BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TPHCM


BÁO CÁO PHƯƠNG PHÁP KIỂM NGHIỆM
VI SINH TRONG THỰC PHẨM
MẪU NƯỚC MÍA

GVHD: ThS. Nguyễn Minh Hiền
SVTH: nhóm 2

1


Bài báo cáo đếm số vsv hiếu khí và định lượng coliform

Yêu cầu chung: tất cả các thiết bị, dụng cụ đều vô trùng, khu vực tiến hành thí
nghiệm phải được lau cồn để vô trùng, thực hiện các tham tác bên ngọn lửa đèn
cồn. tiến hành nhanh, chính xác
1. Định lượng tổng số vsv hiếu khí bằng pp đếm khuẩn lạc
Mục đích: nhằm xác định số lượng vsv hiếu khí trong mẫu nước mía
Xác định tổng số vsv hiếu khí
Các
Thiết bị
bước
Đồng
nhất mẫu
Pha
Máy
loãng
rung

mẫu

Dụng cụ

Nuôi cấy

6 đĩa petri
chứa môi
trường

Môi
trường

Pipet, ống NaCl
nghiệm,
0.85%
bình tam
vô trùng
giác
250ml, đèn
cồn…

PCA

2

Cách tiến hành
Đây là môi trường lỏng nên có thể
bỏ qua bước đồng nhất
Pha loãng với nồng độ 10-1

Bước 1: lắc đều mẫu
Bước 2: lấy 10ml dd từ mẫu ban
đầu cho vào bình tam giác.
Bước 3: cho 90ml NaCl 0.85% vt
vào bình tam giác có chứa dịch mẫu
vừa lấy
Bước 4: lắc đều mẫu.
Pha loãng với nồng độ 10-2
Bước 1: lắc đều và lấy 1ml dd mẫu
ở nồng độ 10-1 cho vào ống
nghiệm.
Bước 3: cho 9ml NaCl 0.85% vt
vào ống nghiệm có chứa dịch mẫu
vừa lấy.sau đó lắc đều mẫu.
Làm tương tự cho các nồng độ pha
loãng 10-3, 10-4, 10-5, 10-6
Chú ý: mỗi lần pha loãng ở các
nồng độ khác nhau đều phải thay
đầu ống lấy dịch mẫu
Lấy 0.1-1ml dd nước mía ở các
nồng độ -4, -5, -6 cho vào 6 đĩa
petri có sẵn môi trường nuôi cấy .


nuôi cấy,
mẫu pha
loãng,
pipet, que
cấy trang,
đèn cồn…


Ủ

Tủ ủ
Incubator

Đếm
khuẩn
lạc

Máy đếm Bút long
khuẩn
lạc bán
tự động

Tính kết quả

nồng độ

Mỗi nồng độ 2 đĩa. Nuôi cấy bằng
cách đổ đĩa hoặc cấy trang (chú ý:
nếu nuôi cấy bằng cách đỗ đĩa thì
cấy ở thể tích 1ml và nhiệt độ MT
là 40-45oC. Còn cách cấy trang thì
cấy ở thể tích 0.1ml và bề mặt MT
phải khô, sau khi cấy để khô bề mặt
15-20’ rồi mới ủ.
Gói gọn số đĩa đã cấy vào giấy báo,
lật ngược đĩa khi ủ. ủ trong
24h/37oC

Chọn đĩa có số khuẩn lạc từ 25-250.
Dặt đĩa lên máy đếm, dùng bút đếm
tất cả khuẩn lạc đơn lẻ mọc trên môi
trường. sau đó đọc kết quả trên máy
đếm.
-4

-5

Đếm 1

123

93

Đếm 2

106

94
=98*104 (cfu/ml)

Tổng số VSHK:
Với:

A: Tổng số vsv đếm được ở 2 nồng độ liên tiếp
n1: số lần đếm ở nồng độ 1
n2: số lần đếm ở nồng độ 2
d: nồng độ nuôi cấy lớn nhất


3


2. Định lượng vsv bằng pp MPN (Coliform)
Mục đích: định lượng tổng số coliform trong mẫu
Cách tiến hành:
Các bước đồng nhất mẫu, pha loãng mẫu tương tự như bài định lượng vsv hiếu khí
Các bước
B1:Nuôi cấy

Dụng cụ
9 ống
nghiệm,
pipette, đèn
cồn, bút viết

Môi trường
Lauryl
tryptose
(LT)

Cách tiến hành
Lấy 9 ống nghiệm mt LT có sẵn các
ống durham.
Cho 1ml dd nước mía nồng độ -3, -4,
-5 vào các ống nghiệm. mỗi nồng độ
3 ống nghiệm.
Ghi rõ tên mẫu, môi trường, nồng độ
lên các ống nghiệm
sau 24h/370C quan sát và đọc kết

quả.

Đọc kết quả:
Nồng độ
-3
-4
-5

Hiện tượng
ống chuông nổi, mt đục
ống chuông chìm, mt
không có biến đổi nhiều
ống chuông chưa nổi
nhưng có bọt khí xuất hiện
trong ống chuông(>=1/10),
mt đục

Các bước
B2: Nuôi cấy

Dụng cụ
4 ống
nghiệm,
piptte, đèn
cồn, bút viết

Kết luận
Dương tính
Âm tính


Số ống đạt
1
0

Dương tính

3

Môi trường Cách tiến hành
BGBL
Lấy 4 ống nghiệm mt BGBL có sẵn
các ống durham
Cho 1ml dd mẫu ở 4 ống dương tính
vào 4 ống nghiệm môi trường (mỗi
mẫu 1 ống nghiệm).
Sau 24h/370C quan sát và đọc kết
quả.

