal antibody against
FSH were selected. Those cells were fused between myeloma SP2/0-Ag14 cells and the
B lymphoid cells isolated from spleen of the FSH immunized mouse. Without any cross
reaction with other tested glycoproteins, the clone Mo_FSH8 was selected for further in
vitro culture at the larger scale to inject into BALB/c mice for ascite fluid propagation.
Among 10 Mo-FSH8 injected mice, we got 7 ones which were collected with 38 ml of
ascite fluid in total. After purification process, there were 72.01 mg of purified
monoclonal antibody were gained. Those are all aliquoted and saved at the -80 0C for
developing the quantitative FSH kit in future.
Keywords: Enzyme Linked Immuno Absorbent Assay (ELISA) Hybridomas, monoclonal
antibody, myeloma, Follicle Stimulating Hormone, glycoprotein
Author for correspondence: Thao Thi Do, Tel: 04-38361774; Email:

9