phương pháp cơ bản trong công nghệ sinh học
( điện di GEL , PCR, AFLP, RFLP )

−
−

−

−

+

+

Câu 1 trình bày hiểu biết về kĩ thuật điện di trên gel agarose.
 Nguyên tắc của điện di trên gel agarose:
Kĩ thuật điện di trên gel agarose hoạt động nhờ vào lực kéo của điện trường
tác động vào các phân tử tích điện và kích thước lỗ của thể nền (gel).
Gel cấu tạo bởi các chuỗi cao phân tử (polymer mạch thẳng không bị
sulphate hóa chứa hai gốc xen kẽ nhau là D-galactose và 3,6-anhydro-Lgalactose. ) được liên kết chéo với nhau tạo thành một hệ thống mạng lưới
với kích thước các mắc lưới tùy thuộc vào nồng độ chất cao phân tử và phản
ứng tạo liên kết chéo.
Các phân tử được phân tách khi di chuyển trong gel với vận tốc khác nhau
nhờ vào sự khác nhau của lực của điện trường tác động lên chúng (nếu các
phân tử tích điện khác nhau),kích thước của phân tử so với kích thước lỗ của
gel và hình dạng, độ cồng kềnh của phân tử.
Vị trí của DNA trong gel được xác định trực tiếp : các băng DNA trong gel
được nhuộm ở nồng độ thấp của thuốc nhuộm huỳnh quang ethidium
bromide (EtBr) và có thể phát hiện dưới ánh sáng tử ngoại.
 Các yếu tố ảnh hưởng
− Kích thước của phân tử

Các phân tử DNA có kích thước càng lớn (khối lượng phân tử lớn) thì tốc độ
dịch chuyển càng chậm. Các phân tử DNA mạch thẳng sợi đôi đi qua bản gel
ở các tốc độ tỷ lệ nghịch với hàm log10 của khối lượng phân tử của chúng.
− Nồng độ agarose
Đoạn DNA mang kích thước khác nhau di ̣ ch chuyển ở các tốc độ khác nhau
qua các bản gel chứa các nồng độ agarose khác nhau.


Cấu hình của DNA
Các DNA dạng vòng đóng, vòng đứt và mạch thẳng có cùng một kh ối lượng
phân tử sẽ dich chuyển trên agarose gel ở các tốc độ khác nhau. DNA của các
plasmid mạch vòng dịch chuyển nhanh hơn DNA của plasmid cùng loại
nhưng có dạng mạch thẳng.
 Thiết bị điện di và hóa chất điện di.
Thiết bị điện di agarose gel gồm 3 bộ phận cơ bản: nắp, khay vận hành và
buồng điện di.
Nắp: trên nắp có đầu ra của dây cáp điện nối điện cực trên buồng điện di với
nguồn điện.
Khay vận hành bao gồm: khay đổ gel, khuôn đổ gel, lược.
Buồng điện di: là nơi đặt gel trong quá trình điện di. Buồng có rãnh để cài
lược, hai điện cực tạo ra điện trường trong dung dịch.
− Hóa chất điện di
Đệm pH: đệm điện di DNA thích hợp là Tris-acetate-EDTA (TAE).Đệm giúp
thiết lập một giá trị pH, cung cấp các ion để hỗ trợ cho độ dẫn.
+ Thuốc nhuộm huỳnh quang EtBr: quan sát DNA trong agarose gel
thuận lợi.
 Quy trình điện di
Chuẩn bị dung dịch đệm và bản gel
Dung dịch đệm thường dùng là TBE
−