4


Kết quả:
Nồng độ
-3
-4
-5

Hiện tượng
Kết luận
ống chuông chưa nổi

Dương tính
nhưng có bọt khí xuất hiện
trong ống chuông, mt đục
ống chuông không nổi,
Âm tính
không xuất hiện bọt khí, mt
đục
ống chuông nổi, mt đục
Dương tính

Bước 3: lập tỉ lệ BGBL : coliform
Nước mía : 10-3 : 10-4 : 10-5 = 1: 0 : 1
Tra bảng Mac Crady ta có 1 : 0 :1 =7.2
Tổng số Coliform = MPN* 10n =7.2*103 MPN/g
( với n là nồng độ nuôi cấy đầu tiên lấy nguyên dương)

5

Số ống đạt
1
0
1


Báo cáo: Định tính vi khuẩn E.coli
Viết báo cáo: Phan Thị Thục Quyên
1. Mẫu thực phẩm: Nước mía
2. Mục đích:Kiểm tra sự hiện diện của vi khuẩn E.coli trong mẫu thực phẩm.
3. Cách tiến hành: Sơ đồ các bước tiến hành:


10-1

10-3

……..

10-4

10-5

Lauryl Tryptose

↓24h/27oC

↓

↓

↓

EC

↓24h/44oC

Nuôi cấy trên EMB agar,Endo agar

6


Nhận diện khuẩn lạc điển hình


Cấy khuẩn lạc điển hình vào môi trường NA

Nghiệm pháp IMvic

Kết luận
• Bước 1: chuẩn bị các môi trường sau:
Nước muối sinh lý vô trùng 0,85%
Môi trường Lauryl Tryptose (LT)
Môi trường Enrichment coli (EC)
Môi trường Eosin Methylene Blue Agar (EMB)
• Bước 2:chuẩn bị dụng cụ
Các dụng cụ đã được vô trùng như: pipet, ống nghiệm, ống Durham, que cấy vòng,
bình nón có thể tích 250ml, đĩa petri.
Tủ ủ,nồi hấp tiệt trùng,máy rung ống nghiệm,đèn cồn, nút bông sạch dùng để đậy
ống nghiệm và phải đảm bảo mặt bàn làm thí nghiệm phải sạch sẽ.
• Bước 3: pha loãng mẫu
Tất cả các thao tác lấy mẫu, dịch mẫu và cấy được thực hiện bên ngọn lửa đèn cồn
và tất cả dụng cụ đều được vô trùng.
Dùng pipet hút 10 ml nước mía vào bình tam giác chứa 90 ml nước muối sinh lí
nồng độ 0,85%. Thu được dịch mẫu nồng độ 10 -1. Chuẩn bị 5 ống nghiệm, mỗi ống
chứa 9 ml nước muối sinh lí nồng độ 0,85%. Dùng pipet hút 1 ml dịch mẫu nồng
độ 10-1 từ bình tam giác vào một ống nghiệm đã chuẩn bị như trên. Thu được dịch
mẫu nồng độ 10-2. Sử dụng máy rung ống nghiệm để làm đều dịch mẫu. Tiếp tục
thực hiện thao tác này để pha loãng dịch mẫu sang các nồng độ kết tiếp. Khi
7


chuyển sang nồng độ khác cần thay đầu pipet khác. Khi lấy mẫu ở cùng nồng độ ta
có thể dùng chung đầu pipet. Hoàn thành bước này ta có các dịch mẫu ở các nồng

độ : 10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5. Ghi rõ nồng độ môi trường lên các ống nghiệm.
• Bước 4 : giai đoạn tiền tăng sinh
Ta chọn ra 3 môi trường có nồng độ 10-3, 10-4, 10-5 để nuôi cấy vào môi trường LT.
Mỗi nồng độ nuôi cấy vào 3 ống nghiệm. Dùng ống pipet hút 1 ml dịch mẫu cho
vào ống nghiệm chứa 5 ml môi trường LT có kèm ống Durham. Không lắc để
tránh hiện tượng dương tính giả. Thực hiện tương tự với các ống nghiệm còn lại.
Mỗi khi cấy sang nồng độ khác cần thay đầu pipet mới.Ghi rõ môi trường và nồng
độ nuôi cấy cho mỗi ống nghiệm.
Dùng giấy bọc tất cả các ống nghiệm lại và cho vào tủ ủ ở 27 0C trong 24h. E. coli
thuộc nhóm vi khuẩn có khả năng sử dụng đường lactose trong môi trường LT và
sinh khí. Dựa vào đặc điểm này là xác định được số ống dương tính (nghi ngờ có
E. coli) ở từng nồng độ pha loãng. Ống được xác định là dương tính khi môi
trường trong ống đục và ống Durham nổi hoặc môi trường đục và có bọt khí trong
ống Durham với thể tích bọt khí lớn hơn hoặc bằng 1/10 thể tích ống chuông.
• Bước 5 : giai đoạn tăng sinh
Sau khi xác định được các ống dương tính,ta bắt đầu cấy vào môi trường EC. Do
thành phần môi trường EC so với môi trường LT có thêm muối mật nên ức chế
được các vi khuẩn gram dương và các vi khuẩn không thuộc nhóm vi khuẩn đường
ruột.
Cấy truyền 1 ml dịch mẫu từ tất cả các ống dương tính lần lượt vào các ống
nghiệm có chứa 5 ml môi trường EC kèm theo một ống Durham. Gói tất cả ống
nghiệm vào giấy và cho vào tủ ủ trong 24h ở 44oC.
Xác định ống nghiệm dương tính tương tự như bước trên.

