TỔNG LIÊN ĐOÀN LAO ĐỘNG VIỆT NAM
TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÔN ĐỨC THẮNG
KHOA KHOA HỌC ỨNG DỤNG



NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG NUÔI CẤY NẤM MEN
RHODOTORULA SP TRÊN MÔI TRƯỜNG BÁN RẮN ĐỂ THU
NHẬN BETA CAROTENE

Giảng viên hướng dẫn:

Sinh viên thực hiện:

ThS.NGUYỄN MINH KHANG

TRẦN NGỌC VÂN KHANH

Thành phố Hồ Chí Minh
Tháng 01/2009


TÓM TẮT LUẬN VĂN
TRẦN NGỌC VÂN KHANH, Đại học Tôn Đức Thắng Tp. Hồ Chí Minh.
Tháng 8/2009 “Nghiên cứu ứng dụng nuôi cấy nấm men Rhodotorula sp trên môi
trường bán rắn để thu nhận beta -carotene”
Giáo viên hướng dẫn: Th.S. Nguyễn Minh Khang
Quá trình lên men bán rắn từ nấm men Rhodotorula sp đã tạo được hướng đi
mới trong việc tận dụng các nguồn phụ phẩm rẻ tiền trong sản xuất nông nghiệp và
ngành công nghiệp thực phẩm thành các chế phẩm giàu dinh dưỡng và hàm lượng
beta- carotene đạt 50mg/kg.

Với mục tiêu nghiên cứu: tìm hiểu các điều kiện nuôi cấy nấm men
Rhodotorula sp trên môi trường bán rắn để thu nhận beta carotene, bước đầu chúng tôi
đã thành công khi mật độ tế bào đạt được 7,40.108 CFU/g sau 7 ngày nuôi cấy với các
điều kiện sau:
 Gạo tấm phụ phẩm ngâm 24 giờ, pH 2,0 trước khi hồ hóa
 Thành phần môi trường nuôi cấy gồm cơm tấm : lõi bắp : khoáng K2HPO4 87%:
5% : 2,8%
 Điều kiện nuôi cấy tối ưu với các thông số ban đầu pH = 5,5, độ ẩm = 60% và
lượng giống cấy là 10%
Sau quá trình nghiên cứu, bước đầu tạo sản phẩm bột màu đỏ nâu từ canh
trường nuôi cấy. Thu được chế phẩm bột canh trường nấm men Rhodotorula sp có độ
ẩm <10% với các thành phần như sau :
+ Cơm tấm :

87%

+ Lõi bắp :

5%

+ Bột đậu nành :

10%

+ Dầu ăn :

1%

+ Khoáng (K2HPO4, MgSO4.7H2O) :


1%

+ K2HPO4:

2,8%

+ Hàm lượng beta-caroten :

50mg/kg

ii


MỤC LỤC
Trang
Lời cảm ơn ................................................................................................................... i
Tóm tắt luận văn ..........................................................................................................ii
Mục lục ..................................................................................................................... iii
Danh sách các chữ viết tắt........................................................................................... vi
Danh sách các bảng ...................................................................................................vii
Danh sách các hình ....................................................................................................vii
Danh sách các sơ đồ.................................................................................................... ix
Danh sách các biểu đồ ................................................................................................. x
Chương 1: MỞ ĐẦU.................................................................................................. 1
1.1 ĐẶT VẤN ĐỀ ................................................................................................... 1
1.2 MỤC ĐÍCH VÀ PHẠM VI ĐỀ TÀI .................................................................. 2
1.3 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI ....................................................... 2
Chương 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU........................................................................ 3
2.1. ĐẠI CƯƠNG VỀ NẤM MEN .......................................................................... 3
2.1.1 Tổng quan về nấm men ............................................................................... 3

2.1.2 Hình dạng và kích thước của tế bào nấm men ............................................. 3
2.2 NẤM MEN RHODOTORULA SP ..................................................................... 8
2.2.1 Phân loại..................................................................................................... 8
2.2.2 Hình dạng và kích thước ............................................................................ 9
2.2.3 Cấu tạo và sinh sản của nấm men Rhodotorula sp..................................... 11
2.2.4 Đặc điểm sinh hóa ................................................................................... 13
2.2.5 Đặc điểm sinh lý: ...................................................................................... 14
2.3 BETA-CAROTENE (β-Carotene) ................................................................... 15
2.3.1 Giới thiệu về Carotenoids ......................................................................... 15
2.3.2 Giới thiệu về Beta-Carotene ..................................................................... 20
2.4 Lên men bán rắn .............................................................................................. 24
2.4.1 Khái quát về lên men bán rắn (SSF).......................................................... 24
2.4.2 Các ứng dụng và yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi bán rắn với nấm men
Rhodotorula sp .................................................................................................. 26
iii


Chương 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .............................. 32
3.1 THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU .................................................. 32
3.2 DỤNG CỤ, THIẾT BỊ VÀ HÓA CHẤT ......................................................... 32
3.2.1 Dụng cụ .................................................................................................... 32
3.2.2 Thiết bị ..................................................................................................... 33
3.2.3 Hóa chất .................................................................................................. 33
3.3 NGUYÊN LIỆU VÀ GIỐNG VI SINH VẬT .................................................. 33
3.3.1 Nguyên liệu .............................................................................................. 33
3.3.2 Giống vi sinh vật ...................................................................................... 34
3.4 CÁC MÔI TRƯỜNG SỬ DỤNG (Phụ lục 1) .................................................. 34
3.4.1 Môi trường phân lập nấm men .................................................................. 34
3.4.2 Môi trường giữ giống nấm men ................................................................ 34
3.4.3 Môi trường hoạt hóa nấm men .................................................................. 35

