1

MỞ ĐẦU
1. Lý do lựa chọn đề tài
Vi sinh vật có ở khắp mọi nơi xung quanh chúng ta như trong phân, nước thải,
rác, bụi, thực phẩm. Trong không khí và ngay cả ở trên cơ thể chúng ta cũng là nơi vi
sinh vật sinh sống, chúng có thể sống kí sinh trên da (đặc biệt là ở bàn tay), ở miệng,
đường hô hấp, đường tiêu hóa,... Đặc biệt là thức ăn, nước uống chính là con đường
chính để vi sinh vật xâm nhập và gây bệnh cho con người.
Hiện nay, ngộ độc thực phẩm do vi sinh vật gây ra là vấn đề cấp bách đang
được cả xã hội quan tâm. Việc gây ngộ độc cho con người phụ thuộc vào loại độc tố
của vi sinh vật, tuổi tác và tình trạng sức khỏe của mỗi người. Một trong số những loài
vi sinh vật gây bệnh cho con người cần phải được quan tâm chính là vi khuẩn
Campylobacter spp. Chúng là nguyên nhân gây ra 4-15% các trường hợp ngộ độc. Đó
là vấn đề ở cả những nước phát triển và đang phát triển và có liên quan đến những sản
phẩm sữa chưa được tiệt trùng, nước bị ô nhiễm, gia cầm và các nông sản. Đối với các
mặt hàng trên, các thị trường nhập khẩu chính như Hoa Kỳ, EU, Úc, Anh, Nhật Bản,
Mexico,... đều đưa ra tiêu chuẩn nghiêm ngặt đối với các mặt hàng này.
Campylobacter spp. là một trong những tác nhân vi khuẩn hàng đầu gây bệnh
tiêu chảy trên thế giới. Theo ước tính của Trung tâm Kiểm soát và Phòng ngừa Bệnh
của Mỹ thì mỗi năm có 2,4 triệu người Mỹ mắc “bệnh nhiễm khuẩn Campylobacter”.
Hầu hết các bệnh nhân đều hồi phục sau vài ngày bị khó chịu, nhưng bệnh này có thể
đe dọa mạng sống của những người có hệ miễn dịch bị tổn hại, kể cả những bệnh nhận
bị AIDS. Ngoài ra, một biến chứng nghiêm trọng nhưng hiếm gặp của bệnh nhiễm
khuẩn campylobacter là làm khởi phát chứng rối loạn tự miễn dịch- còn gọi là hội
chứng liệt Guillain-Barré.
Ở những nước đang phát triển, đối tượng chủ yếu bị nhiễm Campylobacter spp.
là trẻ em dưới 5 tuổi. bên cạnh tình hình nhiễm Campylobacter spp. ngày càng gia
tăng ở cả những nước phát triển và đang phát triển thì tỷ lệ các chủng kháng thuốc
cũng không ngừng tăng lên đặc biệt là với fluoroquinolone (FQ), họ kháng sinh
thường dùng để điều trị tiêu chảy do nhiễm Campylobacter spp.. Ở Việt Nam,

Campylobacter spp. đang là một trong những tác nhân vi khuẩn chính gây tiêu chảy ở
trẻ em dưới 5 tuổi tại thành phố Hồ Chí Minh. Vi khuẩn này chiếm 17,63% trên tổng


2

số 363 trường hợp do tác nhân vi khuẩn trong 1420 bệnh nhi tiêu chảy từ tháng 6/2009
đến tháng 5/2010.
Xuất phát từ thực tiễn về tình hình nhiễm Campylobacter spp. trên thế giới và
Việt Nam chúng tôi tiến hành

thực hiện :”Đánh giá sự có mặt vi khuẩn

Campylobacter spp. trong mẫu thịt gà tươi tại một số địa điểm ở Hải Phòng” nhằm
đưa ra những khuyến cáo về vấn đề an toàn thực phẩm, hạn chế sự lây nhiễm của
Campylobacter spp. trên địa bàn Hải Phòng.
2. Mục tiêu
- Đánh giá sự có mặt Campylobacter spp. trong thực phẩm tươi, đưa ra những
khuyến nghị nhất định về việc sử dụng thực phẩm thịt gà hiện nay tại Hải Phòng.
- Cung cấp kiến thức cơ bản về Campylobacter spp. phân lập trên thực phẩm để
mở đầu cho những nghiên cứu tiếp theo.
3. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu
- Đối tượng là vi khuẩn Campylobacter spp.
- Phạm vi nghiên cứu: Trên các mẫu thịt gà tươi được thu thập tại các chợ, trong
phòng thí nghiệm và tại siêu thị BigC trên địa bàn Hải Phòng.
•

Nội dung nghiên cứu
- Thu thập các mẫu thịt gà tại Hải Phòng
- Phân lập và nhận dạng Campylobacter spp. từ mẫu thịt gà

- Đánh giá sự có mặt của Campylobacter spp. từ mẫu thịt gà
4. Phương pháp nghiên cứu
- Phương pháp thu mẫu: thu theo tiêu chuẩn TCVN 6507-2: 2005
- Phương pháp nuôi cấy: nuôi tăng sinh vi khuẩn trên môi trường chọn lọc
- Phương pháp phát hiện: nhuộm Gram, thử nghiệm oxidase, thử nghiệm
catalase, đách giá sự phát triển của vi khuẩn Campylobacter spp. trên các điều kiện
nuôi cấy khác nhau


3

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. VI KHUẨN CAMPYLOBACTER SPP.
1.1.1. Lịch sử phát hiện
Campylobacter spp. là một chủng vi khuẩn Gram âm gây bệnh ở người và gia
súc trên toàn thế giới. Chúng được miêu tả lần đầu tiên vào năm 1886 bởi Theodor
Escherich. Vào thời gian đó, Escherich đã miêu tả một loại vi khuẩn hình que có trong
ruột kết của các trẻ em chết bởi căn bệnh “cholera infantum”.
Năm 1909, hai nhà bác sĩ thú y là McFadyean và Stockman đã miêu tả sự kết
hợp của một vi sinh vật chưa biết với bệnh dịch sảy thai ở cừu cái, vi khuẩn này giống
với một phẩy khuẩn – I. Và vào năm 1919, trong khi điều tra những trường hợp sảy
thai truyền nhiễm ở bò ở Mỹ, Smith đã phân lập được một vi khuẩn và ông miêu tả đó
là một xoắn khuẩn – spirillum. Sau đó Smith cho rằng mình và nhóm McFadyean và
Stockman đang nghiên cứu cùng một vi khuẩn. Và cùng với Taylor, Smith đã khẳng
định được điều này và đề xuất tên của vi khuẩn đó là ‘Vibirio fetus’.
Cho đến tháng 5 năm 1938, một sự kiện lớn đã xảy ra ở Illinos (Mỹ), bây giờ nó
được xem là một trường hợp có đầy đủ tài liệu dẫn chứng đầu tiên về sự nhiễm
Campylobacter ở người. Sự kiện này liên quan đến trận dịch tiêu chảy do sữa nhiễm
Campylobacter, ảnh hưởng đến 355 người. Sau đó vào năm 1947, Vinzent đã phân
lập được V. fetus từ máu của ba người phụ nữ mang thai nhập viện vì sốt mà không rõ