8


• Bước 6 : cấy vào môi trường tăng sinh chọn lọc và nhận diện khuẩn lạc điển
hình
Dùng que cấy vòng vô trùng cấy phân lập dịch mẫu từ các ống dương tính nghi

ngờ có E. coli sang các đĩa petri có môi trường EMB agar và Endo agar. Lật úp các
đĩa và gói vào giấy cho vào tủ ủ 24h ở 37oC.
Nhận diện khuẩn lạc điển hình của E. coli trên các môi trường (nếu có) : Khuẩn lạc
điển hình của E. coli trên môi trường EMB agar: Mặt trên đĩa: khuẩn lạc tròn,
bóng, có ánh kim loại, mặt dưới đĩa: thấy tâm đen của khuẩn lạc. Khuẩn lạc điển
hình của E. coli trên môi trường Endo agar: khuẩn lạc tròn, màu đỏ, có hoặc không
có ánh kim loại.
• Bước 7 : cấy khuẩn lạc điển hình vào môi trường NA
Sau khi xác định được khuẩn lạc điển hình ta cấy khuẩn lạc điển hình vào môi
trường thạch nghiêng NA. Dùng que cấy vòng lấy khuẩn lạc từ đĩa petri và lên
môi trường thạch nghiêng.Tất cả phải được làm trong điều kiện môi trường vô
trùng(làm gần ngọn lửa đèn cồn) và dụng cụ cũng phải được vô trùng.
• Bước 8 : nghiệm pháp IMVic
Dùng để phân biệt E.coli với các vi khuẩn đường ruột khác, gồm có các phản ứng:
-Phản ứng sinh indol (I): E. coli có indol (+).
-Phản ứng đỏ metyl (M): E. coli có phản ứng đỏ metyl (+).
-Phản ứng Voges Proskauer (V ): Phản ứng này dùng để kiểm tra khả năng sinh ra
acetyl - metyl cacbinol E.coli có pbản ứng Voges Proskauer âm tính
-Phản ứng kiểm tra lên men đường inozitol (I): Trong thực tế không làm
-Phản ứng tìm khả năng sử dụng cacbon của citrat (c) E.coli phản ứng citrat âm
tính.
Ngoài ra E.coli không phân giải được ure, không sinh H2S sau 48 giờ.
4. Kết quả :
9


Trong 9 ống LT có 4 ống dương tính
Nồng độ
10-3
10-4

10-5

Số ống dương tính
1
1
2

Biểu hiện
Nổi,môi trường đục
Nổi,môi trường đục
Có khí trong chuông(chưa nổi nhưng thể tích
bọt khí lớn hơn 1/10 thể tích ống
chuông),môi trường đục.

Trong 4 ống EC có 2 ống dương tính
Nồng độ
Số ống dương tính
-3
10
0
-4
10
0
-5
10
2
Nhóm em không nhận diện được khuẩn lạc điển hình : có tâm đen, có ánh kim.
Vì vậy nhóm em dừng tại bước 6.
5. Kết luận :
Vì nuôi cấy trên môi trường EMB agar và endo agar mà không nhận diện được

khuẩn lạc điển hình nên trong mẫu nước mía không có vi khuẩn E.coli

Kiểm tra định tính vi khuẩn Samonella
 Giới thiệu: Salmonella là trực trùng gram âm, hiếu khí và kị khí tùy ý, có
khả năng di động không tạo bào tử, lên men glucose và mannitol sinh acide
nhưng không lên men saccharose và lactose, không sinh Indole, và không
phân giải ure. Không có khả năng tách nhóm amine, hầu hết các chủng đều
sinh H2S.
 Nguyên tắc: là phương pháp định tính dùng để kiểm tra có hay không có sự
hiện diện của Salmonella.
10


 Quy trình đầy đủ: tiền tăng sinh, tăng sinh chọn lọc, phân lập (nhận diện và
chọn khuẩn lạc điển hình), nhuộm gram, cấy khuẩn lạc vào NA, phản ứng
sinh hóa, kết luận.
1.












Dụng cụ và môi trường:

Mẫu nước mía ép siêu sạch.
Canh Peptone đệm (BPW).
Canh Rappaport-Vassiliadis soy peptone (RV).
Xylose Lysine Deoxycholate agar (XLD Agar).
Lam kính, kính hiển vi, bộ thuốc nhuộm gram (thuốc nhuộm: fucshin loảng,
crystal violet, cồn 900, dung dịch lugol).
Nutrient agar (NA).
Tủ ấm có thể duy trì ở 370C và 420C.
Túi ni lông tiệt trùng.
Máy đồng nhất mẫu Stomacher.
Pipet, micropipet, đầu hút micropipet tất cả đã được tiệt trùng.
Đèn cồn, ống nghiệm đã được tiệt trùng và có nút bông, giá để ống nghiệm,
que cấy vòng, bút lông, nồi hấp tiệt trùng.

