ỦY BAN NHÂN DÂN TỈNH ĐỒNG NAI
SỞ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
----------------

THUYẾT MINH ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC

Đề tài:

“NÂNG CAO GIÁ TRỊ SỬ DỤNG, GIÁ TRỊ GIA TĂNG
TRÁI CACAO ĐỒNG NAI”

CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI: TS. PHAN TẠI HUÂN
PGS.TS. BÙI VĂN MIÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM

Tháng 04.2014



THUYẾT MINH ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU
KHOA HỌC VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ
I. THÔNG TIN CHUNG VỀ ĐỀ TÀI
1

Tên đề tài
Nâng cao giá trị sử dụng, gíá trị gia tăng trái Cacao
Đồng Nai

2

Mã số (được cấp khi Hồ sơ

trúng tuyển)

3

Thời gian thực hiện: 24 tháng
Từ tháng 01/2014 – 01/2016

4

Cấp quản lý

5

Nhà nước
Tỉnh
√

Bộ
Cơ sở

Kinh phí 2.100 triệu đồng, trong đó:
Nguồn
- Từ Ngân sách sự nghiệp khoa học

Tổng số
2.100 triệu

- Từ nguồn tự có của tổ chức
- Từ nguồn khác
6


Thuộc Chương trình (Ghi rõ tên chương trình, nếu có), Mã số:
Thuộc dự án KH&CN;
Đề tài độc lập;

7

Lĩnh vực khoa học
√

8

Tự nhiên;
Kỹ thuật và công nghệ;

Nông, lâm, ngư nghiệp;
Y dược.

Chủ nhiệm đề tài

Họ và tên: Phan Tại Huân
Ngày, tháng, năm sinh: 07/08/1978
Nam/ Nữ: Nam
Học hàm, học vị: Tiến sĩ
Chức vụ: Trưởng Khoa Công nghệ Thực phẩm – ĐHNL TP.HCM, kiêm Trưởng Bộ môn Hóa
sinh thực phẩm.
Điện thoại:
Tổ chức: 84(8)38960871
Nhà riêng: 84 (8) 62821209
Mobile: 090 680 2545.

Fax: 38960713
E-mail:
Tên tổ chức đang công tác: Khoa Công Nghệ Thực Phẩm, Trường Đại Học Nông Lâm -


TP.HCM
Địa chỉ cơ quan: Khu phố 6, Phường Linh Trung, Quận Thủ Đức, Tp. Hồ Chí Minh.
Địa chỉ nhà riêng: Số 11B, Đường số 9, KP. 3, P. Linh Trung, Q. Thủ Đức, TP.HCM
Đồng chủ nhiệm đề tài
Họ và tên: Bùi Văn Miên.
Ngày, tháng, năm sinh: 14 /06/1955
Nam/ Nữ: Nam
Học hàm, học vị: Phó giáo sư, Tiến sĩ
Chức vụ: Trưởng phòng Quản lý nghiên cứu khoa học, Trưởng bộ môn Phát triển sản phẩm ,
khoa CNTP, Đại học Nông Lâm TPHCM
Điện thoại cơ quan: 38963340 Fax: 38960713
Điện thoại nhà riêng: 38963740 DTDĐ: 0903957664 E-mail:
Tên tổ chức đang công tác: Khoa Công Nghệ Thực Phẩm, Trường Đại Học Nông Lâm
TP.HCM
Địa chỉ cơ quan: Khu phố 6, Phường Linh Trung, Quận Thủ Đức, Tp. Hồ Chí Minh.
Địa chỉ nhà riêng: 5/8 Lê Văn Chí, Phường Linh Trung, Quận Thủ Đức TP Hồ Chí Minh.
9

Thư ký đề tài

Họ và tên: Lương Hồng Quang.
Năm sinh: 1979
Nam/ Nữ: Nam
Học hàm, học vị: Thạc sĩ.
Chức danh khoa học

Chức vụ: Phó trưởng Khoa Công nghệ Thực phẩm-Trường
ĐHNL TP.HCM.
Điện thoại:
Tổ chức: 84(8)38960871
Nhà riêng:
Mobile: 01285678456
Fax: 38960713
E-mail:
Tên tổ chức đang công tác: Khoa Công Nghệ Thực Phẩm, Trường Đại Học Nông Lâm
TP.HCM
Địa chỉ cơ quan: Khu phố 6, Phường Linh Trung, Quận Thủ Đức, Tp. Hồ Chí Minh.
Địa chỉ nhà riêng: 160/33/20A, đường Bùi Đình Tuý, P. 12, Q. Bình Thạnh, Tp. Hồ Chí Minh
10

Tổ chức chủ trì đề tài
Tên tổ chức chủ trì đề tài: Trường Đại Học Nông Lâm TP.HCM.
Điện thoại: 08.38963340 – 8966780
Fax: 08.38960713
E-mail:
Website:
Địa chỉ: Khu phố 6, Phường Linh Trung, Quận Thủ Đức, Tp. Hồ Chí Minh
Họ và tên thủ trưởng tổ chức: PGS.TS Nguyễn Hay
Số tài khoản : 932901300024
Ngân hàng: Kho bạc Nhà nước Q. Thủ Đức TP.HCM
Tên cơ quan chủ quản đề tài: Sở Khoa học và Công nghệ Tỉnh Đồng Nai
2


11


Các tổ chức phối hợp chính thực hiện đề tài
Tổ chức: Trung tâm Ứng dụng Công nghệ sinh học Đồng Nai.
Tên cơ quan chủ quản : Sở Khoa học và Công nghệ tỉnh Đồng Nai
Họ và tên thủ trưởng tổ chức: Nguyễn Thị Hoàng
Điện thoại người Lãnh đạo Cơ quan: 0613.822297-8188
Địa chỉ Cơ quan: 1597 Phạm Văn Thuận, Biên Hòa, Đồng Nai.

12

Các cán bộ thực hiện đề tài
(Ghi những người có đóng góp khoa học và chủ trì thực hiện những nội dung chính thuộc tổ chức
chủ trì và tổ chức phối hợp tham gia thực hiện đề tài, không quá 10 người kể cả chủ nhiệm đề tài)
Họ và tên, học
hàm học vị

2

Tổ chức
công tác

Nội dung công việc tham gia

Thời gian làm
việc cho đề tài
(Số tháng quy
đổi2)

1

TS. Phan Tại Huân


ĐH
Nông Lâm

Chủ nhiệm đề tài
Trực tiếp thực hiện các thí nghiệm
lên men hạt cacao, lên men rượu
cacao

24

2

PGS. TS. Bùi Văn
Miên

ĐH
Nông Lâm

24

3

TS. Vũ Thị Lâm An ĐH
Nông Lâm

Đồng chủ nhiệm đề tài
Trực tiếp thực hiện các thí nghiệm
thiết kế bồn cacao, đánh giá rượu
cacao

Tham gia thực hiện thí nghiệm
phân lập và tuyển chọn chủng vi
sinh lên men cacao

4

ThS. Nguyễn Minh
Hiền

ĐH
Nông Lâm

8

5

ThS. Lương Hồng
Quang

ĐH
Nông Lâm

Tham gia thực hiện thí nghiệm
phân lập và tuyển chọn chủng vi
sinh lên men cacao
Tham gia thực hiện thí nghiệm lên
men cacao

6


TS. Lê Trung Thiên

ĐH
Nông Lâm

Tham gia thực hiện thí nghiệm lên
men cacao

8

7

ThS. Lâm Thanh
Hiền

ĐH
Nông Lâm

Tham gia thực hiện thí nghiệm
sản xuất rượu cacao

8

8

TS. Dương Thị
Ngọc Diệp

ĐH
Nông Lâm


Tham gia thực hiện thí nghiệm
sản xuất rượu cacao

8

Một (01) tháng quy đổi là tháng làm việc gồm 22 ngày, mỗi ngày làm việc gồm 8 tiếng

3

8

8


9

ThS. Nguyễn Thị
Hoàng

Trung tâm
Ứng dụng
Công nghệ
sinh học Đồng
Nai.

Điều tra tình hình thời tiết, năng
suất, giống cacao tại Đồng Nai.
Chuyển giao kỹ thuật lên men
cacao


8

10

ThS. Nguyễn
Quang Tuấn

Trung tâm
Ứng dụng
Công nghệ
sinh học Đồng
Nai.

