Chương 3- Kỹ thuật điện di

CHƯƠNG III – KỸ THUẬT ĐIỆN DI
Phương pháp điện di là phương pháp rất phổ biến trong phân tích sinh hóa,
được dùng trong phân tích nucleic acid và protein. Kỹ thuật điện di rất có nhiều
ứng dụng trong sinh học phân tử. Đây là một bước không thể thiếu trong các kỹ
thuật như PCR (Polymerase Chain Reaction), AFLP (Amplified Fragment Length
Polymorphism)…
1 - Nguyên tắc điện di
Kỹ thuật điện di được sử dụng nhằm tách và so sánh kích thước của các
phân tử protein, nucleic acid. Sự so sánh này dựa trên tốc độ di chuyển của các
phân tử trong môi trường điện di.
Trong một điện trường, các phân tử tích điện thuộc pha lỏng sẽ di chuyển
về phía các cực. Vận tốc di chuyển của các phân tử này sẽ tùy thuộc sự tỷ lệ giữa
điện tích và khối lượng của chính các phân tử này. Như vậy giữa các phân tử có
cùng khối lượng, phân tử nào có điện tích lớn hơn sẽ di chuyển về các cực ngược
dấu nhanh hơn.
p dụng nguyên lý trên, trong kỹ thuật sinh hóa và sinh học phân tử, người
ta sử dụng kỹ thuật điện di nhằm phân tích protein hay phân tích nucleic acid.
Điện di trong môi trường lỏng không có ý nghóa trong thực tế. Điện di
thường được tiến hành trên những giá thể bán rắn gọi là các gel. Các gel này là
môi trường xốp với các lỗ nhỏ cho phép các phân tử protein hay nucleic acid đi
qua. Kích thước phân tử càng lớn thì sự di chuyển của phân tử qua gel càng chậm.
Có hai loại gel được sử dụng chủ yếu trong điện di là gel agarose và gel
polyacrylamide. Việc chọn loại gel cũng như nồng độ các chất tạo thành gel tuỳ
thuộc kích thước của các phân tử cần tách.
2 - Điện di trên gel polyacrylamide (PAGE)
+ Cho hiệu suất phân giải cao cho những nucleic acid và protein có kích
thước nhỏ và trung bình (trọng lượng phân tử xấp xỉ đến 1.106 Da).
+ Cho phép phân tách khối lượng mẫu lớn.
+ Giảm thiểu sự tương tác giữa phân tử di chuyển với chất nền

+ Tính hợp lý của chất nền.
Kích thước lỗ gel thay đổi nhờ nồng độ của gel.
Polyacrylamide được chuẩn bò bằng sự polymer hóa giữa acrylamide và N,
`
N -methylen-bis-acrylamide. Quá trình polymer hóa được kiểm soát bởi một chất
xúc tác cảm ứng là –N-N, N`, N` tetramethylethylendiamin (TEMED). Quá trình
quang hóa polymer hóa còn có thể được thúc đẩy bởi sự có mặt của tia UV. Nồng
độ gel tiêu chuẩn cho phân tích protein là 7.5% polyacrylamide. Nó còn có thể
phân tích phân tử có khối lượng dao động từ 10.000-1.000.000 Da. Tuy nhiên hiệu
BÀI GIẢNG LÝ THUYẾT KỸ THUẬT PHÂN TÍCH SINH HÓA HIỆN ĐẠI

6


Chương 3- Kỹ thuật điện di

suất phân tích tốt đối với phân tử từ 30.000 -300.000 Da. Hiệu suất phân giải và
khoảng khối lượng phân tử của cấu tử phụ thuộc vào nồng độ của acrylamide và
bis-acrylamide.
Nồng độ gel thấp hơn sẽ cho lỗ gel lớn hơn, cho phép phân tích những phân
tử sinh học có khối lượng lớn hơn. Ngược lại nồng độ cao hơn của acrylamide sẽ
cho lỗ gel nhỏ hơn.
Điện di trên gel polyacrylamide có thể dùng cho điện di trên cột gel hay
điện di trên bản gel.