2. Yêu cầu:
 Người làm thí nghiệm phải mang đầy đủ các trang phục yêu cầu trong phòng
thí nghiệm. Phải rửa tay sạch và sát trùng sơ qua bằng cồn 900.
 Nơi tiến hành quy trình phải sạch sẽ thoáng mát. Mặt bàn phải được chùi
sạch sẽ.
 Các thiết bị, dụng cụ phải được hấp tiệt trùng để đảm bảo cho kết quả kiểm
tra được chính xác.
 Tất cả các thao tác phải được thực hiện bên cạnh ngọn lửa đèn cồn.
 Sau khi tiến hành kiểm tra xong, các mẫu và các dụng cụ phải được hấp tiệt
trùng, đem bỏ mẫu và rửa lại sạch sẽ.
3. Quy trình và cách thực hiện:
Bước 1: Tiền tăng sinh.
 Mở ngọn lữa đèn cồn, cho 225ml dung dịch peptone đệm vào túi ni lông.
 Lấy mẫu: lấy 25ml mẫu nước mía. Dùng pipet hút 25ml mẫu nước mía cho
vào túi ni lông đã đựng sẵn 225ml peptone đệm. Trộn 25ml mẫu với 225ml
peptone đệm, đồng nhất mẫu bằng máy đồng nhất khoảng 30 giây. Ghi tên

mẫu vào trên thành ống nghiệm. Sau đó đem ủ ở 370C trong vòng 24h.
11


Bước 2: Tăng sinh chọn lọc:
 Dùng pipet khác hút 9,9ml dung dịch môi trường RV (mở nút bông của ống
nghiệm, hơ miệng ống nghiệm qua ngọn lửa đèn cồn) cho vào ống nghiệm
(hơ tiếp miệng ống nghiệm qua ngọn lửa đèn cồn và đậy nút bông lại).
Chuẩn bị 2 ống nghiệm chứa RV.
 Thay đầu hút của micropipet, chỉnh micropipet về vạch 0,1ml. Hút 0,1ml
dung dịch mẫu sau khi được ủ 24h, cho vào 2 ống nghiệm chứa môi trường
RV ( làm tương tự trên). Đem ủ trong tủ ấm khoảng 420C và trong 24h.







Bước 3: Phân lập:
Sau khi tăng sinh trong môi trường RV ( có màu xanh nước biển vì chứa
Malachite green) ta thấy ống nghiệm chuyển sang màu xanh nhạt hơn với
màu xanh của môi trường RV ban đầu chứng tỏ trong mẫu nước mía nghi
ngờ có Salmonella.
Dùng que cấy vòng, đốt nóng đỏ trên ngọn lửa đèn cồn, lấy mẫu cấy vào
trong đĩa chứa môi trường thạch XLD ( có màu đỏ vì chứa Phenol red). Ta
mở nút bông của ống nghiệm sau đó (cà nhẹ que lấy mẫu trên thành ống để
làm nguội que cấy) lấy mẫu bằng cách nhúng que cấy vào trong dung dịch,
rút nhẹ ra ngoài, hơ miệng ống nghiệm qua ngọn lửa đèn cồn. Đậy nút bông
lại. Cấy mẫu và đĩa, ta mở hờ nắp đĩa bằng 1 tay, phía được mở hướng về

phía ngọn lửa đèn cồn, tay còn lại cấy mẫu bằng cách kéo theo hình zíc zắc
đều từ gần thành đĩa ra tới giữa đĩa, xoay đĩa đi qua góc khác và làm tương
tự nhưng bây giờ ta cấy thành hang song song.
Làm tương tự với đĩa thứ 2. Ghi tên mẫu lên thành của đĩa.
Lật ngược các đĩa lại và đem đi ủ trong tủ ấm 370C trong 24h.

Bước 4: Nhận diện khuẩn lạc điển hình:
 Khuẩn lạc điển hình của Salmonella trên môi trường XLD: đỏ cùng màu với
môi trường, trong, đôi khi có tâm đen do Salmonella sinh khí H 2S kết hợp
với Fe2+ tạo ra hợp chất FeS kết tủa có màu đen.
 Quan sát đĩa XLD sau khi ủ 24h ta không thấy khuẩn lạc điển hình của
Salmonella trên môi trường XLD.
Bước 5: khẳng định:
 Kết luận trong mẫu nước mía mang đi kiểm tra định tính Salmonella, ta nhận
thấy không có sự xuất hiện của Salmonella.
12


SV viết bài: Đặng Thị Hoài Bắc

PHƯƠNG PHÁP KIỂM TRA ĐỊNH TÍNH VI KHUẨN STAP. AUREUS

Sinh viên viết bài: Nguyễn Thị Bảo Châu
GIỚI THIỆU:
Staphylococcus aureus hay Tụ cầu vàng là một loài tụ cầu khuẩn Gram-dương kỵ
khí tùy nghi, và là nguyên nhân thông thường nhất gây ra nhiễm khuẩn trong các
loài tụ cầu. Nó là một phần của hệ vi sinh vật sống thường trú ở da được tìm thấy ở
cả mũi và da. Khoảng 20% dân số loài người là vật mang lâu dài của S. aureus.
Phương pháp kiểm tra định tính nhằm xác định có hay không sự hiện diện của
S.aureus