3.4.4 Môi trường nuôi cấy bán rắn ..................................................................... 35
3.5 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................................................................... 36
3.5.1 Các phương pháp phân tích, thu nhận các chỉ tiêu dùng trong nghiên cứu. 36
3.5.2 Phương pháp phân lập và chọn giống ....................................................... 36
3.5.3 Phương pháp bố trí thí nghiệm.................................................................. 37
3.6 TỐI ƯU HÓA MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY .................................................... 44
3.6.1 Tối ưu tỉ lệ cơm tấm bổ sung vào thành phần môi trường nuôi cấy bán rắn
.......................................................................................................................... 44
3.6.2 Tối ưu tỉ lệ lõi bắp bổ sung vào thành phần môi trường nuôi cấy bán rắn45
3.6.3 Tối ưu tỉ lệ khoáng K2HPO4 bổ sung vào thành phần môi trường nuôi cấy
bán rắn .............................................................................................................. 46
3.7. PHƯƠNG PHÁP QUY HOẠCH THỰC NGHIỆM ........................................ 47
3.7.1. Mục đích ................................................................................................. 47
3.7.2. Phương pháp xử lý số liệu ....................................................................... 47
3.8 THỬ NGHIỆM SẢN XUẤT CHẾ PHẨM ...................................................... 49
3.9 PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU ................................................................ 49
Chương 4: K ẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .............................................................. 50
4.1 KHẢO SÁT CÁC ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI CỦA NẤM MEN
RHODOTORULA .................................................................................................. 50
iv


4.2. KHẢO SÁT THÀNH PHẦN MÔI TRƯỜNG NUÔI BÁN RẮN ................... 52
4.3 XÂY DỰNG ĐƯỜNG CONG SINH TRƯỞNG CỦA NẤM MEN
RHODOTORULA TRÊN MÔI TRƯỜNG LÊN MEN BÁN RẮN ......................... 56
4.4. KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA pH VÀ THỜI GIAN NGÂM GẠO ........... 58
4.5. TỐI ƯU HÓA MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY ................................................... 60
4.5.1 Tối ưu tỉ lệ cơm tấm bổ sung vào thành phần môi trường nuôi cấy bán rắn ... 60
4.5.2 Tối ưu tỉ lệ lõi bắp bổ sung vào thành phần môi trường nuôi cấy bán rắn ...... 61
4.5.3 Tối ưu tỉ lệ khoáng K2HPO4 bổ sung vào thành phần môi trường nuôi cấy bán

rắn ......................................................................................................................... 63
4.6 TỐI ƯU HÓA THÀNH PHẦN MÔI TRƯỜNG NUỐI CẤY NẤM MEN
RHODOTORULA BẰNG PHƯƠNG PHÁP THỰC NGHIỆM.............................. 64
4.7 THỬ NGHIỆM SẢN XUẤT CHẾ PHẨM ...................................................... 66
4.8 KIỂM TRA CHẤT LƯỢNG CHẾ PHẨM....................................................... 67
4.9 TÍNH GIÁ THÀNH SẢN PHẨM .................................................................... 67
Chương 5: KẾT QUẢ VÀ KIẾN NGHỊ ................................................................. 69
5.1 KẾT LUẬN ..................................................................................................... 69
5.2 KIẾN NGHỊ .................................................................................................... 69
TÀI LIỆU THAM KHẢO ....................................................................................... 70
PHỤ LỤC 1 .............................................................................................................. 72
PHỤ LỤC 2 .............................................................................................................. 74
PHỤ LỤC 3 .............................................................................................................. 81
PHỤ LỤC 4 .............................................................................................................. 86

v


DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT
SSF

Solid State Fermentation (Lên men bán rắn)

LDL

Low-Density Lipoprotein (lipoprotein có tỷ trọng thấp)

LSD

Sai số nhỏ nhất


Rh

Rhodotorula

Sp

loài

MT

Môi trường

TG

Thời gian

CSS

Corn steep solid ( Bột ngô ngâm)

VSV

Vi sinh vật

vi


DANH SÁCH CÁC BẢNG
Trang

Bảng 2.1 Thành phần hóa học của tế bào nấm men ...................................................... 4
Bảng 2.2 Hình thái tế bào của một số loài Rhodotorula sp nuôi cấy tên môi trường
thạch malt từ các nguồn phân lập khác nhau .............................................................. 10
Bảng 2.3 Đặc điểm sinh lý ......................................................................................... 14
Bảng 3.1: Danh sách dụng cụ sử dụng ....................................................................... 32
Bảng 3.2: Danh sách các thiết bị sử dụng ................................................................... 33
Bảng 3.3 Bảng phân phối nghiệm thức ...................................................................... 42
Bảng 3.4 Các yếu tố thí nghiệm ................................................................................. 48
Bảng 3.5 Bố trí thí nghiệm ......................................................................................... 49
Bảng 4.1: Kết quả phân tích một số chỉ tiêu của nguyên liệu ban đầu ........................ 53
Bảng 4.2: Kết quả khảo sát môi trường lên men bán rắn ............................................ 53
Bàng 4.3: Kết quả theo dõi sự phát triển của nấm men theo ngày............................... 55
Bảng 4.4: Kết quả theo dõi sự phát triển của nấm men theo ngày trên môi trường 2 .. 56
Bảng 4.5: Kết quả ảnh hưởng của pH ngâm gạo đến mật độ nấm men phát triển trong
quá trình nuôi cấy ...................................................................................................... 58
Bảng 4.6: Kết quả ảnh hưởng của thời gian ngâm gạo đến mật độ tế bào nấm men phát
triển trong quá trình nuôi cấy ..................................................................................... 59
Bảng 4.7: Kết quả thí nghiệm tối ưu hóa thành phần cơm ......................................... 60
Bảng 4.8 : Kết quả thí nghiệm tối ưu hóa tỉ lệ lõi bắp ................................................ 61
Bảng 4.9 : Kết quả thí nghiệm tối ưu hóa thành phần khoáng K2HPO4 ...................... 63
Bảng 4.10 : Mức biến thiên của các nhân tố sinh trưởng ............................................ 64
Bảng 4.11 : Kết quả thí nghiệm theo phương pháp thực nghiệm ................................ 65
Bảng 4.12 : Chi phí trong 1 lít môi trường nhấn giống nấm men Rhodotorula ........... 67
Bảng 4.13 : Chi phí trong 1 kg môi trường lên men bán rắn ....................................... 68

