Định lượng E.coli bằng phương pháp đếm
khuẩn lạc

BỘ CÔNG THƯƠNG
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP. HCM
KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM
MÔN PHÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨM


TIỂU LUẬN

Định lượng E.coli bằng phương pháp
đếm khuẩn lạc
GVHD: Nguyễn Thị Kim Oanh
Nhóm thực hiện: Nhóm 5
Buổi: Thứ 3, tiết 11+12, phòng B106

TP. HCM, tháng 4 năm 2016

Trang 1

NHÓM 5

Tp.HCM, Tháng 05/2014


Định lượng E.coli bằng phương pháp đếm
khuẩn lạc

Mục lục
Chương III: ĐỊNH LƯỢNG E.COLI BẰNG PHƯƠNG PHÁP.......................................................................14

ĐẾM KHUẨN LẠC..................................................................................................................................14
TÀI LIỆU THAM KHẢO............................................................................................................................21

Chương I: TỔNG QUAN VỀ VI KHUẨN ESCHERICHIA COLI
1.1. Sơ lược về vi khuẩn Escherichia coli (E.coli)
Escherichia coli do Theodore Escherich
(1857-1911), một nhà vi khuẩn học người Áo, phát
hiện lần đầu tiên năm 1885. Chi Escherichia thuộc
họ vi khuẩn đường ruột. Trong các loài thuộc chi
này, E.coli được chọn làm điển hình và có vai trò
quan trọng nhất trong y học.
E.coli là một trong những thành viên chính
của hệ vi khuẩn bình thường ở ruột nhưng cũng là
căn nguyên của nhiều bệnh nhiễm trùng, trong đó có
những bệnh nó là căn nguyên đứng đầu.

Hình 1.1: Hình chụp vi
khuẩn E.coli dưới kính hiển vi với
kích thước 2 µm

E.coli đã được sử dụng làm mô hình nghiên cứu về sinh học phân tử trong lĩnh
vực vi sinh học nói riêng và sinh học nói chung. E.coli K12 là vi khuẩn được sử dụng
làm mô hình nghiên cứu nhiều nhất. nhiều thành tựu về di truyền học, hóa sinh học đã
được thu trên cơ sở nghiên cứu vi khuẩn này. Ngày nay E.coli cũng được sử dụng
nhiều trong công nghệ sinh học.
Mặc dù E.coli là loài vi khuẩn được nghiên cứu sâu nhất, cho đến nay nó vẫn
tiếp tục được quan tâm nghiên cứu, với rất nhiều phát hiện mới ở tầm phân tử, đặc biệt
cơ chế bệnh sinh của các type gây bệnh (pathotype).
1.2. Đặc điểm sinh học
1.2.1. Hình thái


NHÓM 5

Trang 2


Định lượng E.coli bằng phương pháp đếm
khuẩn lạc
E.coli là trực khuẩn Gram (-). Kích thước trung bình từ 2 đến 3µm x 0,5µm;
trong những điều kiện không thích hợp (ví dụ như trong môi trường có kháng sinh) vi
khuẩn có thể rất dài như sợi chỉ. Rất ít chủng E.coli có vỏ, nhưng hầu hết có lông và
có khả năng di động.

NHÓM 5

Trang 3


Định lượng E.coli bằng phương pháp đếm
khuẩn lạc
1.2.2.

Tính chất nuôi cấy

E.coli phát triển dễ dàng trên các môi trường nuôi cấy thông thường. Một số có
thể phát triển trên môi trường tổng hợp rất nghèo chất dinh dưỡng. Hiếu kỵ khí tùy ý.
Có thể phát triển ở nhiệt độ từ 5-400C. Nhiệt độ thích hợp xung quanh 370C.
Trong điều kiện thích hợp E.coli phát triển rất nhanh, thời gian thế hệ chỉ
khoảng 20 đến 30 phút. Cấy vào môi trường lỏng (như canh thang) sau 3 đến 4 giờ đã
làm đục nhẹ môi trường, sau 24 giờ làm đục đều; sau hai ngày trên mặt môi trường có