Hình II.1 – Điện di trên cột

Hình II.2 – Điện di đứng

Nếu điện di trên cột

Ống thuỷ tinh (10cm6mm) được nạp đầy acrylamide; N, N` -methylen-bisacrylamide, đệm và xúc tác. Quá trình polymer hóa xảy ra từ 30-40 phút. Cột gel
được đặt vào trong một điện trường. Đầu trên là catod và đầu dưới là anod. Mẫu
đem phân tích được nạp vào trên đầu cột, phía cực catod. Mẫu sẽ được phân tách
thành từng lớp trên gel, và dòng điện được đặt vào. Một mẫu thuốc nhuộm dùng
để đánh dấu đường đi của các cấu tử cũng được nạp vào và tốc độ di chuyển của
nó song song với mẫu và nhanh hơn mẫu một chút. Khi mẫu thuốc nhuộm đã di
chuyển ra khỏi mẫu, tắt nguồn điện, gel được lấy ra khỏi cột và tiến hành nhuộâm
mẫu.
Một kiểu điện di của của gel polyacrylamide là điện di trên bản gel mà phổ
biến nhất là bản gel đứng.
Gel polyacrylamide được chuẩn bò và cho vào giữa hai miếng kính. Khoảng
cách giữa hai miếng kính phổ biến từ 0.5-2.0mm. Bề mặt lớp gel có diện tích là
2040cm và có thể cùng một lúc phân tích nhiều mẫu. Một lượt gel được đặt vào
đầu trên của bản gel trong quá trình polymer hóa. Sau khi gel đông đặc, lấy lượt
BÀI GIẢNG LÝ THUYẾT KỸ THUẬT PHÂN TÍCH SINH HÓA HIỆN ĐẠI

7


Chương 3- Kỹ thuật điện di

ra ta sẽ có giếng gel dùng để nạp mẫu. Một lượt có thể tạo ra cùng một lúc 20
giếng. Nạp dung dòch mẫu vào giếng, cắm nguồn điện và bắt đầu điện di.
Trong sinh học phân tử PAGE dùng để phân tích DNA có kích thước
nhỏ.Thường từ 1-500 bp. Bảng mức nồng độ gel khác nhau và khả năng phân
tách:
Nồng độ polyacrylamide(%)
Xếp thứ tự dsDNA (bp)
3.5
100-1000

5
75-500
7.5
50-400
10.0
35-250
15.0
20-150
20.0
5-100
Bảng II.1- Thành phầøn phối hợp với gel polyacrylamide (pha 100ml)
Nồng độ
Tp
Acrylamide (g)
Bis (g)
TEMED (g)
Dung dòch pha
stock (ml)
Nước (ml)
Amomium
persulphate
10% (ml)

3.5

5.0

7.5

10.0


15.0

20.0

3.24
0.26
0.1
10

4.7
0.3
0.1
10

7.13
0.37
0.1
10

9.6
0.4
0.1
10

19.55
0.45
0.1
10


19.5
0.5
0.1
10

86.4
1.0

84.9
1.0

82.4
1.0

79.9
1.0

74.9
1.0

69.4
1.0

Dung dòch pha stock 10X cho 1lít
Buffer
TBE: 108.0 Tris base; 55.0 g boric acid; 93.0 g EDTA, pH 8.2
TAE: 48.4 g Tris base; 11.4ml glacial acetic acid; 20ml EDTA 0.5, pH 7.6
TPE: 108.8 g Tris base, 15.5 ml phosphoric acid 85%; 40.0ml EDTA 0.5,
pH 8.0.
PAGE được dùng rất nhiều trong phân tích.

+ Phương pháp chuẩn bò gel polyacrylamide
1. Chuẩn bò số lượng gel cần, tuỳ theo kích thước khay đựng gel
2. Tính tóan số lượng phản ứng cần theo bảng
3. Hoà số lượng Acrylamide và Bis (chú ý mang găng tay vì hóa chất rất
độc) vào nước buffer, thêm TEMED.
BÀI GIẢNG LÝ THUYẾT KỸ THUẬT PHÂN TÍCH SINH HÓA HIỆN ĐẠI

8


Chương 3- Kỹ thuật điện di

4. Ngay tức khắc cho vào amonium persulphate
5. Đặt lược lên khay gel.
6. 30 phút sau lấy lượt ra khỏi gel và chuẩn bò cho chạy điện di
+ Phương pháp nạp mẫu
Trộn mẫu vào dung dòch nạp mẫu
Có thể sử dụng Bromophenol blue: 0.25
Glycerol 10% thể tích
Tác dụng của Bromophenol blue: có màu xanh để thấy vạch điện di.
Glycerol: có tỷ trọng lớn hơn nước, để mẫu chìm xuống giếng gel.
3 - Điện di trên gel Sodium Dodecyl Sulfate - Polyacrylamide (SDS - PAGE)
Kỹ thuật điện di trước không có thể đo khối lượng phân tử của đại phân tử
sinh học bởi vì nó phụ thuộc vào cả hai yếu tố là điện tích và kích thước phân tử.
Nếu có một phương pháp nào đó loại bỏ ảnh hưởng bởi điện tích của protein (một
đại phân tử sinh học phổ biến) thì trong khi điện di, tốc độ di chuyển của các đại
phân tử chỉ phụ thuộc vào kích thước phân tử. Người ta thường dùng một chất tẩy
mạnh để xử lý protein. Trong phương pháp này các protein được phản ứng với
chất hoạt động bề mặt mang điện tích âm là SDS (Sodium Dodecyl sulfate) để tạo
một phức hợp mang điện tích âm và sẽ di chuyển về phía cực dương của điện