vii


DANH SÁCH CÁC HÌNH
Trang

Hình 2.1: Nấm men Rhodotorula sp............................................................................. 8
Hình 2.2: Tế bào nấm men Rhodotorula glutinis .......................................................... 8
Hình 2.3: Các sắc tố carotenoid chủ yếu của nấm men Rhodotorula sp ...................... 14
Hình 2.4: Công thức cấu tạo của các carotenoids quan trọng...................................... 16
Hình 2.5: Phân loại carotenoids ................................................................................. 17
Hình 2.6:Con đường tổng hợp carotenoid ở vi sinh vật do Simpson đề nghị .............. 19
Hình 2.7: Cấu trúc phân tử Betacaroten ..................................................................... 20
Hình 2.8: Cấu trúc phân tử Betacaroten trong không gian 3D ................................... 20
Hình 2.9: Cấu trúc Vitamin A .................................................................................... 21
Hình 2.10: Sinh tổng hợp vitamin A từ Beta-Carotene ............................................... 22
Hình 4.1: Nấm men đỏ trên môi trường thạch Hensen ............................................... 50
Hình 4.2: Cấy trang quan sát khuẩn lạc trên môi trường thạch Hensen....................... 50
Hình 4.3: Nấm men đỏ quan sát dưới vật kính x 40.................................................... 51
Hình 4.4: Nấm men đỏ quan sát dưới vật kính x100................................................... 51

viii


DANH SÁCH CÁC SƠ ĐỒ
Trang
Sơ đồ 3.1: Sơ đồ nuôi cấy bán rắn nấm men Rodotorula ............................................ 37
Sơ đồ 3.2: Sơ đồ bố trí thí nghiệm 1........................................................................... 40
Sơ đồ 3.3: Sơ đồ bố trí thí nghiệm 2........................................................................... 43

ix


DANH SÁCH CÁC BIỂU ĐỒ
Trang
Biểu đồ 4.1: Khảo sát môi trường lên men bán rắn..................................................... 54

Biểu đồ 4.2: Sự phát triển của nấm men trên môi trường bán rắn ............................... 55
Biểu đồ 4.3: Đường cong sinh trưởng của nấm men Rhodotorula trên môi trường 2 ...... 57
Biểu đồ 4.4: Khảo sát ảnh hưởng của pH nước ngâm gạo .......................................... 58
Biểu đồ 4.5: Khảo sát ảnh hưởng của thời gian ngâm gạo .......................................... 59
Biểu đồ 4.6 : Kết quả tối ưu hóa thành phần cơm ....................................................... 60
Biểu đồ 4.7 : Kết quả tối ưu hóa tỉ lệ lõi bắp .............................................................. 62
Biểu đồ 4.8 : Tối ưu hóa tỉ lệ khoáng K2HPO4 ........................................................... 63
Biểu đồ 4.9 : Biểu đồ thí nghiệm theo phương pháp thực nghiệm .............................. 66

x


Chương 1

MỞ ĐẦU
1.1 ĐẶT VẤN ĐỀ
Việt Nam là nước nông nghiệp đang phát triển kéo theo sự phát triển của các
ngành khoa học kỹ thuật. Công nghệ sinh học đã và đang trở thành một trong những
ngành được quan tâm hàng đầu trên thế giới nói chung và ở Việt Nam nói riêng. Công
nghệ sinh học phát triển nhanh chóng đang tạo ra một cuộc cách mạng sinh học trong
các ngành nông nghiệp và công nghiệp thực phẩm, làm thay đổi phương thức sản xuất
trong các ngành y dược, năng lượng khai khoáng và bảo vệ môi trường.
Khi đất nước ngày càng phát triển, cùng với quá trình công nghiệp hóa hiện đại
hóa. Các ngành nông nghiệp, công nghiệp nâng cao năng suất và các sản phẩm ngày
càng tăng, đa dạng hơn về mặt số lượng cũng như chất lượng. Việc ứng dụng phế liệu
trong ngành nông nghiệp để tạo ra một sản phẩm sinh học có giá trị là một vấn đề đang
được hầu hết các nhà khoa học quan tâm.
Các kết quả nghiên cứu cho thấy tại Việt Nam rất phổ biến giống nấm men
Rhodotorula. Một số chủng đã được nghiên cứu về khả năng tạo sinh khối, tích lũy
carotenoid, chất béo đặc biệt là các acid béo không no có giá trị sinh học cao trên các

phế phụ phẩm chế biến nông sản thực phẩm.
Nấm men Rhodotorula là một trong rất ít giống nấm men có khả năng tổng hợp
một lượng lớn các sắc tố carotenoid trong đó chủ yếu là beta-carotene, một hợp chất có
hoạt tính sinh học, có vai trò quan trọng trên người, gia súc, gia cầm…
Ngoài việc được ứng dụng nhiều trong các lĩnh vực y học, beta-caroten còn
được quan tâm hơn khi bổ sung vào các loại thực phẩm cho người và thức ăn gia súc
nhằm nâng cao giá trị dinh dưỡng, cũng như cải thiện và giảm thiểu một số bệnh do
thiếu vitamin A. Tại các nước có nền sinh học phát triển nấm men Rhodotorula đã
được nghiên cứu và được sử dụng như một nguồn cung cấp chất màu thực phẩm an
toàn, sinh khối nấm men có giá trị dinh dưỡng cao được dùng trong chăn nuôi....

1


Đứng trước nhu cầu đó, bước đầu chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu ứng
dụng nuôi cấy nấm men Rhodotorula sp trên môi trường bán rắn để thu nhận
beta -carotene”
1.2 MỤC ĐÍCH VÀ PHẠM VI ĐỀ TÀI
Khảo sát những điều kiện tối ưu nhất cho sự phát triển của nấm men đỏ
Rhodotorula sp trên môi trường bán rắn thông qua việc tận dụng các nguồn nguyên vật
liệu phụ phẩm rẻ tiền từ các ngành nông nghiệp, công nghiệp, công nghiệp thực
phẩm,… để thu được lượng sinh khối cao nhất.
1.3 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI
- Xây dựng đường cong sinh trưởng của chủng Rhodotorula sp trên môi trường bán
rắn.
- Quan sát vi thể và đại thể của chủg nấm men đỏ Rhodotorula sp
- Lựa chọn ra môi trường bán rắn thích hợp nhất cho việc nuôi cấy nấm men đỏ
Rhodotorula sp.
- Tối ưu hóa các thành phần môi trường nuôi cấy.
- Sản xuất chế phẩm beta-carotene từ nấm men đỏ Rhodotorula sp trên môi trường

tối ưu.
- Kiểm tra hàm lượng beta-carotene trong chế phẩm sản xuất.

