BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG
----------***----------

ĐINH QUANG THUẤN

NGHIÊN CỨU DẠNG GIÁ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CÁC QUẦN
THỂ TU HÀI LUTRARIA RHYNCHAENA JONAS, 1844
Ở QUẢNG NINH, HẢI PHÒNG VÀ KHÁNH HÒA

LUẬN VĂN THẠC SĨ

Khánh Hòa - 2015


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG
----------***----------

ĐINH QUANG THUẤN

NGHIÊN CỨU DẠNG GIÁ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CÁC QUẦN
THỂ TU HÀI LUTRARIA RHYNCHAENA JONAS, 1844
Ở QUẢNG NINH, HẢI PHÒNG VÀ KHÁNH HÒA
LUẬN VĂN THẠC SĨ

Ngành:

Nuôi trồng thủy sản

Mã số:

6062301

Quyết định giao đề tài:

254/QĐ-ĐHNT ngày 25/03/2014

Quyết định thành lập HĐ:

1044/QĐ-ĐHNT ngày 10/11/2015

Ngày bảo vệ:

23/11/2015

Người hướng dẫn khoa học:
TS. THÁI THANH BÌNH
Chủ tịch hội đồng:
TS. LỤC MINH DIỆP
Khoa sau đại học:

Khánh Hòa - 2015


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan mọi kết quả của đề tài: “Nghiên cứu đánh giá đa dạng di
truyền các quần thể tu hài Lutraria rhynchaena Jonas, 1844 ở Quảng Ninh, Hải
Phòng và Khánh Hòa” là công trình nghiên cứu thực sự của cá nhân, được thực hiện
dưới sự hướng dẫn khoa học của TS. Thái Thanh Bình.
Các số liệu, những kết luận nghiên cứu được trình bày trong luận văn này là

trung thực và chưa được công bố dưới bất cứ hình thức nào.
Tôi xin chịu trách nhiệm về nghiên cứu của mình.

Tác giả

Đinh Quang Thuấn

iii


LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc tới TS. Thái Thanh
Bình, người đã định hướng cũng như tận tình hướng dẫn, giúp đỡ và tạo điều kiện để
tôi hoàn thành luận văn này.
Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới ThS. Nguyễn Thị Hiến đã trực tiếp giúp đỡ,
hỗ trợ tôi hoàn thành các thí nghiệm.
Tôi xin gửi lời cảm ơn tới tập thể cán bộ, công nhân viên phòng Khoa học và
Hợp tác Quốc tế, phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học Thủy sản – Trường Cao đẳng
Thủy sản đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi thực hiện luận văn.
Tôi xin chân thành cảm ơn Khoa sau Đại học- Trường Đại học Nha Trang đã
tạo điều kiện để tôi có được khóa học này, Trường Cao đẳng Thủy sản đã tạo điều kiện
về thời gian và ủng hộ trong quá trình thực hiện luận văn.
Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn tới các anh chị đồng nghiệp, bạn bè, gia đình
đã cổ vũ và giúp đỡ tôi suốt quá trình học tập và thực hiện luận văn.
Tôi xin chân thành cảm ơn!

Tác giả

Đinh Quang Thuấn


iv


MỤC LỤC
Lời cam đoan ................................................................................................................ iii
Lời cảm ơn .................................................................................................................... iv
Mục lục ........................................................................................................................... v
Danh mục các từ viết tắt .............................................................................................. vii
Danh mục các bảng ................................................................................................. viiviii
Danh mục các hình ...................................................................................................... iix
Trích yếu luận văn ......................................................................................................... x
Mở đầu ........................................................................................................................... 1
Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................................ 3
1.1. Một số đặc điểm sinh học của tu hài ...................................................................... 3
1.1.1. Nguồn gốc và sự phân bố tu hài ...................................................................... 3
1.1.2. Vị trí phân loại tu hài ...................................................................................... 3
1.1.3. Đặc điểm sinh trưởng..................................................................................... 4
1.1.4. Đặc điểm sinh sản và phát triển ..................................................................... 5
1.2. Giá trị kinh tế và tình hình nuôi tu hài ở Việt Nam ................................................ 6
1.2.1. Giá trị kinh tế và thị trường............................................................................. 6
1.2.2. Tình hình nuôi tu hài tại Việt Nam.................................................................. 6
1.3. Một số nghiên cứu về tu hài ở Việt Nam ............................................................... 9
1.4. Đa dạng sinh học, giá trị của đa dạng sinh học, một số phương pháp đánh
giá .............................................................................................................................. 10
1.4.1. Đa dạng di truyền ......................................................................................... 10
1.4.2. Một số phương pháp đánh giá đa dạng sinh học ............................................ 10
1.5. Ứng dụng chỉ thị phân tử trong nghiên cứu một số loài thủy sản ở nước
ngoài và trong nước.................................................................................................... 13
1.5.1. Những nghiên cứu đánh giá đa dạng di truyền của một số loài nhuyễn thể .... 13
1.5.2. Những nghiên cứu đánh giá đa dạng di truyền một số loài thủy sản và tu

hài ở trong nước ..................................................................................................... 16
Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................... 19
2.1. Thời gian, địa điểm thực hiện đề tài..................................................................... 19
2.2. Vật liệu nghiên cứu ............................................................................................. 19
2.2.1. Đối tượng nghiên cứu ................................................................................... 19
v


2.2.2. Thiết bị ......................................................................................................... 19
2.2.3. Hóa chất ....................................................................................................... 19
2.3. Phương pháp nghiên cứu ..................................................................................... 20
2.3.1. Thu mẫu và bảo quản .................................................................................... 20
2.3.2. Tách chiết ADN tổng số ............................................................................... 22
2.3.3. Thành phần của một phản ứng PCR .............................................................. 24
2.3.4. Chương trình chạy PCR ................................................................................ 24
2.3.5. Kiểm tra sản phẩm PCR ................................................................................ 25
2.3.6. Thực hiện cắt ADN bằng enzyme giới hạn.................................................... 26
2.3.7. Phương pháp định trình tự gen bằng máy giải tự động .................................. 27
2.4. Phương pháp xử lý số liệu ................................................................................... 28
Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ......................................... 29
3.1. Kết quả đánh giá đa dạng di truyền bằng phương pháp RFLP .............................. 29
3.1.1. Tách chiết ADN tổng số ............................................................................... 29
3.2.1. Kết quả đa dạng di truyền bằng phương pháp RFLP ..................................... 29
3.2. Kết quả đánh giá đa dạng di truyền của quần thể tu hài nuôi và tự nhiên
bằng phương pháp giải trình tự ................................................................................... 29
3.2.1. Kết quả tách chiết ADN tổng số.................................................................... 29
3.2.2. Kết quả khuyếch đại đoạn gen 16S mtADN ở các mẫu nghiên cứu ............... 30
3.2.3. Kết quả giải trình tự ...................................................................................... 30
3.2.4. Hệ số biến dị di truyền .................................................................................. 32
3.2.5. Mối quan hệ giữa các quần thể và các cá thể trong mỗi quần thể .................. 34

