CHỦ ĐỀ : CHUYỂN GEN PHÁT SÁNG GFP CHO HOA PHONG LAN
Thành viên :
Nguyễn Mạnh Tường
Vũ Tú Anh
Trần Thị Ngọc Kiều
Phạm Thị Ngọc Anh
MỞ ĐẦU
Từ rất xa xưa, người ta đã chú ý đến khả năng phát quang tự nhiên của đom đóm và sứa biển. Sự
phát quang này không bị kích thích do nhiệt độ mà nó diễn ra một cách bình thường nên được gọi
là sự phát quang lạnh.

Ông Shimomura làm việc tại đại học Nagoya – Nhật Bản và sau đó ông đã cùng với ông Frank
Johnson tại đại học Princeton, New Jersey – Hoa Kỳ tỏ ra rất tò mò về chất mà gây nên sự phát
quang đó. Hai ông đã kiên nhẫn và bắt hơn 10,000 con sứa biển để nghiên cứu, chỉ “đổi lấy” vài
milligram nhóm chất mà hai ông đang tìm hiểu. Đến năm 1962, hai ông đã cô lập thành công chất
hóa học tạo huỳnh quang - aequorin - có ở loài sứa jellyish Aequorea victoria sống ở vùng nước
lạnh biển bắc Thái Bình Dương, protein đó được đặt tên là GFP (green fluorescent protein). Các
nghiên cứu sâu hơn vào thời gian sau đó đã giúp hai ông xác định được ba phân tử amino acid gọi
là chromophore có trong GFP là thành tố quan trọng cho sự phát quang tự nhiên này.
Mang tính nghệ thuật, sự phát quang rực rỡ của GFP cũng dần được con người ứng dụng trong kỹ
nghệ làm đồ chơi và những phẩm sáng tạo có màu khác. Tiêu biểu là việc chuyển gen GFP phát
sáng vào loài lan Denbrobium Burana White.


A.Gen GFP là gì?


GFP (green flourescent protein) là 1 protein gồm 238 acid amin với khối lương 26,9 kDa. GFP tự
nhiên tách chiết từ sứa hấp thu ánh sáng xanh dương tối đa ở bước sóng 395nm với 1 đỉnh nhỏ ở
470nm và phát ra ánh sáng xanh lục với đỉnh phát sáng ở 508nm, 1 vai nhỏ hơn ở 540 nm .
B. Phương pháp :

I/Chuyển gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens:
1. Vectơ Ti - Plasmid của Agrobacterium tumefaciens :
A.tumefaciens là loại vi khuẩn gây bệnh khối u ở thực vật sống trong đất, trong lĩnh vực biến nạp
gen nó được sử dụng làm vectơ đặc biệt để chuyển các gen ngoại lai vào thực vật nhằm tạo ra
những thực vật mang gen có các đặc tính mong muốn.

Ti – plasmid có kích thước khoảng 200 – 800 kbp. Trên Ti – plasmid có đoạn T – DNA (tumor
DNA) được giới hạn bằng bờ phải và bờ trái. Trình tự nucleotid của bờ phải và bờ trái tương tự
nhau. T – DNA là 1 đoạn có kích thước 25 kb chứa các gen tổng hợp opine và đoạn này sẽ được
chuyển vào tế bào thực vật gắn vào bộ nhiễm sắc thể của tế bào cây chủ và gây bệnh.
Vùng tiêu hóa opine:
Các tế bào khối u có một đặc tính là tổng hợp “opine”. Vùng tiêu hóa opine chứa gen mã hóa
protein tham gia quá trình tiêu hóa opine, làm nguồn dinh dưỡng cho Agrobacterium.


Vùng vir:
Chứa các gen vir mã hóa cho các protein đóng vai trò cho quá trình nhận biết, tiếp cận và
hình thành khối u của Agrobacterium. Có khoảng 25 gen được nhận biết trong 7 đơn vị phiên mã là
VirA, VirB, VirC, VirD, VirE, VirF, và VirG nằm trong vùng gen vir của Ti – plasmid.
Vùng T – regions:
Vùng DNA được chuyển vào trong tế bào thực vật, có kích thước khoảng 10 – 30 kbp, nó
nhỏ hơn 10% Ti - plasmid. Ti – plasmid có thể chứa 1 hay nhiều vùng T – region.
T - region được xác định bằng bờ phải (right border) và bờ trái (left border). Các border này
dài 25 bp có độ tương đồng cao. Bất cứ DNA nào định vị giữa 2 chuỗi “border” đều được chuyển
vào cây và DNA này gọi là T – DNA (transferred DNA).
ORI: Vùng mã hóa chức năng sao chép và khởi đầu sao chép.

2. Cơ chế xâm nhiễm của Agrobacterium tumefaciens vào tế bào thực vật :
Bản chất tự nhiên của vi khuẩn A.tumefaciens là xâm nhập vào những vị trí tổn thương trên cây và
gây ra khối u tại những vị trí tổn thương đó.Vi khuẩn xâm nhiễm vào chỗ vết thương, kích thích

hình thành các chất độc có bản chất phenolic (Acetosyringon, Hydroxyl acetosyringon). Chất này có
tác dụng làm lành vết thương, vừa là kết hợp chất dẫn dụ vi khuẩn xâm nhập, lại có vai trò như một
chất kích hoạt vùng gen vir thuộc Ti- plasmid . Vir protein tạo ra T-strand từ vùng T-DNA trên Tiplasmid. Sau đó vi khuẩn gắn vào tế bào thực vật ,T-strand và 1 số protêin vir đi vào tế bào thực vật
qua các kênh vận chuyển . Trong tế bào thực vật , T-strand tương tác với protein vir tạo thành phức