váng mỏng. Những ngày sau, dưới đáy ống có thể thấy lắng cặn. E.coli không mọc
trên canh thang Selenit.
Trên môi trường thạch thường, sau khoảng 8 đến 10 giờ, dung kính lúp đã có
thể quan sát được khuẩn lạc. Sau 24 giờ khuẩn lạc có kích thước khoảng 1,5mm. Hình
thái khuẩn lạc điển hình dạng S, nhưng có thể gặp dạng R, hoặc M. Trên môi trường
phân lập, tùy theo chất chỉ thị màu, E.coli có khuẩn lạc màu vàng (như trên thạch
lactose) hoặc màu đỏ (như trên thạch MacConkey). Không mọc được trên môi trường
SS.
Một số loại E.coli có tính chất nuôi cấy riêng có giá trị trong sàng lọc nhanh,
như EAEC tạo thành váng đặc trường khi nuôi cấy trên canh thang Muller-Hinton.
1.2.3.

Tính chất hóa sinh

E.coli có khả năng lên men nhiều loại đường và có sinh hơi. Hầu hết E.coli đều
lên men lactose và sinh hơi, trừ E.coli trơ (inactive) (trong đó có EIEC) không hoặc
lên men rất chậm. Một số chi khác trong họ vi khuẩn đường ruột cũng có khả năng lên
men nhanh lactose (như Klebsiella, Enterobacter, Serratia và Citrobacter) được gộp
vào một nhóm vi khuẩn có tên chung là coliform.
E.coli có khả năng sinh indole. Không sinh H 2S. Không sử dụng được nguồn
carbon của citrate trong môi trường Simmons. Có decarboxylase, vì vậy có khả năng
khử carboxyl của lysine, ornithin, arginin và acid glutamic. Betagalactosidase dương
tính. Thử nghiệm VP (Voges Proskauer) sau 24 giờ âm tính, sau 48 giờ có thể dương
tính.
NHÓM 5

Trang 4


Định lượng E.coli bằng phương pháp đếm

khuẩn lạc
Bảng 1.2: Tính chất hóa sinh của một số loài thuộc chi Escherichia
Các loài
E.coli

E.coli

(bình

(inactive

thường)
+
+
+

)
T
T
+

-

E.blatta

E.fergus

E.herma

e


onii

nnii

s

i

+

T
+
+

+
+
+

+
+

?

-

-

-


-

-

-

-

-

T

T

-

-

-

T

T

+

+

-


T

+

T

-

-

-

-

T

-

T

T

+

+

+

-


+

+
+

+

+

+
+

+
+

+
+

+

+

-

+

+

+


+

+

+
T
+
+
T

T
T
+
T
T

+

+
+
+
+

T
T
+
+
+

T

+
+
+

+
+

vàng
ONPG: Ortho-nitrophenyl-beta-Dgalactopyranoside

+

T

-

Thử nghiệm
CNPG
Indole
Đỏ methyl
VogesProskauer
Citrate
(Simmons)
Lysine
decarboxylase
Arginine
dihydrolase
Ornithine
decarboxylase
Di động

D-Glucose acid
D-Glucose sinh
hơi
Lactose
Sucrose
D-Mannitol
Adonitol
Cellobiose
D-Sorbitol
D-Arabitol
L-Ramnose
Sinh sắc tố

E.vulneri E.alberti

+: >90% dương tính -: < 10% dương tính.
T: 10-90% dương tính
1.3. Phân loại
NHÓM 5

Trang 5


Định lượng E.coli bằng phương pháp đếm
khuẩn lạc
Dựa vào cấu trúc kháng nguyên, E.coli được chia thành các type huyết thanh.
Với sự tổ hợp của các yếu tố kháng nguyên O, K và H sẽ có rất nhiều type huyết thanh
khác nhau. Mỗi type huyết thanh được ký hiệu bằng kháng nguyên O và K, ví dụ
O86B7 (yếu tố kháng nguyên O số 86, yếu tố kháng nguyên K số 7 loại B).
Dựa vào vị trí gây bệnh các E.coli có khả năng gây bệnh ở người được chia

