Viện khoa học và công nghệ việt nam
viện công nghệ sinh học

Báo cáo tổng kết đề tài nhánh năm 2005

Nghiên cứu, phân tích ADN của tảo độc, tảo gây
hại ở biển (7 loài)

Thuộc đề tài cấp Nhà nớc, chơng trình KC- 09-19

Điều tra, nghiên cứu tảo độc, tảo gây hại ở một số
vùng nuôi trồng thuỷ sản tập trung ven biển,đề xuất
giải pháp phòng ngừa, giảm thiểu những tác hại do
chúng gây ra
doTS. Chu Văn Thuộc làm chủ nhiệm
Chủ nhiệm đề tài nhánh: TS. Đặng Diễm Hồng

6132-21
02/10/2006

Hà Nội, 2005
1


Phần I: Mở đầu
Cho tới nay, cha có một con số thống kê đầy đủ về thiệt hại do tảo độc gây ra
trên phạm vi toàn cầu. Tuy nhiên, sự nở hoa của tảo độc hại thực sự đang là mối
đe doạ không chỉ bởi những thiệt hại về kinh tế mà còn gây ô nhiễm môi trờng,
huỷ hoại hệ sinh thái thuỷ vực cũng nh ảnh hởng đến sức khoẻ con ngời. Việt
Nam là nớc có bờ biển dài với hệ sinh thái động thực vật biển đa dạng, phong
phú và ngành nuôi trồng thuỷ hải sản phát triển. Mặc dù vậy, vấn đề tảo độc cũng

mới chỉ đợc quan tâm nghiên cứu trong vài ba thập kỷ trở lại đây. Nhằm bảo vệ
sức khoẻ con ngời và nguồn lợi sinh vật biển thì vấn đề giám sát tảo độc hại cần
tiến hành thờng xuyên và rộng khắp. Trong chơng trình giám sát, việc xác định
thành phần loài trong các thuỷ vực đợc đặt ra trớc tiên. Trên thế giới, bên cạnh
phơng pháp phân loại truyền thống dựa trên đặc điểm hình thái thì các kĩ thuật
sinh học phân tử đang đợc sử dụng một cách rộng rãi để xác định thành phần
loài. ở Việt Nam, phân loại bằng hình thái vẫn là chủ yếu. Trên thực tế, chúng ta
có thể bắt gặp những dạng biến thái của loài khi điều kiện sống thay đổi. Điều
này có thể gây khó khăn cho phơng pháp phân dựa trên các đặc điểm hình thái.
Vì vậy, phơng pháp phân loại bằng kĩ thuật sinh học phân tử sẽ góp phần giải
quyết những khó khăn này.
Trong báo cáo tổng kết này, chúng tôi xin trình bày kt qu phân loại phân tử
ADN ca 7 loài tảo độc, hại thuộc ba chi Alexandrium, Prorocentrum và
Pseudonitzschia do Viện Hải Dơng học Hải phòng cung cấp bao gồm:
Alexandrium sp5,Alexandrium sp (C), Alexandrium sp16; Prorocetrum sp1,
Prorocetrum sp 3, Pseudo-nitzschia sp 2, Pseudo-nitzschia sp (G3)- dựa trên việc
đọc và so sánh trình tự một phần đoạn gen 18 S rADN đối với các loài thuộc chi
Alexandrium và chi Prorocentrum, on gen ITS1-5.8 S-ITS2 đối với các loài
thuộc chi Pseudonitzschia. Trên cơ sở kết quả đọc trình tự thu đợc, tên và mối
quan hệ về phát sinh chủng loại giữa loài đợc phân lập ở Hải Phòng với các loài
Alexandrium spp., Pseudo-nitzschia sp., Prorocentrium sp. khác đã đợc công bố
trên ngân hàng gen thế giới cũng đã đợc xác định.

Phần II: Vật liệu và phơng pháp
II. 1. Vật liệu
- 7 mẫu tảo độc hại do phòng thực vật phù du, phân viện Hải Dơng học tại Hải
Phòng phân lập và cung cấp. Độ thuần khiết theo tiêu chuẩn hình thái của tảo
đợc kiểm tra dới kính hiển vi laser quét Axiovert 100M của hãng CarlZeiis.
- Plasmit, tế bào khả biến, enzym giới hạn.... đợc mua từ một số hãng nh
Invitrogen (Mỹ), Pharma ( Thuỵ Điển), Biolabs (Anh)

- Các trình tự gen 18S của các loài thuộc chi Alexandrium và chi Prorocentrum,
ITS1-5,8S-ITS2 của các loài thuộc chi Pseudonitzschia đợc công bố trên ngân
hàng gen Quốc tế (Danh sách và số đăng kí phần phụ lục).
2


- Cp mi Alex F-U18 R, U Pro F- U18 R dùng để nhân đoạn gen mã hoá cho
18S rADN ca các loài thuộc chi Alexandrium, Prorocentrum và cặp mồi PseuFPseuR nhân đoạn ITS1- 5.8 S- ITS2 của các loài thuộc chi Pseudonitzschia đã
đợc thiết kế và đặt mua tại hãng Invitrogen (Mỹ).
II.2. Phơng pháp nghiên cứu
* ADN tổng số đợc tách chiết theo phơng pháp của Y.K. Hong có cải tiến cho
phù hợp với điều kiện Việt Nam (Đặng Diễm Hồng và CS., 2002).
* Các phơng pháp sinh học phân tử đợc tiến hành chủ yếu theo sách cẩm nang
phòng thí nghiệm về tạo dòng phân tử (Sambrook, Russell, 2001).
* Thiết kế mồi:
+ Để thiết kế cặp mồi đặc hiệu nhân đoạn gen mã hoá cho 18S rADN của các loài
thuộc chi Alexandrium và chi Prorocentrum, đoạn ITS1-5,8S-ITS2 của các loài
thuộc chi Pseudonitzschia chúng tôi đã tiến hành tra cứu trình tự nucleotit gen
18S rARN và trình tự đoạn ITS1-5,8S-ITS2 của các loài thuộc ba chi nói trên trên
ngân hàng gen Quốc tế, so sánh các trình tự nhận đợc và sử dụng các phần mềm
chuyên dụng để thiết kế 3 cặp mồi đặc hiệu bao gồm Alex- U18R (nhân các loài
thuộc chi Alexandrium), Upro18 F- U18R (nhân các loài thuộc chi Prorocentrum)
và PseuF- PseuR (nhân các loài thuộc chi Pseudonitzschia).
+ Trình tự các cặp mồi nh sau:
Bảng 1. Trình tự các cặp mồi nhân đoạn gen 18S r ADN và đoạn
ITS1-5,8S-ITS2

Kí hiệu

Trình tự Primer


Alex18F
U18R
U Pro18F
U18R
Pseu F
Pseu R

5- gagagggagcttgagaaatg-3
3- GGCATCACAGACCTGTTATTGC-5
5-TACCACATCTAAGGAAGGCAGCAG -3
3-GGCATCACAGACCTGTTATTGC-5
5- GGATCATTACCACACCGATCCAAG -3
3-CGCAGATTCACATCCTGAGCTAGT-5