3.2.6. Xây dựng cây quan hệ di truyền.................................................................... 47
3.2.7. So sánh đa dạng di truyền của quần thể tự nhiên với quần thể nuôi ............... 52
Chương 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................................... 54
4.1. Kết luận............................................................................................................... 54
4.2. Kiến nghị............................................................................................................. 54
TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................................... 55
PHỤ LỤC ..................................................................................................................... 60

vi


DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
RFLP:

Restriction Fragment Length Polymorphisms

bp:

Base pair (cặp bazơ)

Pi:

Nucleotide diversity (Đa dạng Nucleotide)

Hd:

Haplotype diversity

ĐVTM:


Động vật thân mềm

ADN:

Acid deoxyribonucleic

ddNTP:

Dideoxynucleoside triphosphate

dNTP:

Deoxynucleoside triphosphate

AFLP:

Amplified Fragment Length Polymorphism

RAPD:

RADNom Amplified Polymorphic DNA

CTAB:

Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide

EDTA:

Ethylene diamine Tetra-acetic acid


TAE:

Tris-acetate- EDTA

PCR:

Polymerase Chain Reaction

mtADN:

Mitochondrial ADN- Hệ gen ty thể

UPGMA:

Unweighted Pain Group Method using Arithmetic mean

vii


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1. Diện tích và sản lượng nuôi tu hài thương phẩm tại tỉnh Khánh Hòa ............ 6
Bảng 2.1. Địa điểm, code mẫu, số lượng mẫu tu hài được giải trình tự ADN ............. 22
Bảng 2.2. Thành phần của một phản ứng PCR ........................................................... 24
Bảng 2.3.Chu trình nhiệt phản ứng PCR nhân đoạn 16S ............................................ 25
Bảng 3.1. Kết quả so sánh trình tự ADN của tu hài Việt Nam với trình tự ADN của tu
hài đã công bố trên Genbank ...................................................................................... 31
Bảng 3.2. Sự đa dạng di truyền của các quần thể và trong mỗi quần thể tu hài Quảng
Ninh, Hải Phòng và Khánh Hòa ................................................................................. 33
Bảng 3.3. Vị trí sai khác Nucleotide giữa các mẫu tu hài ở Quảng Ninh, Hải Phòng và
Khánh Hòa................................................................................................................. 34

Bảng 3.4. Khoảng cách di truyền giữa các mẫu trong ba quần thể Quảng Ninh, Hải
Phòng, Khánh Hòa (%) .............................................................................................. 37
Bảng 3.5. Khoảng cách di truyền giữa các mẫu trong ba quần thể Quảng Ninh, Hải
Phòng, Khánh Hòa (%) .............................................................................................. 38
Bảng 3.6. Khoảng cách di truyền giữa các mẫu trong ba quần thể Quảng Ninh, Hải
Phòng, Khánh Hòa (%) .............................................................................................. 39
Bảng 3.7. Khoảng cách di truyền giữa các mẫu trong ba quần thể Quảng Ninh, Hải
Phòng, Khánh Hòa (%) .............................................................................................. 40
Bảng 3.8. Khoảng cách di truyền giữa các mẫu trong ba quần thể Quảng Ninh, Hải
Phòng, Khánh Hòa (%) .............................................................................................. 41
Bảng 3.9. Khoảng cách di truyền giữa các mẫu trong ba quần thể Quảng Ninh, Hải
Phòng, Khánh Hòa (%) .............................................................................................. 42
Bảng 3.10. Khoảng cách di truyền giữa các mẫu trong quần thể tu hài Quảng Ninh (%)
.................................................................................................................................. 44
Bảng 3.11. Khoảng cách di truyền giữa các mẫu trong quần thể tu hài Hải Phòng (%)
.................................................................................................................................. 45
Bảng 3.12. Khoảng cách di truyền giữa các mẫu trong quần thể tu hài Khánh Hòa (%)
.................................................................................................................................. 46
Bảng 3.13. Khoảng cách di truyền giữa 3 quần thể tu hài (%) .................................... 47

viii


DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1. Hình thái cấu tạo của tu hài (Lutraria rhynchaena) ...................................... 4
Hình 1.2. Tu hài giống được sản xuất tại Yên Hưng- Quảng Ninh năm 2012 ............... 5
Hình 1.3. Nuôi tu hài ở Khánh Hòa.............................................................................. 8
Hình 1.4. Hệ thống giàn nuôi tu hài ở Vân Đồn- Quảng Ninh ...................................... 9
Hình 2.1. Sơ đồ các bước phân tích mẫu bằng phương pháp RFLP ............................ 20
Hình 2.2. Sơ đồ giải trình tự ADN tu hài.................................................................... 20

Hình 2.3. Địa điểm thu mẫu tu hài ............................................................................. 21
Hình 2.4. Sơ đồ trình tự các bước tách chiết ADN bằng bộ kít Qiagen ....................... 23
Hình 2.5. Chạy điện di sản phẩm PCR ....................................................................... 26
Hình 3.1. Sản phẩm điện di 16S cắt bằng 3 enzyme hạn chế ...................................... 29
Hình 3.2. Kết quả kiểm tra ADN tổng số của một số mẫu tu hài Vân Đồn ................. 30
Hình 3.3. Kết quả điện di sản phẩm PCR khuyếch đại đoạn gen tu hài 16S mtADN .. 30
Hình 3.4. Hình thái tu hài Vân Đồn (2 mẫu Trái) và tu hài Cô Tô (2 mẫu phải) ......... 32
Hình 3.5. Cây Neighbor-Joining được xây dựng từ các trình tự ADN của tu hài vùng
gen 16S mtADN với giá trị Bootstrap được tính trên 1.000 lần lặp, code mẫu được
trình bày ở Bảng 3.1 .................................................................................................. 48
Hình 3.6. Cây Minimum Evolution được xây dựng từ các trình tự ADN của tu hài
vùng gen 16S với giá trị Bootstrap được tính trên 1.000 lần lặp, code mẫu được trình
bày ở Bảng 3.1 ........................................................................................................... 49
Hình 3.7. Cây Maximum Parsimony được xây dựng từ các trình tự ADN của tu hài
vùng gen 16S với giá trị Bootstrap được tính trên 1.000 lần lặp, code mẫu được trình
bày ở Bảng 3.1 ........................................................................................................... 50
Hình 3.8. Cây Unweighted Pain Group Method using Arithmetic mean (UPGMA)
được xây dựng từ các trình tự ADN của tu hài vùng gen 16S với giá trị Bootstrap được
tính trên 1.000 lần lặp, code mẫu được trình bày ở Bảng 3.1 ...................................... 51

ix


TRÍCH YẾU LUẬN VĂN
Chủ đề nghiên cứu:
Tu hài là loài nhuyễn thể có giá trị kinh tế cao và được nuôi phổ biến ở các tỉnh
Quảng Ninh, Hải Phòng và Khánh Hòa. Để nghề nuôi tu hài phát triển bền vững thì
việc thực hiện đề tài “Nghiên cứu đánh giá đa dạng di truyền các quần thể tu hài
Lutraria rhynchaena Jonas, 1844 ở Quảng Ninh, Hải Phòng và Khánh Hòa” là rất
cần thiết. Kết quả của đề tài sẽ cung cấp những cơ sở dữ liệu khoa học về di truyền cho