trường. Thêm vào đó một chất khử là mercaptoethanol hoặc dithireitol (DDT) để
phá vỡ cầu nối –S-S- của protein (và các tiểu đơn vò của chúng). Nhờ đó sự di
chuyển trong gel của các phân tử protein trong cùng một điều kiện chỉ phụ thuộc
vào kích thước, những phân tử có kích thước lớn sẽ di chuyển chậm hơn những
phân tử có kích thước nhỏ khi đi qua lỗ gel có kích thước nhất đònh.
Trong thí nghiệm, protein chưa biết khối lượng và cấu trúc các tiểu đơn vò
được xử lý vơi 1% SDS và 0.1M mercaptoethanol trong dung dòch điện di. Một
hỗn hợp protein chuẩn đã biết trước khối lượng phân tử cũng được cho chạy điện
di với cách xử lý và điều kiện như trên. Hai bản chuẩn điện di, một bản ứng với
những phân tử protein có khối lượng phân tử thấp (từ 14.000-100.000 Da), một
bản ứng với những phân tử protein có khối lượng phân tử cao (45.000-200.000
Da).
SDS-PAGE thì hiệu quả trong xác đònh khối lượng phân tử của các phân tử
protein đơn vò. Là phương pháp điện di trên gel được dùng phổ biến nhất trong
việc xác đònh kích cỡ và những thành phần khác nhau của một phân tử protein.
SDS-PAGE giới hạn xác đònh khối lượng phân tử từ 10.000-200.000 Da. Gel có
hàm lượng acrylamide nhỏ hơn 2.5% có thể dùng để điện di protein có khối lượng
phân tử lớn hơn 200.000 Da. Nếu protein có khối lượng phân tử trung bình người
ta thường dùng hỗn hợp giữa gel agarose và polyacrylamide.

BÀI GIẢNG LÝ THUYẾT KỸ THUẬT PHÂN TÍCH SINH HÓA HIỆN ĐẠI

9


Chương 3- Kỹ thuật điện di

Thực hành
Hoá chất và dụng cụ
+ Dụng cụ:

Bộ nguồn điện di, hộp điện
di, dụng cụ làm gel (tấm kính,
lược, kẹp…) pipet, máy khuấy từ,
máy hút chân không.
Cấu tạo của một khung gel
Gel được chuẩn bò trong
một khoảng hẹp được tạo thành
bởi hai miếng kính, phân cách
nhau bởi một tấm đệm bằng chất
dẻo hoặc nguyên liệu thích hợp.
Miếng đệm dài hơn tấm kính
khoảng1cm chiều rộng và độ dày
khoảng 0.5mm. Các giếng nơi
mẫu cho vào được tạo thành từ
Hình II.3 – Phương pháp SDS -PAGE một mẫu lượt chạy dài ngang đỉnh gel
có cùng chiều dày với miếng đệm. Các
răng lược dài khoảng 1cm, rộng 2-10mm. Khoảng cách giữa các răng 3mm.
+ Hoá chất
1. Dung dòch Acrylamide hay dung dòch đơn hợp
Acrylamide (FW 71.08)
:30g
Bis-acrylamide (FW 154.2) :0.8g
Cho nước đến 100ml. Bảo quản ở nhiệt độ 4oC trong nơi tối. Dung dòch này
độc có khả năng gây ung thư cho nên phải mang găng tay khi làm thí nghiệm.
2. Đệm gel phân tách (stocking separating gel) hay 4X đệm gel lỏng (1.5M
Tris HCl , pH 8.8)
Hoà tan 3.36g Tris (FW 121.1) trong 15ml nước
Chỉnh pH 8.8 bằng HCl 4N
3. Đệm stacking gel
Hoà tan 1.5g Tris (FW 121.1) trong 20ml nước