Kích thớc
sản phẩm
PCR
1100 bp
1100 bp
825 bp

t Theo tính toán lí thuyết cặp mồi Alex18F- U18R, U Pro18F - U18R sẽ nhân
đợc đoạn gen 18S có kích thớc vào khoảng 1,1Kb và cặp mồi PseuF -Pseu R sẽ
nhân đợc đoạn ITS1-5,8S-ITS2 có kích thớc vào khoảng 825bp.
* Chúng tôi tiến hành phản ứng PCR với thành phần và chu trình nhiệt nh sau:
Thành phần phản ứng:
20 àl hỗn hợp phản ứng chứa 1àl ADN khuôn; 2àl buffer 10X;1,5àl dNTP nồng
độ 2.5Mm mỗi loại; 1àl primer mỗi loại, 0,3 Taq polymerase.
Chu trình nhiệt:


3


+ Chu trình nhiệt nhân 1 phần đoạn 18S của các loài thuộc chi Alexandrium:
940C- 3 phút, (940C- 30 giây, 51 0C- 1phút, 720C- 1phút) lặp lại 35 chu kì,720C- 5
phút, giữ ở 40C.
+ Chu trình nhiệt nhân 1 phần đoạn 18S của các loài thuộc chi Prorocentrum:
940C- 3 phút, (940C- 30 giây, 55 0C- 1phút, 720C- 1phút) lặp lại 40 chu kì,720C- 5
phút, giữ ở 40C.
+ Chu trình nhiệt nhân đoạn ITS1-5,8S-ITS2 của các loài thuộc chi
Pseudonitzschia: 940C- 3 phút, (940C- 30 giây, 55 0C- 1phút, 720C- 1phút) lặp
lại35 chu kì,720C- 5 phút, giữ ở 40C. Sản phẩm PCR đợc kiểm tra bằng điện di
trên gel agarose 1%, sau đó nhuộm với Ethidium bromide và quan sát trên máy
soi tử ngoại.
* Sau khi chạy điện di kiểm tra, sản phẩm PCR đợc gắn vào vector pCRđ2.1
TOPOđ và đợc biến nạp vào vi khuẩn E. Coli chng DH5T1, cuối cùng đợc
nuôi trên môi trờng chọn lọc LB có b sung Ampicilin, X-gal (5-Bromo-4chloro-3-indolyl -D- galactopyranoside). ADN plasmit đợc tách chiết và kiểm
tra sự có mặt của một phần đoạn gen 18S (đối với các mẫu thuộc chi
Alexandrium, Prorocentrum) và đoạn ITS1- 5,8S- ITS2 (đối với các mẫu thuộc chi
Pseudonitzschia).
* Trình tự nucleotit ở mẫu nghiên cứu đợc thực hiện trên máy đọc trình tự tự
động ABI PRISM 377 DNA Sequencer, sử dụng ABI PRISM Big Dye Terminator
Cycle Sequencing Ready Reaction Kit của hãng Perkin-Elmer. Dựa trên chơng
trình Clustal X Multiple Sequence Alignment Program (version 1.81, June 2000)
và DNASTAR chúng tôi xây dựng cây phát sinh chủng loại của 7 loài đợc
nghiên cứu với trình tự của các loài thuộc 3 chi Alexandrium, Prorocentrum,
Pseudonitzschia đã đợc công bố trên ngân hàng gen Quốc tế.

Phần III. Kết quả và thảo luận

III.1. Tách chiết ADN tổng số
Kết quả tách chiết ADN tổng số đợc trình bày trên hình 1.
M

1

2

3

4

4

5

6

7


Hình 1. ADN tổng số của 7 mẫu tảo độc, hại
GiếngM: Marker 1Kb Plus DNA Ladder
Giếng 1, 2, 3: ADN tổng số của Alexandrium sp 16, A. sp (C), A.sp5
Giếng 4, 5 : ADN tổng số của Prorocentrum sp 3, P.sp 1
Giếng 6, 7: ADN tổng số của Pseudonitzschia sp (G3), P. sp2

+ Nồng độ và độ tinh sạch của ADN đợc kiểm tra trên máy UV- 1601 của hãng
Shimadzu. Từ kết quả điện di trên gel agarose 1% và trên máy UV-1601 cho
thấyADN tổng số tách chiết có nồng độ và độ tinh sạch cao cho phép tiến hành

các nghiên cứu tiếp theo.
III.2. Nhân đoạn gen mã hoá cho 18S rARN và đoạn ITS1-5,8S-ITS2 bằng kĩ
thuật PCR
Chúng tôi tiến hành phản ứng PCR với thành phần phản ứng và chu trình nhiệt
nh đã đề cập ở trên. Kết quả đợc trình bày ở hình 2
1 2 3
M
4
5
6 7

.

1,1 kb

825 bp

Hình 2. Sản phẩm PCR của 7 mẫu tảo độc, hại
Giếng 1, 2, 3: Sản phẩm PCR với cặp mồi AlexF- U18R của Alexandrium sp (C), A. sp 5,
A. sp 16
Giếng M: Marker 1Kb Plus DNA Ladder
Giếng 4, 5: Sản phẩm PCR với cặp mồi UPro18F- U18R của Prorocentrum sp 1 và P. sp 3
Giếng 6, 7: Sản phẩm PCR với cặp mồi PseuF- PseuR của Pseudonitzschia sp2, P. sp (G3).

Kết quả hình 2 cho thấy các sản phẩm PCR có kích thớc đúng nh tính toán lý
thuyết tuy nhiên sản phẩm PCR với cặp mồi AlexF- U18R của 3 mẫu
Alexandrium và sản phẩm PCR với cặp mồi UPro18F- U18R của hai mẫu
Prorocentrum xuất hiện những smear dài. Nếu dùng sản phẩm PCR của 5 mẫu
này gắn vào vecto tách dòng và biến nạp vào tế bào EColi sẽ gây khó khăn cho
việc chọn lọc các dòng tế bào mang vecto tái tổ hợp. Vì vậy với 3 mẫu

Alexandrium và 2 mẫu Prorocentrum, sau khi chạy PCR chúng tôi tiến hành thôi
gel, sử dụng cột Sigma GenElute TM Agarose Spin column (USA), nhằm thu đợc
sản phẩm PCR đặc hiệu. Kết quả của quá trình thôi gel đợc chỉ ra ở hình 3
5


1

2

M

3

4

5

6

7

1,1 Kb

825 bp

Hình 3. Kết quả kiểm tra sản phẩm PCR sau quá trình thôi gel
Giếng 1, 2: Sản phẩm PCR với cặp mồi PseuF-PseuR của Pseudonitzschia sp 2, P. sp
(G3).
GiếngM: Maker 1Kb Plus DNA Ladder

Giếng 3, 4, 5: Sản phẩm PCR sau khi thôi gel của Alexandrium sp (C), A. sp 5, A. sp 16
Giếng 6, 7: Sản phẩm PCR sau khi thôi gel của Prorocentrum sp 1 và P. sp 3

III.3.Tách dòng đoạn gen 18S rADN, ITS1-5,8S-ITS2
Với sản phẩm PCR rất đặc hiệu ở trên, chúng tôi tiến hành tách dòng theo
TOFO Kit (Invitrogen). Các dòng tế bào mang vectơ tái tổ hợp có chứa đoạn gen
mong muốn đợc kiểm tra bằng PCR-Checking và cắt bằng enzym giới hạn
EcoRI. Các kết quả đợc chỉ ra trên hình 4 và hình 5
1

2

3

4 M

5

1,1Kb

6

7

8

825 bp

Hình4. Kết quả PCR checking các dòng tế bào mang vecto tái tổ hợp (TTH)
Giếng1 : Đối chứng khuẩn lạc xanh- dòng tế bào không mang vecto tái tổ hợp