hệ (T-complex). Phức hệ này vào nhân tế bào, T-DNA được chèn vào bộ gen thực vật và biểu hiện

gen quan tâm.
3. Quy trình :
Quá trình chuyển gen được thực hiện qua các bước sau :
- Xác định gen liên quan đến tính trạng cần quan tâm (gen phát sáng GFP)
- Phân lập gen (PCR hoặc sàng lọc từ thư viện cDNA hoặc từ thư viện genomic DNA).
- Chọn vectơ chuyển gen (Ti – plasmid của Agrobacterium tumefaciens, gắn thêm promoter CaMV35S).
- Biến nạp vào mô hoặc tế bào thực vật
- Chọn lọc các thể biến nạp trên môi trường chọn lọc.
- Tái sinh cây biến nạp.
- Phân tích để xác nhận cá thể chuyển gen và đánh giá mức độ biểu hiện của chúng bằng các thử
nghiệm in vitro.


4. Ưu, nhược điểm :
➢ Ưu
điểm
:
Số bản sao của gen biến nạp chuyển vào tế bào thực vật thấp . Do vậy, giảm tối thiểu sự không
biểu hiện của gen được chuyển, tăng khả năng chuyển gen bền vững, hiệu quả chuyển gen cao.
Tránh
được
sự

hình
thành
của
các
cây
chuyển
gen
khảm.
Kĩ
thuật
đơn
giản,dễ
thực
hiện.
Không đòi hỏi thiết bị đắt tiền.
➢ Nhược
điểm
:
Hiệu
quả
chuyển
gen
ở
cây
1
lá
mầm
thấp.

II/ Phương pháp chuyển gen bằng súng bắn gen:


1. Cơ chế :


Súng bắn gen bao gồm hai buồng bằng thép không gỉ, kích thước 6“x7“x10“ nối với hai bơm chân
không. DNA ngoại lai được gắn vào các hạt tungsten có đường kính rất nhỏ, khoảng 1μm (các kim
loại năng khác như vàng và bạc cũng được sử dụng nhưng không thường xuyên do giá cả đắt).
Các hạt này được đặt trên một cái đĩa ở mặt bên trong của súng. Sự bùng nổ khí helium ở 1000psi
làm cho cái đĩa bắn về phía trước với tốc độ 1300 food/s, tương đương với tốc độ khi một viên đạn
rời khỏi nòng súng. Một tấm chắn làm dừng đĩa lại và các hạt vàng hay tungsten được phóng về
phía các tế bào đích. Chúng xuyên qua vách tế bào và phóng thích các phân tử DNA.
Súng bắn gen sử dụng kỹ thuật DNA tái tổ hợp để hợp nhất sự biểu hiện các gen đã phân phối.
Các tế bào biến đổi di truyền có thể được sử dụng để tạo thực vật bao gồm cả sự sửa đổi di truyền
mong muốn ở trong tất cả các tế bào của chúng


2. Ưu , nhược điểm :
➢ Ưu
điểm
:
Có thể áp dụng ở hầu hết các loại tế bào, mô . Quá trình chuyển gen nhanh, đơn giản về mặt kĩ
thuật
.
Có
thể
sử
lí
lượng
mẫu
lớn

trong
thờii
gian
ngắn
Vectơ mang gen tái tổ hợp cấu tạo đơn giản, chỉ cần 1 lượng nhỏ plasmid
Biểu hiện tạm thời của gen biến nạp có thể quan sát thấy sau vài ngày biến nạp.
➢ Nhược
điểm
:
Nhiều bản sao của gen biến nạp được chuyển vào tế bào cùng lúc gây khó khăn cho kiểm tra, phân
tích
biểu
hiện
gen


Hiệu
quả
chuyển
gen
thấp.
Đòi hỏi thiết bị đắt tiền.
III/ Kiểm tra mức độ biểu hiện gen:
Kiểm tra sự có mặt của promoter CaMV-35S trong hệ gen của cây lan chuyển gen bằng phương
pháp PCR: sử dụng cặp mồi 35S cho đoạn promoter này. Sự xuất hiện của băng có kích thước
đoạn này khẳng định sự có mặt của gen ngoại lai GFP trong hệ gen của vật chủ.
Đoạn CaMV-35S là promoter điều khiển sự hoạt động của gen GFP. Để xác định sự có mặt của
đoạn promoter này, chúng tôi tiến hành làm phản ứng PCR với cặp mồi 35S1/35S2 để nhận được
trình tự đặc trưng của nó. Nếu mẫu DNA nào có phản ứng dương tính (có băng) thì chứng tỏ
promoter 35S đã được chuyển thành công.

GFP tự nhiên tách chiết từ sứa hấp thu ánh sáng xanh dương tối đa ở bước sóng 395nm với 1 đỉnh
nhỏ ở 470nm và phát ra ánh sáng xanh lục với đỉnh phát sáng ở 508nm, 1 vai nhỏ hơn ở 540 nm.
Sự phát sáng này rất ổn định. GFP hoạt động như một protein thứ cấp, nhận năng lượng từ
aequorin được hoạt hóa. Quá trình phát sáng của gfp là một quá trình tự xúc tác không cần sự có
mặt của bất kì cofactor hay enzyme nào.

1.
2.
3.
4.

Tài liệu tham khảo:
Công nghệ gen – Đái Duy Ban
Phát triển cây trồng chuyển gen ở Việt Nam – Lê Trần Bình
Tạp chí khoa học và công nghệ
Webside: luanvan.net.vn, (Viện sinh học nhiệt đới)