+

−
+
+
+

+

−
+


+

+
−
−
−

−
−
−

−
−

−
−


Bản gel được chuẩn bị bằng dung dịch đệm 1x TBE hòa tan với hàm lượng
agarose cần thiết đặt trong lò vi sóng đến khi tan hoàn toàn, đổ vào khuôn có
các lược cài sẵn để tạo bản gel với số giếng nạp mẫu cần thiết.
Khi bản gel đã đông cứng, đặt bản gel vào buồng điện di, đổ dung dịch đệm
ngập bản gel khoảng 1-2 mm.
Nạp mẫu: Mẫu được trộn đều với đệm và thuốc nhuộm và được tra vào từng
giếng.
Chạy điện di: sử dụng nguồn điện thế 100V, cường độ 100mmA, thời gian
chạy điện di khoảng 40’.
Nhuộm bản gel và soi gel: kết thúc điện di bản gel được lấy ra nhuộm và được
đặt vào máy soi UV để quan sát kết quả điện di.
 Ứng dụng của điện di agarose gel
Ước lượng kích thước của các phân tử DNA sau khi thực hiện phản ứng cắt
hạn chế (ví dụ: lập bản đồ hạn chế của DNA được tạo dòng…).
Phân tích các sản phẩm PCR (ví dụ: trong chẩn đoán di truyền phân tử hoặc
in dấu di truyền…).
Phân tách DNA hệ gen đã được cắt hạn chế trước khi thẩm tích Southern,
hoặc RNA trước khi thẩm tích Northern.
 Ưu điểm và nhược điểm
Ưu điểm của phương pháp này là gel được rót dễ dàng, không gây biến tính
mẫu và bền vững vật lý hơn polyacrylamide. Mẫu cũng dễ thu hồi.
Nhược điểm là agarose gel có thể bị nóng chảy trong quá trình điện di, đệm
có thể bị tiêu hao, và các dạng khác nhau của nucleic acid có thể chạy không
ổn định.

Câu 2 trình bày hiểu biết về kĩ thuật điện di.
Nguyên tắc của kĩ thuật điện di:
Điện di là hiện tượng dịch chuyển của các phân tử tích điện dưới tác động
của điện trường, hay nói cách khác là kỹ thuật phân chia các phân tử DNA,

RNA, protein dựa trên các đặc điểm vật lý như khối lượng hay điện tích thực
của chúng.


−

−

−
+
+
+

+

+
+
+
+
+

Khi các phân tử tích điện được đặt trong một điện trường, chúng sẽ dịch
chuyển về các cực (+) hoặc (-) tùy theo điện tích của chúng. Protein có điện
tích thực hoặc dương hoặc âm, còn các nucleic acid có một điện tích âm
không đổi nhờ khung phosphate của mình và vì thế chỉ dịch chuyển hướng
đến cực dương.
Các phân tử protein và nucleic acid có thể được chạy điện di trên một khuôn
đỡ (support matrix) như giấy, cellulose acetate, gel tinh bột, agarose hoặc
polyacrylamide gel. Thông thường, gel là một khuôn đúc dạng phiến mỏng có
cácgiếng để nạp (loading) mẫu. Gel được ngâm trong đệm điện di cung cấp

các ion để dẫn truyền dòng điệnvà một vài loại đệm để duy trì pH ở một giá
trị không đổi tương đối.
 Thiết bị điện di.
Thiết bị điện di gồm 3 bộ phận cơ bản: nắp, khay vận hành và buồng điện di.
Nắp: trên nắp có đầu ra của dây cáp điện nối điện cực trên buồng điện di với
nguồn điện.
Khay vận hành bao gồm: khay đổ gel, khuôn đổ gel, lược.
Buồng điện di: là nơi đặt gel trong quá trình điện di. Buồng có rãnh để cài
lược, hai điện cực tạo ra điện trường trong dung dịch.
− Các thông số điện di:
+ Lực dẫn cơ bản của điện di là hiệu điện thế của hệ thống.
+ Vận tốc của phân tử tỉ lệ thuận với gradient hiệu điện thế xung quanh.
 Các yếu tố quan trọng trong quá trình điện di
− Đệm và pH:
Protein là các chất lưỡng tính, do vậy có thể tích điện âm hoặc dương, vì
chúng có chứa cả hai loại gốc acid và base. Điện tích thực của protein được
xác định bằng pH của môi trường xung quanh, số lạo a.a mang nhóm
carboxyl và amine..
Axit nucleic không phải lưỡng tính, do vậy có thể tích điện âm ở đa số dệm
điện di
pH cần giữ ổn định để duy trì điện tích.
− Tác động của nhiệt lên quá trình phân tách
Sự điều khiển nhiệt là then chốt trong mỗi bước của điện di
Nhiệt độ cao có thể gây ra nhiều vấn đề: nhiệt quá cao sẽ khiến gel agarose bị
nóng chảy, hư hại thiết bị điện di.
Các protein có thể bị biến tính và bất hoạt.
 Các loại gel thông dụng trong quá trình điện di
− Gel agarose