nguyên nhân. Bệnh kéo dài trong 4 tuần và hai trong ba người phụ nữ này bị sảy thai.
Vào năm 1957, Elizabeth King đã miêu tả một phẩy khuẩn với rất nhiều đặc điểm
chung với các tác nhân được miêu tả bởi Vinzent nhưng khác về đặc đểm sinh hóa và
tính kháng nguyên. Mãi đến năm 1963 thì giống Campylobacter (nghĩa là “vi khuẩn
hình que có dạng cong”) được đề xuất bởi Sebald và Veron khi nhận ra rằng vi sinh
vật này không sử dụng đường và có hàm lượng G+C khác với Vibrio spp.
Tuy nhiên vì chưa có phương pháp nuôi cấy, phân lập Campylobacter thích hợp
cho nên có rất ít trường hợp nhiễm Campylobacter trên người được báo cáo. Mãi cho
đến năm 1972, phương pháp phân lập các loài Campylobacter chịu nhiệt mới được
phát triển bởi Dekeyser và Butzler. Phương pháp này liên quan đến việc lọc các mẫu
phân qua màng lọc 0,64 µm và dịch lọc được đem nuôi cấy. Phương pháp này khá tốn
công và mất thời gian do đó vào năm 1977, Martin Skirrow từ phòng thí nghiệm sức
khỏe cộng đồng Worcester, đã miêu tả một kĩ thuật trực tiếp và đơn giản hơn đó là


4

nuôi cấy trực tiếp mẫu phân lên đĩa môi trường thạch máu có chứa vancomycin,
polymyxin, trimethoprim. Các đĩa sau đó được ủ ở 42ºC trong môi trường vi hiếu khí
chứa 5% O2, 10% CO2, 85% N2. Từ đó trở đi có rất nhiều sự thay đổi về phương
pháp, điều này đã cho phép các phòng thí nghiệm vi sinh chẩn đoán lâm sàng có thể
phân lập Campylobacter từ các mẫu phân bệnh nhân.
Đến năm 1983, Ruiz-Palacios và C.S phát hiện độc tố của Campylobacter trong
ruột non. Cũng trong năm này Park C.E, Stankiewiez ZK, Lowett J, Hunt J công bố
ảnh hưởng của nhiệt độ, thời gian ấp trứng, pH môi trường đến sự phục hồi của
Campylobacter trong ruột gà. Năm 1985, Lai-King N, Stiles ME, Tayler-DE đã ức chế
thành công C.coli và C.jejuni bằng kháng sinh bằng cách sử dụng môi trường kháng
sinh chọn lọc. Và đến năm 1987: Harris NV, Kimball TJ, Bennett T, Jonson Y... phát
hiện ra rằng bệnh lí Campylobacteriosis có liên quan đến việc sử dụng sữa chưa tiệt
trùng.

Tính đến năm 1989, Campylobacter gồm có 18 loài, phân loài với 17 cái tên
chính thức được công nhận bởi Ủy ban quốc tế về vi khuẩn học có hệ thống và 1 tên
loài được đề xuất nhưng không chính thức. Các phương pháp phân lập được cải tiến
dẫn đến sự ra đời của những báo cáo đầu tiên về tính thường xuyên của việc vi khuẩn
Campylobacter gây bệnh ở người. Từ đó dẫn đến một loạt các nghiên cứu về dịch tễ
của Campylobacter và nhận ra rằng hiện nay Campylobacter đang là một vấn đề báo
động cho sức khỏe cộng đồng ở cả các nước phát triển và đang phát triển.
1.1.2. Hình thái, cấu trúc và một số đặc điểm sinh hóa
Campylobacter là vi khuẩn Gram âm, không tạo bào tử. Tế bào của tất cả các
thành viên thuộc giống Campylobacter đều nhỏ, có dạng cong, có hình chữ S hay có
dạng xoắn (dài 0,5-5 µm và rộng 0,2-0,8 µm). Chúng di động với một tiêm mao phân
cực nằm ở một đầu hay hai đầu của tế bào tạo nên một kiểu di động như hình xoắn ốc.
Campylobacter là vi khuẩn hiếu khí nhưng đôi khi là hiếu khí tùy ý. Chúng sử dụng
sản phẩm của chu trình Kreb và các amino acid để phát triển vì không lên men hay oxi
hóa carbohydrate. Campylobacter spp. có bộ gen nhỏ chỉ 1,6 – 1,7 Mbp, điều này có
thể giải thích một phần vì sao khi nuôi cấy ở phòng thí nghiệm chúng lại đòi hỏi điều
kiện dinh dưỡng phức tạp.


5

Các phản ứng sinh hóa đặc trưng bao gồm phản ứng khử fumarate thành
succinate, methyl red âm tính, tạo acetoin và indole. Hầu hết các loài đều khử nitrate
và oxidase dương tính.
Campylobacter thay đổi hình thái từ dạng xoắn sang dạng hình cầu khi chịu
stress từ môi trường bên ngoài hay trong các mẻ nuôi cấy thời gian dài. Dạng vi khuẩn
hình cầu có khuynh hướng khó nuôi cấy và mất tính di động. Trạng thái “còn sống
nhưng không nuôi cấy được”(viable but non culturable-VBNC) có lẽ cho phép
Campylobacter tồn tại ở các môi trường khắc nghiệt.
C. jejuni và C. coli là những sinh vật vi hiếu khí và ưa nhiệt. Nhiệt độ phát triển

tốt nhất là 42ºC và đòi hỏi nồng độ oxy từ 3-15% và nồng độ CO 2 là 3-5%. Ưa nhiệt
được cho là đặc điểm giúp chúng thích nghi với môi trường trong ruột của động vật và
chim. Đặc điểm sinh lý học của C. jejuni và C. coli có độ tương đồng cao, sự khác
nhau duy nhất về kiểu hình là C. jejuni cho phản ứng thủy phân hippurate mặc dù có
khoảng 5% C. jejuni không thực hiện phản ứng này.

Hình 1.1 Hình dáng của Campylobacter quan sát dưới kính hiển vi điện tử
truyền suốt (A) và sau khi nhuộm Gram (B)


6

1.1.3. Phân loại
Từ khi giống Campylobacter được đề xuất vào năm 1963 bởi Sebald và Veron
và khi có sự ra đời của các quy trình phân lập thích hợp, ngày càng có nhiều vi sinh
vật giống Campylobacter (Campylobacter-like organisms - CLOs) được phân lập từ
rất nhiều nguồn như con người, động vật, môi trường. Sau đó dần dần các vi sinh vật
giống Campylobacter này được xác định là các loài Campylobacter mới. Từ năm 1974
đến 1988 có tất cả 14 loài và dưới loài Campyloacter được phát hiện trong các môi
trường sống khác nhau và gây các bệnh khác nhau (tổng kết bởi Vandamme và
Goosens năm 1992).
Bảng 1.1. Phân loại giống Campylobacter gồm có 18 loài và 6 dưới loài:
Giới
Ngành
Lớp
Bộ
Họ
Giống