Điều tra tình hình thời tiết, năng
suất, giống cacao tại Đồng Nai.
Chuyển giao kỹ thuật chế biến
rượu cacao và nước cacao lên men

8

II. MỤC TIÊU, NỘI DUNG KH&CN VÀ PHƯƠNG ÁN TỔ CHỨC THỰC HIỆN ĐỀ TÀI
13 Mục tiêu của đề tài (Bám sát và cụ thể hoá định hướng mục tiêu theo đặt hàng - nếu có)
Mục tiêu tổng quát :
- Nâng cao giá trị sử dụng trái cacao Đồng Nai
- Nâng cao chất lượng hạt cacao lên men tại Đồng Nai
Mục tiêu cụ thể :
- Cải thiện quá trình lên men bằng cách tách một phần dịch ép từ lớp cơm nhầy của hạt tươi để tạo ra một
sản phẩm có giá trị,
- Phát triển chế phẩm sinh học nhằm lên men định hướng và ổn định cho quá trình lên men hạt cacao

trong đó ứng dụng hệ thống lên men bằng bồn ủ inox cho chất lượng đồng đều.
- Xây dựng chế độ sấy hạt lên men tương ứng với quá trình lên men định hướng để đảm bảo giá trị
thương phẩm.
- Phá triển sản phẩm rượu cacao và nước cacao lên men có hương vị đặc trưng từ phụ phẩm phẩm dịch
ép cơm nhầy.
14

Tình trạng đề tài
Mới

Kế tiếp hướng nghiên cứu của chính nhóm tác giả
√ Kế tiếp nghiên cứu của người khác
Đề tài kế thừa nhiều thành quả nghiên cứu trước đây về lên men cacao và chế biến rượu trái cây ở
trong nước và trên thế giới. Tính mới ưu việt của đề tài thể hiện ở các điểm sau:
- Mang lại giá trị sử dụng mới từ phụ phẩm thịt quả hạt cacao.
- Ứng dụng, sử dụng phụ phẩm này vào sản xuất sản phẩm mang tính chất đặc trưng.
- Giảm thiểu thiệt hại do ảnh hưởng của thời tiết vùng Đồng Nai đến quá trình lên men hạt cacao
thông qua việc sử dụng lên men có định hướng.
15

Tổng quan tình hình nghiên cứu, luận giải về mục tiêu và những nội dung nghiên cứu của Đề
tài
15.1 Đánh giá tổng quan tình hình nghiên cứu thuộc lĩnh vực của Đề tài
Ngoài nước (Phân tích đánh giá được những công trình nghiên cứu có liên quan và những kết quả
nghiên cứu mới nhất trong lĩnh vực nghiên cứu của đề tài; nêu được những bước tiến về trình độ
KH&CN của những kết quả nghiên cứu đó)
Lên men hạt cacao chịu ảnh hưởng của nhiều phản ứng sinh hóa trong lớp cơm nhầy và trong
nhân để hình thành chất lượng của hạt khi chế biến. Các nghiên cứu trên thế giới đã chú trọng tới vấn đề
4



này và đã xác định được diễn biến của quá trình lên men, cũng như ảnh hưởng của các yếu tố tới các
phản ứng sinh hóa xảy ra. Nhiều nghiên cứu cơ bản về quá trình sinh hóa xảy ra trong quá trình này, các
phản ứng chính và hợp chất chính sản sinh ra là nền tảng cho sự phát triển của hương vị. Lopez và
Dimick (1998), Thompson và công sự (2001) đã khẳng định enzyme và vi sinh vật có tác động lớn đến
các phản ứng sinh hóa và sự hình thành chất lượng hạt.
Mặc dù đã tiến bộ đáng kể trong việc xác định sự đa dạng của các loài vi sinh vật liên quan đến
quá trình lên men, lượng thông tin về các cấu h́nh tăng trưởng của các loài trong suốt quá trình lên men
cacao tại Việt Nam nói chung và tỉnh Đồng Nai nói riêng là chưa đầy đủ. Những dữ liệu định lượng, kết
hợp với hóa chất thích hợp và phân tích cảm quan của hạt và chất lượng chocolate, là cần thiết để xác
định loài vi sinh vật quan trọng nhất đối với quá trình lên men. Với những thông tin này có thể giúp tối
ưu hóa quá trình lên men và nếu cần thiết, chọn các loài thích hợp để sử dụng trong giai đoạn đầu của lên
men (Lopez và Dimick, 1998). Những hệ vi sinh vật chủ yếu trong lên men cacao có thể kể đến như sau:
Nấm men
Trong giai đoạn đầu của quá trình lên men, sự phát triển của nấm men là chiến ưu thế do hàm
lượng đường cao, pH thấp và lượng O2 giới hạn trong phần thịt quả. Hoạt động chính của nấm men là
chuyển hóa đường thành cồn và các hoạt động khác như chuyển hóa axít citric, cắt mạch pectin cũng
được xem là những hoạt động quan trọng của nấm men. Đối với lên men đổ đống người ta thấy có những
loại nấm men sau: Hansenula sp., Kloeckra sp., Tonilopsis sp., Saccharomyces sp., Candida sp., Pichia
sp. và Schizosaccharomyces sp.. Lên men hộp thì thấy có các loại nấm men sau: Candida sp., Kloeckra
sp., Pichia sp., Saccharomyces spp.
Vi khuẩn lactic
Nấm men nhanh chóng tiêu thụ O2 có trong khối lên men, tạo điều kiện thuận lợi cho sự phát
triển của vi khuẩn lactic. Vi khuẩn lactic sẽ lên men đường và chuyển hóa đường thành axít lactic, đồng
thời cũng đồng hóa axít citric. Trong quá trình lên men đổ đống, người ta đã phân lập được các chủng
sau: Lactobacillus colonides, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus mali.
Vi khuẩn axêtic
Sự thủy phân pectin của nấm men làm phân hủy thịt quả, làm tăng sự khuếch tán không khí trong
khối lên men và sự đồng hóa axít citric bởi nấm men và LAB làm cho pH tăng lên. Điều này có lợi cho
sự phát triển của vi khuẩn acetic (AAB). Vi khuẩn axêtic chuyển hóa etanol thành axít acetic và tỏa

nhiệt. Ethanol và axít axêtic khuếch tán trong khối hạt, điều này kết hợp với nhiệt sinh ra làm hạt chết,
diệt phôi và dẫn đến những biến đổi sinh hóa. Sự chuyển hóa ethanol thành axít axêtic bởi AAB là một
quá trình tỏa nhiệt. Điều này được xác nhận đúng ở quá trình lên men đổ đống nhỏ, ở phần đầu của lên
men đống lớn. Sự tăng nhiệt độ liên quan mật thiết đến số lượng AAB.
Có thể nói rằng việc xác định thành phần và vai trò của vi sinh vật tham gia ở từng thời điểm của
quá trình lên men hạt cacao là rất cần thiết, trên cơ sở đó thiết lập quy trình lên men có bổ sung các
chủng vi sinh vật (chế phẩm vi sinh khởi động) thích hợp giúp tạo ra sản phẩm cacao lên men có chất
lượng cao và ổn định đáp ứng với nhu cầu của thị trường trong nước và xuất khẩu.
Trong khi đó lên men rượu từ phần nước ép thịt quả hạ cacao là quá trình chuyển hóa đường
glucose thành rượu ethylic và CO2. Tác nhân lên men rượu chủ yếu là các nấm men, chủ yếu là các nòi
Saccharomyces cerevisiae. Đối với quá trình lên men rượu vang (từ quả nho) và rượu vang trái cây, bên
cạnh việc chuyển hóa đường thành rượu, còn có sự đóng góp của nhiều thành phần khác trong nguyên
liệu, bao gồm các hợp chất carbonyl, ester, acid và acetaldehyd…(Duarte và cộng sự, 2010). Tất cả
chúng tạo thành hương vị đặc biệt cho sản phẩm rượu vang, tùy theo loại nguyên liệu trái cây sử dụng.
Phần cơm nhầy bao quanh hạt cacao, phụ phẩm của ngành chế biến cacao hạt, có thể được sử
dụng để sản xuất nhiều loại thức uống lên men và không lên men. Cơm nhầy cacao chứa 82-87% nước,
10-15% đường (trong đó chiếm 60% là đường saccharose và 39% là hỗn hợp đường glucose và
fructose), 2-3% pentose, 1-3% acid citric, 1-1,5% pectin; các protein, amino axít, vitamin (nhiều nhất là
vitamin C) và thành phần muối khoáng (nhiều nhất là canxi với 316,92mg/100g, tiếp theo là kali, natri,
kẽm, sắt và magiê) làm cho cơm nhầy cacao trở thành môi trường giàu dinh dưỡng cho vi sinh vật phát
5


triển (Puerari, Magalhães & Schwan, 2012). Phần cơm nhầy này, ngay sau khi được tách khỏi vỏ quả
cùng với hạt và trước khi hạt chuẩn bị chuyển vào các thùng lên men, sẽ dần dần chuyển thành dịch lỏng
do tác động của hệ thống enzyme pectinase có sẵn trong quả cacao. Dịch cơm nhầy chảy ra có thể được
tận thu để lên men rượu vang. Dias và cộng sự (2007) khẳng định việc sử dụng dịch cơm nhầy cacao để
sản xuất rượu vang là hoàn toàn khả thi. Với nghiên cứu của mình, Duarte và cộng sự (2010) cũng cho
rằng cơm nhầy cacao rất phù hợp để chế biến sản phẩm rượu vang. Rượu vang tạo thành từ cơm nhầy
cacao có thành phần tương tự các sản phẩm rượu vang truyền thống khác. Bên cạnh đó, rượu vang từ