Quy trình thực hiện

13


Chú ý: tất cả các thao tác đều được thược hiện trong môi trường điều kiện vô
trùng hoặc cách đèn cồn 5cm, thao tác nhanh chính xác,các ống nghiệm que cấy
và các dụng cụ khác đều được tiệt trùng trước khi sử dụng, các ống hay đĩa môi
trường trước khi mang đi ủ phải ghi rõ các thông tin cần thiết như tên mẫu, môi
trường, nồng độ, ngày ủ, người thực hiện,…
1. Đồng nhất, pha loãng mẫu
a. Dụng cụ, thiết bị
Pipet, bình tam giác 250ml, đèn cồn, máy rung.
b. Hóa chất, môi trường
Dịch mẫu nguyên chất. Dung dịch nước muối vô trùng (0,85%)
c. Cách thực hiện
Đong 90ml dd nước muối vô trùng cho vào bình tam giác. Dùng pipet hút
10ml dịch mẫu cho vào bình tam giác giác chứa nước muối vô trùng. Để
bình vào máy rung để đồng nhất mẫu. Ta thu được dung dịch mẫu với
nồng độ 10-1.
2. Tăng sinh Stap.aureus
a. Dụng cụ, thiết bị
Micropipette, đèn cồn, tủ ủ Incubator.
b. Hóa chất, môi trường
2 ống nghiệm chứa môi trường MSB. Dung dịch mẫu nồng độ 10-1.
c. Cách thực hiện
Dùng micropipet hút 1ml dịch mẫu nồng độ 10 -1 lần lượt cho vào 2 ống
nghiệm chứa môi trường MSB (mỗi ống 1ml). Gói cẩn thận 2 ống trên
vào giấy báo sau đó cho vào tủ ủ để ở 37oC trong 24h.
d. Kết quả

Cả 2 ống đều chuyển từ màu đỏ sang vàng => tăng sinh dương tính.
3. Cấy phân lập
a. Dụng cụ, thiết bị
Que cấy trang, đèn cồn, tủ ủ Inclubator
b. Hóa chất, môi trường
2 ống tăng sinh MSB+, 4 đĩa petri chứ môi trường Baird Parter Agar (BP
Agar), tủ ủ.
c. Cách thực hiện
Dùng que cấy trang cấy phân lập 2 ống MSB + trên các đĩa petri chứa môi
trường BP Agar, mỗi ống 2 đĩa. Gói gọn số đĩa đã cấy vào giấy báo,
mang đi ủ ở 37oC trong 24h, lật ngược đĩa khi ủ.
d. Kết quả
14


Nhận dạng khuẩn lạc điển hình: khuẩn lạc điển hình của Stap.aureus trên
BP Agar có đường kính từ 2-5 mm, tròn, bóng, lồi, màu đen, có viền sáng
xung quanh khuẩn lạc. Một số dòng có thể xuất hiện các vòng mờ đục
(khi kéo dài thời gian ủ) ở bên trong của viền sáng trong (do tác động của
lipase).
Sau khi ủ, có 3 đĩa có các khuẩn lạc điển hình, dùng bút lông khoanh tròn
đánh dấu các khuẩn lạc.
4. Nhuộm Gram, quan sát dưới kính hiển vi
a. Dụng cụ, thiết bị
Kính hiển vi, tiêu bản, đèn cồn, giấy lọc, que cấy trang.
b. Hóa chất, môi trường
Thuốc nhuộm crystal violet, dung dịch lugol, cồn 96o, thuốc nhuộm
fuchsin kiềm loãng, nước rửa.
c. Cách tiến hành
- Dùng que cấy trang lấy khuẩn lạc điển hình cho lên mặt trên phiến

kính, cho thêm vào 1 giọt nước ( phạm vi được đánh dấu).
- Dàn đều vi khuẩn trên khu vực đã đánh dấu.
- Cố định vết bôi trên ngọn lửa đèn cồn.
- Đặt mảnh giấy lọc lên vết bôi.
- Nhỏ thuốc nhuộm crystal violet lên miếng giấy lọc sao cho đủ thấm
xuống vết bôi, để 1-2 phút. Rửa nước.
- Nhỏ dung dịch lugol lên vết bôi vừa được nhuộm, để khoảng 1 phút.
Rửa nước
- Tẩy màu bằng cồn 96o khoảng 15-30 giây. Rửa nước.
- Đặt 1 mảnh giấy lọc khác lên vết bôi
- Nhỏ thuốc nhuộm fuchsin kiềm loãng lên miếng giấy lọc sao cho đủ
thấm xuống vết bôi, để khoảng 1 phút. Rửa nước.
- Thấm khô tiêu bản để xem dưới kính hiển vi.
d. Kết quả
Quan sát dưới kính hiển vi vi khuẩn Stap. aureus là các tụ cầu khuẩn bắt
màu tím của thuốc nhuộm crystal violet
5. Cấy khuẩn lạc điển hình vào NA
a. Dụng cụ, thiết bị
Que cấy trang, đèn cồn, tủ ủ.
b. Hóa chất, môi trường
2 ống môi trường thạch nghiêng NA
c. Cách thực hiện

15


Dùng que cấy trang cấy chuyển khuẩn lạc điển hình từ đĩa petri BP Agar
sang môi trường thạch nghiêng NA. Gói cẩn thận các ống rồi mang đi ủ ở
37oC trong 24h.
d. Kết quả