Loài


Bacteria
Proteobacteria
Epsilon Proteobacteria
Campylobacterales
Campylobacteraceae
Campylobacter
C.coli,C.concisus,C.curvus,C.fetus(C.fetussubsp.fetus
,C.fetus
subsp.venerealis),C.gracilis,C.helveticus,C.hyoilei,
C.hyointestinalis(C.hyointestinalis
subsp.hyointestinalis,C.hyointestinali
subsp.lawsonii),C.insulaenigrae,C.jejiun(C.jejiun
subspjejiun,C.jejiunsubsp.doylei),C.lanienae,
C.lari,C.mucosalis,C.rectus,C.showae,C.sputorum,
C.upsaliensis, C.hominis


7

1.2. ĐẶC ĐIỂM GÂY BỆNH VÀ ĐIỀU TRỊ CAMPYLOBACTER SPP.
1.2.1. Đặc điểm gây bệnh
1.2.1.1. Campylobacteriosis
Campylobacteriosis là một bệnh truyền nhiễm lây từ động vật sang người –
zoonosis, do vi khuẩn thuộc giống Campylobacter gây ra. Bệnh này thường được biết
đến là bệnh đường ruột hay bệnh viêm dạ dày - ruột xảy ra ở người do tiêu thụ thức ăn
hay nước bị nhiễm khuẩn. Dạng bệnh Campylobacteriosis gây ảnh hưởng nghiêm
trọng nhất đến sức khỏe cộng đồng là bệnh viêm dạ-dày ruột do hai loài C. coli và C.
jejuni gây ra. Liều nhiễm gây bệnh thấp, khoảng 10 - 500 tế bào, nhưng cũng thể cao
hơn tùy theo sự nhạy cảm với vi khuẩn này ở mỗi người. Thời gian ủ bệnh thường từ

24 đến 72 giờ và có thể lâu hơn khi số lượng vi khuẩn ban đầu thấp.
1.2.1.2. Khả năng gây bệnh
Mỗi liều nhiễm độc từ Campylobacter spp. cho người có thể khoảng 500 tế bào.
Tuy nhiên mức độ biểu hiện bệnh ở mỗi người khác nhau phụ thuộc vào sức đề kháng
của mỗi con người bị nhiễm đối với Campylobacter spp. Bệnh viêm đường ruột là loại
tiêu biểu cho khả năng tự đề kháng của con người đối với bệnh. Hầu hết tiêu chảy cấp
tính gặp ở người khỏe mạnh đột ngột bị mắc bệnh, bệnh có khả năng tự khỏi sau nhiều
ngày hoặc vài tuần.
Độc tố gây tiêu chảy có thể chia làm 2 loại: độc tố trợ lực gây tiết dịch vì nó
hoạt hóa enzyme trong tế bào như andenylat cyclase không gây tổn thương tế bào, độc
tố gây độc gây tổn thương tế bào biểu mô và gây tiết dịch nhưng không hoạt hóa
enzyme.
Cơ chế gây bệnh của Campylobacter spp có thể bao gồm sự kết hợp và gắn vào
biểu mô ruột, xâm nhập vào biểu mô ruột và tiết ra độc tố.
Bệnh nhiễm với vi khuẩn Campylobacter jejuni có thể cũng dẫn đến triệu chứng
viêm khớp. Lúc đầu chưa có sự biểu hiện của viêm khớp nhưng sẽ phát triển trong
vòng từ vài ngày đến vài tuần sau giai đoạn nhiễm bệnh cấp tính. Kháng thể để chống
lại Campylobacter jejuni thì rất cao nhưng loài vi khuẩn này không thể bị tách ly khỏi
khớp xương bị nhiễm.


8

1.2.1.3. Các biểu hiện lâm sàng
 Nhiễm trùng dạ dày- ruột

Campylobacter chịu nhiệt (C. coli và C. jejuni) là hai tác nhân gây nhiễm trùng
đường ruột chủ yếu trên toàn thế giới. C. jejuni gây ra 80-85% số trường hợp viêm dạ
dày - ruột do nhiễm Campylobacter và 10-15% trường hợp là do C. coli. Triệu chứng
chính được quan sát là tiêu chảy. Bệnh nhân đi tiểu ra nước, máu và có thể có các tế

bào máu màu trắng hay màng nhầy. Các triệu chứng thường gặp khác là đau bụng, có
thể kèm theo nôn mửa. Ngoài ra sốt, đau đầu, suy nhược và chán ăn là những triệu
chứng có thể xảy ra trước khi bị tiêu chảy.
Thông thường bệnh nhiễm trùng đường ruột phát triển trong vòng 2 đến 3 ngày
sau khi tiêu thụ thức ăn nhiễm bẩn và các triệu chứng sẽ tự hết trong vòng một tuần.
Liệu pháp dùng thuốc ít khi được sử dụng trừ khi diễn biến bệnh trở nên nghiêm trọng
hay đối với các bệnh nhân bị suy giảm miễn dịch. Bệnh có tỉ lệ tái phát cao, có thể lên
đến 20% bệnh nhân nhưng các triệu chứng bệnh thường nhẹ hơn so với lần đầu.
 Nhiễm trùng hệ thống

Campylobacter là những vi khuẩn xâm lấn, và có thể gây ra nhiễm trùng hệ
thống. Tuy vậy, tần số nhiễm trùng máu gây nên bởi Campylobacter vẫn còn rất thấp
(0,1%) đặc biệt là khi so sánh với Salmonella.
Tỉ lệ C. fetus gây nhiễm trùng hệ thống cao hơn là các loài Campylobacter chịu
nhiệt như C. jejuni và C. coli. Đây là loài Campylobacter hầu như chỉ phân lập được ở
các trường hợp nhiễm trùng hệ thống mà không thấy ở các trường hợp nhiễm trùng
ruột.
Biểu hiện của bệnh là sốt và có hiện tượng di căn một số mô như màng trong
mạch máu (gây phình mạch máu, viêm tĩnh mạch, viêm màng trong tim), xương, khớp
xương, màng não…Bệnh nhiễm trùng hệ thống nếu không được điều trị sẽ rất nguy
hiểm vì có tới 15% trường hợp dẫn đến tử vong.
 Những biểu hiện sau nhiễm trùng

Cũng như các vi khuẩn gây bệnh đường ruột khác, C. jejuni có thể gây ra những
biểu hiện sau nhiễm trùng hay còn gọi là di chứng. Mặc dù các di chứng hiếm xảy ra
sau khi nhiễm Campylobacter nhưng nó lại nghiêm trọng và có thể gây chết.
Di chứng quan trọng nhất là hội chứng Guillian – Barre (GBS), với tỷ lệ 1 trên
1000 – 3000 trường hợp nhiễm Campylobacter, chủ yếu là do C. jejuni (41%). Hội



9

chứng này là một bệnh lí viêm đa dây thần kinh cấp tính, khi sợi thần kinh bị mất bao
myelin, gây mất cảm giác, yếu cơ, và mất phản xạ dây chằng. GBS xảy ra khi hệ miễn
dịch của cơ thể tiết ra kháng thể tấn công bao myelin do nó có thành phần tương tự
như các kháng nguyên do Campylobacter tạo ra.
 Các yếu tố gây bệnh