Chỉnh pH 6.8 bằng HCl 4N
Thêm nước cho đủ 25ml. Bảo quản nơi tối ở 4oC trong ba tháng.
4. Dung dòch SDS 10% (có thể bảo quản trong 6 tháng)
5. Dung dòch amonium persulfate 10% (dùng trong ngày)
6. TEMED
7. Dung môi pha mẫu
BÀI GIẢNG LÝ THUYẾT KỸ THUẬT PHÂN TÍCH SINH HÓA HIỆN ĐẠI

10


Chương 3- Kỹ thuật điện di

Đệm stacking gel
2.5ml
Dung dòch SDS 10%
4ml
Glycerol
2ml
Bromophenol blue
2mg
-mercaptoethanol
1ml
Dẫn nước đến 10ml, bảo quản ở –20oC trong 6 tháng.
8. Gel phủ lỏng (0.375M Tris –HCl, 0.1% SDS, pH 8.8)
Đệm stacking gel
25ml
SDS 10%
1ml
Dẫn nước đến 100ml, bảo quản ở nhiệt độ 4oC ở nơi tối trong 3 tháng.

9. Đệm điện di
Tris (FW 121.1)
3.028g
Glycine
14.413g
SDS
1g
Dẫn nước đến 1000ml. Dung dòch không cần kiểm tra lại pH, bảo quản trên
một tháng ở nhiệt độ phòng.
10. n-butanol bão hoà nước
n-butanol
50ml
Nước
5ml
11.Dung dòch nhuộm protein
Coomassale blue G-250
0.6g
Acetic acid
100ml
Thêm nước cho đủ 1000ml. Dung dòch chứa trong hai có màu, bảo quản ở
nhiệt độ phòng.
12.Dung dòch rửa màu
Acetic acid
70ml
Metanol
50ml
13.Dung dòch cố đònh màu nhanh
Isopropanol
250ml
Acetic acid

100ml
Thêm nước cho đủ 1000ml.
Tiến trình thực hiện theo các bước
+ Bước 1: Chuẩn bò mẫu
Mẫu khô hoặc dung dòch được hoà tan trực tiếp trong dung môi pha mẫu sao
cho có nồng độ 0.5-1.5mg protein/ml. Đun sôi cách thuỷ trong 5 phút. Để nguội.
+ Bước 2: Chuẩn bò gel để chạy điện di
Trước hết ta cần biết chiều dài, chiều rộng hay chiều dày của khung gel để
có thể tính được thể tích gel cần pha chế để tránh lãng phí.

BÀI GIẢNG LÝ THUYẾT KỸ THUẬT PHÂN TÍCH SINH HÓA HIỆN ĐẠI

11


Chương 3- Kỹ thuật điện di

Giả sử cần thiết điều chế 30ml dung dòch gel để điện di, phải cần các dung
dòch gốc theo tỷ lệ sau.
Bảng II.2 - Pha chế hỗn hợp gel điện di
Nồng độ (%)
5
7.5
10
12.5
15
Dd acrylamide (ml)
5
7.5
10

12.5
15
Đệm gel stacking (ml)
7.5
7.5
7.5
7.5
7.5
SDS 10% (ml)
0.3
0.3
0.3
0.3
0.3
Nước (ml)
17.1
14.6
12
9.6
7.1
Cho vào một erlen có nhánh nối với một máy hút chân không. Vừa
hút vừa khuấy bằng máy khuấy từ cho đến khi hết bọt khí
Amonium persulfate (l) 150
150
150
150
150
TEMED (l)
10
10

10
10
10
Lắc nhẹ cho tan hết.
+ Bước 3: cho gel điện di vào khuôn đúc gel
Cho gel đặc vào khuôn đúc gel, cho đến khi cách răng lược khoảng 3-5mm.
Đổ trên mặt của gel đặc 300 l n-butanol bão hòa để tránh hiện tượng oxy
hóa làm ngăn cản sự polymer hóa của gel.
Sau 1-2 giờ, sau khi gel đã polymer hóa xong và đông đặc lại, nghiêng đổ
n-butanol ra ngoài, tráng ngay lại bằng dung dòch phủ gel lỏng (khoảng 0.3ml).
Thêm vào 0.5ml dung dòch phủ lỏng để cố đònh gel.
+ Bước 4: Chuẩn bò gel stacking
Để có 10ml dung dòch gel stacking, tiến hành như sau:
Dung dòch acrylamide 1.32ml
Đệm stacking
2.49ml
SDS 10%
99ml
Nước
6.09ml
Khuấy từ và hút chân không để loại bọt khí.
Amonium persulfate
50.1ml
TEMED
4.95ml
Lắc nhẹ và cho tan hết
+ Bước 5: Điện di
Cho dung dòch phủ trên gel điện di và cho 0.5ml gel stacking vừa điều chế
xong để tráng bề mặt của gel. Đổ bỏ.
Cho đầy gel stacking vào và đặt lược vào để tạo thành các giếng. Chú ý

không để tạo các bọt khí. Để gel cố đònh ít nhất trong 60 phút.