cơm nhầy cacao còn cho hương vị đặc biệt của trái cây, đó là có mùi hương của táo xanh, chuối, có mùi
kẹo ngọt, mùi của chanh, mùi vani, hoa hồng và mật ong.
De Cássia Trindade và cộng sự (1999) đã nghiên cứu quần thể nấm men có trong cơm nhầy cacao
tươi, cũng như đã phân lập và tuyển chọn được chủng lên men tiêu biểu và phát triển một mô hình sản
xuất rượu cacao nhỏ. Với 65 chủng nấm men thu được, tất cả các mẫu cơm nhầy lên men đều cho sản
phẩm có độ cồn từ 8-11,5% (là độ cồn phù hợp cho sản phẩm rượu vang) và độ Brix từ 4,2-7%; trong đó,
các chủng Brettanomyces, đặc biệt là chủng B. custersianus cho chất lượng sản phẩm lên men tốt nhất.
Theo thí nghiệm của Duarte và cộng sự (2010), chủng nấm men Saccharomyces cerevisiae
UFLA CA 1162 mà nhóm sử dụng cho chất lượng lên men cơm nhầy cacao rất tốt. Ở một nghiên cứu
khác, Dias và cộng sự (2007) cũng cho rằng cơm nhầy cacao có thể được lên men dễ dàng bởi
Sacchamyces cerevisiae để tạo thành các loại thức uống có cồn. Nhóm nghiên cứu đã sử dụng 3 chủng
Sacchamyces cerevisiae CA 116, CA 1162 và CA 1183 để lên men cơm nhầy cacao. Phần cơm nhầy
cacao được bổ sung đường saccharose đến 22oBrix, bổ sung CaCO3 để điều chỉnh pH đến 4, bổ sung
enzyme pectinase để làm trong dịch cơm nhầy, và sử dụng K2S2O5 với nồng độ 200mg/l để ngăn chặn sự
nâu hóa dịch lên men và sự phát triển của các vi sinh vật gây hại trong quá trình lên men. Giai đoạn lên
men chính được thực hiện ở 22oC và giai đoạn lên men phụ được thực hiện ở 10oC trong 30 ngày. Kết
quả, chủng S. cerevsiae CA 1183 cho khả năng sản sinh ethanol cao nhất và có hiệu suất tốt nhất. Bằng
các phương pháp phân tích sắc ký, nhóm nghiên cứu phát hiện rằng sản phẩm rượu vang từ cơm nhầy
cacao có hàm lượng cồn, methanol, ester và acetaldehyde tương đồng với tiêu chuẩn rượu vang truyền
thống. Kết quả đánh giá cảm quan cũng cho thấy sự ưa thích của hầu hết các thành viên thử nếm. Tuy
nhiên, ở một nghiên cứu khác, Anvoh và cộng sự (2010) lại cho rằng giai đoạn lên men chính cơm nhầy
cacao bằng nấm men Saccharomyces cerevisiae tốt nhất nên thực hiện ở 28-30oC vì đây là nhiệt độ tối
ưu cho sự phát triển của nấm men. Anvoh và cộng sự (2010) cũng thấy rằng thực hiện quá trình lên men
cơm nhầy cacao có điều khiển sẽ cho chất lượng sản sinh ethanol cao gấp 2 lần so với để lên men tự
nhiên.
Bên cạnh việc sử dụng để sản xuất rượu vang, cơm nhầy cacao còn được nghiên cứu làm sản phẩm kefir
(Puerari và cộng sự, 2012). Darman, Ngang và Etoa (2011) cũng đã thử nghiệm sản phẩm rượu vang từ
cơm nhầy cacao phối hợp với hoa bụp giấm cho chất lượng hóa học và cảm quan rất tốt, so với các sản
phẩm rượu vang thương mai từ quả nho. Thậm chí, dịch cơm nhầy cacao lên men chứa nhiều acid lactic
và acid acetic còn được phát hiện có khả năng diệt trừ sâu bệnh cho cây (Acheampong và cộng sự,

2013).
Trong nước (Phân tích, đánh giá tình hình nghiên cứu trong nước thuộc lĩnh vực nghiên cứu của đề tài,
đặc biệt phải nêu cụ thể được những kết quả KH&CN liên quan đến đề tài mà các cán bộ tham gia đề tài
đã thực hiện. Nếu có các đề tài cùng bản chất đã và đang được thực hiện ở cấp khác, nơi khác thì phải
giải trình rõ các nội dung kỹ thuật liên quan đến đề tài này; Nếu phát hiện có đề tài đang tiến hành mà
đề tài này có thể phối hợp nghiên cứu được thì cần ghi rõ Tên đề tài, Tên Chủ nhiệm đề tài và cơ quan
chủ trì đề tài đó)
Hiện nay ở nước ta, nghiên cứu phát triển cây cacao tập trung chủ yếu về các giải pháp kỹ thuật
trong nhân giống và nâng cao năng suất trồng. Trong khi những nghiên cứu về kỹ thuật lên men nhằm
nâng cao và duy trì ổn định chất lượng cacao lên men cũng như sử dụng hiệu quả nâng cao giá trị sử
dụng hạt cacao c̣n nhiều hạn chế.
Năm 2006, Dự án “Lên men, sấy và đánh giá chất lượng cacao ở Việt Nam” được chấp thuận trong
6


Chương trình hợp tác Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn (Chương trình CARD 013/VIE05). Dự án
này hưởng ứng chương trình phát triển 10.000 ha trồng cây cacao vào năm 2010 của Chính phủ Việt
Nam. Trong thời gian thực hiện Dự án Bộ NN&PTNT đã thay đổi kế hoạch trồng cacao lên đến 60.000
ha vào năm 2015 và 80.000 ha vào năm 2020. Chính phủ đã cam kết đầu từ 40 tỉ đồng để phát triển thị
trường cacao. Sản lượng cacao dự đoán sẽ đạt được khoảng 52.000 tấn vào năm 2015 và 108.000 tấn vào
năm 2020.
Tại Việt Nam, hiện chưa có công trình nghiên cứu thử nghiệm nào từ dịch cơm nhầy cacao chính thức
được công bố mặc dù hiện nay có một số doanh nghiệp đã chính thức đưa rượu cacao ra thị trường. Theo
Baodongnai online, công ty TNHH cacao Trọng Đức -Định Quán, Đồng Nai sản xuất 2 loại rượu cacao
có 12 và 39 độ cồn từ trái cacao tươi
Phan Thanh Bình và cộng sự (2010) bước đầu nghiên cứu sử dụng chế phẩm enzyme Flavourzyme
(Novozyme) trong quá trình lên men hạt cacao với kết quả: bổ sung tốt nhất 80ppm chế phẩm/khối lượng
hạt tươi vào đầu quá trình lên men. Phan Thanh Bình và cộng sự (2011 a) đã bước đầu nghiên cứu sử
dụng chế phẩm enzyme Flavourzyme (Novozyme) trong quá trình lên men hạt cacao để nâng cao chất
lượng sản phẩm. Kết quả cho thấy enzyme protease có tác dụng thay đổi chất lượng cacao sau lên men.

Chế phẩm sử dụng tốt nhất với lượng 40 ppm và bổ sung thích hợp sau 96 giờ lên men. Phan Thanh Bình
và cộng sự (2011 b) đã nghiên cứu lên men cacao có bổ sung chế phẩm chứa enzyme invertase nhằm làm
tăng hàm lượng đường khử có trong hạt và từ đó tăng cao tiền chất tạo hương vị cho chocolate. Kết quả
xác định liều lượng enzyme invertase thích hợp nhất định bổ sung vào trong lên men cacao với quy mô
vừa và nhỏ là 60 ppm với thời điểm bổ sung enzyme invertase thích hợp nhất là ngay sau khi lên men.
Kết quả nghiên cứu khảo sát chất lượng hạt cacao lên men trong điều kiện tự nhiên, những biến đổi
sinh hóa và mật số các vi sinh vật chủ yếu trong quá trình lên men (Vương Thanh Tùng, 2006) cho thấy
hạt cacao lên men trong điều kiện tự nhiên cũng có chất lượng chấp nhận được nhưng không đồng đều
giữa các lớp trong khối ủ, phụ thuộc nhiều vào điều kiện thời tiết. Đây là một chuỗi các quá trình lên
men của các nhóm vi sinh vật nối tiếp nhau. Đầu tiên là sự phát triển của nấm men, tiếp theo là vi khuẩn,
cuối cùng là sự phát triển của một số nấm sợi trên bề mặt của khối ủ. Chất lượng hạt cacao sau lên men
tốt nhất trong điều kiện nhiệt độ lên men ở 40oC, độ ẩm nguyên liệu là 82% và thời gian lên men trong 7
ngày.
Hoàng Văn Tiến và Nguyễn Đức Lượng (2005) đã bước đầu nghiên cứu sản xuất bột cacao bằng
phương pháp lên men có bổ sung vi sinh vật. Theo đó, nghiên cứu đã sử dụng giống nấm mốc
Aspergillus niger. để phân giải cellulose và pectin làm gia tăng lượng chiết chất hòa tan cho hạt cacao và
xác định được tỉ lệ giống Aspergillus niger: bột mì rang là 1:3, độ ẩm tối ưu khối lên men là 60%, lượng
chế phẩm lên men chiếm 1% khối lượng hạt lên men và thời gian lên men kéo dài 96 giờ.
Năm 2002, kết quả nghiên cứu của nhóm tác giả Trần Xuân Ngạch đã phân lập được 4 chủng nấm
men trong quá trình lên men hạt cacao Quãng Ngãi: Hansenia sporauvarum, Galatomyces resii, Candida
sorboxylosa, Candida fructus.
Huỳnh Thị Minh Tuyết và cộng sự (2011) đã nghiên cứu sử dụng Saccharomyces cerevisiae và
Acetobacter aceti để lên men hạt cacao. Sau khi sấy khô, lượng chất béo thu được là 5,67%. Tất cả các
hạt đều có màu nâu hoặc nâu tím, không chua và không có vị đắng chát. Hạt có cacao của phương pháp
lên men có định hướng không xuất hiện nấm mốc trên bề mặt hạt, nguyên nhân là do các mẫu này được
bổ sung nấm men và vi khuẩn để thúc đẩy sinh nhiều ethanol và acid đủ ức chế sự phát triển của nấm
mốc. Tỷ lệ hạt nâu 80% cao hơn so với lên men tự nhiên (chỉ 70%). Hạt cacao sau khi rang của phương
pháp mới có mùi thơm hơn và hầu như không chua, tất cả đều không có vị chat. Ngoài ra, hàm lượng
lipid trong hạt cacao sau khi sấy cũng cao hơn.
Lên men cacao là giai đoạn cần thiết để tạo hương vị cho hạt cacao. Thông thường trên thế giới và tại