Cơ chế gây bệnh của Campylobacter chưa được biết chính xác vì gặp những
khó khăn trong quá trình thao tác trên gen, thiếu mô hình động vật có thể mô phỏng
hiệu quả bệnh nhiễm trùng đường ruột ở người và sự hay thay đổi độc lực ở những
chủng khác nhau. Tuy nhiên vào năm 2000 sau khi bộ gen của C. jejuni NCTC 11168
được giải trình tự hoàn tất đã cho phép xác định một số yếu tố gây độc đường ruột giả
định ở Campylobacter như sau:
a) Tiêm mao

Tính di động cần thiết để vi khuẩn di chuyển qua lớp màng nhầy bao phủ các tế
bào đường ruột. Nhờ các tiêm mao phân cực và hình dáng xoắn lại đã cho phép
Campylobacter di động, thâm nhập một cách hiệu quả qua lớp rào cản màng nhầy này.
Vai trò của sự di động như là một yếu tố gây bệnh đã được chứng minh bằng những
đột biến không tiêm mao làm cho Campylobacter không thể khu trú được trong đường
ruột của các động vật thí nghiệm. Ngoài vai trò giúp cho Campylobacter di động, tiêm
mao còn là một kháng nguyên có tính sinh miễn dịch mạnh trong suốt quá trình gây
nhiễm và quá trình tạo ra các kháng thể chống lại tiêm mao có liên quan tới quá trình
bảo vệ cơ thể chống lại bệnh. Cấu trúc của tiêm mao có chứa cả những vùng bảo tồn
khá cao và những vùng hay thay đổi, ngoài ra còn được biến đổi glycosyl hóa sau dịch
mã. Việc sử dụng thành công một tiêm mao tái tổ hợp bao gồm những vùng bảo tồn
nhất như là một vắc xin chống lại Campylobacter trong hai mô hình chuột cho thấy
tầm quan trọng của tiêm mao trong cơ chế gây bệnh của C. jejuni.
b) Tính hóa hướng động


Tính hóa hướng động là khả năng nhận biết các thang nồng độ hóa chất và có
thể di chuyển qua thang nồng độ này. Cả tính di động và hóa hướng động đều cần thiết
cho sự khu trú của C. jejuni vì những đột biến mất tính hóa hướng động làm cho C.
jejuni không thể sống được trong đường ruột của các mô hình động vật.


10
c) Sự bám dính và xâm lấn

Một đặc điểm quan trọng trong cơ chế gây bệnh của C. jejuni là khả năng bám
và thâm nhập vào các tế bào chủ. Trong quá trình gây nhiễm, Campylobacter di
chuyển qua lớp màng nhầy bao phủ các tế bào biểu mô, bám chặt vào các tế bào này,
sau đó xâm lấn các tế bào biểu mô. Sự xâm lấn sẽ dẫn đến sự phá hủy lớp màng nhầy
và gây hiện tượng viêm mà thường được quan sát thấy ở các trường hợp nhiễm
Campylobacter. Nguyên nhân là do quá trình xâm lấn của C. jejuni cảm ứng rất nhiều
yếu tố kích hoạt quá trình viêm như cytokine interleukine 8. Tiêm mao lần nữa là yếu
tố đầu tiên của C. jejuni được xác định là liên quan đến sự bám dính và xâm lấn vì
những đột biến mất đi tiêm mao làm cho C. jejuni giảm tính di động đồng thời giảm
tính bám dính và mất khả năng xâm nhập. Một số yếu tố khác giúp cho
Campylobacter bám vào các tế bào biểu mô là protein gắn vào khoảng gian bào PEP,
protein nằm ở màng ngoài gắn vào fibronectin CadF và một số yếu tố khác.
d) Sản sinh độc tố

Sự sản sinh ra các độc tố góp phần vào quá trình gây bệnh của Campylobacter
bên trong các tế bào chủ. Mặc dầu có rất nhiều nghiên cứu cho rằng có sự sản sinh
hoặc cytotoxin hoặc độc tố đường ruột – enterotoxin hay cả hai ở Campylobacter
nhưng cơ chế hoạt động và vai trò gây bệnh của chúng vẫn chưa được rõ ràng. Cho
đến bây giờ chỉ có độc tố CDT (cytolethal distending toxin) là độc tố duy nhất của
Campylobacter được xác nhận vì trong trình tự bộ gen của C. jejuni NCTC 11168 chỉ

có chứa các gen gây độc là cdt. Độc tố CDT của C. jejuni được mã hóa bởi một operon
gồm 3 gen (cdtABC) và những thể đột biến cdt gồm 2 gen sẽ làm mất hoạt tính của
CDT. Độc tố CDT khiến cho phần lớn các loại tế bào trong cơ thể người trở nên sưng
phồng lên từ từ và cuối cùng dẫn đến tiêu hủy tế bào. Hầu hết các chủng C. jejuni đều
có hoạt tính CDT khá cao còn các chủng C. coli thường cho thấy hoạt tính độc tố này
khá thấp. Nguyên nhân của sự khác nhau này vẫn chưa được giải thích.
1.2.2. Chuẩn đoán và điều trị
1.2.2.1. Chuẩn đoán lâm sàng
Triệu chứng của sự nhiễm Campylobacter là tiêu chảy, đau bụng, sốt, đau đầu,
suy nhược. Tuy nhiên các triệu chứng này khó phân biệt với bệnh đường ruột do
những vi khuẩn khác như Salmonella, Shigella và E.coli 0157:H7.


11

1.2.2.2. Chuẩn đoán phòng thí nghiệm
Phương pháp nuôi cấy vi sinh truyền thống luôn là tiêu chuẩn vàng trong chẩn
đoán bệnh. C. jejuni và C. coli có thể được nuôi cấy từ mẫu phân còn các loài
Campylobacter khác gồm cả C. fetus có thể được nuôi cấy từ mẫu máu. Phân lập C.
jejuni và C. coli từ mẫu phân đòi hỏi môi trường chọn lọc có chứa kháng sinh (môi
trường mCCDA có chứa cefoperazone, amphotericin B), điều kiện vi hiếu khí và nhiệt
độ ủ là 42ºC. Kháng sinh sẽ ức chế các vi sinh vật khác có trong đường ruột. Nuôi cấy
ở 42ºC kìm hãm sự phát triển của một số loài Campylobacter spp. không chịu nhiệt.
Nếu muốn phát hiện các loài Campylobacter khác, các phòng thí nghiệm có thể sử
dụng kĩ thuật phân lập không chọn lọc như phương pháp lọc vì C. upsaliensis, C.
hyointestinalis và C. fetus nhạy với một số kháng sinh có trong môi trường chọn lọc và
nếu sử dụng môi trường không có kháng sinh thì các loài Campylobacter sẽ gặp sự
cạnh tranh với các vi sinh vật khác trong hệ đường ruột.
Các kỹ thuật nhanh và nhạy để phát hiện Campylobacter như phương pháp PCR
hay ELISA đang được phát triển.