Các khuẩn lạc màu vàng mọc theo đường cấy trên thạch nghiêng NA.
6. Phản ứng sinh hóa tiến hành với huyết tương thỏ có cho thêm lòng đỏ
trứng.
Mục đích: thử nghiệm khả năng làm đông tụ huyết tương bởi enzyme
coalulase. Lòng đỏ trứng được cho vào môi trường để phát hiện khả năng
sinh tổng hợp lycithinase của S.aureus.
a. Dụng cụ, thiết bị
Micropipette, 2 ống nghiệm, đèn cồn, que cấy.
b. Hóa chất, môi trường
Nước muối sinh lý vô trùng, tube huyết tương thỏ đông khô.
c. Cách thực hiện
- Làm tan huyết tương thỏ đông khô: dùng micropipette hút 1ml nước
muối sinh lý vô trùng cho vào tube huyết tương thỏ đông khô. Sau đó
lăn nhẹ tube trong long bàn tay cho huyết tương tan hoàn toàn. Không
được lắc mạnh
- Làm huyền dịch vi khuẩn: hút 1ml nước muối sinh lý vô trùng vào
ống nghiệm, dùng que cấy trang cấy chuyển vi khuẩn từ ống chứa môi
trường thạch nghiêng NA sang ống chứa nước muối sinh lý, đến khi
huyền dịch đục là được.
- Chỉnh micropipette xuống vạc chia 0,5ml. Hút 0,5ml dung dịch huyết
tương thỏ cho vào ống nghiệm, bỏ đầu hút pipet. Tiếp tục hút 0,5ml
huyền dịch vi khuẩn cho vào ống nghiệm trên, trộn đều bằng cách lăn
nhẹ trong long bàn tay.
- Ủ trong tủ ấm khoảng 37oC.
d. Kết quả
Đọc kết quả bằng cách quan sát sự đông tụ sau 2 giờ, 4 giờ, 6 giờ, 12 giờ
trong quá trình ủ.
Nghiêng nhẹ tube lần lượt sau các khoảng thời gian như trên thì ta thấy
không có hiện tượng huyết tương thỏ đông tụ vì vậy không có
Stap.aureus trong mẫu nước mía đem kiểm tra.


16


Phản ứng sinh hóa IDS14 GNR
I.
Mục đích
- Góp phần định danh VSV Gram (-)
II.
Nguyên tắc
- Sử dụng VSV thuần, VSV còn non. Đọc kết quả đúng thời gian quy định
(sau 18-24h nuôi cấy).
- IDS 14 GNR là hệ thống gồm 14 phản ứng sinh hóa cơ bản. Các đĩa giấy
sinh hóa được gắn vào 10 đáy giếng
Giếng
1

Phản ứng
Lên men Glucose
17


2
3
4
5
6
7
8
9

10

Khử Nitrate
β-Galactosidase (với ONPG)
Urease
Phenylalanin Deaminase (PAD)
Sử dụng CIT
Thủy phân Esculin
Sinh H2S
Sinh Indol (IND)
Voges – Proskauer (VP)
Sử dụng Malonate

- Thực hiện Oxidase Test trên đĩa giấy rời được bảo quản trong lọ nắp chặt có
chất hút ẩm.
- Thực hiệm LDC và MOB test trong chai môi trường thạch mềm Lysine
decarboxylase – motility.
III. Cơ chế của các phản ứng sinh hóa
1. Thử nghiệm khả năng lên men
- Khi sử dụng các nguồn cacbon để lên men, tùy phương thức lên men các
sảnphẩm tạo ra sẽ khác nhau bao gồm rượu, các acid hữu cơ, CO2,… Trong
tất cả các trường hợp, các sản phẩm tạo thành đều làm giảm pH môi trường
dẫn đến sự thay đổi màu của chỉ thị pH trong môi trường.
2. Thử nghiệm Nitratase (khử Nitrate)
- Nhằm xác định vi sinh vật có có hệ enzyme citratase có khả năng khử nitrat
thành nitrite hay nitơ tự do trong điều kiện kị khí. Nitrite được tạo ra sẽ phản
ứng vớisulphanilamide và N-napthylethylenediamine hydrochloride ở pH
acid cho hợp chất cómàu hồng.
3. Thử nghiệm ONPG
- Các vi khuẩn có khả năng len men đường lactose nhanh có khả năng sản

xuất cả2 loại men lactose permease và β-galactosidase. Một số vi khuẩn
18


được xem là nhóm vikhuẩn lên men lactose chậm chỉ sản xuất được βgalactosidase. Hoạt tính của enzymenày có thể xác định dựa một cơ chất
tổng hợp là o-nitrophenyl-D-galactopyranoside(ONPG). Sự thủy phân của
cơ chất đường này bởi β-galactosidase sẽ phóng thích onitrophenolcó màu
vàng.
4. Thử nghiệm khả năng biến dưỡng citrate
- Sự biến dưỡng citrate bởi vi sinh vật sẽ tạo ra CO2 làm kiềm hóa môi
trường. Mặt khác mọi sinh vật có khả năng sử dụng citrate làm nguồn
cacbon duy nhất đều có khả năng dùng muối ammonium làm nguồn đạm
duy nhất. Sự phân giải của muối ammonium dùng làm nguồn đạm trong môi
trường sẽ sinh NH3 làm kiềm hóa môi trường. Sự gia tăng giá trị pH này
được chỉ thị bằng sự đổi màu của chỉ thị pH trong môi trường.
5. Thử nghiệm Urease
- Vi khuẩn tiết men urease có khả năng thủy phân urê trong môi trường thành
CO2 và NH3 làm môi trường bị kiềm hóa. Chất chỉ thỉ Phenol Red trong
môi trường thử nghiệm làm môi trường chuyển sang màu đỏ
6. Phenylalanine deaminase (PAD)
- Một số vi khuẩn thuộc bộ lạc Proteeae như Proteus, Morganella, Providencia
có khả năng sản xuất men deaminase khử amin của amino acid
phenylalanine thành một keto acid, chất này kết hợp với ion sắt trong thuốc
thử Ferric chloride 10% để cho ra màu xanh lá cây.
7. Thử nghiệm bile esculine
- Thử nghiệm này giúp phân biệt vi sinh vật dựa trên khả năng thủy phân liên
kết glucoside trong esculine thành esculetin và glucose tự do khi có sự hiện
19