2


Chương 2

TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. ĐẠI CƯƠNG VỀ NẤM MEN
2.1.1 Tổng quan về nấm men [2], [6], [7], [12]
Nấm men là tên chung để chỉ nhóm nấm thường có cấu tạo đơn bào và thường
sinh sản vô tính theo lối nảy chồi. Nấm men không thuộc về một nhóm phân loại nào
nhất định, chúng có thể thuộc ngành Nấm túi (Ascomycota) hoặc ngành Nấm đảm
(Basidiomycota).
Nấm men phân bố hết sức rộng rải trong tự nhiên: đất, nước, lương thực thực
phẩm, rau quả,… Đặc biệt chúng hiện diện nhiều ở các môi trường chứa đường, pH
thấp như đất trồng nho và cây ăn quả.
Nấm men có khả năng sinh sản nhanh chóng, sinh khối giàu protein, vitamin và
lipid. Vì vậy chúng được sử dụng rộng rãi trong công nghệ chế biến rượu trắng, rượu
vang, bia, cồn, thức ăn bổ sung cho người và gia súc, làm nở bột mì, gây hương nước
chấm, làm dược phẩm, sản xuất enzym, sản xuất acid citric từ khí thiên nhiên, sản xuất
riboflavin (vitamin B2), .... Bên cạnh rất nhiều nấm men có ích còn có những loại nấm
men có thể gây bệnh (Candida, Mycoderma).
2.1.2 Hình dạng và kích thước của tế bào nấm men [3], [7]
2.1.2.1 Hình dạng nấm men [7]
Nấm men thường có cấu tạo đơn bào. Hình dạng tế bào nấm men thường thay đổi
tùy theo loài, ngoài ra một phần còn phụ thuộc vào tuổi giống và điều kiện ngoại cảnh,
điều kiện nuôi cấy. Nói chung nấm men thường có hình trứng, bầu dục
(Saccharomyces serevisiae), hình cầu (Candida utilis), hình oval hoặc elip, hình ống

(Pychia), hình trụ, hình quả chanh, hình tam giác,…và một số hình dạng đặc biệt. Hình
dạng của nấm men hầu như không ổn định, nó phụ thuộc vào tuổi của nấm men và
điều kiện nuôi cấy.
Ngoài ra một số loài nấm men có tế bào hình que nối với nhau thành những sợi
gọi là khuẩn ty hoặc khuẩn ty giả, thường gặp ở các giống Endomycopsis, Candida,
Trichosporon.
3


2.1.2.2 Kích thước tế bào nấm men [7]
Kích thước tế bào nấm men thay đổi rất nhiều, theo từng giống, từng loài, hay
tuổi sinh lý. Nói chung thường to hơn tế bào vi khuẩn từ 5 ÷ 10 lần. Kích thước trung
bình của tế bào nấm men.
 Chiều dài: 9 ÷ 10 µm.
 Chiều rộng: 2 ÷ 7 µm.
Các loài nấm men đơn bào trong công nghiệp thường có kích thước 3 – 5 µm. x
5- 10 µm.
2.1.3 Dinh dưỡng nấm men
2.1.3.1 Thành phần hóa học của tế bào nấm men [12]
Thành phần cơ bản và chủ yếu là nước (nước liên kết và nước tự do) - khoảng
75% khối lượng chung. Thành phần sinh khối khô của nấm men như sau (%)
Bảng 2.1 Thành phần hóa học của tế bào nấm men
Chất hữu cơ

5-10 %

Cacbon

25-50 %


Nitơ

4,8-12 %

Protein

30-75 %

Lipid

2-5 %

Chất khô của tế bào nấm men gồm có 23 – 28 % là chất hữu cơ và 5 – 7 % chất tro.
Chất hữu cơ gồm có : Protein 13 -14 %, glucogen 6 – 8 %, xenluloza 1,8 -2 %, chất
béo 0,5 – 2 %.
2.1.3.2 Dinh dưỡng nấm men [12]
Dinh dưỡng nấm men thường chia làm hai nguồn dinh dưỡng. Đó là dinh dưỡng
ngoại bào và dinh dưỡng nội bào. Chất dinh dưỡng ngoại bào được thấm qua màng
vào tế bào từ các chất của môi trường nuôi cấy bên ngoài. Khi tế bào ở trạng thái đối
với môi trường bên ngoài nghèo hoặc cạn các chất dinh dưỡng thì những chất dự trữ
nội bào như glycogen, tregeloza, lipit, các hợp chất chứa N sẽ được nấm men sử dụng
– dinh dưỡng nội bào.
Các chất dinh dưỡng khi được sử dụng sẽ hoặc là đi vào thành phần tế bào phục
vụ cho sinh trưởng hoặc là cung cấp năng lượng cần thiết cho đời sống tế bào.

4


 Dinh dưỡng cacbon [12],[4]
Nguồn dinh dưỡng carbon của nấm men bao gồm các loại hợp chất hữu cơ khác