định hướng chọn giống và bảo tồn các quần thể tu hài ở Việt Nam.
Mục tiêu của để tài:
Đánh giá được đa dạng di truyền của tu hài phục vụ cho công tác bảo tồn, phát
triển nguồn gen và lựa chọn vật liệu ban đầu phục vụ cho chọn giống.
Phương pháp nghiên cứu đã sử dụng:
Cách thu mẫu: Tu hài phân bố tự nhiên và tu hài nuôi được thu mẫu ở các tỉnh
Quảng Ninh, Hải Phòng, Khánh Hòa. Tổng số mẫu thu và phân tích 58 mẫu.
Cách bảo quản mẫu: Mẫu tu hài là một phân cơ của vòi tu hài (10-15g/mẫu).
Mẫu được bảo quản trong ống eppendoft (2 ml) có chứa cồn nồng độ 90%.
Tách chiết ADN và giải trình tự ADN: ADN tổng số được tách chiết từ cơ vòi
của tu hài bằng bộ kít Qiagen. Phương pháp tách chiết theo hướng dẫn của nhà sản
xuất. Đoạn gen 16S mtADN được khuếch đại bằng cặp mồi có trình tự như sau: 16Sar:
(5’-3’) GGG CTA GTA TGAATG GTT TGA và 16Sbr: (5’-3’) ATG CTG TTA TCC
CTATGG TAACT. Mỗi phản ứng PCR được thực hiện với thể tích 25μl (12,5 μl
Toptaq Master Mix 2x; 5μl Coral load; 4,5μl nước tinh kiết; 1μl 16sar; 1μl 16sbr; 1μl
ADN khuôn). Chu kỳ nhiệt của phản ứng PCR nhân bản vùng gen 16S: 94oC trong 3
phút, tiếp theo 30 chu kỳ (94oC trong 30 giây, nhiệt độ gắn mồi 56oC trong 30 giây và
72oC trong 1 phút), kéo dài đoạn 72oC trong 5 phút. Sản phẩm PCR được bảo quản và
kiểm tra bằng phương pháp chạy điện di trên bản gel agarose 2%/TAE1X. Tiếp theo,
trình tự ADN được giải trên máy ABI/3130XL, mỗi mẫu được giải trình tự bằng 2 mồi
xuôi ngược.
Kết quả nghiên cứu:
Kết quả tách chiết ADN và khuếch đại vùng gen 16S mtADN
Kết quả đã tách chiết 58 mẫu ADN tổng số của các mẫu tu hài thu tại 3 tỉnh
Quảng Ninh, Hải Phòng, Khánh Hòa gồm tu hài tự nhiên và nuôi. Mẫu ADN tổng số
x


được kiểm tra bằng phương pháp điện di trên gel agarose 1%. Kết quả điện di cho thấy
các băng ADN thu được của các mẫu tu hài khá gọn và đồng đều chứng tỏ chất lượng

ADN của các mẫu tốt.
Kết quả kiểm tra các sản phẩm PCR cho thấy kích thước  500bp gọn, rõ nét,
đủ tiêu chuẩn để thực hiện các nghiên cứu tiếp.
Kết quả giải trình tự
Tổng số 58 mẫu tu hài thu từ Quảng Ninh, Hải Phòng và Khánh Hòa được giải
trình tự ADN ty thể vùng gen 16S thành công. Sau khi dóng trình tự và so sánh trình
tự các nucleotide, mỗi mẫu có 440 nucleotide được dùng trong phân tích về phả hệ.
Trong đó có Adenine (A) chiếm 31,2%; Cytocyne (C) chiếm 14,7%; Guanine (G)
chiếm 27% và Thymine (T) chiếm 27,2%.
Kết quả so sánh trình tự ADN của các mẫu tu hài Việt Nam với các trình tự
ADN của tu hài ở Genbank cho thấy trình tự ADN của các mẫu tu hài Việt Nam có sự
tương đồng cao với trình tự ADN của 3 loài tu hài (Lutraria arcuata, Lutraria
australis và Lutraria rhynchaena) đã công bố trên Genbank.
Hệ số biến dị di truyền
Quần thể tu hài Quảng Ninh có hệ số biến dị di truyền cao nhất
(hd=0,671±0,061; Π=0,0267±0,00828), không có sự sai khác của các cá thể tu hài ở
Hải Phòng và Khánh Hòa (hd=0; Π=0). Trong 58 mẫu tu hài của 3 quần thể với 4
haplotype có hệ số biến dị di truyền (hd =0,399±0,071; Π=0,0115±0,00445). So với
các nghiên cứu về nhuyễn thể thì tu hài Việt Nam có đa dạng di truyền thấp.
Mối quan hệ giữa các quần thể và các cá thể trong mỗi quần thể
Kết quả so sánh trình tự nucleotide xác định được ở 3 quần thể tu hài nghiên
cứu cho thấy 36 vị trí trên vùng gen 16S mtADN có sự sai khác. Sự sai khác tập trung
chủ yếu ở tu hài tự nhiên thu mẫu tại Cô Tô.
Khoảng cách di truyền cho thấy hệ số sai khác giữa tu hài của 3 tỉnh dao động
trong khoảng từ 0-4,3%; Khoảng cách di truyền giữa một số mẫu tu hài ở Cô Tô so với
các mẫu tu hài khác lần lượt CTT14, CTT21, CTT8 dao động từ 2,5-2,7% và lớn nhất
là mẫu tu hài CTT2 dao động từ 4,1-4,3%. Khoảng cách di truyền thấp nhất ở các mẫu
tu hài của quần thể Khánh Hòa có d=0. Đồng thời qua bảng cho thấy tu hài ở Cô Tô có
khoảng các di truyền cao hơn nhiều so với tu hài ở các mẫu khác với khoảng cách di
truyền dao động từ 2,5-4,3%.

xi


Trong 3 quần thể nghiên cứu, quần thể tu hài Hải Phòng có mối quan hệ di
truyền gần gũi nhất với quần thể tu hài Khánh Hòa, khoảng cách di truyền của các mẫu
tu hài Hải Phòng với các mẫu tu hài Khánh Hòa là 0, có nghĩa là sự tương đồng về
trình tự nucleotide giữa các mẫu tu hài ở Hải Phòng so với Khánh Hòa là 100%.
Giữa 3 quần thể, sự sai khác về trình tự nucleotide giữa tu hài Quảng Ninh so
với tu hài ở Hải Phòng và Khánh Hòa là cao nhất, giá trị hệ số khoảng cách di truyền
của quần thể tu hài Quảng Ninh so với quần thể tu hài Hải Phòng và Khánh Hòa là
2%.
Qua phân tích cây phả hệ cho thấy tu hài Quảng Ninh, Hải Phòng, Khánh Hòa
có thể giải thích quá trình di giống tu hài từ Bắc vào Khánh Hòa.
Kết luận và đề nghị:
Kết quả nghiên cứu ban đầu về giải trình tự ADN tu hài ở vùng gen 16S
mtADN cho thấy Việt Nam có 2 loài tu hài và có tên khoa học là Lutraria rhynchaena
và Lutraria arcuata. Đa dạng di truyền tu hài Việt Nam ở mức trung bình 0,399±0,071.
Cần tiến hành những nghiên cứu sâu hơn trên nhiều cá thể tu hài thuộc quần thể
Việt Nam và phát triển chỉ thị đánh giá đa dạng di truyền trong nhân tế bào tu hài như
IST, H3, Microsatellite, SNP.
Từ khóa: Đa dạng di truyền, Lutraria sp, tu hài,16S mtADN