diện của muối mật. Esculetin tạo ra sẽ phản ứng với muối sắt trong môi
trường thử nghiệm tạo thành hợp chất màu đen hay nâu đen.
8. Thử nghiệm khả năng sinh indol
- Thử nghiệm này phát hiên vi sinh vật sản xuất men tryptophanase khi nuôi
cấy vi sinh vật trong môi trường canh trypton. Phản ứng thủy phân trytophan
tạo thành Indole, chất này kết hợp với Para-dimethylamino benzaldehyde
trong thuốc thử Kovác cho ra một hợp chất muối dimethyl ammonium màu
đỏ.
9. Thử nghiệm VP (Voges – Proskauer)
- Thử nghiệm VP nhằm mục đích phát hiện acetoin, một sản phẩm trung tính
trong quá trình trao đổi glucose trong tế bào vi sinh vật. Chất này bị oxid
hóa trong môi trường kiềm biến đổi thành diacetyl, dưới sự xúc tác của
alpha-naphthol để cho một phức chất màu hồng đỏ.
10.Thử nghiệm khả năng biến dưỡng malonate
- Thử nghiệm nhằm xác định khả năng của vi sinh vật sử dụng malonate như
là nguồn carbon duy nhất trong môi trường. Các vi sinh vật biến dưỡng
malonate sẽ sử dụng chu trình glyoxylic acid để biến dưỡng năng lượng.
Nếu không sử dụng được malonate, chất này có tác dụng như một chất diệt
khuẩn. Các vi sinh vật có khả năng biến dưỡng malonate đồng thời có khả
năng sử dụng ammonium là nguồn đạm duy nhất. Do vậy khả năng biến
dưỡng malonate được ghi nhận nhờ sự phóng thích NH3 làm kiềm hóa môi
trường và chuyển màu của chỉ thị pH.
11.Thử nghiệm KIA

20


- Thử nghiệm này nhằm phát hiện khả năng sử dụng các nguồn
carbonhydrate, khả năng sinh H2S và sinh khí trong môi trường KIA chứa
hai loại đường lactose 1% và glucose 0.1%. Sau khi nuôi cấy chủng này 1824 giờ, có ba trường hợp có thể xảy ra:

 Nếu vi sinh vật chỉ lên men glucose, phần trên bề mặt của ống thạch nghiêng
trở nên có pH kiềm và phần sâu trong ống có pH acid. Điều này có thể giải
thích do vi sinh vật sau khi sử dụng hoàn toàn lượng glucose ít ỏi trên bề
mặt mội trường, chúng tiếp tục dị hóa pepton trong môi trường giải phóng
NH3 làm phần bề mặt của môi trường có pH kiềm. Ở phần sâu trong môi
trường với điều kiện thiếu ôxi, glucose được lên men kỵ khí sinh ra các acid
hữu cơ làm giảm pH của môi trường. Nếu trong môi trường có chất chỉ thị
phenol red thì trên mặt thạch nghiêng sẽ có màu đỏ và phần sâu sẽ có màu
vàng.
 Nếu vi sinh vật có thể sử dụng cả glucose và lactose, toàn bộ môi trường trở
nên có pH acid, vi sinh vật không cần phải sử dụng đến pepton để tạo năng
lượng.
 Nếu vi sinh vật không sử dụng được cả hai nguồn carbon này, thì pepton
được sử dụng để biến dưỡng thu năng lượng và vật chất cần cho sự tăng
trưởng của vi sinh vật. Tuy nhiên, do pepton chỉ được biến dưỡng trong điều
kiện hiếu khí nên hiện tượng kiềm hóa chỉ diễn ra trên phần của bề mặt môi
trường và chỉ phần này mới trở nên có màu đỏ. Trong khi đó, phần môi
trường sâu trong ống nghiệm sẽ không có hiện tượng đổi màu.
- Trong các trường hợp nêu trên, sự lên men đường tạo ra các sản phẩm khí
được nhận biết nhờ các khí này đẩy ống thạch lên trên hay làm vỡ thạch.
Thử nghiệm này cũng có thể phát hiện khả năng sinh H2S do thành phần
môi trường có chứa sodium thiosulphate. Vi sinh vật khử sulfate có thể khử
hợp chất này để giải phóng H2S. Khí H2S tạo ra sẽ được phát hiện dựa vào

21


phản ứng tạo kết tủa màu đen FeS giữa H2S và ion Fe2+ của chỉ thị
ammonium citrate hiện diện trong môi trường.
12.Thử nghiệm tính di động