1.2.2.3. Điều trị
Ở những bệnh nhân có hệ miễn dịch tốt thì bệnh nhiễm trùng đường ruột do
Campylobacter thường tự khỏi. Nếu bệnh chỉ biểu hiện những triệu chứng nhẹ đến
trung bình thì bệnh nhân không cần uống kháng sinh chỉ cần bù nước đặc biệt là đối
với trẻ em. Đối với những trường hợp bệnh nặng kéo dài, sốt dai dẳng, tiêu máu, tiêu
chảy trên 7 ngày hay những người bị suy giảm miễn dịch như những bệnh nhân bị
AIDS thì cần được chữa trị bằng kháng sinh.
Để điều trị bệnh tiêu chảy do Campylobacter bằng liệu pháp kháng sinh, theo
khuyến cáo của tổ chứa y tế thế giới WHO, họ kháng sinh macrolide (gồm
erythromycin, azithromycin) và fluoroquinolone là hai họ kháng sinh ưu tiên được lựa
chọn.
Erythromycin và azithromycin giúp rút ngắn thời gian bị bệnh, giảm bài tiết các
vi khuẩn và ngăn chặn tái phát khi được dùng vào giai đoạn đầu nhiễm bệnh.
Erythromycin giúp giảm thời gian nhiễm bệnh từ 16,8 thành 2 ngày và azithromycin
giúp loại bỏ sự bài tiết Campylobacter trong vòng 24 giờ. Fluoroquinolone như
ciprofloxacin cũng thường được sử dụng để điều trị nhiễm Campylobacter. Việc
dùng fluoroquinolone phổ biến để điều trị nhiễm Campylobacter là do triệu chứng


12

bệnh giống với triệu chứng của bệnh viêm dạ dày - ruột do các vi khuẩn khác như
Salmonella, Shigella. Những trường hợp bệnh viêm dạ dày-ruột nghiêm trọng,
fluoroquinolone được sử dụng ngay mà không cần chờ kết quả phân lập.
1.3. TÌNH HÌNH NHIỄM CAMPYLOBACTER SPP. TRÊN THẾ GIỚI VÀ
VIỆT NAM
1.3.1. Tình hình nhiễm Campylobacter trên thế giới
Ở cả các nước phát triển [10] và đang phát triển [6], Campylobacter đang là
một trong những tác nhân vi khuẩn phổ biến nhất gây tiêu chảy.
Ở các nước phát triển Campylobacter là nguyên nhân gây bệnh viêm dạ dàyruột (Campylobacteriosis) nhưng thường ít gây nên các trận dịch lớn. Trẻ em dưới 1

tuổi và người trưởng thành từ 20-29 tuổi là hai nhóm tuổi chiếm tỉ lệ nhiễm
Campylobacter cao nhất ở những nước phát triển. Các trận dịch tiêu chảy do
Campylobacter thường xảy ra vào mùa hè và mùa thu ở những nước này. Hằng năm số
trường hợp nhiễm Campylobacter có khuynh huớng giảm ở những quốc gia có cải
thiện trong các qui trình công nghiệp chế biến thịt gia cầm.
Ở Mỹ tỉ lệ mắc bệnh ước tính là 880 khai báo/100.000 dân, đại diện cho 2,4
tỉtrường hợp nhiễm Campylobacter xảy ra mỗi năm [8]. Tuy nhiên từ năm 1996-2004,
theo CDC thì các trường hợp nhiễm Campylobacter có khuynh hướng giảm xuống
(giảm 28%). Và từ năm 2005-2008 thì tỉ lệ nhiễm Campylobacter ước tính là không
thay đổi đáng kể.
Ở các nước thuộc liên minh Châu Âu (gồm 25 thành viên), có 183.961 trường
hợp nhiễm Campylobacter được báo cáo vào năm 2004 với tỉ lệ nhiễm là 47,6/100.000
dân. Và đến năm 2007 thì có tới 200.507 trường hợp được báo cáo với tỉ lệ nhiễm là
45/100.000 dân. Tỉ lệ nhiễm này thay đổi theo độ tuổi, trẻ em dưới 5 tuổi thì nhạy
cảm cao với bệnh Campylobacteriosis (120 trường hợp/100.000 người) trong khi các
độ tuổi khác thì thay đổi giữa 32 và 53 trường hợp trên 100.000 người. Hầu hết các
nước thành viên đều được báo cáo là tăng tỉ lệ nhiễm Campylobacter vào năm 2007,
đặc biệt là nước Đức tăng 56% [11].
Ở các nước nhiệt đới đang phát triển, bệnh do Campylobacter không phải là vấn
đề nghiêm trọng ở người lớn nhưng lại là bệnh dịch của trẻ em, đặc biệt là trẻ nhỏ hơn
hai tuổi. Tuy nhiên, tình trạng nhiễm Campylobacter không triệu chứng bệnh xảy ra
phổ biến ở cả người lớn và trẻ em [5], [6]. Bệnh viêm dạ dày-ruột do Campylobacter


13

ở các nước đang phát triển không xảy ra theo mùa, tỉ lệ nhiễm Campylobacter không
có sự khác biệt đáng kể giữa các mùa trong năm.
Nói chung ở các nước đang phát triển vì không có các chương trình điều tra
quốc gia về Campylobacteriosis nên không có các số liệu về tỉ lệ nhiễm bệnh ở dạng

số trường hợp trên toàn bộ dân số. Tuy nhiên nhờ có các chương trình điều tra quốc
gia ở các nước phát triển đã tạo điều kiện cho các nước đang phát triển có thể kiểm
soát được các trường hợp bệnh xảy ra rải rác cũng như các trận dịch bệnh
Campylobacteriosis ở người. Tỉ lệ phân lập Campylobacter ở các nước đang phát triển
là từ 5 đến 20% (bảng 1.1). Mặc dù thiếu các dữ liệu về tỉ lệ nhiễm bệnh từ các cuộc
điều tra trong nước nhưng những nghiên cứu bệnh-chứng dựa trên cộng đồng ở các
nước đang phát triển đã ước tính tỉ lệ nhiễm Campylobacter ở trẻ em dưới 5 tuổi là từ
40.000 đến 60.000 khai báo/100.000 dân.
Bảng 1.2 Tỉ lệ phân lập Campylobacter ở các nước đang phát triển từ những
nghiên cứu về bệnh tiêu chảy ở trẻ em dưới 5 tuổi [9].
Quốc gia
Tỉ lệ phân lập (%)
Châu phi
Algeria
17,7
Cameroon
7,7
Ethiopia
13,8
Nigeria
16,5
Tanzania
18
Zimbabwe
9,3
Châu Mỹ
Brazil
9,9
Guatemala
12,1

Phía đông Địa Trung Hải
Ai cập
9,0
Jordan
5,5
Nam Á
Bangladesh
17,4
Đông Nam Á
Thái Lan
13,0
Lào
12,1
1.3.2. Tình hình nhiễm Campylobacter ở Việt Nam
Vào năm 1996 – 1999, nghiên cứu về Campylobacteriosis ở Việt Nam của DW
Isenbarger cho thấy Campylobacter là một trong những nguyên nhân chính gây tiêu
chảy, đặc biệt là ở trẻ em dưới 5 tuổi. Những trẻ lớn hơn 5 tuổi nhiễm Campylobacter