BÀI GIẢNG LÝ THUYẾT KỸ THUẬT PHÂN TÍCH SINH HÓA HIỆN ĐẠI

12


Chương 3- Kỹ thuật điện di

Nhẹ nhàng lấy lược ra khỏi gel, tránh làm hỏng các vách ngăn cách. Tráng
lại giếng bằng dung dòch điện di. Bơm 5-10l có nồng độ khoảng 1g/l mẫu đã
được xử lý bằng dung dòch pha mẫu vào giếng. Đóng điện và tiến hành điện di.
+ Bước 6: Nhuộm và đọc kết quả
Đặt gel trong dung dòch cố đònh màu nhanh trong 30 phút, thỉnh thoảng lắc
nhẹ.
Chuyển gel qua dung dòch nhuộm protein trong vài giờ, thỉnh thoảng lắc
nhẹ đến khi nào vạch màu hiện lên.
Cuối cùng cho gel vào dung dòch tẩy màu, dung dòch này được thay hai lần
trong một ngày đến khi này gel trong.
Gel hoàn tất có thể được bảo quản trong acetic acid 7% hoặc trong nước.
4 - Điện di trên gel agarose
Những kỹ thuật điện di được nghiên cứu ở trên đây chủ yếu dùng để phân
tích protein và những nucleic acid nhỏ, có khối lượng phân tử tới 350.000 Da
(500bp). Tuy nhiên, những lỗ nhỏ trong gel thì không có thể phân tích được những
cấu phần nucleic acid có khối lượng phân tử cao hơn. Phương pháp chuẩn dùng để
phân tích RNA và DNA có số nucleic từ 200-50.000 bp là điên di với gel agarose
với nồng độ trung bình.

Hình II.4: Cấu trúc agarose (theo Nông Văn Hải 2002)
Agarose là một hợp chất được chiết xuất từ tảo biển, là một loại polymer

mạch thẳng của galactose pyranose. Gel được chuẩn bò bằng cách hòa tan agarose
trong dung dòch điên di có nhiệt độ ấm. Sau đó làm ấm hỗn hợp gel đến 50oC, hỗn
hợp gel được đổ giữa hai tấm kính, tương tự như trong cách đổ gel
polyacrylamide.

BÀI GIẢNG LÝ THUYẾT KỸ THUẬT PHÂN TÍCH SINH HÓA HIỆN ĐẠI

13


Chương 3- Kỹ thuật điện di

Hình II.5 Các bước tạo gel điện di agarose
1,2 Tạo khuôn-3 Đổ gel vào khuôn-4 lắp lược, tra mẫu-5 chạy điện di
Mẫu được đặt vào giếng gel (tạo ra bởi lược gel) và điện áp được đặt vào
hai đầu.
Gel agarose được đỗ lên một giá thể nằm ngang. Điện di được thực hiện
theo phương ngang.
Các nucleic acid trong gel agarose sẽ được hiện hình dưới tia tử ngoại nhờ
một hóa chất có tên là ethidium bromide. Chất này có chức năng gắn xen vào
giữa các base của nucleic acid và dưới tác dụng của tia tử ngoại sẽ phát huỳnh
quang. Trong thao tác, ethidium bromide được cho vào gel trước khi đổ. Sau điện
BÀI GIẢNG LÝ THUYẾT KỸ THUẬT PHÂN TÍCH SINH HÓA HIỆN ĐẠI