nhau như đường, rượu, acid hữu cơ, acid amin,…. Hầu hết các loài nấm men đều
không có enzyme polyhydrolase trong đó có amylase và cellulase. Vì vậy, nấm men
không sử dụng trực tiếp được tinh bột cũng như cellulose và hemicellulose.
Đường là một trong những nguồn carbon quan trọng cho nấm men sử dụng đặc
biệt là đường glucose thuộc loại đường 6 (hexose) là thông dụng nhất cho tất cả các
loài nấm men. Glucose được coi như nguồn carbon vạn năng đối với vi sinh vật.
Tỷ số đường sử dụng là đặc điểm riêng của từng loài nấm men. Đối với các
nguồn carbon khác như rượu và acid hữu cơ thì đặc điểm này là giống nhau ở tất cả
các loài nấm men. Các loài Saccharomyces lên men rượu vang sử dụng glucose,
fructose, maltose, saccharose và galactose, với rafinose chỉ sử dụng được một phần.
Với lactose, melibiose, dextrin, pentose và tinh bột lại hoàn toàn không sử dụng được.
Trong môi trường có một hỗn hợp các nguồn carbon dinh dưỡng thì nguồn nào
cung cấp cho nấm men sinh trưởng tốt sẽ được ưu tiên sử dụng trước, tính sử dụng kế
tiếp các nguồn carbon trong canh trường được gọi là tính đa dưỡng của nấm men.
Trong quá trình nuôi cấy glucose và fructose sẽ được sử dụng trước hết.
Những loài nấm men cùng một giống không phải bao giờ cùng đồng hóa vật chất
như nhau. Các loài khác nhau (dù là một giống) sẽ đồng hóa các nguồn dinh dưỡng
khác nhau.
Những disaccharide (maltose và saccharose) trước khi được nấm men sử dụng
phải qua thủy phân sơ bộ thành đường đơn nhờ enzyme tương ứng của nấm men. Các
acid hữu cơ cũng chiếm một vị trí quan trọng trong trao đổi chất của nấm men. Chúng
có thể kích thích hoặc ức chế sinh trưởng của nấm men. Chúng cũng có thể là nguồn
dinh dưỡng carbon và năng lượng duy nhất.
Các acid béo có mạch carbon tương đối dài (từ 6 ÷ 10) nấm men chỉ sử dụng ở
nồng độ trong môi trường rất thấp (0,02 ÷ 0,05 %). Ở nồng độ cao sẽ ức chế nấm men
phát triển. Acid béo có từ C12 ÷ C17 carbon trong phân tử được sử dụng tùy thuộc vào
từng chủng loại nấm men.
 Dinh dưỡng nitơ [12], [4]
Nguồn nitơ cần thiết cho tế bào nấm men thường là các hợp chất hữu cơ hoặc vô
cơ có sẵn trong môi trường.

5


Thông thường, nitơ của tế bào nấm men thường vào khoảng 7 ÷ 10 %, đôi khi lên
tới 12% vật chất khô. Để tạo thành 10 tỷ tế bào nấm men chi phí nitơ trong điều kiện
kị khí là 66 ÷ 67 mgN, trong điều kiện hiếu khí là 37 ÷ 53 mgN. Tuy nhiên hàm lượng
nitơ trong nấm men phụ thuộc vào thành phần môi trường, điều kiện hiếu khí và số
lượng các chất dinh dưỡng bổ sung vào môi trường đối với từng chủng nấm men.
Các hợp chất hữu cơ chứa nitơ của tế bào là các acid amin, các nucleotic purin và
pyrimidin, protein và một số vitamin.
Nguồn nitơ vô cơ được nấm men sử dụng tốt là các muối amoni của acid vô cơ
cũng như hữu cơ. Đó là các muối amoni sunfat, amoni phosphat rồi đến các muối
amoni acetat, amoni lactat, amoni maltat và amoni sucxinat. Trong môi trường có
muối amoni đặc biệt là sunfat thì nấm men sẽ sử dụng gốc amoni trước, gốc acid còn
lại sẽ sử dụng sau hoặc ít sử dụng do vậy có thể làm môi trường acid hóa, giảm pH.
Các nguồn nitơ hữu cơ thường là hỗn hợp các acid amin, các peptid, các
nucleic,.... Trong thực tế người ta hay dùng cao ngô, cao nấm men, dịch thủy phân
protein tự nhiên (đậu tương, khô lạc,...) làm nguồn nitơ hữu cơ.
Xếp theo thứ tự nấm men tiêu hóa tốt nhất là các muối amon, tiếp theo là các
acid amin, sử dụng pepton kém và hoàn toàn không sử dụng được protein. Trong quá
trình nuôi cấy nấm men các acid amin vừa là nguồn nitơ vừa là nguồn carbon dinh
dưỡng. Chúng đồng thời tham gia vào phản ứng cetoacid để tạo thành các acid amin
mới như là chất cho nhóm amin (NH2-).
 Dinh dưỡng các nguyên tố vô cơ [12], [4]
Các nguyên tố vô cơ trong nuôi cấy vi sinh vật nói chung, trong đó có nấm men
thì phospho được quan tâm trước hết, sau đó là kali, magiê và lưu huỳnh,….
Phospho: tham gia vào các thành phần quan trọng của tế bào, như các
nucleoproteic, acid nucleic, polyphosphate, phospholipid,…. Các hợp chất phospho
đóng vai trò xác định trong các biến đổi hóa sinh khác nhau, đặc biệt là trong trao đổi
chất hydrocacbon và trong vận chuyển năng lượng. Nấm men sử dụng rất tốt nguồn

phospho vô cơ là orthophosphate. Hợp chất này sẽ chuyển thành polyphosphate và sau
khi được hoạt hóa sẽ dùng vào các quá trình tổng hợp.
Khi không đủ phospho trong môi trường sự trao đổi chất ở nấm men bị thay đổi
đáng kể liên quan tới sự phá vỡ nhu cầu sử dụng hydratcacbon và nitơ. Nhu cầu sinh lý
về phospho đối với 10 tỷ tế bào nấm men vào khoảng 10 ÷ 13 mgP.
6


Người ta thường dùng KH2PO4, K2HPO4 hoặc dung dịch chiết từ supephosphat
làm nguồn P và K. Trong dịch đường hóa từ tinh bột thường đủ P đáp ứng nhu cầu của
nấm men, rỉ đường củ cải cũng như rỉ đường mía thường thiếu P, vì vậy cần phải bổ
sung vào môi trường acid orthophosphoric hoặc supephosphat.
Lưu huỳnh là thành phần của một số acid amin trong phân tử protein và là nhóm
phụ (-SH) của một số enzyme CoA. Bởi vậy, khi không có mặt lưu huỳnh trong môi
trường sự trao đổi chất có thể không tổng hợp được protein. Những chất chứa lưu
huỳnh như acid amin (cystine, cysteine, metionine), vitamin (tiamin, biotin) và một số
hợp chất khác đóng vai trò quan trọng trong hoạt động sống của nấm men. Trong môi
trường nuôi cấy nấm men thường có (NH4)2SO4 làm nguồn amon và nguồn lưu huỳnh.
Trong môi trường với hàm lượng lưu huỳnh nhỏ làm tăng sự nảy chồi của nấm men.
Nhưng ở nồng độ 1mg/l lưu huỳnh đã kìm hãm quá trình này. Do vậy, khi sử dụng các
nguồn lưu huỳnh dinh dưỡng cho vi sinh vật nói chung, trong đó có nấm men, cần phải
thận trọng.
Các ion K+, Ca2+, Mg2+ cũng cần có trong môi trường nuôi cấy hoặc lên men.
Thông thường ion K+ được bổ sung cùng với các muối phosphat hoặc sunfat, ion Ca2+,
Mg2+ thường có mặt trong nước sinh hoạt, tuy nhiên khi hàm lượng ion Ca2+, Mg2+ quá
cao (nước cứng), cần phải loại bớt hai ion này (làm mềm nước). Giúp cho quá trình
nuôi cấy vi sinh vật hiệu quả hơn.
 Dinh dưỡng các chất sinh trưởng [12], [4]
Những chất kích thích sinh trưởng là các vitamin, các base purin và pyrimidin.
Những nhân tố sinh trưởng cơ bản đối với nấm men không có sắc tố là 6 vitamin nhóm