14

có thể bị tiêu chảy nhưng cũng có thể mang trùng mà không có triệu chứng gì, việc
này rất hiếm gặp ở những nước phương tây.
Theo một nghiên cứu của Viện nghiên cứu thú y quốc gia và Viện vệ dinh dịch
tể trung ương về tình hình nhiễm Campylobacter spp. trên thịt gà ở Hà Nội từ năm
2003-2005, trong 100 mẫu ức gà được thu nhận từ 5 chợ lẻ ở Hà Nội thì có 31 mẫu
(31%) dương tính với Campylobacter. Trong đó Campylobacter jejuni (C. jejuni)
được phân lập thường xuyên nhất chiếm 45,2% và tiếp đến là Campylobacter coli (C.
coli) chiếm 25,8%.
Vào khoảng thời gian từ năm 2003-2004, kết quả nghiên cứu của Hà Thị Thanh

Đào và Phạm Thanh Yến [7] về tình hình nhiễm khuẩn đường ruột trong các thực
phẩm thô ở căn tin của các trường học, bệnh viện ở Hà Nội cho thấy có khoảng 28,3%
thịt gà chứa C. jejuni.
Theo Tài liệu hướng dẫn xử trí tiêu chảy ở trẻ em ban hành ngày 28/10/2009
của bộ y tế, trong số các tác nhân gây tiêu chảy ở Việt Nam từ năm 2000-2004 thì vi
khuẩn Campylobacter chiếm tỉ lệ 4%. Theo kết quả nghiên cứu chưa công bố của Đơn
Vị Nghiên Cứu Lâm Sàng Đại Học Oxford (OUCRU) từ năm 2009 - 2010,
Campylobacter đang là một trong những tác nhân vi khuẩn chính gây tiêu chảy ở trẻ
em dưới 5 tuổi ở thành phố Hồ Chí Minh (bảng 1.2).
Bảng 1.3 Các tác nhân vi khuẩn gây tiêu chảy ở trẻ em dưới 5 tuổi phân
lập tại tp Hồ Chí Minh từ năm 2009 – 2010 (n =1420)
Các tác nhân vi khuẩn gây
tiêu chảy
Campylobacter
Shigella
Salmonella
Các vi khuẩn đường ruột khác
Tổng cộng

Số trường hợp

Phần trăm(%)

64
64
77
16
363

17,63

17,63
21,21
4,41
25,56

Chú thích: Kết quả trong bảng chưa tính tới tác nhân gây bệnh là E. coli
Tuy nhiên, cho đến nay vì có rất ít những nghiên cứu về Campylobacter ở Việt
Nam cho nên những thông tin về tình hình nhiễm vi khuẩn Campylobacter ở
Việt Nam còn rất sơ sài, thiếu dữ liệu.


15

1.4. CÁC NGUỒN CHỨA VÀ CÁC CON ĐƯỜNG LAN TRUYỀN
CAMPYLOBACTER
1.4.1. Con người
Campylobacter không phải là một trong những vi sinh vật thường được tìm thấy
trong ruột người. Tỉ lệ lây truyền giữa người và người thường thấp.
Tuy nhiên, những trẻ sơ sinh được sinh ra từ những bà mẹ mà đang bài tiết
Campylobacter có nguy cơ nhiễm bệnh đường ruột kết hợp với tiêu chảy ra máu
nhưng bệnh này thường tự giới hạn.
1.4.2. Động vật
Campylobacter spp. thường được tìm thấy trong bao tử và ruột của các động
vật, các loài chim hoang dã và nuôi trong nhà.
 Gia cầm: Hầu hết các gia cầm nuôi công nghiệp đều có Campylobacter trong hệ

đường ruột. Nhiệt độ cơ thể cao 42ºC của các loài chim có thể giải thích cho việc nhiệt
độ phát triển tối ưu của Campylobacter jejuni (C. jejuni) cũng cao.
 Gia súc: Campylobacter spp. tồn tại phổ biến trong phân của gia súc, với tỉ lệ phân lập
từ 5-100%. C. jejuni thường được cho là nguồn gây sảy thai cho gia súc ở miền tây

Canada. Những nghiên cứu ở Mỹ và Phần Lan cho thấy rằng có hơn một nửa số lượng
heo nuôi công nghiệp bài tiết Campylobacter. Ngoài ra Campylobacter cũng là một
tác nhân quan trọng gây nên bệnh dịch ở cừu. Trong một bài báo gần đây xuất bản
năm 2004 bởi Zweifel, từ 653 cừu bị mổ thịt, đã phân lập được 114 chủng
Campylobacter trong đó có 64% là C. jejuni.
 Các thú cưng: Các thú cưng trong nhà cũng là một yếu tố nguy cơ của bệnh
Campylobacteriosis trong các nghiên cứu về kiểm soát bệnh.
 Côn trùng: Ruồi và các côn trùng khác cũng là những sinh vật truyền bệnh
Campylobacteriosis.
Sự lây truyền trực tiếp từ động vật sang người chỉ chiếm một tỉ lệ rất nhỏ trong
các trường hợp nhiễm vi khuẩn ở người, thường xảy ra ở trẻ em tiếp xúc gần với chó
con hay mèo con đang bị tiêu chảy.
1.4.3. Thực phẩm
Có nhiều yếu tố nguy cơ của sự lây truyền Campylobacter đã được xác định có
liên quan đến các thực phẩm thô, thực phẩm nhiễm bẩn bao gồm sữa chưa được tiệt
trùng, thịt gia cầm, thịt heo, thịt bò thô và nước chưa được xử lý đúng cách. Trong đó,
thịt gà hay các sản phẩm thịt gà chưa nấu chín được tin là nguồn chứa Campylobacter
quan trọng gây nên hầu hết các trường hợp bệnh rải rác ở người do Campylobacter.
Các điều tra về dịch tễ học đã chứng minh được là có một mối tương quan quan trọng


16

giữa việc tiếp xúc và tiêu thụ thịt gà với các trường hợp bệnh đường ruột do
Campylobacter.
Tuy nhiên các trận dịch lớn do Campylobacter thường là do sữa không tiệt trùng
và nước chưa được xử lý.
1.4.4. Các nguồn khác
Bao gồm các yếu tố thuộc môi trường:
•

•

Nguồn nước tự nhiên bị nhiễm bẩn
Đất
Bên cạnh những nguồn chứa và các con đường lan truyền nêu ở trên, bệnh
Campylobacteriosis cũng có thể phát tán qua con đường du lịch. Do đó du lịch đến các
nước đang phát triển và sinh sống ở các nước mà Campylobacter phổ biến là một
trong các yếu tố nguy cơ gây nên bệnh tiêu chảy do Campylobacter.