Giếng 2, 3, 4: Dòng tế bào của Alexandrium sp(C), A. sp 16, A.sp 5 mang vecto TTH
Giếng M: 1Kb Plus DNA Ladder
Giếng 5, 6: Dòng tế bào của Prorocentrum sp 1, P.sp 3 mang vecto TTH
Giếng 7, 8: Dòng tế bào của Pseudonitzschia sp2, P. sp (G3) mang vecto TTH

6


1

2

3

4 M

5

6

7 8

1,1kb

825 bp

Hình 5. Sản phẩm cắt bởi enzym giới hạn EcoRI
Giếng 1, 2, 3 : Sản phẩm cắt ADN plasmit tái tổ hợp của mẫu Alexandrium sp (C), A.sp (5),
A.sp(16)
Giếng 4: Đối chứng - AND plasmit tách từ khuẩn lạc xanh

Giếng M: Maker 1Kb Plus DNA Ladder
Giếng 5, 6: Sản phẩm cắt ADN plasmit tái tổ hợp của mẫu Prorocentrum sp(1), P. sp (2)

Các dòng tế bào mang vectơ tái tổ hợp này đợc chúng tôi tiến hành tách chiết
ADN-plasmit, sau đó tinh sạch bằng cột QIAprep(R)Miniprep (QIAGEN). Kết quả
trình bày trên hình 6
DC

1

2

3

4

5

Hình 6. Kết quả tách chiết ADN plasmit
Giếng DC : ADN plasmit tách chiết từ khuẩn lạc xanh
Giếng 1, 2,3, 4, 5 : ADN plasmit tái tổ hợp

III.4. Xử lí kết quả đọc trình tự
7


Sau khi xác định trình tự đoạn gen 18S rADN của 3 mẫu thuộc chi
Alexandrium: Alexandrium sp (C), A.sp 5, A.sp 16 ; 2 mẫu thuộc chi
Prorocentrum: Prorocentrum sp 1, P. sp 3 và đoạn trình tự ITS1-5,8S- ITS2 của 2
mẫu thuộc chi Pseudonitzschia, chúng tôi tiến hành so sánh các trình tự thu đợc

của 7 mẫu nghiên cứu nói trên với 31 trình tự của các loài thuộc 3 chi
Alexandrium, Prorocentrum, Pseudonitzschia đợc công bố trên ngân hàng gen
Quốc tế với sự hỗ trợ của phần mềm DNAStar và ClustalX.
1, Xây dựng cây phát sinh chủng loại của chi Alexandrium và định tên cho
Alexandrium sp (C), A.sp 5, A.sp 16 .
Sử dụng phơng pháp ClustalW trong bộ phần mềm DNAStar để so sánh trình
tự của 3 mẫu nghiên cứu với 12 trình tự của các loài Alexandrium đợc công bố
trên ngân hàng gen Quốc tế chúng tôi thu đợc tỷ lệ phần trăm tơng đồng của
từng cặp trình tự các loài trong chi Alexandrium (ma trận tam giác trên) và
khoảng cách di truyền (ma trận tam giác dới). Kết quả chỉ ra ở bảng 2
Bảng 2. Tỉ lệ % tơng đồng và khoảng cách di truyền giữa các loài trong chi
Alexandrium

Bảng 2 cho thấy độ tơng đồng giữa các loài tảo thuộc chi Alexandrium từ
92,5% (giữa loài Alexandrium leei và A.cohorticula) đến 99,9% (giữa các loài
Alexandrium minutum và A. ostenfeldii, A.affine và A.sp 16, A.sp 16 và A.sp (C),
A.cohorticula và A. tamiyavanichii). Qua kết quả trên có thể nhận thấy sự chênh
lệch về độ tơng đồng không lớn giữa các loài trong chi này chứng tỏ gen 18S
rADN có tính bảo thủ cao do vậy việc đọc và so sánh trình tự đoạn gen 18S rất
thích hợp cho việc xác định mối quan hệ phát sinh chủng loại của loài và trên loài.
Dựa trên hệ số tơng đồng và khoảng cách di truyền của các loài thuộc chi
Alexandrium, cây phát sinh chủng loại đợc xây dựng.

8


Hình 6. Cây phát sinh chủng loại của 15 loài Alexandrium spp. dựa trên việc so
sánh trình tự nucleotit đoạn gen 18S rADN.
* Định tên mẫu Alexandrium sp 16 và A. sp (C )
Dựa trên bảng hệ số tơng đồng chúng tôi nhận thấy:

Alexandrium sp 16 có độ tơng đồng cao nhất với A.sp (C) và A. affine
( 99,9%) sau đó đến A.cohorticula (98,9%), A.catenella (98,6%).
Dựa vào cây phát sinh chủng loại ta thấy Alexandrium sp 16 cùng với loài
A.sp (C) làm thành một nhóm và nằm ngay cạnh A. affine.
Alexandrium sp (C) có độ tơng đồng cao nhất với A.sp 16 (99,9%), sau đó
là A. affine ( 99,8%), A.cohorticula (98,8%), A.catenella(98,6%)
Nh vậy, dựa vào hệ số tơng đồng và cây phát sinh chủng loại chúng tôi xếp
hai mẫu Alexandrium sp 16 và A. sp (C ) vào loài A. affine.
* Định tên mẫu Alexandrium sp 5
Dựa vào bảng hệ số tơng đồng chúng tôi thấy rằng Alexandrium sp 5 có độ
tơng đồng cao nhất với A. minutum (99,7%) sau đó là loài A. ostenfeldii (99,6%),
A.sp tamutum (99,2%)
Cây phát sinh chủng loại cho thấy Alexandrium sp 5 có độ dài nhánh tiến
hoá bằng với A. minutum .
Căn cứ vào những kết quả trên chúng tôi xếp Alexandrium sp 5 vào loài A.
minutum .
2, Xây dựng cây phát sinh chủng loại của chi Prorocentrum và định tên cho
Prorocentrum sp 1, P.sp 3.

9


Tiến hành xử lí và so sánh trình tự hai mẫu Prorocentrum sp 1, P. sp 3 với trình
tự của 7 loài Prorocentrum đã đợc công bố trên ngân hàng gen chúng tôi thu
đợc bảng hệ số tơng đồng và cây phát sinh chủng loại nh trên hình 7 và bảng
3
Bảng 3. Tỉ lệ % tơng đồng và khoảng cách di truyền giữa các loài trong chi
Prorocentrum

Hình 7. Cây phát sinh chủng loại của 9 loài Prorocentrum spp. dựa trên việc so

sánh trình tự nucleotit đoạn gen 18S rADN
* Định tên mẫu Prorocentrum sp 1, P.sp 3
- Mẫu Prorocentrum sp 1 có hệ số tơng đồng cao nhất với Prorocentrum
mexicanum (100%) sau đó là các mẫu P.sp 3 với hệ số tơng đồng là 99,8%, P.
minimum (99,7%)
- Mẫu Prorocentrum sp3 có hệ số tơng đồng cao nhất Prorocentrum mexicanum
và P.sp 3 (99,8%) sau đó là các mẫu P. minimum (99,7%) , P. micans (99,2%).
- Dựa trên cây phát sinh chủng loại thì Prorocentrum sp1 là loài P.mexicanum,
P.sp 3 nằm cạnh Prorocentrum sp 1 và P. mexicanum
10