xii


MỞ ĐẦU
Tính cấp thiết của đề tài
Tu hài (Lutraria sp) là loài nhuyễn thể thuộc lớp 2 mảnh vỏ (Bivalvia). Thịt tu
hài có hàm lượng dinh dưỡng cao: protein chiếm 11,63%, gluicid chiếm 0,42%,
khoáng chiếm 1,22% và có tới 8 loại axit amin không thay thế [19]. Tu hài là đối

tượng hải sản có giá trị kinh tế cao [19]. Ở Việt Nam, tu hài phân bố tự nhiên chủ yếu
ở vùng biển tỉnh Hải Phòng, Quảng Ninh và được di giống vào miền trung cách đây
hơn 10 năm. Tu hài lọc nước để lấy thức ăn, sử dụng vi tảo biển tự nhiên làm thức ăn,
hạn chế sự ô nhiễm môi trường, đây là cơ sở để nghề nuôi tu hài phát triển bền vững.
Vùng biển Hải Phòng - Quảng Ninh là cái nôi của nuôi trồng và phát triển hải sản có
giá trị kinh tế cao như cá biển (cá song, cá giò, cá Hồng Mỹ v.v…) và nhuyễn thể (Trai
ngọc, Hầu, Ngao, Điệp, tu hài v.v...). Với ưu thế thuận lợi về điều kiện tự nhiên và có
nhiều di sản thiên nhiên được thế giới công nhận (Vịnh Hạ Long, Khu dự trữ sinh
quyển Cát Bà), trong những năm tới việc phát triển nghề nuôi tu hài trên quy mô lớn
sẽ phù hợp với xu thế phát triển kinh tế biển và đảm bảo an ninh quốc gia của khu vực
này.
Tu hài là đối tượng nuôi thủy sản có giá trị kinh tế cao cho sản lượng lớn do đó
mục tiêu qui hoạch nuôi nhuyễn thể đến năm 2020 (số: 1628/QĐ-BNN-TCTS) của Bộ
Nông nghiệp và Phát triển nông thôn, sẽ phát triển diện tích nuôi tu hài lên tới 1360 ha
với sản lượng trung bình 3.950 tấn/năm.
Ở Việt Nam, các nghiên cứu về tu hài còn rất hạn chế. Các nhà khoa học chủ
yếu tập trung nghiên cứu đánh giá sản lượng, kỹ thuật sản xuất giống và nuôi thương
phẩm. Báo cáo kết quả điều tra động vật vùng triều của Tổng cục thuỷ sản các năm
1966-1967, hai tác giả Trần Hữu Doanh và Nguyễn Như Tùng đã thống kê 133 loài
động vật thân mềm, trong đó có tên loài tu hài Lutraria rhynchaena Jonas, 1844 [3].
Năm 1979 Nguyễn Xuân Dục, Nguyễn Mạnh Hùng đã có công trình về kết quả điều
tra trữ lượng, dẫn liệu sinh thái tự nhiên của tu hài ở vùng biển Cát Bà [4]. Năm 1978,
trên cơ sở các mẫu vật thu được ở vùng biển Cát Bà, Mai Văn Minh (Sinh học, Đại
học Tổng hợp Hà Nội) đã tiến hành nghiên cứu thành phần sinh hoá của thịt tu hài [7].
Mặc dù tu hài đã được nuôi ở Việt Nam từ lâu nhưng những hiểu biết về đa
dạng di truyền các quần thể của loài này còn rất hạn chế.

1



Để nghề nuôi tu hài phát triển bền vững thì việc thực hiện đề tài “Nghiên cứu
đánh giá đa dạng di truyền các quần thể tu hài Lutraria rhynchaena Jonas, 1844 ở
Quảng Ninh, Hải Phòng và Khánh Hòa” là rất cần thiết. Kết quả của đề tài sẽ cung
cấp những cơ sở dữ liệu khoa học về di truyền cho định hướng chọn giống và bảo tồn
các quần thể tu hài ở Việt Nam.
Mục tiêu nghiên cứu
Đánh giá được đa dạng di truyền của tu hài phục vụ cho công tác bảo tồn, phát
triển nguồn gen và lựa chọn vật liệu ban đầu phục vụ cho chọn giống.
Nội dung nghiên cứu
- Đánh giá mức độ đa dạng di truyền trong các quần thể tu hài;
- Xác định các haplotype trong các quần thể tu hài.
Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn
- Là nghiên cứu mới về đa dạng di truyền quần thể, thiết lập được các bộ chỉ thị
phân tử đầu tiên cho tu hài ở Việt Nam.
- Là cơ sở dữ liệu khoa học quan trọng, góp phần trong định hướng lựa chọn
nguồn vật liệu ban đầu phục vụ cho bảo tồn và chọn giống tu hài nhằm phát triển nghề
nuôi tu hài theo hướng bền vững.
Đối tượng và phạm vi nghiên cứu
- Đối tượng nghiên cứu: các quần đàn tu hài nuôi và quần thể tu hài tự nhiên ở
Quảng Ninh, Hải phòng và Khánh Hòa.
- Đề tài nghiên cứu thuộc phạm vi nghiên cứu bảo tồn, khai thác và sử dụng tài
nguyên di truyền động vật.

2


Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Một số đặc điểm sinh học của tu hài
1.1.1. Nguồn gốc và sự phân bố tu hài
Trên thế giới, tu hài sống chủ yếu ở vùng bờ biển nước Mỹ, Canada, Tây và