thành 2 nhóm: thứ nhất là nhóm gây bệnh đường ruột (IPEC-intestinal pathogenic
E.coli) hay E.coli gây tiên chảy (DEC-Dierrheagenic E.coli), thứ hai là nhóm gây bệnh
ngoài đường ruột (ExPEC-extraintestinal pathogenic E.coli).
- Các loại E.coli gây bệnh đường ruột (IPEC) đã được biết gồm:
EPEC (Enteropathogenic E.coli): E.coli gây bệnh đường ruột
ETEC (Enterotoxigenic E.coli): E.coli sinh độc tố ruột
EIEC (Enteroinvasive E.coli): E.coli xâm nhập ruột
EAEC (Enteroaggregative E.coli): E.coli ngưng tập ruột
DAEC (Diffusely adherent E.coli): E.coli bám dính phân tán
EHEC (Enterohaemorrhagic E.coli): E.coli gây xuất huyết ruột
- Hai loại E.coli gây bệnh ngoài đường ruột quan trọng nhất là:
MAEC (Meningitidis-associated E.coli): E.coli gây viêm màng não
UPEC (Uropathogenic E.coli): E.coli gây nhiễm khuẩn đường tiết niệu

1.4. Khả năng gây bệnh
E.coli là thành viên thuộc nhóm vi hệ bình thường của đường tiêu hóa, chiếm
tỷ lệ cao nhất trong số các vi khuẩn hiếu khí (khoảng 80%). Tuy nhiên, E.coli cũng là
1 vi khuẩn gây bệnh quan trọng, nó đứng đầu trong các vi khuẩn gây tiêu chảy, viêm
đường tiết niệu, viêm đường mật; đứng hàng đầu trong các căn nguyên gây nhiễm
khuẩn huyết. E.coli là căn nguyên thường gặp trong viêm màng não, viêm phổi ở trẻ
mới sinh. E.coli còn gặp trong nhiễm trùng ngoại khoa, nhiễm trùng trong bỏng. Theo
NHÓM 5

Trang 6


Định lượng E.coli bằng phương pháp đếm
khuẩn lạc
báo cáo của chương trình quốc gia giám sát tính kháng thuốc của các vi khuẩn gây
bệnh thường gặp (1988-1994) thì E.coli đứng thứ hai (sau S.aureus) về tỷ lệ phân lập

được (tính chung tất cả các loại bệnh phẩm) ở nước ta.
Những type huyết thanh có khả năng gây bệnh thường gặp trên lâm sàng là:
O111B4, O86B7, O126B16, O55B5, O119B4, O127B8, O26B6, O25B15, O128B12.
Cơ chế gây bệnh của E.coli khác nhau tùy loại.
Bảng 1.4: Tóm tắt các đặc điểm liên quan đến khả năng gây bệnh của các E.coli gây
bệnh đường ruột
Loại
E.coli

Gen động lực
hoặc yếu tố độc lực
Plasmid 50-70 MDa (EAF):

Cơ chế gây bệnh

Đặc điểm

lâm sàng
Bám dính tại chỗ nhờ Các
tổn

Mã hóa BFP (bundle-forming pilus), BFP

thương

Per (plasmid-encoded regulator) và

A/E

Ler (LEE-encoded regulator. PAI Tổn thương mô A/E

EPEC

nhiễm sắc thể (LEE)

Tiêu chảy

TTSS gồm: intimin (eaeA), các

cấp

protein tiết; Tir, EspA, EspB, EspD,
EspF, EspG và MAP (mitochondriaassociated protein)
EAST-1
CDT (Cytolethal distending toxin)
Các CFA mã hóa bởi plasmid: CFA-I Bám vào niêm mạc Tiêu chảy
(fimbriae cứng), CFA-III (tạo bó), ruột non (CFA I-IV) cấp, phân
CFA-II và CFA-IV (fimbriae mềm) và và sản xuất các độc tố thường
ETEC

pili dài liên quan với type IV

ruột LTI, LTII, STa, toàn nước
STb

Độc tố chịu nhiệt LT I và LT II (mã
hóa bởi plasmid)

không có
nhầy máu


Hoạt hóa adenylate
cyclase- tăng cAMP –
giảm hấp thu Na+/tăng
tiết Cl- - tiêu chảy