B: inozit (B8), biotin (B7 hay H), acid pantotenic (B3), tiamin (B1), pyridoxine (B6),
acid nicotinic (B5 hay PP). Đối với nấm men có sắc tố đỏ cần các chất sinh trưởng là
tiamin, ngoài ra còn có acid paraaminobenzic.
Trong công nghiệp thường dùng các nguồn vitamin là cao ngô, cao nấm men (có
thể dùng dịch men tự phân hay nước chiết nấm men), nước chiết cám (cám gạo hoặc
cám mì), dịch thủy phân đậu tương bằng enzyme và đặc biệt là rỉ đường (cung cấp
bionin). Trong các thí nghiệm nuôi cấy ở phòng thí nghiệm vi sinh vật hoặc ở quy mô
nhỏ có thể dùng các dịch chiết từ giá đậu, từ rau cải, bắp cải, cà chua, cà rốt, khoai
tây,…làm nguồn vitamin bổ sung vào môi trường.

7


2.2 NẤM MEN RHODOTORULA SP
2.2.1 Phân loại [20]
Theo phân loại Harison (1927) nấm men Rhodotorula sp thuộc:
 Giới: Nấm (fungi)
 Ngành: Basidiomycota
 Lớp: Urediniomycetes
 Bộ: Sporidiales
 Họ: Sporidiobolaceae
 Giống: Rhodotorula

Hình 2.1: Nấm men Rhodotorula sp [20],[21]

Hình 2.2: Tế bào nấm men Rhodotorula glutinis [19]
Nấm men Rhodotorula sp còn được gọi là nấm men sinh sắc tố carotenoid
(carotengensis), là một trong rất ít các chi nấm men có khả năng tổng hợp tích luỹ một
lượng lớn các sắc tố carotenoid trong đó chủ yếu là β-carotene, torulene, torularhodin.
Năm 1921, A. Harden là người đầu tiên phân lập được loài Rhodotorula

mucilaginose, tiếp sau đó năm 1928 Harison và nhiều nhà khoa học khác đã phân lập
được 34 loài, trong đó phổ biến nhất là 3 loài Rhodotorula glutinus, Rh. Mucilaginosa
8


và Rhodotorula gracilis. Năm 2000, Krutzman và Fell cho rằng giống nấm men
Rhodotorula sp gồm 45 loài, theo mô tả của tác giả cho rằng loài Rh. mucilaginosa
trước đó có tên gọi là Rh. rubra, loài này tạo ra enzyme urease, không đồng hoá
nitrate, không phát triển trên cycloheximide hoặc nhiệt độ 40 oC và loài Rh. rubra thực
ra chỉ là một dạng riêng của loài Rh. glutinis, tên gọi Rh. ruba ở một số tài liệu hiện
nay không còn nữa và được thay thế bằng tên mới là Rh. Mucilaginosa [10],[11].
Riêng tác giả người Nhật Hasegawa lại dựa vào quang phổ hấp thụ sắc tố
carotenoide để chia giống nấm men Rhodotorula sp thành hai giống phụ là:
Rhodotorula (hấp thụ tối đa ở bước sóng 610nm) và Flavotorrula (hấp thụ tối đa ở
bước sóng 450nm).
Theo Lodder (1971), Koneman E.W. và Robert (1983), thì Rhodotorula sp thuộc
cơ thể đơn bào, nhóm nấm men không sinh bào tử, không có sợi khuẩn ty hay sợi
khuẩn ty giả và là nhóm vi sinh vật ưa ấm, khoảng nhiệt độ hoạt động từ 20 400C.Chúng phân bố rộng rãi ở khắp nơi: trong đất, không khí, trên các vỏ lá cây: táo,
dưa hấu, dâu tây, dâm bụt,…
Khi quan sát dưới kính hiển vi tế bào nấm men Rhodotorula sp có dạng hình
tròn, oval, elip đến dạng thon dài hoặc gậy. Kích thước tế bào dao động trong khoảng
2 ÷ 5 µm chiều rộng, 2,5 – 10 µm chiều dài tùy thuộc vào điều kiện nuôi cấy và độ
tuổi.
Khuẩn lạc phát triển nhanh, bề mặt trơn nhẵn, bóng sáng hoặc mờ đục, đôi khi
ghồ ghề, mịn và nhớt. Mép khuẩn lạc không có răng cưa. Khuẩn lạc có màu từ kem,
hồng đến đỏ san hô cũng có khi có màu vàng và đỏ cam. Kích thước khuẩn lạc tuỳ môi
trường, có thể đạt từ 1 – 10 mm. Quan sát dưới kính hiển vi không hình thành sợi nấm,
một số có sinh sợi nấm giả nhưng rất kém phát triển, không hình thành bào tử túi [4].
2.2.2 Hình dạng và kích thước [3], [4], [12]
Rhodotorula sp có nhiều hình dạng khác nhau tùy thuộc vào điều kiện nuôi cấy

và loài khác nhau. Gồm hình trứng, hình dài, hình elip, hình cầu, tròn và hình gậy.
Rhodotorula sp có khuẩn lạc trơn, không nhăn, có màu từ kem đến vàng hoặc đỏ.
Sinh trưởng sinh dưỡng: khuẩn lạc màu cam đến màu đỏ, vàng, dạng bơ hoặc
nhầy.
Tế bào hình cầu, gần cầu, elip, trứng hoặc trứng kéo dài, thường nảy chồi ở đỉnh.
Có thể xuất hiện sợi giả và sợi thật.
9