+

+
+

Là dẫn xuất polysacharide từ agar có độ tinh khiết cao, thường được cung
cấp dưới dạng bột khô, trạng thái lỏng ở nhiệt độ cao, tạo gel ở nhieeetj độ
khoảng 40oC.
Nông độ càng cao, mạng lưới càng nhỏ, thông thường nồng độ thích hợp cho
sử dụng là từ 0.4% đến 4%.
Ưng dụng để tách và phân tích ADN, sử dụng EtBr và tia UV để phát hiện các
băng DNA.

+

Gel polyacrylamide
Điện di trên gel polyyacrymide có SDS: tách protein dựa trên KLPT
Khi tách bằng sds, sự di động được xác định không phải do điện tích của
chuỗi polypeptide mà so khối lượng phân tử
SDS là một chất tẩy anion gây biến tính protein.



Các bước cơ bản

−

+
+



−
−
−
−
−
−
−
−

−

−

−

−

−
−
−
−

B1: xác định được chất phân tích, loại, khối lượng phân tử.
B2: xác định gel
B3: pha loãng dung dịch gel có nồng độ ( C%) xác định cần thiết cho việc điện
di.
B4: đun nóng chảy gel, đổ gel vào khuôn, chờ gel đông
B5:đặt gel vào bể điện di có dung dịch đệm, rút lược.
B6: tra mẫuvào giếng.

B7: khởi động thiết bị điện di
B8: lấy bản gel từ bể điện di ra ngâm thuốc nhuộm bắt màu huỳnh quang, cho
len máy soi UV có kết nối máy tính và phân tích kết quả.
 ứng dụng của điện di
Phương pháp điện di cho khả năng phân tách nhanh và chính xác, giúp nhận
biết, phân tích và tinh sạch DNA, phân tách protein. Nhờ phương pháp này
mà người ta ứng dụng để phân tích giải trình tự DNA, ứng dụng trong các
nghiên cứu về DNA rất hiệu quả
 Hạn chế:
Nhiệt độ cao có thể gây ra nhiều vấn đề: nhiệt quá cao sẽ khiến gel agarose bị
nóng chảy, hư hại thiết bị điện di.Các protein có thể bị biến tính và bất hoạt.
Nhưng hiện nay được khắc phục bằng cách dùng sự hỗ trợ của các thiết bị
làm lạnh và hóa chất điều nhiệt,
Câu 3 trình bày hiểu biết về kĩ thuật PCR
 Nguyên lí cơ bản:
Đặc điểm tự nhiên của DNA: là một phân tử acid nucleic mang thông tin di
truyền mã hóa cho hoạt động sinh trưởng và phát triển của các vật chất hữu
cơ. Đặc biệt DNA có khả năng tự nhân đôi, sau khi nhân đôi 2 phân tử ADN
mới (mỗi phân tử chứa một chuỗi cũ và một chuỗi mới) đều giống hệt trình
tự nhau.
Sự phân tách sản phẩm PCR khi điện di: sau khi kết thúc quá trình PCR thì vô
số bản sao DNA được tạo thành, các sản phâm này sẽ được phân tích và đánh
giá thông qua quá trình điện di nhờ vào đặc điểm và kích thước, độ cồng
kềnh… của từng đoạn DNA.
 Nguyên lí kỹ thuật:
Nhiệt độ: nhiệt độ cao dùng để tháo xoắn, tách sợi đôi DNA thành 2 sợi đơn
thay chp enzyme helicase.
Mồi: các cặp mồi được thiết kế để mồi này nhận biết được sợi có nghĩa của
DNA mà ta cần tái bản còn mồi kia nhận biết được sợi đối nghĩa.
Enzyme: xúc tác cho quá trình lắp giáp nucleotide A,T,G,X vào mạch DNA mới