Việt Nam, cacao thường được lên men đơn giản bằng cách sử dụng các nguồn nấm men và vi khuẩn tự
nhiên từ môi trường xâm nhập vào lớp cơm nhầy. Với phương pháp lên men tự nhiên này giá trị kinh tế
của các hạt thu được không cao, đặc biệt là trong trường hợp điều kiện phát triển của hệ vi sinh không
thể kiểm soát một cách ổn định. Phương pháp lên men cacao có sử dụng Sacharosemyses cerevisiae,
7


Aacetobacter một cách chọn lọc đã được tiến hành tại trường Đại học Công nghiệp Tp. Hồ Chí Minh.
Quá trình diễn ra trong sáu ngày, hai ngày đầu nhiệt độ 350C, các ngày còn lại nhiệt độ 500C. Tổng
lượng chất khô trong cơm nhầy giảm đột ngột sau 24 giờ lên men. Hàm lượng cơm nhầy giảm mạnh dạt
8,9% sau 144 giờ. Sau khi sấy khô lượng chất béo thu được là 5,67%. Tất cả hạt đều có hạt màu nâu tím
không chua và không có vị đắng chát.
15.2 Luận giải về việc đặt ra mục tiêu và những nội dung cần nghiên cứu của Đề tài
(Trên cơ sở đánh giá tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước, phân tích những công trình nghiên cứu
có liên quan, những kết quả mới nhất trong lĩnh vực nghiên cứu đề tài, đánh giá những khác biệt về trình
độ KH&CN trong nước và thế giới, những vấn đề đã được giải quyết, cần nêu rõ những vấn đề còn tồn
tại, chỉ ra những hạn chế cụ thể, từ đó nêu được hướng giải quyết mới - luận giải và cụ thể hoá mục tiêu
đặt ra của đề tài và những nội dung cần thực hiện trong Đề tài để đạt được mục tiêu)
Với sự hỗ trợ mạnh mẽ của Hiệp hội cacao thế giới, diện tích cacao ngày càng được mở rộng tại Việt
Nam. Hiện nay, cacao đang trở thành cây trồng chuyên canh của nhiều vùng, trong đó có tỉnh Đồng Nai.
Việc phát triển cacao tại Đồng Nai là một hướng đi mới mang lại nhiều lợi ích cho người dân. Tuy nhiên,
lợi nhuận thu được từ cây cacao chưa cao.
Ước tính, cứ mỗi quả cacao, phần hạt tươi chiếm khoảng gần 40% khối lượng quả, phần còn lại là vỏ quả
và cùi trụ khoảng hơn 60%. Trong phần hạt tươi, lớp cơm nhầy chứa khoảng 0,2%. Chất nhầy bao quanh
hạt cacao tươi tại Đồng Nai thường có hàm lượng đường cao. Bên cạnh điều kiện thời tiết mưa nắng
không ổn định, đây là 1 trong những lý do dẫn đến hạt cacao sau lên men thường có hàm lượng acid cao
và làm chất lượng liquor (nguyên liệu làm chocolate) bị đánh giá là chua. Hơn nữa, lớp nhầy quá nhiều
cũng làm ảnh hưởng đến quá trình tạo hương cho sản phẩm. Đây cũng chính là nguyên nhân hạt cacao
lên men tại Đồng Nai chưa đạt giá trị thương phẩm cao.
Việc kiểm soát chất lượng của hạt cacao thành phần, nâng cao giá trị xuất khẩu của hạt cacao Đồng Nai

là một nhu cầu mang tính cấp thiết. Chất lượng của hạt cacao Đồng Nai bị hạn chế bởi điều kiện thời tiết
và lượng thịt quả hạt nhiều làm cho hạt có hàm lượng a-xít cao; các tiền hợp chất về mùi, vị sô-cô-la tạo
thành trong quá trình ủ lên men, phơi hạt chưa tốt. Nên giá trị xuất khẩu không ổn định. Việc này ảnh
hưởng đến sự phát triển bền vững cây cacao (nguy cơ chuyển đổi cơ cấu cây trồng từ người nông dân rất
cao). Bên cạnh đó vì chất lượng hạt cacao chua, chất lượng hạt chưa tốt nên cũng khó phát triển các sản
phẩm công nghiệp chế biến đi kèm. Cho nên, việc nâng cao chất lượng hạt cacao thông qua công đoạn
lên men/ủ hạt cacao tươi rất quan trọng. Những nghiên cứu trong và ngoài nước về việc sử dụng chế
phẩm sinh học nói chung và vi sinh nói riêng đã chứng tỏ được hiệu quả trong việc nâng cao chất lượng
của cacao sau lên men, đặc biệt là ở những vùng mà điều kiện lên men tự nhiên khó được kiểm soát ổn
định. Tuy nhiên chưa có một nghiên cứu hệ thống nào về hệ vi sinh vật lên men tự nhiên cacao và sử
dụng chế phẩm vi sinh để ổn định và cải thiện chất lượng cacao tại Đồng Nai. Các kỹ thuật lên men
trong bồn ủ sử dụng chế phẩm vi sinh và kỹ thuật sấy hạt cacao tương cũng chưa được nghiên cứu và
đưa vào thử nghiệm toàn diện. Hơn thế nữa việc khai thác đồng thời phụ phẩm dịch ép từ màng nhầy
cacao để sản xuất rượu cacao đặc trưng sẽ giúp khai thác tối đa giá trị kinh tế từ hạt cacao Đồng Nai.
Quá trình lên men hạt cacao là sự phân hủy phần lớn cơm nhầy cacao bởi phức hợp vi sinh vật. Nên
chúng tôi tiến hành nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến sự phát triển của vi sinh vật như: Nguồn dinh
dưỡng cho vi sinh vật (hàm lượng lớp cơm nhầy, thành phần các chất dinh dưỡng trong lớp cơm cacao
tươi) và phương pháp lên men (dạng thùng, khối lượng hạt cacao tươi/mẻ, đảo trộn khối hạt trong quá
trình ủ, bổ sung lượng vi sinh vật khơi mào quá trình lên men).
Nội dung cụ thể
- Tận thu thêm phần phụ phẩm là dịch ép từ lớp cơm nhầy cacao sử dụng làm cơ chất lên men rượu đặc
trưng, đồng thời tạo điều kiện giảm độ acid và độ đườngtuy nhiên vẫn đảm bảo phần cơ chất còn lại đủ
để lên men hạt cacao đạt chất lượng cao.
- Phân lập và định danh được các chủng vi sinh vật (các chủng nấm men và vi khuẩn) trong quá trình
8


lên men cacao tự nhiên đạt chuẩn.
- Tuyển chọn được các chủng nấm men và vi khuẩn thích hợp cho quá trình lên men định hướng hạt
cacao để sản xuất chế phẩm vi sinh khởi động (starter cultures).