14


Chương 3- Kỹ thuật điện di

di gel được chiếu bằng tia tử ngoại (bước sóng 300nm). Nuleic acid sẽ hiện hình

dưới các vệt màu đỏ cam.
Mặt khác, để ước lượng kích thước các trình tự nucleic acid trong gel
agarose. Người ta sử dụng một “yếu tố đánh dấu trọng lượng phân tử”. Đó là một
tập hợp nhiều trình tự DNA có kích thước đã biết (thang DNA), thông thường
người ta sử dụng thang DNA là thực khuẩn thể  được thuỷ giải bởi enzyme cắt
giới hạn Hind III.
Một hệ thống điện di mới Instacry, được giới thiệu bởi Eastman Kodak, gần
như có thể được thay thế cho agarose gel. Instacryl H Copolymer, là một loại
polymer có sự hiện diện của dithioreitol. Nồng độ gel từ 3-6% có thể được dùng
để phân tách DNA mạch đôi từ 10-3500bp.
5 - Điện di trong điện trường xung
Trong lý thuyết, điện di trên gel agarose được dùng để phân tích nucleic
acid có trình tự nhỏ hơn 50.000bp. Trong thực tế, chúng chỉ có thể phân tích tốt
trong giới hạn 20.000-30.000bp. Và những DNA có kích thước lớn hơn 50kb thì
quá lớn để có thể chui qua lỗ gel. Từ lúc DNA ribosome của đa số các sinh vật có
kích thước lên đến hàng ngàn đến hàng triệu bp. DNA muốn điện di được phải cắt
ngắn bằng enzyme cắt giới hạn và sau đó được phân tách bằng điện di thông
thường. Trong những năm đầu những năm 1980, Schawarts và Cantor tại đại học
Columbia (Mỹ), đã phát hiện rằng những DNA có kích thước phân tử lớn (như
nhân nấm men- kích thước từ 200-3000kb) có thể phân tách bằng điện di trong
điện trường xung (PFGE). Phương pháp này về cơ bản giống như trong điện di
thông thường. Trong điện di trong điện trường xung, hướng của điện trường không
phải cố đònh như phương pháp thông thường và được thay đổi theo chu kỳ, cả lực
điện trường cũng được thay đổi. Mỗi lần hướng của điện trường thay đổi thì phân
tử DNA phải tự đònh hướng lại. Thời gian cho việc tự đònh hướng này phụ thuộc
kích thước của phân tử. Phân tử càng dài thì thời gian tự đònh hướng càng lớn
khiến nó di chuyển chậm hơn một phân tử có kích thước nhỏ.
Mặc dù theo lý thuyết, PFGE được sử dụng ít, nhưng trong thực tế nó được
áp dụng rất nhiều. PFGE đã thay đổi rất lớn kỹ thuật nghiên cưú DNA. Những
DNA có trọng lượng phân tử trung bình, được cô lập khỏi tế bào dưới sự hiện diện

của lysozyme, chất tẩy và EDTA có kích thước phân tử khoảng 400-500kb được
phân tách tốt bởi kỹ thuật điện di trong điện trường xung.
Có nhiều thiết bò được phát triển để thay đổi thiết kế thí nghiệm của PFGE.
Một vài yếu tố có thể bò thay đổi trong mỗi thí nghiệm như hiệu điện thế, số
lượng điện cực, chu kỳ thay đổi hướng điện trường, thiết kế hộp gel, nhiệt độ,
nồng độ agarose, pH của dung dòch điện di, thời gian điện di.

BÀI GIẢNG LÝ THUYẾT KỸ THUẬT PHÂN TÍCH SINH HÓA HIỆN ĐẠI

15


Chương 3- Kỹ thuật điện di

Cũng giống như các kỹ thuật thí nghiệm khác, PFGE cũng có một số nhược
điểm cần phải được lưu ý ví dụ như thời gian điện di lâu (trong vòng vài ngày)
thường đòi hỏi sự phân giải tốt. Sự di chuyển của những cấu phần phụ thuộc vào
điều kiện tiến hành thí nghiệm.
PFGE là công cụ hiệu quả trong việc phân tách những phân tử có khối
lượng rất lớn. Kỹ thuật này đã được sử dụng trong dự án bộ gen người.
6 - Điện di trên giấy
Nguyên liệu, hoá chất và thiết bò
+ Nguyên liệu: dung dòch amin chuẩn, hỗn hợp M1, dung dòch nghiên cứu.
+ Hoá chất: dung dòch điện di: dung dòch đệm phosphate M/5 pH 6.1.
+ Thiết bò: giấy điện di (giấy Whatman No 1)
Máy điện di gồm: hai chậu lớn, hai miếng kính thuỷ tinh hình chữ nhật cùng
kích thước, hai điện cực nối với nguốn điện một chiều có hiệu điện thế cao (250400V), một volt kế hay một ampe kế cho phép đo hiệu điện thế và cường độ dòng
điện đi qua giấy.

Lys

Asp
Leu
M1
Arg
His
Tyr

a)
Hình II.4 - Điện di trên giấy
a) Thiết bò điện di b) Chuẩn bò giấy điện di

b)

+ Bước 1: chuẩn bò giấy điện di
Cắt một băng giấy điện di theo kích thước 3512cm. Vẽ một đường viết
chì ở giữa tờ giấy theo chiều ngang. Đònh vò các acid amin trên giấy.
+ Bước 2: chấm dung dòch acid amin
Tiến hành chấm acid amin trên giấy như phần sắc ký (xem 3.12)
Bước 3: tiến hành chạy điện di

BÀI GIẢNG LÝ THUYẾT KỸ THUẬT PHÂN TÍCH SINH HÓA HIỆN ĐẠI

16


Chương 3- Kỹ thuật điện di

Nhúng ướt giấy: kẹp một đầu và nhúng một đầu vào chậu dung dòch đệm
sao cho mực nước còn cách lằn viết chì 1cm, đem ra thấm khô ngay giữa hai tờ
giấy lọc và lặp lại như trên đối với nữa kia.