tổng hợp
Đơn phân: 4 loai dNTP là nguyên liệu tham gia tạo lên DNA mới


−

−
−
−

•
•
•
•
•
+

+

•
•

•

Dung dịch đệm, pH: giúp cho enzyme Taq hoạt động chức năng, cân bằng pH
trong dung dịch.
 Thiết bị PCR:
Phản ứng PCR được thực hiện trong máy chu trình nhiệt
Cần đáp ứng yêu cầu thay đổi nhiệt độ thật nhanh và chính xác
Mỗi kiểu thiết bị có đặc điểm khuếch đại riêng nên mọi thí nghiệm của một

nghiên cứu cần tiến hành trên cùng một loại.
 Các bước cơ bản:
− Xác định thành phần PCR
+ Các thành phần của PCR
DNA khuôn được tinh sạch ( sử dụng Proteinase K, CTAB để loại bỏ các thành
phần không phải DNA)
Mồi: gồm mồi xuôi và mồi ngược tùy vào mục đích mà thiết kế các cặp mồi.
Enzyme: thường sử dụng enzyme taq polymerase.
Các loại dNTP: dATP, dTTP, dGTP, dCTP,
Dung dịch đệm: thành phần dung dịch đệm phụ thuộc vào loại enzyme sử
dụng, quan trọng nhất là Mg2+
Tính toán: cần xác định số lượng, thể tích mẫu cần tra vào giếng để định
lượng thể tích các thành phần cần cho phản ứng chạy PCR. Tính toán tổng số
thể tích các thành phần cho vào tuýp lớn sao cho khi chia được các tuýp nhỏ
có thể tích bằng nhau.
Kỹ thuật mix: Mix các thành phần trên theo nguyên tắc cho nước đầu tiên và
cho Taq cuối cùng. Sau đó chia hỗn hợp mix cho từng tuýp. Cho nước đầu tiên
để khi lấy những hóa chất tiếp theo sẽ dê tan không bị bám dính ở đầu côn.
Cho taq cuối đẻ tránh taq mất hoạt tính vì để ngoài lâu.
− Đặt chu trình PCR
+ Phản ứng PCR gồm nhiều chu kì, mỗi chu kì gồm 3 giai đoạn:
Thời kì biến tính DNA: tách sợi đôi thành sợi đơn, nhiệt độ thiết kế là 95 độ C,
với nhiệt độ này DNA sẽ tạo ra sợi đơn DNA.
Thời kì lai giữa primer và DNA: nhiệt độ thay đổi trong khoảng 50 độ C đến
60 độ C. Nhiệt độ này tùy thuộc vào từng loại marker mà ta sử dụng. ở giai
đoạn này các đoạn mồi sẽ bắt cặp với mạch đơn DNA khuôn mẫu ở vị trí bổ
sung.
Thời kì kéo dài DNA mới nhờ Taq polymerase. Ở nhiệt độ 72 độ C là nhiệt độ
tối ưu cho hoạt động của DNA polymeerase. Dưới sự tác động của DNA
polymerase những đoạn mồi đã bắt cặp với DNA khuôn mẫu sẽ được kéo dài.

Các DNA mới được hình thành lại được sử dụng làm khuôn để tổng hợp cho
các chu kì tiếp theo.