Nh vậy Prorocentrum sp 1 là loài P.mexicanum (vì có hệ số tơng đồng là
100%) còn loài P.sp 3 có thể đợc xếp vào P.mexicanum hoặc là P. micans.
3, Xây dựng cây phát sinh chủng loại của chi Pseudonitzschia và định tên
cho Pseudonitzschia sp2, P.sp (G3)
Cũng bằng chơng trình Clustal X trong phần mềm DNAStar chúng tôi tiến
hành so sánh trình tự đoạn ITS1-5,8S- ITS2 của hai mẫu nghiên cứu là
Pseudonitzschia sp2, P.sp (G3) với trình tự đoạn ITS1-5,8S- ITS2 của 12 loài
Pseudonitzschia spp. khác trên ngân hàng gen .Kết quả đợc chỉ ra ở bảng 4 và
hình 8.
Bảng 4. Tỉ lệ % tơng đồng và khoảng cách di truyền giữa các loài trong chi
Pseudonitzschia

Từ bảng hệ số tơng đồng, chúng ta nhận thấy độ tong đồng của các loài
thuộc chi Pseudonitzschia nằm trong khoảng 53,1% - 99,7%. Rõ ràng sự chênh
lệch về hệ số tơng đồng rất lớn và rất khác với kết quả khi chúng ta so sánh dựa
trên đoạn gen 18S rADN . Điều này cho thấyvùng đệm ITS1, ITS2 là những vùng
siêu biến đổi và chính những biến đổi trong vùng này đặc trng cho loài trong
những vùng địa lí khác nhau và việc phân tích và so sánh trình tự đoạn ITS1-5,8SITS2 cho phép chúng ta xác định mối quan hệ dới loài.


11


Hình 8. Cây phát sinh chủng loại của 14 loài Pseudnitzschia spp. dựa trên việc so
sánh trình tự nucleotit đoạn gen ITS1-5,8S-ITS2
* Định tên mẫu Pseudonitzschia sp2
- Bảng hệ số tơng đồng cho thấy Pseudonitzschia sp2 có hệ số tong đồng cao
nhất
với P.cf autralis (83,1%) sau đó là P. autralis (82,8%), P.
micropora( 81,3%). Trên cây phát sinh chủng loại Pseudonitzschia sp2 nằm
cạnh P.cf autralis và P. autralis .Nh vậy có thể xếp Pseudonitzschia sp2 vào
loài P.cf autralis
* Định tên mẫu Pseudonitzschia sp (G3)
- Hệ số tơng đồng của Pseudonitzschia sp ( G3) với P. pungens đạt giá trị cao
nhất (98,8%) sau đó là P. multiseries (83,2%), P.cf autralis (79,4%) .
- Trên cây phát sinh chủng loại Pseudonitzschia sp (G3) nằm cạnh P.pungens .Vì
vậy, mẫu Pseudonitzschia sp (G3) có thể là loài P. pungens .
Tóm tắt sơ bộ kết quả định tên của 7 mẫu tảo độc, hại đợc nghiên cứu
đợc chỉ ra trên Bảng 5.
Bảng 5: Kết quả định tên 7 mẫu tảo độc hại, hại
Stt Kí hiệu mẫu
1
2
3
4
5

Alexandrium sp 16
Alexandrium sp (C )

Alexandrium sp 5
Prorocentrum sp 1
Prorocentrum sp 3

Đoạn gen
nghiên cứu
18S r ARN
18S r ARN
18S r ARN
18S r ARN
18S r ARN

6

Pseudonitzschia sp2

ITS1-5,8S- ITS2

7

Pseudonitzschia sp (G3)

ITS1-5,8S- ITS2
12

Kết quả định tên
Alexandrium affine
Alexandrium affine
Alexandrium minutum
Prorocentrum mexicanum

Prorocentrum mexicanum
hoặc là P.micans
Pseudonitzschia
cf
australis
Pseudonitzschia pungens


IV. Kết luận
Từ các kết quả nghiên cứu đã đạt đợc, chúng tôi rút ra một số kết luận sau:
1. Đã tách chiết và tinh sạch đợc ADN tổng số của 7 mẫu vi tảo độc, hại là:
Prorocentrum sp1, Prorocentrum sp3, Alexandrium sp5 , Alexandrium sp16
Alexandrium sp (C), Pseudoniszschia sp2, Pseudonitzschia sp (G3) đợc phân
lập ở Đồ Sơn và Cát Bà, Hải Phòng.
2. Đã thiết kế thành công cặp mồi cặp mồi Alex18F/U18R, UPro18F/U18R để
nhân đoạn gen 18 S rADN của các mẫu thuộc chi Alexandrium ,Prorocentrium và
cặp mồi PseuF/ PseuR để nhân đoạn ITS1- 5.8S- ITS2 của các mẫu tảo thuộc chi
Pseudonitzschia. Sử dụng các cặp mồi nêu trên, đoạn gen 18S rADN và đoạn
ITS1- 5.8S- ITS2 có kích thớc khoảng 1.1kb và 825 bp của 7 mẫu trên đã đợc
nhân bằng kỹ thuật PCR.
3. Đã tạo dòng phân tử các sản phẩm PCR của các mẫu trên bằng việc sử dụng hệ
vector tách dòng pCR2.1đ-TOPOđ, tách chiết các plasmit tái tổ hợp có gắn đoạn
gen đã nhân đợc đảm bảo chất lợng cho việc xác định trình tự nucleotit.
4. Trình tự nucleotid của đoạn gen 18S rADN và đoạn ITS1- 5.8S- ITS2 của 7
mẫu vi tảo độc, hại trên đã đợc xác định.
5. Mối quan hệ phát sinh chủng loại của các mẫu vi tảo nêu trên với một số loài vi
tảo khác thuộc chi Alexandrium, Prorocentrum, Pseudonitzschia có quan hệ gần
với chúng về mặt tiến hoá đã đợc phân tích.
6. 7 mẫu vi tảo độc, hại đã đợc định tên dựa trên việc đọc và so sánh trình tự
nucleotid của đoạn gen 18S rADN và đoạn ITS1-5,8S-ITS2 với sự hỗ trợ của các

phần mềm máy tính chuyên dụng. Mẫu Alexandrium sp5 là loài A. minutum , A.
sp16 và A.sp (C) là loài A. affine. Mẫu Prorocentrum sp1 đợc định tên là loài
Prorocentrum mexicanum; P. sp3 có thể là loài Prorocentrum mexicanum hoặc
không loại trừ có thể là P.micans; mẫu Pseudonitzschia sp2 có thể là loài
Pseudonitzschia cf australis và

Pseudonitzschia sp (G3) có thể là loài

Pseudonitzschia pungens.