NHÓM 5

Trang 7


Định lượng E.coli bằng phương pháp đếm
khuẩn lạc
Độc tố vững bền với nhiệt STa và STb Hoạt hóa guanylate
(mã hóa bởi plasmid và transposon)

cyclase- tăng cGMP –
tiết chloride và/hoặc

ETEC

giảm hấp thu NaCl –
tiêu chảy
Các gen trên plasmid 140 MDa mã Vi khuẩn bám và xâm Hội chứng
hóa các kháng nguyên xâm nhập nhập vào biểu mô đại lỵ

EIEC

trực

(invasion plasmid antigen) IPaA – tràng, nhân lên gây khuẩn

IpaD
Điểm

viêm loét hoại tử niêm
bám

dính

kết

tập

mạc đại tràng
AAF AAF tạo nên kiểu bám Tiêu chảy

(aggregative adhesion fimbriae)

dính hình chồng gạch

kéo dài

aggR điều hòa sự biểu
Yếu tố điều hòa bám dính kết tập aggr

hiện của AAF

Protein pet

gây tích tụ dịch và gây
độc tố cho biểu mô


EAEC

tiêu hóa
Độc tố EAST-1 (enteroaggregative EAST-1 phá hủy tế
heat-stable toxin-1)

bào biểu mô

Protein làm tan máu và mất thăng Protein làm tan máu
bằng vận chuyển ion qua màng

và làm mất thăng bằng
vận chuyển ion qua

màng
Plasmid 60 MDa mã hóa heamolysin, Độc tố Shiga:
LCT, EspP

Tiêu chảy

- Hủy hoại các vi ra máu (do
nhung mao hấp thu cả xuất huyết
tế bào biểu mô ruột.

EHEC/

PAI nhiễm sắc thể

VTEC


đại tràng)

- ức chế quá trình tổng
hợp protein của tế bào
biểu mô đại tràng, dẫn
đến làm chết tế bào,

Độc tố Shiga (Stx1, Stx2, Stx2v) mã - gây hội chứng HUS
hóa bởi các gen trên nhiễm sắc thể
NHÓM 5

Trang 8


Định lượng E.coli bằng phương pháp đếm
khuẩn lạc

DAEC

Các yếu tố bám dính Afa/Dr

Afa/Dr gây bám dính Tiêu chảy

(AIDA)

phân tán

EAST-1


EAST-1 phá hủy tế thường
bào biểu mô

Các geb set (enterotoxin)

phân
không có
máu

Có thể có TTSS với esc

NHÓM 5

Trang 9


Định lượng E.coli bằng phương pháp đếm
khuẩn lạc
1.5. Nguyên tắc điều trị và phòng bệnh
1.5.1.

Điều trị

E.coli thuộc vào các vi khuẩn có tỷ lệ kháng thuốc cao, nhất là các chủng phân
lập được từ nước tiểu, vì vậy cần phải làm kháng sinh đồ để chọn kháng sinh thích
hợp.
Ngoài việc sử dụng kháng sinh, một số việc khác rất có giá trị trong điều trị
như bồi phụ nước, điện giải trong trường hơp ỉa chảy (việc này nhiều khi có vai trò
quyết định để cứu sống bệnh nhân), giải quyết các cản trở trên đường tiết niệu, rút
ống thông sớm nếu có thể được.

1.5.2.

Phòng bệnh

Hiện nay chưa có phương pháp nào phòng bệnh đặc hiệu. Để đề phòng nhiễm
khuẩn đường tiêu hóa do E.coli, thực hiện các biện pháp phòng bệnh chung không
đặc hiệu giống như đối với các vi khuẩn đường ruột khác.
Thực hiện các biện pháp ngăn ngừa nhiễm trùng bệnh viên vì E.coli là một
trong các vi khuẩn gây bệnh cơ hội quan trọng.
Để phòng nhiễm khuẩn đường tiết niệu do E.coli: thực hiện vệ sinh vùng hậu
môn và bộ phận sinh dục ngoài, thực hiện nghiêm túc nguyên tắc vô trùng khi phải
tiến hành thăm dò hoặc đặt thông đường tiết niệu. Điều trị loại trừ các yếu tố nguy cơ
khác.