−

−
−

−
−

−

+

Thu nhận kết quả: sau khi chạy xong PCR cần tiến hành điện di sản phẩm trên
gel agarose đê phân tích, đánh giá kết quả.
+ Ưu điểm – Nhược điểm:
Ưu điểm: thời gian thực hiện nhanh, đơn giản, ít tốn kém, độ tinh sạch của
mẫu không cần cao
Nhược điểm: sự ngoại nhiễm, các sai sót gây ra do Taq polymerase cho tỉ lệ
sai quá cao 10-4
 Hướng ứng dụng và hướng phát triển:
− Hướng ứng dụng:
+ Chuẩn đoán bệnh di truyền
+ Tách dòng các sản phẩm pcr
+ Nhật biết đột biến, xen mất đoạn.
+ Nghiên cứu quá trình tiến hóa.
+ Chọn giống vật nuôi, cây trồng

+ Xác định huyết thống, truy tìm dấu vết tội phạm.
− Hướng ứng dụng:
+ RT-PCR: nhạy hơn, được dùng cho sự phân tách ARN
+ RT-PCR cạnh tranh: định lượng các loại mARN chuyên biệt
+ Real- Time PCR: đánh giá sự tích lũy và định lượng sản phẩm PCR.
Câu 4 Trình bày hiểu biết về kỹ thuật AFLP
 Nguyên lý cơ bản
AFLP là một trong số những kĩ thuật phát hiện dấu vết DNA, đánh giá sự đa
dạng cjieeuf dài của DNA .
Kĩ thuật gồm 3 bước: (1) sự cắt hạn chế DNA có sự tham gia của RF. (2) sự
khuếch đại có chọn lọc các phân mảnh hạn chế đang tìm kiếm. (3) sự phân
tích các đoạn khuếch đại bằng điện di gel.
Khuếch đại PCR các phân mảnh hạn chế được thực hiện bằng cách sử dụng
các adapter và trình tự hạn chế để tạo ra các trình tự cho các primer khi chạy
PCR. Khuếch đại có chọn lọc được diễn ra khi sử dụng các primer bắt cặp
được với các phân mảnh hạn chế bằm ở phía đầu 3’ của các adapter và trình
tự hạn chế
=> Vì thế khi sử dụng AFLP để phân tích độ đa dạng chiều dài của các DNA
không cần biết trình tự của các nucleotide
 Các bước của kĩ thuật AFLP
− Bước 1 chuẩn bị khuôn mẫu AFLP
Mẫu DNA được phân lập và tinh chế từ một sinh vật. Toàn bộ DNA có trình tự
cắt của MseI và EcoRI
MseI cắt trình tự T T A A
T
T A A
A AT T
A A T
T



EcoRI cắt trình tự G A A T T C
C T T A A G

G
C T T A A

A A T T C
G

Bước 2 Cắt hạn chế RE và nối
Cắt hạn chế bằng RE
Bằng cách ủ DNA khuôn với RE: chú ý các khuôn mẫu với enzyme hạn chế
được chuẩn bị, sử dụng nhất thiết cùng protocol( biếu thị các chất giống
nhau, nồng độ, điều kiện như nhau)
Phân mảnh hạn chế có đặc điểm:
T A A
G end € EcoRI
End € MseI T
C T T A A
−
+

•

•

•

+

•
•
•

•

Được cắt bởi 2 enzyme. Một đàu là trình tự bắt cặp bổ sung giữa hau đầu
dính của adapter MseI-trình tự cắt MseI. Một đầu là trình tự bổ sung giữa
hai đầu dính của adapter EcoRI- Trình tự cắt EcoRI( adapter > 20 nu). Đoạn
giữa 2 đầu không biết trình tự.
+ Nối RE với adapter
RE + 2 adapter ( đoạn trình tự nhân tao, có đặc điểm kết hợp được với đầu
dính của ez cắt theo nguyên tắc bổ sung) + ligase  dsARE( DNA phân đoạn
hạn chế sợi kép)
− Bước 3 khuếch đại chọn lọc.
Trong bước này cần chú ý đến mồi AFLP gồm 3 phần: trình tự lõi, trình tự đặc
hiệu enzyme ( ENZ) và trình tự mở rộng chọn lọc ( EXT)
Primer được thiêt kế dựa vào trình tự của các adapter và trình tự cắt của RE
Primer đối với EcoRI: 5’-lõi – EN2 – EXT = 19.
EXT = 1 thì primer có 4 loại. EXT = 2 thì primer có 16 loai. EXT=3 thì primer
có 64 loại.
+ Chạy PCR:
Chuẩn bị thành phần PCR: Khuôn mẫu DNA là sản phẩm của bước 2.Enzyme
taq DNA polymerase .Prime: được thiết kế theo nguyên tắc trên .dNTP: khi
chuẩn bi vật liệu thì buộc phải ở điều kiện 3 gốc phosphate
• Chu trình nhiệt:
 Trường hợp 1 chạy 20 ch kì đơn với AFLP sử dụng mồi có EXT = 1 hoặc
0
 Trường hợp 2 chạy 36 chu kì đơn với AFLP sử dụng có mồi EXT = 2
hoặc 3