13


7. Đã tiến hành đăng ký trình tự đoạn gen 18S rADN và đoạn đoạn ITS1-5,8SITS2 của 7 mẫu vi tảo trên Genbank với các số đăng ký là: mẫu Prorocentrium
sp1. vì có trình tự nucleotit giống 100% với loài P. mexicanum (số đăng ký là
Y16232) nên chúng tôi chỉ tiến hành đăng ký đợc trình tự gen ITS1-5,8S-ITS2
của mẫu này trên ngân hàng gen Quốc tế với số đăng ký là AY886763; mẫu
Prorocentrum sp3. có số đăng ký là DQ174089; mẫu Alexandrium sp5. có số
đăng ký là DQ168664; mẫu Alexandrium sp16. có số đăng ký là DQ171879; mẫu
Alexandrium sp (C) có số đăng ký là DQ166532; mẫu Pseudonitzschia sp (G3)
có số đăng ký là DQ166533, Pseudonitzschia sp2 có số đăng kí là DQ192110.
Nh vậy, chúng tôi đã hoàn thành đầy đủ công việc năm 2005 do chủ nhiệm đề
tài KC-09 giao cho.
V/ Kết quả thu đợc của đề tài nhánh đã đợc công bố trong
Hội nghị và tạp chí nh sau:

1.Ngô Hoài Thu, Hoàng Minh Hiền, Hoàng Lan Anh, Luyện Quốc Hải, Trần Vân
Khánh, Chu Văn Thuộc, Nguyễn Minh Huyền, Đặng Diễm Hồng. Tách dòng và
đọc trình tự gen mac hoá cho 18S và ITS1-5,8S-ITS2 của hai loài Alexandrium sp.
và Pseudonitschia sp. Báo cáo tại Hội thảo quốc gia về tảo độc và các vấn đề

liên quan, Viện hải Dơng Học, Nha Trang, 7-8/1/2005.
2.Hoàng Minh Hiền, Ngô Hoài Thu, Hoàng Lan Anh, Luyện Quốc Hải, Chu Văn
Thuộc, Nguyễn Minh Huyền, Đặng Diễm Hồng. Phân tích di truyền loài
Prorocentrium sp. dựa trên trình tự nucleotit của đoạn gen mã hoá cho 18S rARN
và ITS1-5,8S-ITS2. Báo cáo tại Hội thảo quốc gia về tảo độc và các vấn đề liên
quan, Viện hải Dơng Học, Nha Trang, 7-8/1/2005.
3. Hoàng Thị Lan Anh, Chu Văn Thuộc, Đặng Diễm Hồng (2005). "Xây dựng cây
phát sinh chủng loại của Pseudonizschia sp(G3) đợc phân lập tại Hải Phòng dựa
trên phân tích trình tự nucleotid của đoạn gen ITS1-5,8S-ITS2", Tạp chí Sinh học,
(đang gửi).
4. Đặng Diễm Hồng, Hoàng Minh Hiền, Ngô Thị Hoài Thu, Hoàng Thị Lan Anh,
Chu Văn Thuộc (2005), Định loại tên loài Prorocentrium sp. phân lập tại Hải

14


Phòng dựa trên trình tự nucleotid của đoạn gen 18S rADN và ITS1-5,8S-ITS2,
Tạp chí Sinh học, (đang in).
5.Ngô Thị Hoài Thu, Luyện Quốc Hải, Đặng Diễm Hồng, Chu Văn Thuộc (2005),
Định loại Alexandrium sp(C). phân lập ở Đồ Sơn, Hải Phòng dựa trên trình tự
nucleotit của đoạn gen 18S rADN, Hội nghị khoa học toàn quốc 2005, Những
vấn đề nghiên cứu cơ bản trong khoa học sự sống, (đang in).
VI/ Đào tạo:

- Một luận văn thạc sỹ bảo vệ 8/2005
VII/ Tài liệu tham khảo

1. Altamirano R. C. and Beltran A. P. S. 2003. Morphology and taxonomy of
Prorocentrum mexicanum and reinstatement of Prorocentrum rhathymum
(dinophyceae). J. Phycol. 39: 221-225.

2. Asai R., Nakashi K., Nakamura C., Kebukuro K., Miyake J. and Karube I.,
2003. A polymerase chain reaction-based ribosomal DNA detection technique
using a surface plasmon resonance detector for a red tide causing microalga,
Alexandrium affine. Phycological Research 51: 118-125.
3. Nguyễn Đức Bách, Đặng Diễm Hồng, Dơng Đức Tiến, Nguyễn Văn Đồng,
2003. Mối quan hệ di truyền của một số chủng Scenedesmus phân lập từ hồ Hoàn
Kiếm dựa trên trình tự nucleotit của đoạn ITS-1 ribosome. Tạp chí Sinh học. Tập
25(3), trang 1-4.
4. Bates S.S., 2000. Domoic acid producing diatoms: another genus added.
J.Phycol.36: 978- 985.
5. Cagelost G. A., Hamlin A. M., Marin III R. and Scholin C. A., 1997. Detection of
Stable Pre-rRNA in toxic Pseudo-nitzschia Species. Applied and Enviromental
Microbiology. Vol. 63(12): 4859-4865.
6. Destombe C., Cembella A. D., Murphy C. A. and Ragan M. A., 1992. Nucleotide
sequence of the 18S ribosomal RNA genes from the marine dinoflagellate
Alexandrium tamarese (Gonyaulacales, Dinophyta). Phycological. Vol. 31(1): 121124.
7. Faust M. A. 1997.Three new benthic species of Prorocentrum (dinophyceae)
from Belize: P. norrisianum sp. nov., P. tropicalis sp. nov., and P. reticulatum sp.
nov. J. Phycol. 33: 851-858.
8. Fehling J., Green D. H., Davidson K., Bolch C. J. and Bates S.S., 2004. Domoic
acid production by Pseudo-nitzschi seriata (Bacillariophyceae) in Scottish waters.
J.Phycol. ***-*** (2004) (C) Phycological Society of America. P. 1-9.
9. Galluzzi L., Penna A., Bertozzini E., Vila M., Garcos E., and Magnani M., 2003.
15


Development of a Real-Time PCR Assay for Rapid Detection and Quantification of
Alexandrium minutum (a Dinoflagellate). Appied and Enviromental Microbiology.
Vol 70(2): 1199-1206.
10. Đặng Diễm Hồng, Nguyễn Đức Bách, Luyện Quốc Hải, Ngô Thị Hoài Thu,

Dơng Đức Tiến, Nguyễn Văn Đồng, 2003. Phân loại một số loài tảo Việt Nam
(Gracilaria, Hypnea, Cauulerpa, Scenedesmus) bằng kỹ thuật so sánh trình tự
nucleotit của đoạn ITS-1. Những vấn đề nghiên cứu cơ bản trong khoa học sự sống.
Báo cáo khoa học, Hội nghị Khoa học toàn quốc lần thứ 2 nghiên cứu cơ bản trong
Sinh học, Nông nghiệp, Y học, Huế, trang 913-916.
11. ng Dim Hng, Hong Minh Hin, Phm Ngc Sn, Nguyn c Bách,
Nguyn Vn ng. 2004. p dng k thut c v so sánh trình t nucleotit ca
on ITS-1 trong vic phân loi mt s loi to ca Vit Nam. Tuyển tp báo cáo
khoa hc Hi ngh khoa hc Bin ông 2002 Nha Trang: 424-436.
12. ng Dim Hng, Hong Minh Hin, Phm Ngc Sn, Nguyn c Bách,
Nguyn Vn ng. 2002. So sánh trình t nucleotit ca on ITS-1 ca mt s loi
to bin Vit Nam. Tp chí khoa hc v công ngh. S 40: 161-167.
13. ng ình Kim, ng Hong Phc Hin. 1999. Công ngh Sinh hc Vi to.
Nh xut bn Nông nghip, H Ni.
14. J. Lasen and N.L. Nguyen, 2004. Potentially toxic microalgae of Vietnamese
waters. Nghiên cứu các loài vi tảo có khả năng độc hại trong các thuỷ vực ven bờ
Việt Nam. OPERA Botanica 140- 2004.
15. John U., Fensome R. A., Medlen L. K., 2003. The application of a molecular
clock based on molecular sequences and the fossil record to explain biogeographic
distributions within the Alexandrium tamarense Species complex (Dinophyceae).
Mol. Bio. Evol. Vol. 20(7): 1015-1027.
16. Nina Lundholm N., Moestrup ., Hasle G. R., Hoef-Emden K., 2003. A study
of the Pseudo-nitzschia pseudelicatissima/cuspidata complex (Bacillariophyceae):
What is P. pseudodelicatissima ?. Phycol. 39: 797-813.
17. Trn Hu Quang, Trn Kiên Cng, V Vn Dng, Võ Thng Lan, ng
Dim Hng. 1998. Nghiên cu quá trình tách chit nhanh v lm sch axit nucleic
t các loi to bin. K yu ca Vin Công ngh Sinh hc. Trung tâm KHTN &
CNQG: 107-113.
18. Sambrook J., Russell D. W., 2001. Molecullar cloning. A Laboratory manual.
Cold Spring HarborLaboratory Press.