NHÓM 5

Trang 10


Định lượng E.coli bằng phương pháp đếm
khuẩn lạc

Chương II: CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN
VÀ ĐỊNH LƯỢNG E.COLI
2.1. Phương pháp truyền thống
2.1.1. Định lượng E.coli bằng phương pháp đếm khuẩn lạc
 Nguyên tắc
Cấy một lượng mẫu xác định trên môi trường rắn chọn lọc thích hợp (thạch
TBX) chứa lactose và một chất chỉ thị pH. Đếm số khuẩn lạc lên men lactose tiêu
biểu sau khi ủ môi trường ở 44oC trong 24 giờ. Đếm các khuẩn lạc E.coli điển hình

trên môi trường TBX. Kết quả được biểu thị bằng số E.coli trên 1g mẫu chưa pha
loãng.


Ưu điểm và nhược điểm.

Ưu điểm:
- Cho phép xác định số tế bào sống
- Định lượng chọn lọc vi sinh vật
Nhược điểm:
- Mất nhiều thời gian, hóa chất và công sức.
- Đòi hỏi kĩ thuật phân tích khắc khe.
2.1.2.

Định lượng E.coli bằng phương pháp MPN
 Nguyên tắc

Số lương E.coli trong mẫu nước, thực phẩm chứa mật độ thấp có thể được xác
định bằng phương pháp MPN (Most Probable Number). Phương pháp này dựa vào
nguyên tắc mẫu được pha loãng thành một dãy thập phân (hai nồng độ kế tiếp khác
nhau 10 lần); 3 hoặc 5 mẫu có độ pha loãng thập phân liên tiếp được ủ trong ống
nghiệm chứa môi trường thích hợp có ống bẫy khí Durham. Mỗi nồng độ pha loãng
được ủ từ 3 đến 5 ống lặp lại. Theo dõi sự sinh hơi và đổi màu để định tính sự hiện
diện trong từng ống thử nghiệm; đây là các ống dương tính. Ghi nhận số ống nghiệm
cho phản ứng dương tính ở mỗi nồng độ pha loãng và được vào bảng MPN để suy ra
số lượng nhóm vi sinh vật tương ứng hiện diện trong 1g (hoặc 1ml) mẫu ban đầu.

NHÓM 5

Trang 11



Định lượng E.coli bằng phương pháp đếm
khuẩn lạc


Ưu điểm và nhược điểm

Ưu điểm:
- Khắc phục được nhược điểm của phương pháp đếm trực tiếp.
- Cho biết được số lượng vi sinh vật có trong mẫu.
Nhược điểm
- Dễ nhằm lẫn
- Độ chính xác không cao
- Không thích hợp cho huyền phù vi sinh vật có mật độ thấp.
2.2. Phương pháp hiện đại
2.2.1. Phương pháp PCR (polymerase Chain Reaction)
 Nguyên tắc
Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) là một phương pháp invitro
để tổng hợp DNA dựa trên khuôn là một trình tự đích DNA ban đầu khuếch đại, nhân
số lượng bản sao của khuôn này thành hàng triệu bản sao nhờ hoạt động của enzyme
polymerase và một cặp mồi (primer) đặc hiệu cho đoạn DNA này.


Ưu điểm và nhược điểm:

Ưu điểm:
-

Thời gian cho kết quả nhanh.

Có thể áp dụng với vi sinh vật khó nuôi cấy.
Khá đơn giản, ít tốn kém.
Phát hiện được bào tử tiềm sinh.
Nhược điểm:

- Mật độ vi sinh thấp cần thời gian nuôi cấy để làm giàu.
- Không phân biệt được tế bào sống và tế bào chết.
2.2.2.