- Đánh giá được chất lượng hạt cacao sau lên men giữa hai phương pháp lên men tự nhiên và lên men
có bổ sung vi sinh vật (chế phẩm vi sinh vật khởi động) thông qua các chỉ tiêu như: polyphenol, tannin,
ethanol, axít lactic, axít axêtic, độ nhiễm mốc và vi khuẩn gây bệnh; cảm quan: độ chát, đắng, hương vị,
màu sắc.
- Phát triển phương pháp ủ bằng bồn inox (có vỏ bọc cách nhiệt) thay thế bồn gỗ để dễ làm vệ sinh,
không bị lây nhiễm vi sinh vật lạ không được kiểm, đồng thời ổn định nhiệt độ để không bị ảnh hưởng
bởi yếu tố thời tiết (mưa, nắng, nhiệt độ…).
- Xây dựng được quy trình lên men có bổ sung vi sinh vật (chế phẩm vi sinh vật khởi động) giúp nâng
cao chất lượng hạt cacao Đồng Nai lên men
- Tận thu thêm phần phụ phẩm là dịch ép từ lớp cơm nhầy cacao sử dụng làm cơ chất lên men rượu
cacao đặc trưng.
16 Liệt kê danh mục các công trình nghiên cứu, tài liệu có liên quan đến đề tài đã trích dẫn khi
đánh giá tổng quan
(Tên công trình, tác giả, nơi và năm công bố, chỉ nêu những danh mục đã được trích dẫn để luận giải
cho sự cần thiết nghiên cứu đề tài)
Tài liệu tiếng Anh:
Acheampong, K., Lowor, S. T., Owusu-Ansah, F., & Opoku-Ameyaw, K. (2013). Use of fermented
cocoa pulp juice for the control of non-vascular epiphytes on cocoa. ARPN Journal of Agricultural and
Biological Science, 8 (3), 191-195.
Anvoh, K. Y. B., Guéhi, T. S., Beugré, G. A. M., Kinimo, J. M., & Gnakri, D. (2010). Comparison of
biochemical changes during alcoholic fermentation of cocoa juice conducted by spontaneous and
induced processes for the production of ethanol. Ajfand online, 10 (6), 2740-2754.
Darman, R, D., Ngang, J.-J. E., & Etoa, F.-X. (2011).Fermentation of cocoa juice (Theobroma cacao L.)
and roselle (Hibiscus Saddariffa L.) extracts into a wine-like alcoholic drink. Fruits, Vegetable and
Cereal Science and Biotechnology, 5, 57-63.
de Cássia Trindade, R., de Resende, M. A., Barreto, E. G. S., de Carvalho Mendes, T., & Rosa, C. A.
(1999).
Duarte, W. F., Dias, D. R., Oliveira, J. M., Teixeira, J. A., de Almeida e Silva, J. B., & Schwan, R. F.
(2010). Characterization of different fruit wines made from cacao, cupuassu, gabiroba, jaboticaba and
umbu. LWT - Food Science and Technology, 43, 1564 – 1572.

Identification of yeasts isolated from processed and frozen cocoa (Theobroma cacao) pulp for wine
production.
Dias, D. R., Schwan, R. F., Freire, E. S., & dos Santos Sero, R. (2007). Elaboration of a fruit wine from
cocoa (Theobroma cacao L.) pulp. International Journal of Food Science and Technology, 42, 319–329.
Lopez AS and Dimick PS. 1991 Enzymes involved in cocoa curing. In: Food Enzymology (Vol 1), ed.
Fox PF. Elsevier Science Publisher Ltd, London, UK, pp 211–236.
Puerari, C., Magalhães, K. T., & Schwan, R. F. (2012). New cocoa pulp-based kefir beverages:
Microbiological, chemical composition and sensory analysis. Food Research International, 48, 634–640
Thompson SS, Miller KB, and Lopez AS. 2001. Cocoa and coffee. In: Doyle MJ and Beuchat LR (Ed.),
Food Microbiology - Fundamentals and frontiers. Doyle MP and Beuchat LR Food Microbiology:
Fundamentals and Frontiers, Third Edition ASM Press, Washington, D.C (pp 837 - 850)

9


Tài liệu tiếng Việt:
1. Phan Thanh Bình. 2009. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men, phơi/sấy hạt cacao và biện
pháp kiểm soát. Thông tin KH&CN số 01/2009, trang 21-23.
2. Phan Thanh Bình và cộng sự. 2010. Bước đầu sử dụng chế phẩm Ultrazyme AFPL có chứa enzyme
pectinase vào quá trình lên men hạt cacao. Thông tin KH&CN số 04/2010, trang 11-15.
3. Phan Thanh Bình và cộng sự. 2011 a. Bước đầu nghiên cứu sử dụng chế phẩm enzyme Flavourzyme
(Novozyme) trong quá trình lên men hạt cacao để nâng cao chất lượng sản phẩm. Thông tin KH&CN
Đắk La81k, số 03/2011, trang 15-19.
4. Phan Thanh Bình và cộng sự. 2011 b. Kết quả nghiên cứu sử dụng chế phẩm enzyme invertase vào
trong quá trình lên men hạt cacao để nâng cao chất lượng của hạt. Trung tâm Tin học và Thông tin
KH&CN Đắk Lak. Bản tin thông tin KH&CN, số 01, trang 1-6.
5. Nguyễn Đức Lượng. Thực hành công nghệ vinh vật 2. Trường đại học bách khoa thành phố HCM.
1996.
6. Ngô Thị Hồng Thư. 1996. Kiểm nghiệm thực phẩm bằng phương pháp cảm quan. Nhà xuất bản
KHKT Hà Nội.

7. Vương Thanh Tùng, Hà Thanh Toàn. 2006. Khảo sát ảnh hưởng của quá trình ủ lên men đến chất
lượng hạt cacao. Tạp chí Nghiên cứu Khoa học Trường Đại học Cần Thơ 5: 149-1572.
8. Lên men, sấy và đánh giá chất lượng hạt cacao Việt Nam. 2008. Chương trình Hợp tác Nông nghiệp
và Phát triển Nông thôn – CARD013/VIE05.
9. Trần Xuân Ngạch, Lê Thị Liên Thanh. 2002. Nghiên cứu phân lập và định tên một số loài nấm men
trong quá trình lên men hạt cacao Quảng Ngãi. Trường Đại học Kỹ thuật, Đại học Đà Nẵng.
Trần Xuân Ngạch, Lê Thị Liên Thanh, Nguyễn Thị Hoài Trâm. 2006. Một số nòi nấm men trong quá
trình lên men hạt cacao. Tạp chí Khoa học và Công nghệ, 59-64.
10. Trần Linh Thước. 2005. Phương pháp phân tích vi sinh vật trong nước, thực phẩm và mỹ phẩm. Nhà
xuất bản Giáo Dục.
11. Huỳnh Thị Minh Tuyết, Nguyễn Hoài Xuân Phương, Đàm Sao M. 2011. Nghiên cứu sử dụng
Sacxharosemyces và Acetobater Aceti trong lên men hạt cacao. Tạp chí Đại học Công nghiệp số 2
(3)/201.
12. Hoàng Văn Tiến và Nguyễn Đức Lượng. 2005. Bước đầu nghiên cứu sản xuất bột cacao bằng
phương pháp lên men có bổ sung vi sinh vật. Trường Đại học Nông Lâm tp. Hồ Chí Minh.
13. />17

Nội dung nghiên cứu khoa học và triển khai thực nghiệm của Đề tài và phương án thực hiện

(Liệt kê và mô tả chi tiết những nội dung nghiên cứu khoa học và triển khai thực nghiệm phù hợp cần
thực hiện để giải quyết vấn đề đặt ra kèm theo các nhu cầu về nhân lực, tài chính và nguyên vật liệu
trong đó chỉ rõ những nội dung mới , những nội dung kế thừa kết quả nghiên cứu của các đề tài trước đó
Nội dung 1: Tìm hiểu điều kiện thời tiết, độ ổn định nguyên liệu
Điều kiện khí hậu, thời tiết ảnh hưởng rất lớn đến điều kiện trồng và lên men cacao. Đánh giá đúng nhiệt
độ trung bình ở các thời điểm thu hoạch và lên men cacao tại Đồng Nai sẽ là cơ sở cho việc bố trí các thí
nghiệm liên quan. Việc thống kê các giống và chất lượng cacao đang trồng đại trà, tìm hiểu độ ổn định
nguyên liệu cacao Đồng Nai sẽ giúp có cái nhìn chính xác về nồng độ các chất dinh dưỡng chính của
nguồn nguyên liệu và đưa ra định hướng xử lý nguyên liệu trước khi lên men.

10



Nội dung 1 được thực hiện gồm 2 chuyên đề:
+ Chuyên đề 1: Tìm hiểu điều kiện khí hậu, thời tiết ở các vùng trồng cacao Đồng Nai.
+ Chuyên đề 2: Khảo sát giống và chất lượng trái cacao được trồng chính ở khu vực Đồng Nai.
Nội dung 2: Sàng lọc hệ vi sinh thích hợp lên men hạt cacao Đồng Nai
Hệ vi sinh vật tham gia trong quá trình lên men rất đa dạng về chủng, loài tùy theo điều kiện địa lý,
khí hậu thời tiết của từng vùng trong cùng một quốc gia hay giữa các quốc gia với nhau. Chính vì thế, để
đảm bảo quá trình lên men đạt chất lượng tốt, ổn định thì việc nghiên cứu, đánh giá hệ vi sinh vật (các
chủng, loại vi sinh vật) cũng như diễn biến (hiện diện và mật số trong giai đoạn nào của quá trình lên
men v.v.) cụ thể tại trên từng mẫu cacao thu thập tại từng địa phương là rất quan trọng và cần thiết. Trên
cơ sở đó, tuyển chọn được những vi sinh vật (nấm men và vi khuẩn) phù hợp cho quá trình lên men.
Nội dung 2 được thực hiện gồm 9 chuyên đề:
+ Chuyên đề 3: Phân lập, định danh và tuyển chọn các chủng nấm men.
+ Chuyên đề 4: Đánh giá sự đa dạng và diễn biến của các chủng nấm men qua các giai đoạn
trong quá trình lên men cacao.
+ Chuyên đề 5: Đánh giá sự biến đổi vật lý, hóa học của khối hạt cacao trong quá trình lên men
với chủng nấm men tuyển chọn.
+ Chuyên đề 6: Phân lập, định danh và tuyển chọn các chủng vi khuẩn lactic. Đặc biệt là các
chủng lactic có khả năng sinh hương.
+ Chuyên đề 7: Đánh giá sự đa dạng và diễn biến của các chủng vi khuẩn lactic qua các giai
đoạn trong quá trình lên men cacao.
+ Chuyên đề 8: Đánh giá sự biến đổi vật lý, hóa học của khối hạt cacao trong quá trình lên men
với chủng lactic tuyển chọn.
+ Chuyên đề 9: Phân lập, định danh và tuyển chọn các chủng vi khuẩn axêtic.
+ Chuyên đề 10: Đánh giá sự đa dạng và diễn biến của các chủng vi khuẩn axêtic qua các giai
đoạn trong quá trình lên men cacao.
+ Chuyên đề 11: Đánh giá sự biến đổi vật lý, hóa học của khối hạt cacao trong quá trình lên men
với chủng acetic tuyển chọn.
Nội dung 3: Nghiên cứu sản xuất chế phẩm vi sinh khởi động (starter cultures)

Dựa trên kết quả của những thí nghiệm ở nội dung 2, chúng tôi thực hiện nhân sinh khối để sản xuất
chế phẩm vi sinh (gồm các chủng nấm men và vi khuẩn) ở dạng lỏng (dùng dịch ép màng nhầy hạt cacao
làm cơ chất) và dạng bột (sấy phun/sấy khay) để bổ sung vào quá trình lên men nhằm nâng cao chất
lượng, sự đồng đều và ổn định của hạt cacao lên men.