19. Taylor F. J. R. 1993. The species problem and its impact on harmful
phytoplankton studies, with emphasis on dinoflagellate morphology. In: T. J.
Smayda and Y. Shimizu (eds), Toxic Phytoplankton Blooms in the Sea. New York,
Elsevier Science Inc.: 81-86.
20. Taylor F. J. R. 1992. The taxonomy of harmful marine phytoplankton. Gior.
Bot. Ital. No. 26: 209-219.
21. Watanabe M. M, Tanabe Y. and Otsuka S. 2004. Global water stresses and toxic
cyanobacterial blooms. Innovative roles of biological resource centers. Proceedings
16


of the tenth international congress for culture collections. Tsukuba, Japan, 10-15
Octorber 2004: 209-215.
22. Witek B., Plinski M. 2000. The first recorded bloom of Prorocentrum minimum
(Pavillard) Schiller in the coastal zone of the Gulf of Gdansk. Oceanologia. 41 (2):
29-36.
23. Yeung P. K. K., Kong K. F., Wong F. T. W. and Wong J. T. Y. 1996. Sequence
data for two large-subunit rRNA genes from an Asian strain of Alexandrium
catenella. Appied and Enviromental Microbiology. Vol. 62 (11): 4199-4201.
24. />25. />
Xin chân thành cảm ơn !
Hà Nội, ngày 9 tháng 9 năm 2005
Xác nhận của Viện CNSH

Ngời viết báo cáo

TS. Đặng Diễm Hồng

17



Phô lôc
B¶ng 1: C¸c loµi Alexandrium cã tr×nh tù ®o¹n gen 18S rADN ®· c«ng bè trªn
ng©n trªn ng©n hµng gen Quèc tÕ ®−îc sö dông ®Ó ph©n lo¹i 3 mÉu vi t¶o thuéc
nhãm Alexandrium
Stt
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12

M· sè
GENBANK
AJ535388
AJ535383
X54946
AY641565
U27498
AB088325
AJ535375
AY883005
AJ535379

AJ535390
AJ535392
AF113935

Tªn loµi
Alexandrium minutum
Alexandrium ostenfeldii
Alexandrium tamarense
Alexandrium leei
Alexandrium margaelefii
Alexandrium tamiyavanichii
Alexandrium affine
Alexandrium monilatum
Alexandrium sp. tamutum
Alexandrium taylori
Alexandrium cantenella
Alexandrium cohorticula

Gen m· ho¸
18S rRNA
18S rRNA
18S rRNA
18S rRNA
18S rRNA
18S rRNA
18S rRNA
18S rRNA
18S rRNA
18S rRNA
18S rRNA

18S rRNA

B¶ng 2: C¸c loµi Prorocentrum cã tr×nh tù ®o¹n gen 18S rADN ®· c«ng bè trªn
ng©n trªn ng©n hµng gen Quèc tÕ ®−îc sö dông ®Ó ph©n lo¹i 2 mÉu vi t¶o thuéc
nhãm Prorocentrum
Stt
1
2
3
4
5
6
7

Tªn loµi
Prorocentrum lima
Prorocentrum maculosum
Prorocentrum concavum
Prorocentrum micans
Prorocentrum minimum
Prorocentrum mexicanum
Prorocentrum emarginatum

M· sè
GENBANK

Gen m· ho¸

Y16235
Y16236

Y16237
M14649
Y16238
Y16232
Y16239

18S rRNA
18S rRNA
18S rRNA
18S rRNA
18S rRNA
18S rRNA
18S rRNA

B¶ng 3: C¸c loµi Pseudonitzschia cã tr×nh tù ®o¹n gen 18S rADN ®· c«ng bè
trªn ng©n trªn ng©n hµng gen Quèc tÕ ®−îc sö dông ®Ó ph©n lo¹i 2 mÉu vi t¶o
thuéc nhãm Pseudonitzschia

18


Stt

Tªn loµi

1
2
3
4
5

6
7
8
9
10
11
12

Psedonitzschia pungens
Psedonitzschia sp.Hobart5
Psedonitzschia australis
Psedonitzschia calliantha
Psedonitzschia cf.australis
Psedonitzschia cf.subpacifica
Psedonitzschia cuspidata
Psedonitzschia delicatissima
Psedonitzschia fraudulenta
Psedonitzschia galaxiae
Psedonitzschia micropora
Psedonitzschia multiseries

M· sè
GENBANK
AY544769
AY 257851
ay452528
AY 257857
AY 559850
AY257860
AY 257853

AY 257849
AY257840
AY 257850
AY 257847
AY 257844

Gen m· ho¸
ITS1-5,8S-ITS2
ITS1-5,8S-ITS2
ITS1-5,8S-ITS2
ITS1-5,8S-ITS2
ITS1-5,8S-ITS2
ITS1-5,8S-ITS2
ITS1-5,8S-ITS2
ITS1-5,8S-ITS2
ITS1-5,8S-ITS2
ITS1-5,8S-ITS2
ITS1-5,8S-ITS2
ITS1-5,8S-ITS2

I.Tr×nh tù nucleotit cña c¸c mÉu thuéc chi Alexandrium
I.1.Tr×nh tù nucleotit cña mÉu Alexandrium sp (C)
TACCACATCTAAGGAAGGCAGCAGGCGCGCAAATTACCCAATCCTAG
CACAGGGAGGTAGTGACAAGAAATAACAATACAAGGCATCCATGTCT
TGTACTTGGAATGAATGGATATTAAACCTTTCTATAAGTATCAATTGG
AGGGCAAGTCTGGTGCCAGCAGCCGCGGTAATTCCAGCTCCAATAGC
GTATATTAAAGTTGTTGCGGTTAAAAAGCTCGTAGTTGGATTTCTGCT
GAGGGTGGCTGGTCCGCCCTCTGGGTGAGTATTTGGCACAGCCTGGGC
ATTTATCTTGAAAGCACAACTGCACTTGACTGTGTGGTGTGTTATCGA
GAACATTTACTTTGAGGAAATCAGAGTGTTTCAAGCAGGTGTTTAGCC