Đem để băng giấy lên một tấm thuỷ tinh đã rửa sạch và khô. Làm ẩm đầu
phần khô bằng mẫu giấy lọc thấm dung dòch đệm sao cho giấy đủ ướt để những
amino acid không bò lôi đi. Chồng tấm kính thứ hai lên. Chú ý là: hai đầu giấy
phải nhúng vào dung dòch và bề mặt hai tấm kính cũng như băng giấy không được
dính dấu vân tay. Đóng mạch điện.
Dòng điện có hiệu điện thế cao nên kể từ đây không chạm vào bất cứ bộ
phận nào của máy. Cho máy chạy trong 1 giờ 15 phút, sau đó ngắt mạch điện.
Bước 4: xác đònh acid amin bằng thuốc thử
Lấy tấm kính phía trên ra và sấy khô giấy bằng máy sấy. Quan sát các vệt
acid amin hiện ra. Nhuộm băng giấy bằng thuốc thử ninhydrin, sau đó làm khô
bằng máy sấy. Quan sát các vệt acid amin hiện ra và kết luận thành phần acid
amin có trong hỗn hợp M1.
Bước 5: Đònh lượng protein
Xác đònh cường độ protein bằng cách đo cường độ màu của các vết.
Cắt từng vết acid amin ra khỏi giấy sắc ký, cắt nhỏ giấy cho hết vào ống
nghiệm, rồi cho vào đó dung dòch CdCl2 48% trong ethanol hay 48% CuSO4 trong
ethanol, ngâm trong 3 giờ. Sau đó đem đo mật dộ quang trên máy soi màu ở bước
sóng 520nm. Xác đònh đường chuẩn acid amin (để biết nồng độ) dựa vào đường
chuẩn để xác đònh nồng độ acid amin có trong vết cắt.
7 - Phát hiện vạch điện di
Sau khi phân tích bằng điện di các phân tử DNA trên gel người ta sử dụng
một số phương pháp làm hiện hình như sau:
Đối với gel agarose, người ta nhuộm bằng ethidium bromide. Chất này sẽ
gắn xen vào giữa các base của phân tử DNA và phát huỳnh quang dưới tia tử
ngoại. Điều này cho phép phát hiện các đoạn DNA trên gel.
Đối với gel polyacrylamide, các phân tử DNA được đánh dấu bằng đồng vò
phóng xạ và vò trí của chúng sẽ được phát hiện bằng kỹ thuật phóng xạ tự ghi.
Chúng còn có thể được đánh dấu bằng chất nhuộm chuyên biệt.

BÀI GIẢNG LÝ THUYẾT KỸ THUẬT PHÂN TÍCH SINH HÓA HIỆN ĐẠI


17


Chương 3- Kỹ thuật điện di

Hình II.5 – Phát hiện vạch
điện di bằng cách quan sát
dưới tia tử ngoại

Hình II.6 – Chụp ảnh trên gel document nhờ máy vi
tính

8 - Phương pháp chụp hình gel
Giới thiệu
Đối với điện di DNA, người ta thường nhuộm ethidium bromide. Gel được
khuêùch đại thông qua UV transilluminator. Với phương pháp này chúng ta cần
phim để chụp. Hiện nay với công nghệ thông tin hiện đại. Máy chụp được qua
một hệ thống là gel document nhờ máy vi tính điều chỉnh thông qua phần mềm
chuyên dụng. Với phương pháp này người ta in trực tiếp và lưu vào đóa.
Phương pháp
Hệ thống chụp được đặt trong phòng tối.
1. Để gel trên UV transilluminator. Chú ý cẩn thận tránh tạo bọt khí. Tốt
nhất là lấy giấy mềm thấm nước.
2. Đặt phim vào trong máy chụp.
3. Điều chỉnh máy chụp hình. Tập trung ảnh vào vò trí trung tâm và chỉnh
hình cho rõ nét. Lúc này dùng hệ thống đèn sáng để chỉnh hình.
4. Tắt hệ thống đèn, mở đèn UV, lúc này phải mang kính bảo hộ để tránh
tia UV, ảnh hưởng đến mắt và da. Dùng tay nhẹ nhành di chuyển ống
kính để điều chỉnh hình cho sắc nét. Khi hình vào tiêu điểm, chỉnh hình.