11


Nội dung 3 thực hiện gồm 8 chuyên đề:
+ Chuyên đề 12: Xây dựng quy trình sản xuất chế phẩm nấm men sử dụng dịch ép màng nhầy
cacao.
+ Chuyên đề 13: Xây dựng quy trình sản xuất chế phẩm vi khuẩn lactic sử dụng dịch ép màng nhầy
cacao.
+ Chuyên đề 14: Xây dựng quy trình sản xuất chế phẩm vi khuẩn acetic sử dụng dịch ép màng
nhầy cacao.
+ Chuyên đề 15: Xây dựng quy trình phối chế chế phẩm vi sinh sử dụng dịch ép màng nhầy cacao.
+ Chuyên đề 16: Xây dựng quy trình sản xuất chế phẩm nấm men cacao sấy khô.
+ Chuyên đề 17: Xây dựng quy trình sản xuất chế phẩm vi khuẩn lactic cacao sấy khô.
+ Chuyên đề 18: Xây dựng quy trình sản xuất chế phẩm vi khuẩn acetic cacao sấy khô.
+ Chuyên đề 19: Xây dựng quy trình phối chế chế phẩm vi sinh cacao sấy khô.
Nội dung 4: Đánh giá việc bổ sung các chủng vi sinh vật (chế phẩm vi sinh khởi động/starter
cultures) trong quá trình lên men cacao.
Việc bổ sung vi sinh vật khởi động trong quá trình lên men cacao đã được đề xuất như một giải
pháp giúp kiểm soát sự ổn định của quá trình lên men và nâng cao chất lượng cacao lên men. Nghiên cứu
đánh giá ảnh hưởng của các hỗn hợp chủng loại nấm men và vi khuẩn đến thành phần lý, hóa học cũng
như chất lượng và mùi vị cacao nhằm chọn được chủng loại nấm men và vi khuẩn cho hiệu quả lên men
tốt nhất là rất cần thiết. Nghiên cứu đánh giá việc sử dụng thùng inox thay thế thùng gỗ để ổn định đảm
bảo chất lượng vi sinh. Đồng thời xác định chế độ sấy thích hợp đối với hạt cacao được lên men bằng
phương pháp bổ sung các chủng vi sinh vật.
Nội dung 4 được thực hiện gồm 6 chuyên đề, thực hiện ở quy mô phòng thí nghiệm:

+ Chuyên đề 20: Đánh giá ảnh hưởng của việc bổ sung các chủng vi sinh (starter culrures) lên hệ
sinh thái vi sinh vật, thành phần hóa học, chất lượng và mùi vị cacao sau lên men sử dụng thùng gỗ
truyền thống.
+ Chuyên đề 21: Sử dụng bồn inox thay thế bồn gỗ.
+ Chuyên đề 22: Đánh giá ảnh hưởng của việc bổ sung các chủng vi sinh (starter culrures) lên hệ
sinh thái vi sinh vật, thành phần hóa học, chất lượng và mùi vị cacao sau lên men sử dụng thùng inox.
+ Chuyên đề 23: Khảo sát chế độ phơi nắng phù hợp với hạt cacao được lên men theo phương
pháp có bổ sung vi sinh (starter culrures).
+ Chuyên đề 24: Khảo sát chế độ sấy phù hợp với hạt cacao được lên men theo phương pháp có
bổ sung vi sinh (starter culrures).
+ Chuyên đề 25: Đánh giá chất lượng hạt, chọn nghiệm thức tối ưu, xây dựng quy trình lên men
và làm khô hạt cacao hoàn chỉnh.

12


Nội dung 5: Tổ chức chuyển giao quy trình kỹ thuật lên men định hướng cacao Đồng Nai
Mục đích: Thử nghiệm sản xuất ở quy mô pilot tại địa phương thuộc Đồng Nai đồng thời tổ chức lớp
huấn luyện để phổ biến kỹ thuật lên men mới định hướng hạt cacao có bổ sung vi sinh vật trong bồn
inox. Lấy mẫu, đánh giá ưu nhược điểm của quy trình và thu thập ý kiến đóng góp của nông dân, cơ sở
lên men v.v. nhằm hoàn thiện quy trình lên men cacao có bổ sung vi sinh khởi động.
Nội dung 5 được thực hiện gồm 1 chuyên đề thực hiện ở quy mô pilot và một đợt tập huấn chuyển
giao kỹ thuật sản xuất:
+ Chuyên đề 26: Đánh giá ảnh hưởng của việc bổ sung các chủng vi sinh (starter culrures) lên hệ
sinh thái vi sinh vật, thành phần hóa học, chất lượng và mùi vị ca cao sau lên men trong bồn inox quy mô
pilot.
+ Tập huấn chuyển giao kỹ thuật sản xuất hạt cacao lên men trong bồn inox có sử dụng chế phẩm
vi sinh.
Nội dung 6: Tuyển chọn các chủng nấm men thích hợp lên men rượu từ phụ phẩm dịch cơm nhầy
hạt cacao Đồng Nai

Phụ phẩm dịch quả cơm nhầy hạt cacao thu được bằng phương pháp trích ép bớt nhằm tạo điều kiện lên
men thích hợp. Dịch quả hạt này có đầy đủ chất dinh dưỡng cần thiết để lên men sản xuất rượu vang
cacao hoặc nước cacao lên men đặc trưng. Tuyển chọn và đánh giá khả năng lên men rượu cacao của các
chủng nấm men phân lập trong tự nhiên và thương mại.
Nội dung 6 được thực hiện gồm 2 chuyên đề:
+ Chuyên đề 27: Tuyển chọn và đánh giá khả năng lên men của các chủng nấm men từ dịch
cơm nhầy để chế biến rượu. Đánh giá và so sánh khả năng lên men rượu cacao của các chủng phân lập
và giống thương mại trong những điều kiện lên men cụ thể.
+ Chuyên đề 28: Đánh giá sự biến đổi vật lý, hóa học dịch quả hạt trong quá trình lên men với
chủng nấm men tuyển chọn.
Nội dung 7: Tối ưu hóa qui trình chế biến rượu và nước cacao lên men từ dịch cơm nhầy hạt cacao
Đồng Nai
Mục đích nhằm xác định lượng thịt quả cần tách và kỹ thuật trích ép thích hợp đối với dịch cơm nhầy
dùng làm cơ chất lên men rượu, xác định ảnh hưởng của điều kiện lên men đến chất lượng rượu cacao
như tỷ lệ men giống, hàm lượng chất rắn hòa tan và pH của dịch cơm nhầy thích hợp trong quá trình lên
men chính, xác định ảnh hưởng của phương pháp và nhiệt độ môi trường trong quá trình lên men phụ.
Các nội dung nghiên cứu ở quy mô phòng thí nghiệm.
Nội dung 7 được thực hiện gồm 6 chuyên đề:
+ Chuyên đề 29: Khảo sát kỹ thuật tách ép và xử lý sơ bộ dịch cơm nhầy của hạt cacao tươi
dùng làm cơ chất lên men rượu (phối hợp với nội dung 2 và nội dung 3).
+ Chuyên đề 30: Tối ưu hóa các thông số kỹ thuật chính (tỷ lệ nấm men, hàm lượng chất rắn
hòa tan và pH của dịch lên men) ảnh hưởng đến quá trình lên men rượu cacao.
+ Chuyên đề 31: Khảo sát ảnh hưởng của kỹ thuật làm trong, ổn định rượu và nhiệt độ môi
trường trong quá trình lên men phụ.
+ Chuyên đề 32: Khảo sát ảnh hưởng của kỹ thuật làm trong, ổn định rượu và nhiệt độ môi
trường trong quá trình lên men phụ.
+ Chuyên đề 33: Xây dựng quy trình hoàn chỉnh chế biến rượu vang cacao.
+ Chuyên đề 34: Xây dựng quy trình hoàn chỉnh chế biến nước cacao lên men.