Nam Australia. Theo thông tin từ khoa sinh thái học trường Puget Sound (Mỹ) cho biết
loài tu hài (Geoduck) sống tới 40 năm và nặng tới 9kg. Khối lượng trung bình là 7,15
Pound tương đương 3,2kg và vùng Puget Sound là một vùng có trên 109 triệu con tu
hài, với mật độ cao nhất ở Hoa Kỳ. Cũng theo nguồn thông tin này ở Mỹ người ta gọi
loài này là “King Clam” và được coi là đặc sản châu Á. Thị trường lớn nhất của tu hài
là Đài Loan, Nhật, Trung Quốc và Hồng Kông [26].
Ở Việt Nam tu hài chỉ phân bố ở khu vực phía Bắc thuộc vùng biển từ đảo Cát
Bà -Hải Phòng đến Vịnh Hạ Long - Quảng Ninh, ở vùng trung triều và hạ triều đến độ
sâu 30m [4]. Tu hài phân bố chủ yếu ở Vạn Bội, vịnh Lan Hạ, Cát Dứa, Lão Vọng,
Cống Kê, Cáp Quan, Vạn Dong, Soi Gianh, Đầu Bê, Cửa Vạn và Lạch Miều. Hai khu
vực tập trung chủ yếu là từ Đông đảo Cát Bà đến Hòn Đá Mài và từ Đảo Cống Tây
đến Cây Khế Đông. Riêng khu vực Cát Bà diện tích phân bố tự nhiên khoảng 100 ha,
trữ lượng 60- 100 tấn/năm [4, 5]. Tu hài phân bố ở những vùng biển tương đối xa bờ,
nước có độ mặn cao từ 25 - 30‰, trong sạch. Những nơi không có tu hài phân bố gồm:
Bãi cát sâu trên 10m hoặc các vùng bãi bùn cửa sông châu thổ và những nơi có độ mặn
thấp hơn 25‰ trong mùa mưa. Không thấy có tu hài ở vùng Trung bộ, Nam bộ. Có thể
đây là loài thích hợp với nhiệt độ thấp vì vậy không thấy có ở những vùng biển quanh
năm nóng ẩm. Khoảng 10 năm trở lại đây tu hài được di giống vào tỉnh Khánh Hòa và
Phú Yên do điều kiện môi trường phù hợp với sản xuất giống sớm phục vụ chủ yếu
cho các tỉnh phía Bắc.
1.1.2. Vị trí phân loại tu hài
Vị trí phân loại:
Ngành động vật thân mềm: Mollusca
Lớp 2 mảnh vỏ: Bivalvia
Bộ biện mang: Eulamellibranchia
Họ vọp: Mactridae
Giống: Lutraria
Loài: Lutraria rhynchaena Jonas, 1844
3



Tên tiếng Việt: Tu hài
Tên tiếng Anh: Geo-Duck, Snout Otter Clam, Otter Clam

Hình 1.1. Hình thái cấu tạo của tu hài (Lutraria rhynchaena) (Ảnh: Thuấn)
1.1.3. Đặc điểm sinh trưởng
Trong quá trình phát triển của tu hài cũng như các loài nhuyễn thể hai mảnh vỏ
khác, hầu hết phải trải qua hai giai đoạn, giai đoạn ấu trùng và giai đoạn trưởng thành.
Tập tính sống của chúng cũng thay đổi theo mỗi giai đoạn:
+ Giai đoạn ấu trùng (từ Morula- Umbo): ấu trùng bơi lội tự do, giai đoạn này
là giai đoạn sống phù du, cuối giai đoạn ấu trùng umbo (đỉnh vỏ) và bắt đầu giai đoạn
Spat (ấu trùng chân bò) chúng chuyển xuống sống đáy, chân chúng bắt đầu phát triển
để đào bới làm nơi định cư.
+ Giai đoạn trưởng thành: dùng chân đào bới vùi mình sâu trong nền đáy, thò
ống xi phông (xúc tu) lên trên. Thông thường ống xi phông vươn dài 5 - 7 cm và liên
tục hút nước để lọc thức ăn, khi gặp điều kiện bất lợi hoặc bị va chạm bởi vật lạ chúng
thu ống xi phong lại rất nhanh. Nếu sống trong điều kiện thuận lợi chỉ 7- 10 tháng tuổi
tu hài bắt đầu thành thục và sinh sản.
 Tu hài giống cỡ 1,5 cm; khối lượng trung bình 2,16g
 Sau 3 tháng nuôi đạt kích thước 2,42 cm; khối lượng trung bình 4,20g
 Sau 6 tháng nuôi đạt kích thước 3,82cm; khối lượng trung bình 26,60g
 Sau 12 tháng nuôi đạt kích thước 5,58 cm; khối lượng trung bình 34,00g
 Sau 18 tháng nuôi đạt kích thước 7,13 cm; khối lượng trung bình 60,00g [5].
4


1.1.4. Đặc điểm sinh sản và phát triển
Tu hài là loài động vật thân mềm (ĐVTM) hai mảnh vỏ, phân biệt đực, cái
riêng biệt, chúng đẻ trứng, phóng tinh vào môi trường nước, trứng được thụ tinh tạo
thành hợp tử, phát triển thành phôi và nở thành ấu trùng. Trải qua vài lần biến thái ấu

trùng phát triển thành con non.
Tu hài có thể thành thục ở trên một tuổi (1+). Mùa vụ sinh sản của tu hài chịu
ảnh hưởng rất lớn bởi các điều kiện môi trường đặc biệt là nhiệt độ và độ mặn. Các
điều kiện môi trường không chỉ có vai trò trong việc kích thích thành thục sinh dục,
sinh sản, đẻ trứng mà còn đảm bảo cho sự tồn tại và phát triển của trứng, phôi và ấu
trùng. Hầu hết các tháng trong năm đều có tu hài thành thục nhưng tỷ lệ thành thục cao
nhất tập trung vào thời gian từ tháng 12 năm trước đến tháng 2 năm sau. Mùa vụ sinh
sản vào tháng 2-4 [19].
Tu hài có hiện tượng tự điều chỉnh tỉ lệ đực, cái. Vào thời kì sinh sản rộ, tỷ lệ
đực: cái thường là 1:1. Tuyến sinh dục đực có màu trắng sữa, tuyến sinh dục cái có
màu phớt hồng. Trứng chín có hình cầu đường kính 60-65μm, tinh trùng hình búp sen,
đuôi dài. Trứng và tinh trùng được phóng vào môi trường nước và thụ tinh trong
nước. Tinh trùng vận động mạnh trong nước biển tới 3-4h (ở độ mặn 30‰); nhiệt độ
22-24oC; độ pH = 8, sau đó yếu dần và chết sau 12h.
Sức sinh sản của từng cá thể phụ thuộc cỡ cá thể, trung bình mỗi cá thể mang 3
triệu trứng . Cỡ cá thể có khối lượng 35,7g có sức sinh sản 1,28 x 106 trứng, cỡ 75,7g
có sức sinh sản 3,14 x 106 trứng; cỡ 130g có sức sinh sản 5,72 x 106 trứng [5].

Hình 1.2. Tu hài giống được sản xuất tại Yên Hưng- Quảng Ninh năm 2012

5


1.2. Giá trị kinh tế và tình hình nuôi tu hài ở Việt Nam
1.2.1. Giá trị kinh tế và thị trường
Tu hài là loại động vật có giá trị kinh tế cao hơn các loài động vật hai mảnh vỏ
khác và hơn nhiều loài cá phân bố ở Việt Nam. Thịt tu hài có hương vị thơm ngon,
ngọt.
Thịt tu hài khá giàu chất dinh dưỡng, trong thịt có chứa 11,63% đạm, 0,42%
đường, 1,22% muối khoáng và đặc biệt là 18 loại axit amin, trong đó có một số là