 Cả hai trường hợp thì mỗi chu kì đều có các giai đoạn sau:
 Nhiệt độ biến tính ở 94 độ trong 30s


Nhiệt độ hồi tính 36 độ trong 30s
Kéo dài 72 độ trong 1 phút
Nhiệt độ hồi tính trong chu kì đầu tiên là 65 độ, sau đó giảm ở mỗi chu kì tiếp
theo là 0.7 độ cho 12 chu kì tiếp theo và tiếp tục tại 56 độ cho 23 chu kì còn
lại.
− Bước 4: chạy điện di
+ Gel polyacrymadie có khả năng biến tính
+ Chuẩn bị gel, chuẩn bị hệ thống điện di
+ Tra mẫu vào gel
+ Kết nối với ngồn điện
− Bước 5: đánh giá độ đa dạng
 Ưu nhược điểm và ứng dụng
Ưu điểm: AFLP nhanh hơn, không phức tạp như RELP nhưng vẫn khảo sát
được toàn bộ gen. Kỹ thuật đòi hỏi ít lượng DNA ban đầu, không cần biết
trước trình tự đích và độ lặp lại phản ứng cao các mồi sử dung không cần đặ
hiệu loại
Nhược điểm: là một maker trội, điều này hạn chế phân biệt cá thể đồng trội
và dị hợp.
ứng dụng: đánh giá đa dạng sinh học, phân tích và thu thập quỹ gen, đánh
giá kiểu gen cá thể, phân tích khoảng cách di truyền. thiết lập nhóm liên kết
các chỉ thị đối với gen quan tâm, đánh giá mức độ liên quan hoặc sự khác biệt
giữa các giông.
Câu 5 trình bài hiểu biết và kĩ thuật RFLP
 Nguyên lí cơ bản:
Phản ứng PCR được thực hiện để khuếch đại một vùng DNA cần khảo sát
bằng cách sử dụng một cặp mồi oligonucleotide và các thành phần phần khác

của phẩn ứng PCR để tạo ra vô số bản sao DNA.
Sau đó các sản phẩm của PCR được ủ với enzyme RE sẽ tạo ra những phân
đoạn DNA có kích thước khác nhau.
Sử dụng kĩ thuật điện di trên gel để tách rời các đoạn DNA có kích thước
khác.
Sử dụng kĩ thuật Southern bot: Gây biến tính DNA trên gel ,sau đó chuyển
DNA từ gel sang màng lai. Thẩm tích các phân tử DNA lên màng lai, Lai phân
tử (lai với mẫu dò đặc hiệu có mang phóng xạ hoạt động). Chụp ảnh phóng xạ
tự ghi để thu nhận và đánh giá kết quả.
− Sơ đồ nguyên lý:
PCR+RE  Điện di  thẩm tách  lai  chụp
 Nguyên tắc kĩ thuật:





−

−
−

−

−
−
−


−


−

−

+
+

+
+

+

+

+

Môi trường cho PCR hoạt động: Để cho PCR hoạt động cần đòi hỏi có đầy đủ
thành phần của phản ứng PCR: DNA khuôn, mồi, enzyme polymezase, dNTP,
dung dịch đệm và một máy luân chuyển nhiệt thật nhanh và chính xác.Chú ý
đệm trong phản ứng PCR là tris – HCL, KCl, MgCl 2.
Môi trường cho RE hoạt động: Để đảm bảo cho RE hoạt động cần ủ RE với
DNA trong nhiệt độ, pH, dung dịch đệm và môi trường phù hợp, đặc biệt phải
có dung dịch đệm Nacl và ion Mg2+. Trên DNA phải có trình tự cắt của enzyme
RE.
Dựa trên độ đặc hiệu của enzyme cắt hạn chế đối với vị trí nhận biết của
chúng trên DNA bộ gen. Sự khác biệt về vị trí cắt tạo ra những phân đoạn cắt
DNA khác nhau.
 Các bước cơ bản
− Bước 1: tách chiết và tinh sạch DNA

Mẫu DNA có thể không đặc hiệu hoặc nhiễm các tạp chất khác lên cần phải
được tinh sạch
Thành tế bào của sinh vật bị phá vỡ bằng biện pháp cơ học và các chất tẩy
mạnh. DNA được giải phóng và làm sạch tạp chất Rnase. DNA được kết tủa
trong Ethanol 100% và thu lại nhờ li tâm
− Bước 2: Phản ứng PCR
Chuẩn bị Khuôn mẫu DNA đã được tinh sạch ở bước 1. Enzyme taq. Primer
được thiết kế gắn được vào trình tự của các adaptor về trình tự cắt RE. dNTP
Chu trình nhiệt:
• Nhiệt độ biến tính ở 94 độ trong 30s
• Nhiệt độ hồi tính 36 độ trong 30s
• Kéo dài 72 độ trong 1 phút
− Bước 3: Tiến hành xử lí RE
Nồng độ NaCl của dung dịch đệm: nếu phải sử dụng nhiều RE có nồng độ
NaCl của dung dịch đệm khác nhau thì cắt RE có nông độ NaCL thấp trước rồi
đến RE cần NaCL nồng độ cao hơn.
RE được bảo quản trong dung dịch đệm có 50% glycerol ở 200 độ C tiếp xúc
với nhau càng tốt, tuy nhiên phai đảm bảo thể tích RE không quá 1/10 thể
tích phản ứng vì Glycerol sẽ gây ức chế hoạt động cảu RE
Thành phần hỗn hợp phản ứng cắt: nước tinh khiết, RE 10 x bufer, BSA, RE,
DNA.
− Bước 4 điện di: Điện di trên gel agarose để phân tích kết quả
− Bước 5 Southerm Blotting:
+ Chuyển DNA sang màng nylon
+ Chọn đoạn dò, đánh dấu đoạn dò
+ Lai gép gen.
− Bước 6 chụp ảnh, soi UV thu nhận kết quả.


Ưu điểm, nhược điểm, ứng dung

Ưu điểm: Marker đồn trội cho phép phân biệt các thể dị hợp do kích thước
DNA khảo sát trong RFLP lớn vì vậy số lượng phân tử DNA tạo ra nhiều, đủ
đáp ứng nhu cầu nghiên cứu.
− Nhược điểm
+ Quy trình thực hiện phức tạp, nguy hiểm tới sức khỏa người nghiên
cứu
+ DNA yêu cầu chất lượng caoddax làm hạn chế vược sử dung kĩ thuật
này
+ Sử dụng các đồng vị phóng xạ để phân tách thì tương đối tốn kém và
độc hại
− ứng dụng
xác định mối quan hệ đơn phân loại liê quan chặt chẽ hoặc cấp độ trong một
kiểu như công cụ in vân tay cho các nghiên cứu đa dạng và nghiên cứu về lai
sử dụng trong các kiểm tra hình sự và kiểm tra huyết thóng, định vị gen, rối
loạn di truyền và xác định nguy cơ gây bệnh.


−

+
+