TTGAATACATTAGCATGGAATAATACTCAAGACCGTGATTCTTTTTTG
TTGGTTTCTAGAATTGAGGTAATGATTAATAGGGATAGTTGGGGGCAT
TCGTATTTGATTGTCAGAGGTGAAATTCTTGGATTTGTTAAAGACGGA
CTACTGCGAAAGCATTTGCCAAGGATGTTTTCATTGATCAAGAACGAA
AGTTAGGGGATCGAAGACGATCAGATACCGTCCTAGTCTTAACCATA
AACCATGCCAACTAGAGATTGAAGGTTGTTACTTGTATGACTTCTTCA
GCACCCTATGAGAAATCAAAGTGTTTGGGTTCCGGGGGGAGTATGGT
CGCAAGGCTGAAACTTAAAGGAATTGACGGAAGGGCACCACCAGGA
GTGGAGCCTGCGGCTTAATTTGACTCAACACGGGGAAACTTACCAGG
TCCAGACATAATGAGGATTGACAGATTGATAGCTTTTTCTTGATTCTA
TGGGTGGTGGTGCATGGCCGTTCTTAGTTGGTGGAGTGATTTGTCTGG
TTAATTCCGTTAACGAACGAGACCTTAACCTGCTAAATAGTTACATGT

19


AATTTCGATTATGTGGGCAACTTCTTAGAGGGACTTTGTGTGTATAAT
GCAAGGAAGTTTGAGGCAATAACAGGTCTGTGATGCC
I.2.Tr×nh tù nucleotit cña mÉu Alexandrium sp 16
TACCACATCTAAGGAAGGCAGCAGGCGCGCAAATTACCCAATCCTAG
CACAGGGAGGTAGTGACAAGAAATAACAATACAAGGCATCCATGTCT
TGTACTTGGAATGAATGGATATTAAACCTTTCTATAAGTATCAATTGG
AGGGCAAGTCTGGTGCCAGCAGCCGCGGTAATTCCAGCTCCAATAGC
GTATATTAAAGTTGTTGCGGTTAAAAAGCTCGTAGTTGGATTTCTGCT
GAGGGTGGCTGGTCCGCCCTCTGGGTGAGTATTTGGCACAGCCTGAGC
ATTTATCTTGAAAGCACAACTGCACTTGACTGTGTGGTGTGTTATCGA
GAACATTTACTTTGAGGAAATCAGAGTGTTTCAAGCAGGTGTTTAGCC
TTGAATACATTAGCATGGAATAATACTCAAGACCGTGATTCTTTTTTG
TTGGTTTCTAGAATTGAGGTAATGATTAATAGGGATAGTTGGGGGCAT
TCGTATTTGATTGTCAGAGGTGAAATTCTTGGATTTGTTAAAGACGGA

CTACTGCGAAAGCATTTGCCAAGGATGTTTTCATTGATCAAGAACGAA
AGTTAGGGGATCGAAGACGATCAGATACCGTCCTAGTCTTAACCATA
AACCATGCCAACTAGAGATTGAAGGTTGTTACTTGTATGACTTCTTCA
GCACCCTATGAGAAATCAAAGTGTTTGGGTTCCGGGGGGAGTATGGT
CGCAAGGCTGAAACTTAAAGGAATTGACGGAAGGGCACCACCAGGA
GTGGAGCCTGCGGCTTAATTTGACTCAACACGGGGAAACTTACCAGG
TCCAGACATAATGAGGATTGACAGATTGATAGCTTTTTCTTGATTCTA
TGGGTGGTGGTGCATGGCCGTTCTTAGTTGGTGGAGTGATTTGTCTGG
TTAATTCCGTTAACGAACGAGACCTTAACCTGCTAAATAGTTACATGT
AATTTCGATTATGTGGGCAACTTCTTAGAGGGACTTTGTGTGTATAAT
GCAAGGAAGTTTGAGGCAATAACAGGTCTGTGATGCC
I.3. Tr×nh tù nucleotit cña mÉu Alexandrium sp5
GAGAGGGAGCTTGAGAAATGGCTACCACATCTAAGGAAGGCAGCAGGC
GCGCAAATTACCCAATCCTGACACAGGGAGGTAGTGACAAGAAATAAC
AATACAAGGCATCCATGTCTTGTACTTGGAATGAATGGATATTAAACCT
TTCTATGAGTATCAATTGGAGGGCAAGTCTGGTGCCAGCAGCCGCGGTA
ATTCCAGCTCCAATAGCGTATATTAAAGTTGTTGCGGTTAAAAAGCTCG
TAGTTGGATTTCTGCTGAGGGTGGCTGGTCCGCCCTCTGGGTGAGTATCT
GGCACAGCCTGAGCATTCTTCTTGAAAGCACAACTGCACTTGACTGTGT
GGTGTGGTATTGAGAACCTTTACTTTGAGGAAATCAGAGTGTTTCAAGC
AGGTGTTTGCCTTGAATACATTAGCATGGAATAATATTATAGGGCCTTG
GTTCTATTTTGTTGGTTTCTAGAACTGAGGTAATGATTAATAGGGATAGT
TGGGGGCATTCGTATTTAATTGTCAGAGGTGAAATTCTTGGATTTGTTAA
AGACGGACTACTGCGAAAGCATTTGCCAAGGATGTTTTCATTGATCAAG
AACGAAAGTTAGGGGATCGAAGACGATCAGATACCGTCCTAGTCTTAA
CCATAAACCATGCCAACTAGAGATTGGAGGTCGTTATCTCTATGACTTC
20


TTCAGCACCTTATGAGAAATCGAAGTCTTTGGGTTCCGGGGGGAGTATG

GTCGCAAGGCTGAAACTTAAAGGAATTGACGGAAGGGCACCACCAGGA
GTGGAGCCTGCGGCTTAATTTGACTCAACACGGGGAAACTTACCAGGTC
CAGACATAATGAGGATTGACAGATTGATAGCTTTTTCTTGATTCTATGG
GTGGTGGTGCATGGCCGTTCTTAGTTGGTGGAGTGATTTGTCTGGTTAAT
TCCGTTAACGAACGAGACCTTAACCTGCTAAATAGTTACACGTAATTCC
GGTTATGTGGGCAACTTCTTAGAGGGACTTTGTGTGTATAACGCAAGGA
AGTTTGAGGCAATAACAGGTCTGTGATGCC
II. Tr×nh tù nucleotit cña c¸c mÉu thuéc chi Prorocentrum
II.1.Tr×nh tù nucleotit cña mÉu Prorocentrum sp1
TACCACATCTAAGGAAGGCAGCAGGCGCGCAAATTACCCAATCCTGA
CACAGGGAGGTAGTGACAAGAAATAACAATACAGGGCATATCTGTCT
TGTAATTGGAATGAGTAGAATTTAAATCCCTTTACGAGTACCAATTGG
AGGGCAAGTCTGGTGCCAGCAGCCGCGGTAATTCCAGCTCCAATAGC
GTATATTAAAGTTGTTGCGGTTAAAAAGCTCGTAGTTGGATTTCTGCC
GAGGACGACCGGTCCGCCCTCTGGGTGAGTATCTGGCTCGGCCTGGG
CATCTTCTTGGAGAACGTAGCTGCACTTGACTGTGTGGTGCGGTATCC
AGGACTTTTACTTTGAGGAAATTAGAGTGTTTCAAGCAGGCTTACGCC
TTGAATACATTAGCATGGAATAATAAGATAGGACCTCGGTTCTATTTT
GTTGGTTTCTAGAGCTGAGGTAATGATTAATAGGGATAGTTGGGGGC
ATTCGTATTTAACTGTCAGAGGTGAAATTCTTGGATTTGTTAAAGACG
GACTACTGCGAAAGCATTTGCCAAGGATGTTTTCATTGATCAAGAACG
AAAGTTAGGGGATCGAAGACGATCAGATACCGTCCTAGTCTTAACCA
TAAACCATGCCGACTAGAGATTGGAGGTCGTTATCTATACGACTCCTT
CAGCACCTTATGAGAAATCAAAGTCTTTGGGTTCCGGGGGGAGTATG
GTCGCAAGGCTGAAACTTAAAGGAATTGACGGAAGGGCACCACCAGG
AGTGGAGCCTGCGGCTTAATTTGACTCAACACGGGGAAACTTACCAG
GTCCAGACATAGTAAGGATTGACAGATTGATAGCTCTTTCTTGATTCT
ATGGGTGGTGGTGCATGGCCGTTCTTAGTTGGTGGAGTGATTTGTCTG
GTTAATTCCGTTAACGAACGAGACCTTAACCTGCTAAATAGTTACACG
TAACTTCGGTTACGTGGGCAACTTCTTAGAGGGACTTTGCGTGTCTAA