13



Nội dung 8: Tổ chức chuyển giao quy trình kỹ thuật chế biến rượu cacao và nước cacao lên men
tại Đồng Nai
Mục đích: Thử nghiệm sản xuất ở quy mô pilot (50L) đồng tổ chức lớp huấn luyện để phổ biến kỹ thuật
sản xuất rượu vang và nước cacao lên men. Thu thập ý kiến đóng góp của nông dân, cơ sở lên men v.v.
nhằm hoàn thiện quy trình sản xuất.
Nội dung 8 được thực hiện gồm 2 chuyên đề và một đợt tập huấn chuyển giao kỹ thuật sản xuất:
+ Chuyên đề 35: Sản xuất thử nghiệm rượu vang cacao qui mô pilot (từ nguồn dịch ép của
100kg hạt/mẻ).
+ Chuyên đề 36: Sản xuất thử nghiệm nước cacao lên men qui mô pilot (từ nguồn dịch ép của
100kg hạt/mẻ).
+ Tập huấn chuyển giao qui trình kỹ thuật sản xuất rượu vang cacao và nước cacao lên men từ
dịch cơm nhầy hạt tươi cho đơn vị chức năng ở Đồng Nai.
18 Cách tiếp cận, phương pháp nghiên cứu, kỹ thuật sử dụng
(Luận cứ rõ cách tiếp cận vấn đề nghiên cứu, thiết kế nghiên cứu, phương pháp nghiên cứu, kỹ thuật sẽ
sử dụng gắn với từng nội dung chính của đề tài; so sánh với các phương pháp giải quyết tương tự khác
và phân tích để làm rõ được tính mới, tính độc đáo, tính sáng tạo của đề tài)
Cách tiếp cận
- Dựa vào nguồn tài liệu phong phú trên các website chuyên ngành về vi sinh, công nghệ lên men,
sinh học phân tử để tham khảo và định hướng cho nghiên cứu.
- Dựa vào góp ý từ các chuyên gia trong lĩnh vực nghiên cứu về cây cacao, lên men cacao để chọn các
địa điểm thu thập mẫu hạt cũng như phương pháp ủ lên men cacao.
- Tra cứu, sưu tầm những tài liệu, bài báo khoa học, công trình nghiên cứu trong và ngoài nước có liên
quan đến lĩnh vực nghiên cứu của đề tài về cây cacao, đặc biệt là lên men cacao và đánh giá chất lượng
hạt cacao.
- Dựa vào trang thiết bị hiện có tại Khoa Công nghệ Thực phẩm nói riêng và của Trường Đại học
Nông Lâm nói chung như máy PCR, RealTime PCR, máy giải trình tự, máy sắc ký lỏng cao áp, sắc ký
khí và các thiết bị, máy móc, dụng cụ tại phòng thí nghiệm vi sinh, sinh hóa, kỹ thuật thực phẩm để lựa
chọn các phương pháp nghiên cứu và kỹ thuật sử dụng chuẩn, hợp lý.

- Nghiên cứu này sẽ được kế thừa các kết quả của những nghiên cứu trước đây của chủ nhiệm đề tài
và các thành viên tham gia đề tài như nghiên cứu một số chủng nấm men trong quá trình lên men hạt
cacao hay những nghiên cứu lên men thực phẩm và nước giải khát v.v.
- Dựa vào những nguyên tắc chung trong việc xây dựng quy trình phân lập, tuyển chọn, định danh
bằng sinh hóa và sinh học phân tử các chủng nấm men, vi khuẩn.
Phương pháp nghiên cứu, kỹ thuật sử dụng:
Đề tài được tiến hành với sự tham gia nghiên cứu của đầy đủ 6 bộ môn thuộc Khoa Công nghệ Thực
phẩm – Trường Đại học Nông Lâm Tp.HCM, chưa kể các đơn vị phối hợp khác.
Nhằm đáp ứng những mục của đề tài được cụ thể hóa thành từng nội dung nghiên cứu được đề cập bên
trên, các phương pháp nghiên cứu và kỹ thuật sử dụng trong đề tài được cụ thể hóa như sau:
Về nội dung 1: Tìm hiểu điều kiện thời tiết, độ ổn định nguyên liệu
Thu thập số liệu thông qua các báo cáo về điều kiện khí hậu, thời tiết và các giống cacao đang trồng ở
Đồng Nai…
Thu thập mẫu và đánh giá độ ổng định thông qua lượng đường và độ acid trung bình của các mẫu cacao
trồng đại trà ở Đồng Nai.
14


Về nội dung 2: Sàng lọc hệ vi sinh thích hợp lên men hạt cacao Đồng Nai
Để đánh giá một cách đầy đủ và chính xác hệ vi sinh vật tham gia trong quá trình lên men cũng như
biến đổi về vật lý, hóa học của hạt cacao lên men tại Đồng Nai, đề tài sử dụng các phương pháp nghiên
cứu như sau:
Thực hiện thu thập mẫu cacao trồng đại trà ở Đồng Nai và đang được lên men theo quy trình truyền
thống cho chất lượng đạt chuẩn thu mua của công ty Cargil. Trái cacao chín sau khi thu hoạch ngoài
vườn, tồn trữ 7-9 ngày trước khi lên men (Nguyễn Văn Thành, 2006). Hạt cacao sử dụng trong nghiên
cứu được tách ra từ những trái cacao chín không bị hư hỏng, nhiễm nấm mốc và sâu bệnh. Không dùng
dụng cụ sắt nên dùng dụng cụ đã cùn để đập trái, tách hạt nhằm tránh làm tổn thương hạt. Loại bỏ hạt có
màu đen, hạt đã có rễ và hạt lép.
Phân tích vi sinh vật và sự biến đổi vật lý, hóa học trong quá trình lên men:
- Mẫu được lấy để phân tích vi sinh và thành phần lý, hóa học ngay từ thời điểm bắt đầu quá trình lên

men (0 giờ).
- Định kỳ lấy mẫu từ đống ủ lên men để phân tích là 24 giờ, thực hiện trong suốt quá trình lên men.
Khối lượng mẫu lấy là 1 kg hạt cacao.
- Mẫu phân tích là mẫu đồng nhất sau cùng của 5 mẫu lấy tại 5 vị trị khác nhau trong thùng ủ nhằm
đảm bảo tính đại diện của mẫu. Một phần (250 g) của mẫu sử dụng để phân tích vi sinh ngay lập tức và
phần còn lại (750 g) giữ mẫu đông lạnh (-20 °C) sử dụng trong phân tích các chỉ tiêu lý, hóa học.
Phân tích các tính chất vật lý của hạt cacao:
+ Xác định độ pH: pH của lớp cơm nhày và phần nhân hạt được xác định theo phương pháp của
Ardhana và cs (2003):
- Lớp cơm nhầy và nhân hạt được tách ra từ 30 hạt cacao.
- Sử dụng máy xay đa năng để xay nhuyễn lớp cơm nhầy cũng như nhân hạt (phôi nhũ). Lượng
nước cất bổ sung vào với tỉ lệ 1:1 theo trọng lượng.
- Hiệu chuẩn đầu dò máy đo pH trước khi đo: sử dụng bộ đệm chuẩn pH 4.0 và 7.0
- Tiến hành đo pH của dịch cơm nhầy và nhân hạt.
+ Xác định trọng lượng của lớp vỏ nhầy và nhân hạt
Phương pháp thực hiện như sau: cân 50 g hạt cacao lên, sau đó tách vỏ nhầy và cân xác định
trọng lượng nhầy và nhân hạt, vỏ trấu cũng được xem như một phần của vỏ nhầy.
+ Ẩm độ của hạt, vỏ nhầy và nhân hạt
Ẩm độ của hạt, vỏ nhầy và nhân hạt được xác định theo phương pháp chuẩn (AOAC -1997).
Phân tích các tính chất hóa học của hạt cacao:
Sử dụng các phương pháp phân tích đã được công nhận và áp dụng rộng rãi ở Việt Nam cũng như
trên Thế giới như AOAC, TCVN để xác định hợp chất polyphenol, ethanol bằng phương pháp sắc ký
lỏng cao áp (HPLC), tannin (AOAC &TC 2000), axít axêtic (TCVN 3702: 1981), axít lactic (AOAC
2000-947.05), nấm mốc (TCVN 5166: 1990), vi khuẩn E. coli (TCVN 5155-1990), coliforms (TCVN
4883 – 90).
Phân tích đánh giá cảm quan:
Hạt cacao sau khi lên men phải làm khô bằng phơi hay sấy để độ ẩm từ 60% xuống còn khoảng
6,5%. Để đánh giá ảnh hưởng của quá trình lên men đến chất lượng hạt cacao lên men, sẽ thực hiện đánh
giá cảm quan hạt cacao sau phơi hoặc sấy khô bằng một số phương pháp như sau:
- Cắt hạt (cut test) (Wood và Lass, 1985; Senenayake và cs)