Bảng 2.2 Hình thái tế bào của một số loài Rhodotorula sp nuôi cấy tên môi
trường thạch malt từ các nguồn phân lập khác nhau [4]
STT

Loài

Màu khuẩn lạc

Hình

Nguồn phân lập

dạng
1

Rh. Acheniorum

Hồng

Dài


Quả dâu, lá lê

2

Rh. Araucariae

Hồng

Tròn cầu

Gỗ cây bách tán

3

Rh. Aurantiaca

Hồng hoặc đỏ

Dài

Không khí, bia,
đất

4

Rh. Bogoriensis

Kem hoặc hồng

Gậy


5

Rh. Diffluens

Kem

Tròn cầu,
elip

6

Rh. Fujisanense

Kem hoặc hồng

Gậy

7

Rh. Glutinis

Hồng hoặc đỏ

Tròn cầu

8

Rh. Graminis


Hồng

Tròn cầu

9

Rh. Ingeniosa

Kem

Tròn cầu

10

Rh. Javanica

Kem

Dài

11

Rh. Lactosa

Vàng,

hồng Tròn cầu

Cây nho dại


Không khí

hoặc đỏ
12

Rh. Marina

Hồng hoặc đỏ

Tròn cầu

Con tôm

13

Rh. Minuta

Hồng hoặc đỏ

Tròn cầu

Không khí, biển

14

Rh.

Kem, hồng hoặc Dài

Nước, không khí,


Mucilaginosa

đỏ

…

(rubra)
15

Rh. Muscorum

Kem hoặc nâu Gậy
nhạt

16

Rh. Pallida

Kem hoặc hồng

Tròn cầu

Nước biển, dưa
leo ngâm

17

Rh. Pilatii


Kem

Tròn cầu

Cây tùng bách

18

Rh. Pilimanae

Hồng hoặc đỏ

Tròn cầu

Nước, đất

10


2.2.3 Cấu tạo và sinh sản của nấm men Rhodotorula sp [11]
2.2.3.1 Thành phần cấu tạo nấm men
Các nghiên cứu cho thấy, nấm men Rhodotorula sp có hình thái và cấu tạo tế bào
giống như các loài nấm men khác, được cấu tạo từ các thành phần.
a. Thành tế bào
Được cấu tạo từ các thành phần khác nhau, trong đó đáng kể nhất là: glucan,
manan, protein, lipit và một số thành phần nhỏ như kitin.
 Glucan: là hợp chất cao phân tử của D-glucoza. Đó là một polysacharit phân
nhánh có liên kết β-1,3 và β-1,6. Cả hai thành phần này phân bố đều trên thành
tế bào.
 Manan: là hợp chất cao phân tử của D-manoza, mỗi phân tử thường chứa 200 400 thành phần manoza. Thường manan liên kết với protit theo tỷ lệ 2:1. Manan

thường có mối liên kết α-1,6; α-1,3; β-1,3. Phân tử lượng của chúng khoảng
5.104 dalton.
 Protein: thường protein liên kết với các thành phần khác như là manan. Trong
thành phần của chúng chứa nhiều axit amin. Phân bố ở màng tế bào, gần sát bào
tương.
 Kitin: nằm ở phần nẩy chồi. Chúng chiếm số lượng rất nhỏ khoảng 3%. Đầu là
chất bền vững không bị enzym phá hủy, vì thế chúng có tác dụng bảo vệ chồi
còn non.
 Ngoài ra còn thấy trong thành tế bào có lipit ở dạng phospholipit, khoảng 1%10 %.
b. Màng nguyên chất
Màng nguyên sinh gồm các hợp chất phức tạp như protein, phospholipit, enzym
permerase.
Trong thời kì còn non màng nguyên sinh chất bám sát lấy thành tế bào làm cho
khả năng trao đổi chất của nấm men gặp khó khăn. Ngược lại ở thời kì tế bào già màng
nguyên sinh chất co lại, tạo thành khoảng trống giữa tế bào và chất nguyên sinh vì thế
mà khả năng trao đổi chất của nấm men gặp khó khăn. Hai hiện tượng này được gọi là
co nguyên sinh và trương nguyên sinh chất.
c. Nguyên sinh chất
11


Tế bào còn non thì nguyên sinh chất càng đồng nhất, càng về già càng mất tính
đồng nhất do xuất hiện nhiều không bào và hạt voluten. Thành phần bao gồm: nước,
protit, lipit, gluxit, muối khoáng và enzym. Tế bào chất luôn luôn chuyển động,
thường chuyển động một chiều xung quanh thành tế bào.
d. Nhân
Ở Rhodotorula sp đã có nhân thật, nhân hình bầu dục hay hình cầu. Nó được bao
bọc bởi lớp màng bên trong là lớp dịch nhân. Nhân thường có hình bầu dục và hình
cầu. Giống như các vi sinh vật khác, nhân nấm men có chứa protein và acid nucleic. Ở
trạng thái lên men nhân tăng 20 - 30 lần so với ở trạng thái hô hấp.

e. Các thành phần khác
- Không bào: là nơi chứa đựng protease.
- Hạt không bào: thường nằm trong không bào, là chất dinh dưỡng của tế bào,
nguồn năng lượng cho tế bào, tham gia điều hoà các quá trình sinh trưởng và phát triển
của tế bào.
- Ty thể: cung cấp năng lượng hoạt động cho tế bào.
- Riboxom: tham gia vào nhiều quá trình sinh tổng hợp của nấm men.
- Volutin: không phải là thành phần cấu trúc tế bào, chúng xuất hiện ở những
điều kiện đặc biệt như khi nuôi cấy trên môi trường giàu hydratcacbon và phoshat vô
cơ. Số lượng volutin còn phụ thuộc vào tỷ lệ C : N và sự có mặt của S cũng như của
vitamin. Volutin đóng vai trò quan trọng sau:
+ Là chất dự trữ dinh dưỡng cho tế bào.
+ Tham gia điều hòa quá trình sinh trưởng, phát triển của tế bào.
+ Làm nguồn năng lượng cho tế bào.
2.2.3.2 Sinh sản nấm men [3], [4], [11]
Đa số loài của nấm men Rhodotorula sp sinh sản bằng cách nẩy chồi như: Rh.
pilimanae, Rh. pilatii, Rh. javaniti, Rh. ingniosa, Rh. diffluens và Rh. bogoriensis.
Ngoài ra, Rhodotorula sp còn sinh sản theo kiểu phân đôi nhưng giống Rhodotorula sp
không có kiểu sinh sản theo hữu tính.
a. Sinh sản bằng hình thức nẩy chồi
Đầu tiên hạch nấm men bắt đầu dài ra và sau đó hạch bắt đầu thắt lại ở chính
giữa. Tế bào mẹ bắt đầu phát triển một chồi con. Hạch một phần chuyển vào chồi và
một phần ở tế bào mẹ, nguyên sinh chất cũng chuyển sang chồi con. Khi chồi con gần
12