CGCAAGGAAGTTTGAGGCAATAACAGGTCTGTGATGCC
II.2.Tr×nh tù nucleotit cña mÉu Prorocentrum sp3
TACCACATCTAAGGAAGGCAGCAGGCGCGCAAATTACCCAATCCTGA
CACAGGGAGGTAGTGACAAGAAATAACAATACAGGGCATATCTGTCT
TGTAATTGGAATGAGTAGAATTTAAATCCCTTTACGAGTACCAATTGG
AGGGCAAGTCTGGTGCCAGCAGCCGCGGTAATTCCAGCTCCAATAGC
GTATATTAAAGTTGTTGCGGTTAAAAAGCTCGTAGTTGGATTTCTGCC
GAGGACGACCGGTCCGCCCTCTGGGTGAGTATCTGGCTCGGCCTGGG
21


CATCTTCTTGGAGAACGTAGCTGCACTTGACTGTGTGGTGCGGTATCC
AGGACTTTTACTTTGAGGAAATTAGAGTGTTTCAAGCAGGCTTACGCC
TTGAATACATTAGCATGGAATAATAAGATAGGACCTCGGTTCTATTTT
GTTGGTTTCTAGAGCTGAGGTAATGATTAATAGGGATAGTTGGGGGC
ATTCGTATTTAACTGTCAGAGGTGAAATTCTTGGATTTGTTAAAGACG
GACTACTGCGAAAGCATTTGCCAAGGATGTTTTCATTGATCAAGAACG
AAAGTTAGGGGATCGAAGACGATCAGATACCGTCCTAGTCTTAACCA
TAAACCATGCCGACTAGAGATTGGAGGTCGTTATCTATACGACTCCTT
CAGCACCTTATGAGAAATCAAAGTCTTTGGGTTCCGGGGGGAGTATG
GTCGCAAGGCTGAAACTTAAAGGAATTGACGGAAAGGCACCACCAGG
AGTGGAGCCTGCGGCTTAATTTGACTCAACACGGGGAAACTTACCAG
GTCCAGACATAGTAAGGATTGACAGATTGATAGCTCTTTCTTGATTCT
ATGGGTGGTGGTGCATGGCCGTTCTTAGTTGGTGGAGTGATTTGTCTG
GTTAATTCCGTTAACGAACGAGACCTTAACCTGCTAAATAGTTACACA
TAACTTCGGTTACGTGGGCAACTTCTTAGAGGGACTTTGCGTGTCTAA
CGCAAGGAAGTTTGAGGCAATAACAGGTCTGTGATGCC
III.Tr×nh tù nucleotit cña c¸c mÉu thuéc chi Pseudonitzschia
III.1. Tr×nh tù nucleotit cña mÉu Pseudonitzschia sp’2
GGATCATTACCACACCGATCCAAGATCAGTCTTCATTGTGAATTGTGCTATCGCGG

GCTTGGGTTTGTTTAACCCATCCCGACGCCAACTTAACGCCGAATCGAGCACTAGG
ATCGAGCTTCGGCTCCATCTAACGATCTCTCCGGCAAACACCCGGTCGAAAGACTG
GGTGCCCAATACGTTTTTACGATTGGTAACTGGAAAGAACCAAATGACCTAAAGC
AAAAATGCAGTGGTTTTGGTGTCGTGTCCCTCTCGGGCCGACGCCACCCTGTACAT
TATACCTAATACATTACAACTTTCAGCGGTGGATGTCTAGGTTCCCACAACGATGA
AGAACGCAGCGAAATGCGATACGTAATGCGAATTGCAAGACCTCGTGAATCATTA
AGATTTTGAACGCACATTGCGCTTTCGGGATTTTCCCGGTAGCATGCTTGTCTGAG
TGTCTGTGGATCCCACTCAGCGCTGTTGCCTTTCTTTTGGCATCGGCTGCTGGTTGT
TTTGGCTTTGACCGCCTCGTTTGCGGTCTCTGCTCAAGTTCTACGGTTACCGTACGT
GCATAGATCTAGAACCCTCAACCTGTCTTGCTCAAGACGGCGTTGACACTCTTGTC
TATCTCTGGTAGAAGTTGGCTCGTTCCGATTTTTTTCTAGAGTTTGTTTAGGAGTCG
TCATGCTAAAGCCGTTTCTGTAGCTTTGTTGGTGGAGCGGACCTAGGTCTAGCTAT
GGCATGTAATGTCGTGGCTATCCAATTCCGGATCTCAGATCAAGCAAGAGGACCC
GCCGAATTTAAGCATATAATTAAGCGGAGGAAAAGAAACTAACTAGGATTCCCTC
AGTAACGGCGGTAGAAGCGGGACTAGCTCAGGATGTGAATCTGCG

III.2. Tr×nh tù nucleotit cña mÉu Pseudonitzschia sp (G3)
GGATCATTACCACACCGATCCAAGATCAGTCTTCATTGTGAATCTGATTGCACTGG
TCTAGTATTTTTACTAAACCGCTGCCGTCAAACTTAAACTTGCAACGCGATGATTA
ATTCCGCCTTGCTGCCATTCTTCACGATTGGTAACTGGAAAGAACCAAATGACCTA
AAGCAAAAATGATGCAGTGTTTCGGAGCGCTGAGCGGGCGTCTTAAGTATTAGAT
GCATACCAAACCGACTCTATTGCTGGCACTGCACATTACACCTAATACATTACAAC
TTTCAGCGGTGGATGTCTAGGTTCCCACAACGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGA

22


TACGTAATGCGAATTGCAAGACCTCGTGAATCATCAAGATTTTGAACGCACATTGC
GCTTTCGGGTATTCCCGGTAGCATGCTTGTCTGAGTGTCTGTGGATCCCACTCAGC
GCTGGCTTCGTGCTGGCTGCTGGTATTTTGGCCGTGACTGAATTTGTTTAGTCTCGG

CTTAAGTTTTACGTTAAGTACGTGCATAGATCTAGAAAGCTCTGCCCGTTTAGTTA
AAAACACGGCGTTGACACTCTTGTCTATCTCTGGTAGGTTTATTCGACTGGAGTTT
GCTACGAGTTGTCTATAGCTGTTTTGAAACTACTGGAATGAGCGCTTGTAGATCTA
ACTAGCTGGAAACAGTTAGTTATACAATTCCGGATCTCAGATCAAGCAAGAGGAC
CCGCCGAATTTAAGCATATAATTAAGCGGAGGAAAAGAAACTAACTAGGATTCCC
TCAGTAACGGCGAGTGAAGCGGGACTAGCTCAGGATGTGAATCTGCG

23