Phương pháp ELISA
 Nguyên tắc

Sử dụng kháng thể đơn dòng phủ bên ngoài những đĩa giếng (microplate). Nếu
có sự hiện diện của kháng nguyên mục tiêu trong mẫu, kháng nguyên này sẽ được giữ
lại trên bề mặt giếng. Các kháng nguyên này sẽ được phát hiện bằng cách sử dụng
NHÓM 5

Trang 12


Định lượng E.coli bằng phương pháp đếm
khuẩn lạc
kháng thể thứ cấp có gắn với enzyme như horseradish peroxidase hay alkaline
phosphate. Khi bổ sung một cơ chất đặc hiệu enzyme vào giếng, enzyme sẽ xúc tác
phản ứng thủy phân cơ chất để tạo ra các phản ứng có màu hay phát sáng. Bằng cách
theo dõi sự đổi màu, có thể phát hiện sự hiện diện và định lượng kháng nguyên.
 Một số phương pháp ELISA thường sử dụng
- ELISA gián tiếp (indirect ELISA)
- Sandwich ELISA:
- ELISA cạnh tranh

 Ưu điểm của phương pháp Elisa
Ưu điểm:
- Nhanh chóng và thuận tiện .
- Kháng nguyên của nồng độ rất thấp hoặc không biết có thể được phát hiện kể từ
khi bắt giữ kháng thể chỉ lấy kháng nguyên cụ thể .
Nhược điểm:
-

Thời gian xét nghiệm lâu.
Chỉ có các kháng thể đơn dòng có thể được sử dụng như cặp phù hợp.
Kháng thể đơn dòng có thể chi phí nhiều hơn so với các kháng thể đa dòng.
Enzyme / chất nền phản ứng trong microwells phải được đọc càng sớm càng tốt

NHÓM 5

Trang 13


Định lượng E.coli bằng phương pháp đếm
khuẩn lạc

Chương III: ĐỊNH LƯỢNG E.COLI BẰNG PHƯƠNG PHÁP
ĐẾM KHUẨN LẠC
3.1. Phạm vi áp dụng
Phương pháp này tham chiếu theo tiêu chuẩn ISO 16649 – 2:2001 được áp
dụng cho tất cả các loại thực phẩm.
3.2. Nguyên tắc
Cấy một lượng mẫu xác định trên môi trường rắn chọn lọc thích hợp (thạch
TBX) chứa lactose và một chất chỉ thị pH. Đếm số khuẩn lạc lên men lactose tiêu
biểu sau khi ủ môi trường ở 44oC trong 24 giờ. Đếm các khuẩn lạc E.coli điển hình

trên môi trường TBX. Kết quả được biểu thị bằng số E.coli trên 1g mẫu chưa pha
loãng.
3.3. Môi trường và hóa chất
3.3.1. Dung dịch pha loãng SPW
Dung dịch pha loãng được tham chiếu theo TCVN 6507-1:2005 (ISO 68871:2003)
 Thành phần
- NaCl: 8.5g
- Pepton: 1g
- Nước cất: 1 lít
 Chuẩn bị
Hòa tan các thành phần trong nước, đun nóng nếu cần. Phân phối 90ml dịch
pha loãng vào các bình (hoặc lọ có nấp vặn) và 9mlvào các ống nghiệm. Đậy nấp
bình và ống nghiệp, hấp khử trùng. Chỉnh pH sao cho sau khi khử trùng, pH là 7 ± 0,2
ở 25oC (nếu cần).
 Mục đích
Dùng để pha loãng mẫu.
3.3.2. Môi trường Thạch trypton-mật-glucuronid (TBX)
NHÓM 5

Trang 14


Định lượng E.coli bằng phương pháp đếm
khuẩn lạc
Tham chiếu theo TCVN 7924-2: 2008 (ISO 16649-2: 2001)
 Thành phần
Sản phẩm thủy phân casein bằng enzym

20,0 g


Muối mật No.3

1,5 g

Axit 5-bromo-4-clo-3-indolyl-β-D-glucuronid (BCIG)
Dimetyl sulfoxit (DMSO)(b)

144 μmol(a)
3 ml

Thạch

9 g đến 18 g(c)

Nước

1 000 ml

(a) Ví dụ: 0,075 g muối xyclohexylamoni.
(b) Dimetyl sulfoxit là rất độc khi hít hoặc tiếp xúc phải. Cần sử dụng trong tủ hút
khói. Vì độc tính đó nên nhà sản xuất khuyến cáo dùng dung dịch pha loãng.
(c) Phụ thuộc vào sức đông của thạch.