5. Bấm máy, tắt hệ thống đèn UV
6. Cẩn thận rút phim ra khỏi máy. Đợi 45 phút, xong bỏ giấy bao trên
hình.
BÀI GIẢNG LÝ THUYẾT KỸ THUẬT PHÂN TÍCH SINH HÓA HIỆN ĐẠI

18


Chương 3- Kỹ thuật điện di

Chú ý máy dễ bò dơ do phim chụp nhiều hoặc phim cũ, hệ thống càng
bẩn chụp càng rất khó in hình. Do đó cần phải tháo kính ra lau chùi bằng
cồn 70%.
7. Sau khi chụp xong bỏ gel vào thùng chứa, lau sạch bàn.
Chụp ảnh trên gel document
Trường hợp dùng hệ thống gel document, hình ảnh sẽ hiện ngay khi đặt
trong buồng tối. Đặt gel vào trong buồng tối, điều chỉnh máy chụp hình.
Có thể thông qua hệ thống vi tính điều chỉnh hình sắc nét trước khi chụp
ảnh. Thông qua hình ảnh lưu vào đóa lâu dài.
9 - Thu nhận mẫu điện di
Đối với điện di trên gel agarose còn được sử dụng để tinh sạch và thu nhận
mẫu. Nguyên tắc và điều kiện giống như điện di phân tích đã đề cập ở trên. Sau
khi điện di các vạch tương ứng với DNA cần tinh sạch được phát hiện và thu nhận
lại bằng một trong cách cách sau đây:
+ Phương pháp 1: Phần agarose chứa các vạch đó được cắt ra và DNA được
thu nhận sau khi đã khuếch tán từ gel agarose vào trong một dung dòch đệm thích
hợp.
+ Phương pháp 2: Một “giếng” nhỏ được khoét trong agarose ngay trước
vạch DNA. “Giếng” này được bơm đầy dung dòch đệm và điện trường được tái
lập. DNA di chuyển vào “giếng” chứa đầy dung dòch đệm và được thu nhận lại.

+ Phương pháp 3: Điện di được thực hiện trên một agarose gel đặc biệt có
điểm nóng chảy rất thấp (65oC). Sau khi điện di vạch DNA được cắt ra, ủ trong
một dung dòch đệm ở nhiệt độ 65oC. Sau khi agarose đã hoàn toàn nóng chảy,
DNA được thu nhận lại sau nhiều công đoạn tách chiết và tủa.
10 - Phân tích kết quả điện di
Do việc phân tách sinh hoá kết quả điện di dựa trên điện tích, kích thước và
cấu tạo, điện di có thể cung cấp nhiều thông tin giá trò như độ tinh sạch và khối
lượng phân tử. Độ tinh sạch được đánh giá thông qua số vạch trên băng điện di.
Nếu chỉ có một vạch, nghóa là chỉ có một cấu tử hiện diện. Kết quả phân tích này
được đánh gía là tinh sạch. Nếu có hai hay nhiều vạch chúng tỏ mẫu có hai hay
nhiều cấu tử hiện diện, bò tạp nhiễm hay không tinh sạch và do đó ta gọi là dò
hình hay không tinh sạch.
Để kiểm tra về độ đồng nhất, người ta thường cho chạy một vệt chuẩn, từ
đó so sánh. Và thông thường để kiểm tra độ tinh sạch người ta kết hợp sử dụng
phương pháp sắc ký khí hay sắc ký lỏng cao áp.

BÀI GIẢNG LÝ THUYẾT KỸ THUẬT PHÂN TÍCH SINH HÓA HIỆN ĐẠI

19


Chương 3- Kỹ thuật điện di

Câu hỏi ôn tập
1. Nêu nguyên tắc của phương pháp điện di.
2. Những ưu điểm của phương pháp điện di trên gel polyacrylamid?
3. Những thành phần tạo gel polyacrylamid?
4. Nguyên tắc của phương pháp điện di trên gel Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide (SDS - PAGE)?
5. Trình bày phương pháp điện di trên gel agarose.
6. Nguyên tắc của phương pháp điện di trên điện trường xung?

7. Có những phương pháp nào phát hiện vạch điện di?
8. Trình bày các phương pháp thu nhận mẫu điện di.

BÀI GIẢNG LÝ THUYẾT KỸ THUẬT PHÂN TÍCH SINH HÓA HIỆN ĐẠI

20