Hình 1.2. Các nguồn chứa và các con đường lan truyền Campylobacter
quan trọng
CHƯƠNG II: ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG
VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU, ĐỊA ĐIỂM
- Đối tượng: vi khuẩn Campylobacter spp.
- Vật liệu:
+ Các mẫu thịt gà được thu thập tại các chợ trên địa bàn Hải Phòng:


17
•

Mẫu thịt gà lấy ở chợ Lạc Viên, quận Ngô Quyền, Hải Phòng: tại đây mẫu chủ yếu lấy

trên phần đùi, vào lúc sáng sớm.
• Mẫu thịt gà lấy ở chợ Ngô Quyền, quận Ngô Quyền, Hải Phòng: tại đây mẫu chủ yếu
lấy trên phần lườn gà, và cũng vào lúc sáng sớm.
+ Trong phòng thí nghiệm: tại đây các mẫu được lấy trực tiếp trong phòng thí
nghiệm ở chợ Đôn, quận Lê Chân và chợ Đầm Triều, quận Kiến An trong thành phố
Hải Phòng gửi đến. Mẫu được lưu lại và làm đông lạnh.

+ Tại siêu thị BigC: lấy mẫu bằng cách rửa thân thịt trên các phần đùi, lườn,
cánh và trên toàn thân tại quầy bán gà vào buổi trưa.
- Địa điểm nghiên cứu: Trung tâm chất lượng nông lâm thủy sản vùng I số 51
Lê Lai, Ngô Quyền, Hải Phòng
2.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
2.2.1. Nuôi cấy phân lập Campylobacter spp. trong các mẫu
thịt gà
2.2.2. Nhận dạng Campylobacter spp. bằng môi trường nuôi
cấy chọn lọc
2.2.3. Đánh giá sự phát triển Campylobacter spp.
2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3.1. Quy trình phân tích
Quy trình phân tích được áp dụng theo TCVN 7715-3 : 2013 (ISO/TS 10272-3 :
2010)


18

Bước 1: Cân 25g mẫu

Bước 2: Bổ sung dung dịch tăng sinh Bolton Broth. Dập mẫu trong 30 giây.

•

37 ± 1ºC, 4 - 6h, vi hiếu khí

•

41,5ºC, 44 ± 4h


Bước 3: mCCD Agar

•

41,5ºC, 44 ± 4h, vi hiếu khí

Bước 4: Columbia Blood Agar

•

41,5ºC, 24 - 48h, vi hiếu khí

Bước 5: Kiểm tra sinh hóa

•
•
•
•
•

Di động (+)
Phát triển ở 25ºC, vi hiếu khí
Phát triển ở 41,5ºC, hiếu khí (-)
Oxidase (+)
Catalase


19

2.3.2. Phương pháp thu mẫu

 Chuẩn bị hóa chất: dung dịch tăng sinh Bolton Broth

Bảng 2.1 Thành phần môi trường tăng sinh Bolton Broth
Meat Peptone
Lactoalbumine Hydrolized
Yeast Extract
Sodium Chloride
Alpha-cetoglutaric Acid
Sodium Carbonate
Sodium Piruvate
Sodium Metabisulfite
Haemin

10g
5g
5g
5g
1g
0,6g
0,5g
0,5g
0,01g

Trước khi tiến hành thu mẫu, cần chuẩn bị dung dịch tăng sinh Bolton Broth
bằng cách: Hòa tan 13,8g môi trường hoàn chỉnh khô (môi trường đã được tổng hợp)
vào trong 500ml nước cất rồi đem đi hấp khử trùng ở 121ºC trong 15 phút. Sau đó làm
nguội trong bể ổn nhiệt ở 45-50ºC. Sau khi dung dịch nguội, bổ sung thêm 1 lọ Bolton
Broth Supplement.
Cách pha Bolton Broth Supplement: thêm 5ml cồn vào lọ Bolton Broth
Supplement. Lắc tan bằng máy Vortex. Bổ sung lọ Supplement vào dung dịch tăng

sinh sau đó lắc đều bằng máy khuấy từ. Cuối cùng thêm vào 25ml máu cừu.
Chuẩn pH: 7,4 ± 0,2 ở 25ºC. Bảo quản trong ngăn mát tủ lạnh nếu chưa sử
dụng.
 Tiến hành thu mẫu:

Mẫu được tiến hành thu theo TCVN 6507-2:2005 Phần 2: các nguyên tắc cụ thể
để chuẩn bị các mẫu thịt và mẫu sản phẩm thịt.
Tiến hành thu thập mẫu thịt gà ngẫu nhiên tại một số chợ ở Hải Phòng, tại siêu
thị BigC và các mẫu sẵn có tại phòng thí nghiệm. Lấy mẫu tại các vị trí khác nhau trên
gà: thân, cánh, đùi, chân, lấy phần da và phần thịt.
Lưu ý: Vì Campylobacter spp. rất nhậy với nhiệt độ đông lạnh nhưng lại tồn tại
rất tốt ở nhiệt độ thấp, nên các mẫu thử cần được bảo quản ở +3ºC ± 2ºC và nên phân
tích càng nhanh càng tốt. Chú ý để không làm mẫu khô.


20

Tiến hành chuẩn bị mẫu xác định vi sinh vật:
+ Đối với mẫu lấy trực tiếp: cân 25g mẫu bằng cách lấy panh và kéo đã được
hấp khử trùng cho vào túi PE (polyetylen). Sau đó đổ 225ml dung dịch tăng sinh
Bolton Broth vào túi mẫu PE. Cho túi mẫu vào máy dập mẫu dập trong 30 giây.
+ Đối với cách lấy mẫu rửa thân thịt, ta cho phần bông đã được hấp khử trùng
vào 25ml nước muối sinh lí, dùng banh, kéo được sấy khử trùng lấy phần bông đã
được ngấm nước lau phết thật mạnh trên bề mặt của da gà tại các phần cần lấy. Lưu ý:
lau mẫu lặp đi lặp lại nhiều lần. Sau khi lau xong thì đưa phần bông vừa lau trở lại ống
falcon có chứa 25ml dung dịch nước muối sinh lí để chuyển về phòng thí nghiệm
chuẩn bị pha mẫu.
2.3.3. Phương pháp nuôi cấy
2.3.3.1. Tăng sinh
Sau khi xử lí mẫu xong, đem mẫu chứa môi trường tăng sinh đi ủ trong môi

trường vi hiếu khí ở 37ºC trong khoảng từ 4-6h, sau đó đem đi ủ tiếp ở 41,5ºC trong
khoảng 44 ± 4h.
2.3.3.2. Phân lập mẫu trên môi trường chọn lọc
 Chuẩn bị môi trường chọn lọc: môi trường thạch mCCD

Bảng 2.2 Thành phần môi trường thạch mCCD
Peptones
Casein hydrolysate
Activated charcoal
Sodium chloride
Sodium deoxycholate
Sodium pyruvate
Ferrous sulfate
Agar

20g
3g
4g
5g
1g
0,25g
0,25g
12g

Cách pha: Hòa tan 45,5g môi trường hoàn chỉnh khô trong 1 lít nước cất. Đem
hấp khử trùng ở 121ºC trong 15 phút. Làm nguội trong bể ổn nhiệt ở 45-50ºC. Sau đó,
thêm vào môi trường 2 lọ chất bổ sung CCDA.
Cách pha lọ bổ sung CCDA: thêm 5-10ml nước cất đã được hấp thanh trùng vào
lọ. Lắc tan bằng máy Vortex. Sau khi thêm chất bổ sung, lắc đều bằng máy khuấy từ