 Chuẩn bị
Hòa tan BCIG trong dimety sulfoxit hoặc trong dung dịch loãng theo khuyến
cáo của nhà sản xuất. Hòa tan tất cả các thành phần trên trong nước và đun đến sôi.
Chỉnh pH để sau khi khử trùng pH phải là 7,2 ± 0,2 ở 25 oC, nếu cần.
Khử trùng môi trường 15 phút ở nhiệt độ 121oC trong nồi hấp áp lực. Làm
nguội ngay môi trường trên nồi cách thủy đến khoảng từ 44 oC đến 47 oC.
 Mục đích

Dùng làm môi trường nuôi cấy chọn lọc.

NHÓM 5

Trang 15


Định lượng E.coli bằng phương pháp đếm
khuẩn lạc
3.4. Quy trình phân tích

Hình 3.4.1: Quy trình định lượng E.coli bằng phương pháp đếm khuẩn lạc
Bước 1. Chuẩn bị mẫu thử và huyền phù ban đầu.
Cân chính xác 10g/25g đối với mẫu rắn hoặc đong mẫu với thể tích 10ml/25ml
đối với mẫu lỏng của phần mẫu thử đại diện với sai số cho phép ±5%, cho vào túi
nhựa vô trùng (bình tam giác).
Cho dung dịch pha loãng SPW 90ml/225ml (sai số cho phép ± 5%) vô trùng
vào túi nhựa (bình tam giác) chứa mẫu.
Đồng nhất mẫu và dung dịch pha loãng SPW trong máy dập mẫu trong 1 phút
hoặc lắc đều bình tam giác có mẫu và dịch pha loãng trong suốt quá trình thao tác
luôn phải giữ xấp xỉ bằng nhiệt độ phòng.
Do các bào tử lắng xuống nhanh trong pipet, nên để pipet ở tư thế nằm ngang
(không để đứng) khi được làm đầy với một thể tích của huyền phù hoặc dung dịch
pha loãng thích hợp.

NHÓM 5

Trang 16



Định lượng E.coli bằng phương pháp đếm
khuẩn lạc
Lắc huyền phù ban đầu và các dung dịch pha loãng bằng máy vortex để tránh
các phần tử có vi sinh vật lắng xuống.

Hình 3.4.2:Túi nhựa dập mẫu có màng lọc

Hình 3.4.3: Máy dập mẫu

Hình 3.4.4: Hút lấy mẫu bằng Micropipet
Bước 2. Pha loãng mẫu
Dùng pipet vô trùng lấy 1ml huyền phù ban đầu vời sai số ±5% cho vào một
ống nghiệm chứa 9ml dịch pha loãng SPW vô trùng ở nhiệt độ thích hợp.
Trộn kỹ bằng máy vortex trong 5 – 10 giây để thu được dung dịch pha loãng
10-2 (đối với các loại mẫu làm từ nguyên chất thì thu được dung dịch pha loãng là 10 1

). Nếu cần, lặp lại thao tác trên để có được dung dịch pha loãng 10 -3, 10-4, 10-5,… cho

đến khi thu được lượng vi khuẩn thích hợp.

NHÓM 5

Trang 17


Định lượng E.coli bằng phương pháp đếm
khuẩn lạc

Hình 3.4.5: Quy trình pha loãng
Bước 3. Cấy và ủ mẫu

Dùng pipet vô trùng chuyển 1ml mẫu thử dạng lỏng hoặc 1ml huyền phù ban
đầu đối với sản phẩm ở dạng khác cho vào giữa đĩa petri. Sử dụng 2 nồng độ pha
loãng liên tiếp, mỗi nồng độ 2 đĩa petri. Rót vào mỗi đĩa khoảng 15ml môi trường
TBX. Lật úp đĩa và ủ ở 440C trong 24 giờ.