những axit amin không thay thế, nên được thị trường ưa chuộng [19].
Tu hài là đối tượng thủy sản có tiềm năng, từ những năm 2013 trở về trước giá
tu hài thương phẩm dao động trong khoảng 150-220 nghìn đồng/kg. Từ sau năm 2013
do tình hình dịch bệnh xảy ra trên tu hài, làm nghề nuôi tu hài giảm cả về quy mô lẫn
sản lượng [10, 11]. Do vậy giá tu hài thương phẩm tăng cao. Năm 2015 giá bán tu hài
thương phẩm dao động trong khoảng 450-550 nghìn đồng/kg. Nhu cầu sản phẩm tu hài
rất lớn như tiêu thụ trong nước ở các thành phố lớn như Hà Nội, TP Hồ Chí Minh, …
Ngoài ra, tu hài còn được xuất khẩu tới Đài Loan, Nhật, Trung Quốc, Hồng Kông [26].
1.2.2. Tình hình nuôi tu hài tại Việt Nam
Nguồn lợi tu hài vùng biển Hải Phòng phong phú hơn vùng biển Quảng Ninh.
Tu hài phân bố đến độ sâu 10m. Nơi có mật độ tập trung cao là vùng biển đông Cát
Bà, Bắc và Đông Bắc Cống Tây - Quảng Ninh. Trong vòng 27 năm, mật độ sản lượng
giảm từ 1,07 tấn/ha (1979) xuống chỉ còn 0,01 tấn/ha (2005). Tính cho toàn bộ vùng
biển Hải Phòng- Quảng Ninh những vùng có tu hài phân bố với diện tích là 64.260,6
ha thì trữ lượng ước tính khoảng 511,9 tấn và khả năng khai thác trên dưới 100 tấn
(20%) [11].
Tu hài được di giống vào miền trung và thả nuôi ở một số tiểu vùng Khánh Hòa
như: Cam Nghĩa, Cam Phúc Bắc (Tp.Cam Ranh); Vạn Thạnh (huyện Vạn Ninh) [10].
Diện tích và sản lượng nuôi tu hài thương phẩm tại Khánh Hòa từ 2010 – 2014
thể hiện ở Bảng 1.1 [10].
Bảng 1.1. Diện tích và sản lượng nuôi tu hài thương phẩm tại tỉnh Khánh Hòa
Năm 2010

Năm 2011

Năm 2012

Diện tích (ha)

92,5


75

41

Sản lượng (tấn)

310

250

111

6


Những năm gần đây phong trào nuôi hu hài phát triển mạnh, các địa phương có
sản lượng lớn là Quảng Ninh, Hải Phòng, Khánh Hòa. Theo báo cáo của Chi cục nuôi
trồng thủy sản Quảng Ninh, sản lượng tu hài năm 2011 đạt khoảng 1.200 tấn giá trị
trên 110 tỷ đồng. Tuy nhiên chất lượng con giống ngày càng giảm sút, tình hình dịch
bệnh gia tăng, chỉ tính 6 tháng đầu năm 2012, Quảng Ninh và Hải Phòng thiệt hại hơn
200 tỷ đồng do tu hài chết và hiện nay dịch bệnh vẫn xẩy ra (Tổng cục thủy sản,
2014). Đề tài nghiên cứu “Xác định nguyên nhân gây chết hàng loạt ở tu hài nuôi tại
Việt Nam” của Viện nghiên cứu nuôi trồng thủy sản I thực hiện từ tháng 1 năm 2012
đến nay vẫn chưa xác định rõ nguyên nhân gây bệnh trên tu hài. Nên các đơn vị quản
lý nhà nước như Chi cục thủy sản, Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn khuyến
cáo người dân tạm dừng thả nuôi tu hài để nhằm hạn chế dịch bênh và rủ ro [11].
Trong vài năm gần đây, nuôi tu hài phát triển mạnh mẽ ở các tỉnh ven biển như
Quảng Ninh, Hải Phòng, Phú Yên và Khánh Hoà. Nghề nuôi này đem lại nguồn lợi
nhuận lớn cho nguời dân địa phương vì giá thị trường tu hài rất cao, chi phí đầu tư

nuôi không lớn và kỹ thuật nuôi đã được phổ biến. Nuôi tu hài phát triển còn có ý
nghĩa về mặt môi trường rất lớn vì tu hài ăn lọc thực vật phù du nên giúp môi trường
nuôi ngày càng sạch hơn. Tuy nhiên, sự thiếu hụt về con giống là rất lớn.
Từ năm 2012 đến nay, do môi trường nuôi ngày càng ô nhiễm, thời tiết diễn
biến thất thường nên tu hài mới thả nuôi được vài tháng đã chết hàng loạt, gây thiệt hại
nặng cho người nuôi. Dấu hiệu bệnh chủ yếu vẫn là sưng vòi, teo cơ,… Năm 2013, các
hộ đã bỏ nghề nuôi tu hài, một số ít hộ duy trì nuôi với quy mô nhỏ, nuôi xen với các
đối tượng nuôi khác [10].
Tốc độ phát triển nuôi tu hài ở Quảng Ninh tăng quá nhanh nên nhu cầu con
giống hết sức khó khăn. Nếu từ đầu năm 2003 mới chỉ có 10 hộ nuôi thì đến năm 2013
đã có trên 20 doanh nghiệp và gần 700 hộ nuôi trồng tu hài với diện tích trên 1.000ha.
Điều này đồng nghĩa với việc phải đáp ứng khoảng 100 triệu con giống mỗi năm.
Trong khi đó sản xuất con giống tại địa bàn tỉnh chỉ đáp ứng được 5 - 10% lượng con
giống. Số còn lại phải nhập từ các tỉnh miền Trung và miền Nam, nhưng cũng chỉ đủ
khoảng 70%, nên phải nhập con giống tu hài từ Trung Quốc qua đường tiểu ngạch
[11].

7


Một số cơ sở sản xuất giống tu hài trên địa bàn sử dụng bố mẹ là tu hài thương
phẩm tại vùng, chưa đủ tiêu chuẩn (tuổi, khối lượng, thời gian…) dẫn đến chất lượng
con giống không đảm bảo,khó thích nghi với môi trường biến đổi và bệnh [11].
Chất lượng con giống mua từ các tỉnh miền Trung, miền Nam và chính nguồn
giống được nhập về từ Trung Quốc không kiểm tra chất lượng, kiểm dịch được khiến
dịch bệnh phát triển phức tạp [11].
Môi trường nuôi ngày càng ô nhiễm do phát triển quá nhanh nuôi nghề nuôi tu
hài, sự xả thải rác sinh hoạt và sản xuất làm cho môi trường vùng nuôi đang bị nghèo
muối dinh dưỡng, động vật phù du tự nhiên, nhiều khí độc và vi sinh vật có hại cho tu
hài.

Người dân chưa ý thức bảo vệ môi trường, nuôi tự phát chưa theo quy hoạch
vùng nuôi và kỹ thuật nuôi của cơ quan chuyên môn.
Theo thống kê của Viện Kinh tế và Quy hoạch thủy sản, nguồn lợi tu hài ở
ngoài tự nhiên ngày càng giảm sút, sản lượng tu hài khai thác tự nhiên dưới 3000 tấn.
Những năm gần đây phong trào nuôi hu hài phát triển mạnh, các địa phương có sản
lượng lớn là Quảng Ninh, Hải Phòng, Khánh Hòa. Theo báo cáo của Chi cục nuôi
trồng thủy sản Quảng Ninh, sản lượng tu hài năm 2011 đạt khoảng 1.200 tấn giá trị
trên 110 tỷ đồng. Tuy nhiên chất lượng con giống ngày càng giảm sút, tình hình dịch
bệnh gia tăng, chỉ tính 6 tháng đầu năm 2012, Quảng Ninh và Hải Phòng thiệt hại hơn
100 tỷ đồng do tu hài chết [11].