bằng chồi mẹ nó sẽ được tách ra và sống độc lập. Đây là phương pháp sinh sản vô tính
chủ yếu nhất ở nấm men.
b. Sinh sản bằng hình thức phân đôi
Lúc đầu tế bào dài ra, sau đó từ từ thắt lại ở chính giữa, nơi thắt này nhỏ dần, nhỏ

dần tới khi đứt hẳn và tạo thành hai tế bào con độc lập. Hai tế bào con này giống hệt
nhau và đều mang một nửa vật chất di truyền của tế bào mẹ.
Tốc độ sinh sản của Rhodotorula sp nhanh, thời gian để số tế bào tăng gấp đôi
thường từ 2 ÷ 6 giờ.
Quá trình sinh trưởng và phát triển của nấm men gồm bốn giai đoạn: Giai đoạn
thích nghi, giai đoạn phát triển, giai đoạn ổn định và giai đoạn diệt vong.
Thời gian sinh trưởng tốt nhất của Rhodotorula sp trong khoảng 24 - 48 giờ nếu
môi trường cung cấp đủ các chất cần thiết.
2.2.4 Đặc điểm sinh hóa [19], [22]
Nấm men Rhodotorula sp có một số đặc tính sinh hoá sau:
 Không lên men các loại đường như: D-glucose, D-galactose, maltose, me- α -D
glucoide, saccharose và nhiều loại đường khác nhưng chúng lại sử dụng các loại
đường này để cung cấp nguồn carbon cho việc xây dựng tế bào.
 Tạo ra ezyme urease.
 Đồng hoá DBB (Diazonium Blue B).
 Có chứa sắc tố carotenoid.
 Không tạo thành hợp chất loại tinh bột.
 Không tạo ra acid acetic.
 Không đồng hoá được inositol, đây là nét đặc trưng cơ bản nhất của
Rhodotorula sp khác với các giống nấm men Cryptococus, Candida.
 Khả năng sinh tổng hợp sắc tố carotenoid.

13


2.2.5 Đặc điểm sinh lý:
Bảng 2.3 Đặc điểm sinh lý
Lên men

-


D-Glucuronate

+/-

Myo-inositol

-

Đồng hoá nitrat

+/-

Cơ chất giống tinh bột

-

Phản ứng DBB

+

Hoạt hoá Ureaza

+

Coenzym

Q9 hoặc Q10

Xylose


-

Ghi chú :
+ : Lên men
- : Không lên men

Hình 2.3: Các sắc tố carotenoid chủ yếu của nấm men Rhodotorula sp [19]
Đã có nhiều công trình nghiên cứu về khả năng sinh tổng hợp sắc tố carotenoid
trên nhiều các nguồn cơ chất khác nhau, với các phương pháp nuôi cấy khác nhau: như
nuôi cấy gián đoạn, bán liên tục, lên men dịch thể, lên men bán rắn,… chỉ từ giống
14


Rhodotorula sp hay nuôi cấy kết hợp với một chủng vi sinh vật khác như: nấm men,
nấm mốc, vi khuẩn.
2.3 BETA-CAROTENE (β-Carotene)
2.3.1 Giới thiệu về Carotenoids
2.3.1.1 Tổng quan về Carotenoids
a. Định nghĩa [22]
Carotenoids là các sắc tố hữu cơ tự nhiên được tìm thấy trong thực vật và một số
cơ thể sinh vật quang hợp, thực vật, tảo, nấm mốc, nấm men và vi khuẩn.
b. Lịch sử của carotenoids [17], [18], [19], [20]
Nghiên cứu sớm nhất về carotenoids là những ngày đầu của thế kỷ 19. Và
Carotenoid đã được phân lập lần đầu tiên trong lịch sử bởi Wackenroder vào năm 1831
(thu lập trên cà rốt) và nhiều phát hiện khác về carotenoids đã được đặt tên trong suốt
những năm 1800 dù cấu trúc của chúng vẫn chưa được biết.
Đến tận năm 1907 nhờ kinh nghiệm mà Willstatter và Mieg đã thiết lập được
công thức của beta-caroten C10H56 và cấu trúc này đã được giải thích bởi Karrer trong
năm 1930 -1931. Và trong năm 1919, Steenbock đã đưa ra giả thiết là có thể có mối

quan hệ giữa beta-caroten và vitamin A.
Năm 1837 Berzelius đã gọi sắc tố có màu vàng trong là cây là xanthophylls. Và
thập niên 1950, carotenoids đã được sinh tổng hợp để sử dụng như là một chất màu
thực phẩm.
Trong năm 1954 Roche đã bắt đầu sản xuất thương mại carotenoids. Có rất nhiều
nghiên cứu đã được thực hiện trong những năm 1970 – 1980 để xác định sự phù hợp
của beta-caroten để sử dụng trong thực phẩm và hoạt động của nó trong cơ thể người.
Và trong những năm đầu thập niên 80 beta-caroten được đề nghị có thể hữu ích trong
việc phòng chống ung thư và nó là một chất chống oxy hoá.
Ngày nay số lượng các carotenoids tìm thấy trong tự nhiên lên đấn 700 hợp chất
với các màu sắc khác nhau. Các carotenoids chủ yếu được tách từ các nguồn nguyên
liệu tự nhiên như thực vật và vi sinh vật.
c. Danh pháp và cấu tạo [4]
Có hai cách gọi tên carotenoids:
+ Tên truyền thống: tên theo nguồn gốc mà loại carotenoid đó được trích chiết
đầu tiên.
15