Hình 3.4.6: Quy trình cấy và ủ mẫu
NHÓM 5

Trang 18


Định lượng E.coli bằng phương pháp đếm
khuẩn lạc
Bước 4. Đếm và chọn các khuẩn lạc để khẳng định
Đếm các đĩa có số khuẩn lạc dưới 150 sau 24 giờ nuôi cấy. Khuẩn lạc E. coli
đặc trưng trên môi trường TBX có màu xanh. Đếm các khuẩn lạc E. coli đặc trưng
trên những đĩa có số đếm phù hợp. Tính giá trị trung bình từ các độ pha loãng để quy
về số E. coli trong 1g mẫu.

Hình 3.4.7: Hình ảnh khuẩn lạc trên môi trường TBX
3.5. Kết quả
Tổng số E. coli trong 1g mẫu (X) được tính theo công thức:

(CFU/g hay CFU/ml)

C: Tổng số khuẩn lạc nấm men hoặc nấm mốc đếm được trên 4 đĩa của hai độ
pha loãng liên tiếp.
V: Thể tích dịch cấy đã cấy trên mỗi đĩa, tính bang mililit
: Số đĩa được giữ lại ở độ pha loãng thứ nhất


NHÓM 5

Trang 19


Định lượng E.coli bằng phương pháp đếm
khuẩn lạc
: Số đĩa được giữ lại ở độ pha loãng thứ hai
d: hệ số pha loãng ứng với độ pha loãng thứ nhất

KẾT LUẬN
Hiện nay, ngộ độc thực phẩm đã trở thành mối quan tâm của toàn xã hội. Có
nhiều nguyên nhân gây ra các vụ ngộ độc thực phẩm nhưng phần lớn các trường hợp
có nguồn gốc từ vi sinh vật.
Ngộ độc thực phẩm thường xảy ra do nguyên liệu dùng chế biến hay thực
phẩm bị nhiễm vi khuẩn và độc tố của vi khuẩn. Một trong những loại ngộc độc thực
phẩm gây ra bởi vi sinh vật thường gặp là ngộ độc thực phẩm do vi khuẩn E.coli.
Trong thực tế cuộc sống, theo dõi khảo sát đảm bảo vệ sinh an toàn thực phẩm
để hạn chế sự ô nhiễm và tác hại của vi khuẩn trong quá trình thu hoạch các sản phẩm
nông nghiệp, chăn nuôi, đánh bắt hải sản đến quá trình ‘bảo quản chế biến và nấu
nướng tới tay người tiêu dùng thường rất phức tạp và gặp nhiều khó khăn.
Do đó các phương pháp phát hiện vi khuẩn E.coli có vai trò quan trọng trong
nhiệm vụ đảm bảo vệ sinh an toàn thực phẩm nhằm làm giảm tỷ lệ ngộ độc do vi
khuẩn gây nên.

NHÓM 5

Trang 20



Định lượng E.coli bằng phương pháp đếm
khuẩn lạc

TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 7924-2: 2008 (ISO 16649-2: 2001)
2. Vi sinh vật thực phẩm, tập Kỹ thuật kiểm tra và chỉ tiêu dánh giá chất lượng an toàn
thực phẩm, NXB Y học.
3. Trần Linh Thước, Các phương pháp phân tích vi sinh vật trong nước, thực phẩm và
mỹ phẩm, NXB Giáo dục.
4. Vi khuẩn y học, Bộ y tế, NXB Giáo dục Việt nam, chủ biên PGS. TS Lê Văn
Phủng.
5. Thực hành phân tích vi sinh thực phẩm (Lưu hành nội bộ) , Đinh Thị Hải Thuận
(chủ biên), tháng 7 năm 2013
6. Leo Heijnen and Gertjan Medema , Journal of water and health 04.04.2006,
Quantitative detection of E. coli, E. coli O157 and other shiga toxin producing E.coli
in water samples using a culture method combined with real-time PCR.
7. Youngsheng He, James, E.Keen, Ralph B.Westama, E.Travis Littledike, Jimmy
Kwang (1996) “Monoclonal Antibodies for Dectiction of the H7 Antigen of
Escherichia Coli”, Applied and enviromental microbiology, Vol-62 No. 9p 3325-3332.

NHÓM 5

Trang 21