Hình 1.3. Nuôi tu hài ở Khánh Hòa (Nguồn: Chi cục thủy sản Khánh Hòa)

8


Hình 1.4. Hệ thống giàn nuôi tu hài ở Vân Đồn- Quảng Ninh (Nguồn: Chi cục thủy
sản Quảng Ninh)
1.3. Một số nghiên cứu về tu hài ở Việt Nam
Ở nước ta đối tượng này còn ít được nghiên cứu. Trong báo cáo kết quả điều tra
động vật vùng triều của Tổng cục thuỷ sản các năm 1966-1967, hai tác giả Trần Hữu
Doanh và Nguyễn Như Tùng đã thống kê 133 loài động vật thân mềm, trong đó có tên
loài tu hài Lutraria rhynchaena Jonas.
Trong các năm 1977-1979, Nguyễn Xuân Dục đã tiến hành nghiên cứu khá chi
tiết về tình hình phân bố, đánh giá trữ lượng cùng các đặc điểm sinh học và sinh thái
loài tu hài ở vùng biển Cát Bà: sinh trưởng sinh sản, và quan hệ với các điều kiện môi
trường sống như nhiệt độ và độ mặn nước biển, sinh vật phù du và chất đáy [4].
Cũng trong năm 1978, trên cơ sở các mẫu vật thu được ở vùng biển Cát Bà, Mai
Văn Minh (Khoa Sinh học, Đại học Tổng hợp Hà Nội) đã tiến hành nghiên cứu thành
phần sinh hoá của thịt tu hài [7].

Sau thời gian dài gián đoạn (trên 10 năm) cho tới năm 2001, đối tượng này lại
được tiếp tục nghiên cứu. Lê Xân và ctv thuộc Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thuỷ sản
I, bước đầu đã nghiên cứu tìm hiểu đặc điểm sinh học, sinh sản và sản xuất giống nhân
tạo tu hài ở vùng biển Cát Bà [22]. Tiếp đó Hà Đức Thắng, Nguyễn Xuân Dục và cộng
sự cũng tiến hành nghiên cứu các đặc điểm sinh học và sản xuất giống nhân tạo, nuôi
đối tượng này ở vùng biển Cát Bà và Quảng Ninh bước đầu có kết quả. Hợp phần Hỗ
trợ Nuôi trồng Thuỷ sản biển và nước lợ (SUMA) của Bộ Thuỷ sản cũng tiến hành
nuôi thử nghiệm tu hài ở vùng biển Quảng Ninh [13].
9


Năm 2004, với sự giúp đỡ của SUMA, Vũ Văn Toàn và Đặng Khánh Hùng đã
xuất bản tài liệu “Kỹ thuật ương giống và nuôi tu hài thương phẩm”. Trong tài liệu đã
giới thiệu đặc điểm sinh học của tu hài, kỹ thuật ương giống và nuôi tu hài thương
phẩm. Phần phụ lục có viết sơ bộ tính hiệu quả kinh tế và những khuyến cáo [18].
Năm 2005 trong tuyển tập Quy trình công nghệ sản xuất giống thuỷ sản – Hà
Đức Thắng đã công bố quy trình công nghệ sản xuất giống tu hài. Trong quy trình tác
giả có nêu một số đặc tính sinh học của tu hài (hình dạng cấu tạo, vị trí phân loại, đặc
tính sinh thái). Sự phát triển của tu hài (quá trình biến thái, kỹ thuật sản xuất giống
nhân tạo) [13].
Tuy nhiên phương thức và kỹ thuật sản xuất giống nhân tạo cũng như nuôi; đặc
biệt là tổ chức thăm dò khảo sát trên biển còn nhiều vấn đề tồn tại, cần được tiếp tục
nghiên cứu.
Mặt khác do nhu cầu thị trường ngày một tăng, kỹ thuật khai thác đang được
hoàn thiện một cách nhanh chóng, cường độ khai thác cao đã làm môi trường và nguồn
lợi ngày càng suy thoái; vấn đề bảo tồn và phát triển bền vững trở nên bức xúc. Các ý
tưởng nghiên cứu về động vật quý hiếm nói chung và nguồn lợi tu hài nói riêng liên
tục được đề xuất và triển khai trong những năm gần đây.
1.4. Đa dạng sinh học, giá trị của đa dạng sinh học, một số phương pháp đánh giá
1.4.1. Đa dạng di truyền

Đa dạng di truyền là tất cả các gen di truyền khác nhau của tất cả các cá thể
thực vật, động vật, nấm, và vi sinh vật. Đa dạng di truyền tồn tại trong một loài và giữa
các loài khác nhau.
Đa dạng di truyền là sự đa dạng về thành phần gen giữa các cá thể trong cùng
một loài và giữa các loài khác nhau; là sự đa dạng về gen có thể di truyền được trong
một quần thể hoặc giữa các quần thể.
Đa dạng di truyền là biểu hiện sự đa dạng của các biến dị có thể di truyền trong
một loài, một quần xã hoặc giữa các loài, các quần xã. Xét cho cùng, đa dạng di truyền
chính là sự biến dị của sự tổ hợp trình tự của bốn cặp bazơ cơ bản, thành phần của axit
nucleic, tạo thành mã di truyền [47].
1.4.2. Một số phương pháp đánh giá đa dạng sinh học
Ở động vật, ngoài hệ gen trong nhân còn có hệ gen tế bào chất nằm trong ty thể
(Mitochondrial DNA-mtDNA) chiếm tỉ lệ từ 1 - 5% ADN của tế bào. Người ta đã đưa
10


ra nhiều giả thuyết về nguồn gốc tiến hóa của hệ gen ty thể. Giả thuyết được chấp nhận
rộng rãi nhất là hệ gen ty thể là dấu vết còn lại của hệ gen vi khuẩn cổ, sống cộng sinh
bên trong tế bào sinh vật nhân chuẩn. Mỗi ty thể có từ 2 đến 10 bản sao của ADN và
bởi vì mỗi tế bào chứa từ hàng trăm đến hàng triệu ty thể nên số lượng ADN ty thể là
rất lớn. ADN ty thể có các ưu điểm hơn ADN trong nhân như sau:
- Tốc độ đột biến lớn gấp 5 - 10 lần so với hệ gen nhân [27].
- Số lượng bản sao lớn.
- Đơn bội, hầu như không có sự tái tổ hợp [31].
- Di truyền theo dòng mẹ ở phần lớn các loài [31].
Phân tử mtADN có tốc độ tiến hóa nhanh hơn 5 - 10 lần so với các gen nhân do
cơ chế sửa chữa tái bản ADN không hiệu quả do đó dẫn đến nhiều biến dị trong ty thể,
không chỉ giữa các loài mà còn cả trong một loài. Bên cạnh đó, các biến dị này không
giống nhau giữa các ty thể trong cùng một tế bào và giữa các tế bào khác nhau.
mtADN có đặc điểm đơn bội, không tái tổ hợp, di truyền theo dòng mẹ, điều đó có