- Vi sinh vật di động thường là các vi sinh vật có tiêm mao phân bố tại các vi
trí khác nhau trên tế bào vi sinh vật. Trong môi trường thử nghiệm tính di
động thường bổ sung triphenyltetrazolium chloride để phát hiện dễ dàng vị
trí hiện diện của tế bào vi sinh vật trong môi trường do hợp chất này khi vào
bên trong tế bào sẽ bị khử thành formazan có màu đỏ.
13.Thử nghiệm decarboxylase
- Thử nghiệm này giúp xác định khả năng một vi sinh vật tạo enzyme
carboxylase thủy phân được các axít amin đặc hiệu để xúc tác phản ứng loại
bỏ nhóm carboxyl. Các enzyme carboxylase chỉ được cảm ứng tổng hợp khi
môi trường có tính acid và chứa chất cảm ứng đặc hiệu. Phản ứng tạo CO2
trong điều kiện kỵ khí, CO2 sinh ra làm giảm pH của môi trường và được
ghi nhận qua sự đổi màu của chỉ thị pH.

IV. Chuẩn bị và cách tiến hành
1. Đĩa giấy oxidase (OXI): thực hiện thử nghiệm oxidase
- Nhỏ một giọt nước muối sinh lý vô trùng lên lame.
- Dùng kẹp giấy lấy một đĩa giấy oxidase nhúng vào giọt nước muối sinh lý
cho vừa đủ ướt và đặt lên lame.
- Dùng vòng cấy vô trùng lấy khúm khuẩn quệt lên đĩa giấy oxidase.
- Đọc kết quả sau 10 giây: phản ứng dương tính khi đĩa giấy oxidase xuất hiện
màu tím đen; âm tính khi đĩa giấy oxidase không có màu tím đen.
2. Bảng nhựa có 10 giếng chứa 10 loại đĩa giấy sinh hóa

22


- Dùng tăm bông vô trùng lấy khúm khuẩn cho vào nước muối sinh lý vô
trùng để làm thành huyền dịch có độ đục McFarland 2,0.
- Cho vào mỗi giếng 200 μl huyền dịch, đậy nắp.
- Ủ 35-37oC/12-24 giờ.

3. Môi trường Lysin decarboxylase (LDC) thực hiện thử nghiệm
Lysindecarboxylase
- Dùng pipet pasteur hay micropiper lấy 2-3 giọt huyền phù cho vào môi
trường LDC, xuyên pha lớp parafilm.
- Ủ 35-37oC/12-24 giờ.
- Đọc kết quả: dương tính khi môi trường có vi khuẩn mọc và có màu tím; âm
tính khi môi trường có màu vàng hoặc có vàng tím.
4. Môi trường mobility (MOB) thực hiện thử nghiệm di động
- Dùng que cấy vô trùng lấy khúm khuẩn và cắm kim cấy cách 2/3 đáy
ampule chứa môi trường MOB, rút que cấy theo chiều thẳng đứng, cấy ria
trên bề mặt thạch.
- Ủ 35-37oC/12-24 giờ
- Đọc kết quả: vi khuẩn có khả năng di động khi màu đỏ lan rộng ra khỏi
đường cấy.
5. Hướng dẫn đọc kết quả các phản ứng sinh hóa trong bộ IDS14 GNR
Giếng

Ký
hiệu

1

GLU

2

NIT

3


ONPG

4

URE

Thử nghiệm
sinh hóa
Lên men
Glucose
Khử Nitrate
thành Nitrite
Thủy giải
ONPG

Thuốc thử
thêm vào

Tìm Nitrite

Kết quả thử nghiệm
(+)
(-)
Vàng

Tím

Đỏ/hồng (xuất hiện
trong vòng 3 phút)


Vàng nhạt

Vàng nhạt

Sinh Urease

Đỏ cánh sen
23

Vàng/đỏ
nhạt


5

PAD

Phenyl
Alanine
Deaminase

6

CIT

Sử dụng
Citrate

7


ESC

Thủy giải
Esculine

H2S

Sinh H2S

IND

Sinh indol

Kovac

9

VP

Voges Proskauer

KOH +
Napthtol

10

MLO

Sử dụng
malonate


8

FeCl3

Xanh lá (xuất hiện
ngay khi bỏ thuốc
thử, để lâu sẽ mất
màu)
Xanh biển (chỉ cần
có ánh xanh biển)
Đen (có màu từ
đen nhạt qua đen
đậm
Đen (xuất hiện đáy
giếng, mất màu khi
nhỏ Kovac vào)
Đỏ bề mặt (đọc sau
1 phút, không đọc
sau 10 phút)
Đỏ (xuất hiện sau 5
phút, không đọc
kết quả sau 2h)
Xanh biển

24

Vàng nhạt
Xanh
lá/vàng

Không đen
Không đen
Vàng bề
mặt
Vàng nhạt
Xanh
lá/vàng


- Sau khi có kết quả các phản ứng sinh hóa cùng số điểm tương ứng với từng
nhóm, ta có được mã định danh. Từ đó ta có thể tra cứu hệ thống mã định
danh của IDS14 GNR để xác định vi khuẩn cần định danh.

V.

Kết quả và kết luận

Giếng
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10

Phản ứng

Lên men Glucose
Khử Nitrate
β-Galactosidase (với ONPG)
Urease
Phenylalanin Deaminase
(PAD)
Sử dụng CIT
Thủy phân Esculin
Sinh H2S
Sinh Indol (IND)
Voges – Proskauer (VP)
Sử dụng Malonate
25

Kết quả
+
+
+
+
-