21

rồi đổ môi trường thạch sang các đĩa đã được khử trùng. Lưu ý: đổ nhanh tay, tránh
làm đông môi trường.
pH: 7,4 ± 0,2 ở 25ºC
 Tiến hành:

Bước này nhằm tách và nhận dạng Campylobacter spp. khỏi các quẩn thể vi
sinh vật khác trong mẫu.
Mẫu sau khi ủ, sử dụng que cấy vòng vô trùng cấy một vòng dịch cấy thu được
trong môi trường tăng sinh lên bề mặt đĩa thạch mCCD môi trường phân lập chọn lọc.
Lật ngược các đĩa ủ ở 41,5ºC trong môi trường vi hiếu khí.
2.3.4. Phương pháp phát hiện
2.3.4.1. Nhuộm Gram
- Nhỏ lên lam kính sạch 1 giọt nước muối sinh lý, lấy 1-3 khuẩn lạc dàn đều
trên lam kính và kéo một ít nước muối sinh lý vào để tránh làm loãng mẫu nhuộm
- Để khô tự nhiên. Cố định tiêu bản trên phiến kính bằng cách hơ cao trên ngọn
lửa đèn cồn, kiểm tra độ nóng (nhẹ vừa phải trên mu bàn tay). Chú ý: nóng quá, hoặc
hơ lâu, vi khuẩn sẽ biến dạng.
- Đổ thuốc nhuộm tím kết tinh lên tiêu bản, để 1 phút, rửa nước.
- Đổ dung dịch lugol lên tiêu bản, để 1 phút, hất bỏ đi.
- Tẩy màu bằng cồn 90º cho tới khi không còn màu tím kết tinh.
- Rửa qua nước.
- Đổ thuốc nhuộm Safranin lên tiêu bản, để 30s.
- Rửa qua nước.
- Thấm giấy hoặc để khô ở không khí.
- Quan sát dưới kính hiển vi ở vật kính 100 có nhỏ dầu soi.
Đọc kết quả: Vi khuẩn Gram dương bắt màu tím (do màu tím kết tinh) còn vi
khuẩn Gram âm có màu đỏ hồng (đỏ Safranin).



22

2.3.4.2. Khẳng định Campylobacter spp.
 Chuẩn bị môi trường phân lập khuẩn lạc: môi trường thạch huyết Columbia

Bảng 2.3 Thành phần môi trường thạch huyết Columbia
Peptone from casein
10g
Peptone from meat
5g
Heart extract
3g
Extract from yeast
5g
Starch
1g
Sodium chloride
5g
Agar
13g
Hòa tan 42g môi trường hoàn chỉnh khô trong 1 lít nước cất. Đem hấp khử trùng
ở 121ºC trong 15 phút. Làm nguội trong bể ổn nhiệt ở 45-50ºC. Sau đó bổ sung 50ml
máu cừu. Lắc đều bằng máy khuấy từ rồi đổ ra đĩa đã khử trùng.
Lưu ý: đổ nhanh tránh cho thạch bị đông, nhưng cần nhẹ nhàng để tránh tạo bọt
trên bề mặt thạch.
Để khẳng định, từ mỗi đĩa của mỗi môi trường chọn lọc lấy ít nhất một khuẩn
lạc được coi là Campylobacter spp. điển hình hoặc nghi ngờ, cấy ria từng khuẩn lạc đã
chọn lên đĩa thạch huyết Columbia để cho phát triển các khuẩn lạc phân lập tốt. Ủ các

đĩa trong môi trường vi hiếu khí ở 41,5ºC trong 24h đến 48h. Sử dụng các khuẩn lạc
thuần khiết để kiểm tra hình thái, tính di động và khả năng phát triển trong điều kiện vi
hiếu khí ở 25ºC, mọc trong điều kiện hiếu khí ở 41,5ºC và sự có mặt của oxidase.
2.3.4.3. Thử nghiệm oxidase
Dùng vòng cấy hoặc que cấy bằng platin/iridi, que cấy bằng chất dẻo hoặc đũa
thủy tinh, lấy một phần của mỗi khuẩn lạc được tách biệt rõ từ mỗi đĩa và ria cấy lên
giấy lọc đã được làm ẩm bằng thuốc thử oxidase; viền ngoài có màu tím hoa cà, màu
tím hoặc màu xanh đậm trong 10s chứng tỏ phản ứng dương tính.
2.3.4.4. Thử nghiệm catalase
Nhỏ một giọt H2O2 3% vào lam kính, dùng que cấy lấy khuẩn lạc thuần đặt vào
giữa giọt H2O2, nếu thấy sủi bọt là phản ứng dương tính.
2.3.4.5. Đánh giá sự phát triển của vi khuẩn Campylobacter spp. ở các điều
kiện nuôi cấy khác nhau.
 Môi trường nuôi cấy là môi trường thạch huyết Columbia (mục 2.3.4.2)
 Cách tiến hành:


23

Sử dụng vòng cấy lấy các khuẩn lạc đã phân lập, cấy lên bề mặt đĩa thạch huyết
Columbia.
Ủ các đĩa ở các điều kiện nuôi cấy khác nhau cùng khoảng thời gian là 44 ± 4h.
Kiểm tra các đĩa về sự phát triển có thể nhìn thấy được của khuẩn lạc
Campylobacter spp.
 Các điều kiện nuôi cấy:

+ Nuôi cấy ở điều kiện 25ºC trong môi trường vi hiếu khí
+Nuôi cấy ở điều kiện 41,5ºC trong môi trường hiếu khí
Ở đây với mẫu lấy ở các địa điểm khác nhau đều tiến hành đánh giá sự phát
triển của vi khuẩn Campylobacter spp. ở các điều kiện nuôi cấy 25ºC trong môi trường

vi hiếu khí và 41,5ºC trong môi trường hiếu khí.


24

CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. KẾT QUẢ PHÂN LẬP TRÊN MÔI TRƯỜNG CHỌN LỌC
Các mẫu sau khi thu thập được phải tiến hành nuôi cấy tăng sinh trên môi
trường Bolton Broth trong điều kiện vi hiếu khí 37 0C trong 4-6 giờ đầu, tiếp tục nuôi
trong điều kiện 41,50C trong vòng 44 ± 4h. Sau khoảng thời gian kéo dài 44- 50h tiến
hành cấy mẫu đã tăng sinh sang môi trường chọn lọc mCCD. mCCD là môi trường
chọn giúp tách và nhận dạng Campylobacter spp. khỏi các quẩn thể vi sinh vật khác
trong mẫu khá cao.
Thực hiện thao tác cấy ria, đường cấy càng dày càng thể hiện rõ khuẩn lạc rời.
Nuôi trong điều kiện vi hiếu khí, với thời gian nuôi 44 ± 4h ta có kết quả thu được thể
hiện ở các đĩa nuôi cấy chọn lọc.

A

B
Hình 3.1: Khuẩn lạc có trong mẫu lấy tại chợ
(A) trên da gà, (B) da và thịt của gà


25

B

A


Hình 3.2: Khuẩn lạc có trong mẫu tại phòng thí nghiệm
(A) thịt ở lườn gà, (B) da ở đùi gà

A

C

B

D

E