nghĩa là mỗi phân tử cũng như toàn bộ mtADN thường chỉ có một lịch sử phả hệ theo
dòng mẹ. Thêm vào đó mtADN tồn tại với số lượng bản sao lớn trong mỗi tế bào. Các
đặc điểm trên cùng với việc mtADN bền vững hơn ADN nhân trong khi tách chiết do
có cấu trúc dạng vòng [36], nên sử dụng mtADN như là một công cụ phân tử trong
việc phân tích các mối quan hệ tiến hóa và biến đổi di truyền trong loài và giữa các
loài có nhiều thuận lợi [27].
1.4.2.1. Kỹ thuật RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphisms):
Kỹ thuật RFLP là kỹ thuật nghiên cứu tính đa hình chiều dài của các phân đoạn
ADN dựa trên điểm cắt các enzyme giới hạn (Restriction Enzyme, RE). Khi ủ ADN
với enzyme giới hạn ở dung dịch đệm thích hợp ở pH, nhiệt độ thích hợp sẽ sẽ tạo ra
những phân đoạn ADN với kích thước khác nhau, từ đó lập nên các bản đồ gen. Kỹ
thuật này được sử dụng phổ biến từ thập niên 80 đến nay.
Nguyên tắc của kỹ thuật này dựa trên độ đặc hiệu của các enzyme cắt giới hạn
(Restriction Enzyme-RE) đối với vị trí nhận biết của chúng trên ADN bộ gen. Sự khác
biệt vị trí cắt giữa hai cá thể sẽ tạo ra những phân đoạn cắt khác nhau.
Ưu và nhược điểm của RFLP
+ Ưu điểm:
- Giá thành thấp nên có thể làm nhiều mẫu, có khả năng lặp lại cao
11


- Xác định được di truyền đồng trội
- Marker có tính đặc hiệu locus (nên trình tự bảo thủ của các gen của các sinh
vật có quan hệ gần gũi có thể xác định được)
- Không yêu cầu thông tin chuỗi
- Dễ ghi điểm do kích thước các băng thường khác nhau đáng kể
+ Nhược điểm:
- Yêu cầu số lượng và chất lượng ADN cao
- Việc xây dựng bộ dò khá phức tạp
- Không thể tự động hóa được

- Mức độ đa hình thấp, chỉ một số ít locus được nghiên cứu trong một lần thử
- Tốn thời gian
1.4.2.2. Phương pháp giải trình tự axit nucleic (Sequencing)
 Phương pháp hóa học của Maxam-Gilbert
Vào năm 1977, Maxam và Gilbert lần đầu tiên phát minh ra phương pháp giải
trình tự gen bằng phương pháp hóa học. Nguyên tắc của phương pháp là dựa trên phản
ứng hóa học thủy giải đặc hiệu, các ADN không tự xoắn lại với nhau, tạo thành tập
hợp nhiều phân đoạn có kích thước khác nhau [8, 9].
 Phương pháp enzyme sử dụng các dideoxynucleotide
Phương pháp này được F. Sanger và cộng sự phát minh vào năm 1977. Nguyên
tắc của phương pháp dideoxy là dựa vào sự tổng hợp mạch bổ sung cho trình tự cần
xác định nhờ hoạt động của enzyme ADN-polymerase. Với việc sử dụng thêm các
dideoxynucleotide (ddNTP) với các deoxynucleotide (dNTP) thông thường, kết quả
tổng hợp cũng là sự hình thành một tập hợp nhiều đoạn ADN có kích thước khác nhau
[8, 9].
 Phương pháp xác định trình tự nucleotide bằng máy tự động
Trong kĩ thuật này, người ta không đánh dấu bằng các đồng vị phóng xạ mà
bằng hóa chất (các fluochrome). Mỗi loại ddNTP được đánh dấu bằng một fluochrome
có màu khác nhau. Như vậy, tất cả các oligonucleotide cùng chấm dứt tại một loại
ddNTP sẽ có cùng một màu. Sau khi điện di trên gel polyacriamid (mao quản), kết quả
sẽ được xử lí qua một hệ thống vi tính [8, 9].
Ưu, nhược điểm của phương pháp giải trình tự
+ Ưu điểm:
12


- Xác định được cả đoạn gen dài dễ dàng, thuận lợi hơn phương pháp RFLP
- Độ chính xác cao
- So sánh được đoạn ADN bất kỳ với dữ liệu trong ngân hàng gen (số hóa)
- Biết được trình tự sắp xếp của các nucleotide

- Xác định đột biến, sự sai khác trong trình tự sắp xếp các nucleotide
+ Nhược điểm:
- Chi phí cao
1.5. Ứng dụng chỉ thị phân tử trong nghiên cứu một số loài thủy sản ở nước
ngoài và trong nước
Các markers di truyền cung cấp một công cụ hữu hiệu trong theo dõi mức độ
biến thể di truyền trong quần thể tự nhiên và quần đàn nuôi, đặc biệt là trong những
tình huống mà các chương trình sinh sản có cấu trúc cao và kiểm soát không được thực
hiện. Trong số các các chỉ thị phân tử ADN, RAPDs có sức mạnh khác biệt nhất,
AFLPs và microsatellites được đánh giá cao trong việc phát hiện tính đa dạng di
truyền. Chỉ thị phân tử AFLP đã được chứng minh rất hữu ích cho việc phân tích đa
dạng di truyền vì số lượng lớn các locus đó có thể được trình chiếu đồng thời. Bagley
et al. (2001) so với việc sử dụng các RAPDs và AFLPs trong cá hồi vân và kết luận
rằng AFLP là phương pháp được lựa chọn để phân tích đa dạng di truyền. Bagley et al.
(2001) cũng tăng khả năng tái sinh của các chỉ thị AFLP tới gần 100% bằng cách loại
trừ 10% trong những đoạn lớn nhất và nhỏ nhất, cũng như đoạn gồm ít hơn 1% của
tổng cường độ trong phân tích AFLP [25]. Chỉ thị phân tử microsatellite đã được lựa
chọn để nghiên cứu sự đa dạng di truyền quần ở hầu hết các loài trong nuôi trồng thủy
sản (Xu, 2001) [45].
1.5.1. Những nghiên cứu đánh giá đa dạng di truyền của một số loài nhuyễn thể
Nghiên cứu về động vật thân mềm đang đi theo chiều hướng chuyên sâu kể cả
về lý thuyết cơ bản và nghiên cứu ứng dụng. Việc đi sâu nghiên cứu các cơ quan và tổ
chức cấu tạo cơ thể từng nhóm loài bằng các kỹ thuật hiện đại đang được thực hiện
phổ biến ở các nước phát triển. Bằng các đặc trưng cơ bản các nhà khoa học đang
chuẩn hoá việc phân loại bằng việc xây dựng các phần mềm để sử dụng trong phân
loại. Công việc này đòi hỏi rất nhiều kỹ năng, trong đó việc kết hợp giữa kiến thức
phân loại truyền thống và kỹ thuật sử dụng máy tính, lập trình v.v… được xem là
không thể thiếu. Việc sử dụng kỹ thuật phân tử trong nghiên cứu cấu trúc quần thể
13