- Hàm lượng vỏ (%, shell content) (Wood và Lass, 1985)
- Các chỉ tiêu: vị đắng, chát, mùi hương; sử dụng phương pháp sai biệt (mô tả, nhận biết các giá
15


trị cảm quan) trong đánh giá cảm quan (Ngô Thị Hồng Thư, 1996).
Phân tích vi sinh vật:
Phân lập và đếm mật số vi sinh vật tham gia trong quá trình lên men cacao
- Cân 250g hạt cacao (bao gồm cả phần cơm nhầy) cho vào bịch nylon vô trùng, sau đó tiếp tục cho
vào 250ml dung dịch đệm peptone vô trùng (0,1%). Lắc và trộn đều mẫu trong 5 phút để tạo thành một
đồng chất đồng nhất.
- Sử dụng micropipette hút 5 ml dịch đồng nhất ở bước trên cho vào bình tam giác có chứa 45ml
dung dịch peptone 0,1% vô trùng (pha loãng ở nồng độ 10-1).
- Tiếp tục hút 1ml dung dịch pha loãng trên (10-1) cho vào ống nghiệm chứa 9ml dung dịch pepton
0,1% vô trùng, lắc đều dung dịch (được nồng độ 10-2). Thực hiện pha loãng tương tự đến nồng độ mong
muốn (10-6).
- Hút 0,1ml dịch ở mỗi nồng độ pha loãng khác nhau (từ 10-3 – 10-6) cho vào đĩa thạch môi trường.
Dùng que gạt thủy tinh trải đều mặt thạch đến khi khô. Thực hiện ở 4 nồng độ pha loãng liên tiếp, mỗi
nồng độ pha loãng lặp lại 3 lần (tương ứng 3 đĩa petri).
- Nấm men và những loại nấm khác được phân lập và đếm mật số trên môi trường đặc hiệu: môi
trường Malt Agar Extract có chứa kháng sinh oxytetracycline 100 ppm nhằm kiểm soát vi khuẩn phát
triển và trên môi trường thạch Dichloran Rose Bengal Chloramphenicol. Đặt đĩa petri đã cấy mẫu trong
tủ ủ ở nhiệt độ 25°C trong 4-5 ngày.
- Vi khuẩn tổng số được phân lập và đếm mật số trên môi trường thạch Plate Count agar có bổ sung
kháng sinh cycloheximide với nồng độ 100 ppm để ngăn chặn sự phát triển của nấm men và các nấm
khác. Đặt đĩa petri đã cấy mẫu trong tủ ủ ở nhiệt độ 35°C trong 3-4 ngày.
- Vi khuẩn axêtic được phân lập và đếm mật số trên môi trường thạch Nutrient agar có bổ sung
kháng sinh cycloheximide với nồng độ 100 ppm (Pallmann và cs, 2001). Đặt đĩa petri đã cấy mẫu trong
tủ ủ ở nhiệt độ 30°C trong 4-5 ngày.
- Vi khuẩn lactic được được phân lập và đếm mật số trên môi trường thạch MRS chứa kháng sinh

cycloheximide nồng độ 100 ppm. Đặt đĩa petri đã cấy mẫu trong tủ ủ ở nhiệt độ 35°C trong 3-4 ngày
trong điều kiện kỵ khí, có thể sử dụng phương pháp đặt mẫu trong một hộp kín, trong hộp có để 1 ngọn
đèn cầy đang cháy).
Các đĩa môi trường cấy mẫu được đặt trong những điều kiện thích hợp đặc hiệu cho đến khi xuất
hiện khuẩn lạc, tiến hành:
Thực hiện quan sát hình thái khuẩn lạc và tế bào, tiến hành nhuộm gram và một số phản ứng sinh hóa
đặc trưng cho từng loại vi sinh vật.
Đối với nấm men thực hiện một số thử nghiệm xác định hoạt tính catalase, oxidase, pectinase, khả
năng lên men đường
Đối với vi khuẩn khảo sát khả năng sinh axít lactic, axít axêtic
Định danh nấm men dựa dựa trên các phản ứng sinh hóa, sử dụng bộ kit API ID 32.
Định danh vi khuẩn dựa dựa trên các phản ứng sinh hóa, sử dụng bộ kit API 50 CH .
Định danh nấm men bằng kỹ thuật sinh học phân tử: Để định danh chính xác đến loài các chủng vi
sinh phân lập thì bên cạnh thực hiện các quan sát về hình thái khuẩn lạc, hình thái tế bào, nhuộm Gram
và đinh danh dựa trên các phản ứng sinh hóa (sử dụng kit API ID 32) nên tiến hành phân tích trình tự
vùng D1/D2 của 26S rDNA.
- Ly trích DNA
+ Ly trích DNA nấm men
Quy trình ly trích DNA (theo Cocolin và cs, 2000).
Nấm men được nhân sinh khối trong môi trường Malt Extract Broth, sau 24 giờ tăng sinh, tiến
hành thu nhận sinh khối để thực hiện ly trích DNA. Quy trình ly trích như sau:

16


- Hút 1 ml dung dịch sinh khối nấm men cho vào eppendorf 1,5ml.
- Ly tâm (tốc độ ly tâm 12, 000 rpm/phút, 10 phút, 40C), hút bỏ dịch nổi phía trên.
- Hòa tan sinh khối (thu được sau ly tâm) trong 200μl dung dịch đệm ly trích (1% SDS, 2%
Triton X-100, 100mM; NaCl, 10mM Tris, 1mM EDTA, pH 8,0), tiếp tục thêm vào 200μl hỗn hợp
phenol/chloroform/isoamylalcohol (25:24:1), lắc (vortex) đồng nhất mẫu trong 1 phút.

- Ly tâm (12.000rpm/phút trong 10 phút ở 4°C), hút lấy phần dịch nổi phía trên sang eppendorf
mới.
- Cho vào một lượng isopropanol ngang bằng phần dịch nổi đã hút ở bước trên (tính theo thể
tích).
- Ly tâm (12.000rpm/phút trong 10 phút ở 4°C), hút bỏ phần dịch nổi phía trên
Rửa kết tủa bằng ethnol 70% (500l) hai lần và sau đó ly tâm (12.000rpm/phút trong 2 phút ở
4°C), hút bỏ dịch nổi trên, để khô mẫu tự nhiên.
- Hoà tan DNA kết tủa trong 50l dung dịch đệm TE (10mM Tris, 1mM EDTA, pH 8,0) chứa
RNAse (1l RNAse nồng độ 20mg/ml trong 1ml dung dịch TE).
- Giữ mẫu DNA ở -200C.
+ Ly trích DNA vi khuẩn
Thực hiện theo quy trích DNA của Lopez và cs, 2003. Các bước thực hiện tương tự như quy trình
ly trích nấm men (Cocolin và cs, 2000) chỉ khác ở môi trường nhân sinh khối vi khuẩn là MRS Broth
thay vì Malt Extract Broth (môi trường nhân sinh khối nấm men).
- Thực hiện phản ứng PCR
* Đối với DNA nấm men
Sử dụng cặp mồi chung (universal) NL1 và NL4 (Kurtzman và Robnett, 1998) để khuếch đại một phần
đoạn gen 26S rDNA .
NL1: 5'-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3 '
NL4: 5'-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3'
Tổng thể tích mỗi phản ứng 50μl: dung dịch đệm PCR (PCR buffer); 0,2 mM mỗi mồi; 200μM
của mỗi dNTP 1,5 mM MgCl2; 1,25 U Taq ADN polymerase và 10ng DNA khuôn mẫu, nước (nuclease
free water).
Chương trình nhiệt của phản ứng PCR gồm 1 chu kỳ ở 950C trong 7 phút; thực hiện 36 chu kỳ
950C trong 1 phút, 520C trong 2 phút và 720C trong 2 phút; 1 chu kỳ ở 720C trong 10 phút. Điện di sản
phẩm PCR trên gel agarose 1 % với dung dịch đệm TBE 0,5 X, hiệu điện thế 100 V, cường độ dòng điện
400mA trong 20 phút, nhuộm ethidium bromide (1%) trong khoảng 15 phút, rửa sạch và chụp gel bằng
tia tử ngoại (UV).
* Đối với DNA vi khuẩn
Sử dụng cặp mồi chung (universal) 986 và 1401 khuếch đại một phần gen vùng Internal

Transcribed Space rDNA (16S), Bae và cs (2004).
5'-AACGCGAAGAACCTTAC-3 '
5'-CGGTGTGTACAAGACCC-3'
Phản ứng PCR thực hiện trên mẫu DNA vi khuẩn cũng tương tự về thành phần hóa chất, chỉ khác
biệt ở cặp mồi (primer) và chu trình nhiệt: 1 chu kỳ ở 94°C 7 phút; thực hiện 30 chu kỳ 94°C trong 30
giây, 50°C trong 30 giây, 72°C trong 2 phút; 1 chu kỳ ở 720C trong 10 phút. Điện di sản phẩm PCR trên
gel agarose 1% với dung dịch đệm TBE 0,5 X, hiệu điện thế 100 V, cường độ dòng điện 400mA trong
20 phút, nhuộm ethidium bromide (1%) trong khoảng 15 phút, rửa sạch và chụp gel bằng tia tử ngoại
(UV).

17


Tuyển chọn các chủng nấm men và vi khuẩn an toàn, thích hợp cho lên men cacao:
Mục đích: tuyển chọn các vi sinh vật có ảnh hưởng tích cực đến quá trình lên men cacao, trên cơ sở
xác định một số đặc tính như: có hoạt tính phân hủy pectin, tannin, lên men đường tạo ethanol, axít
lactic, axít axêtic, tạo hương vị.
Phương pháp thực hiện:
Sử dụng môi trường chuyên biệt để nuôi cấy nấm men, vi khuẩn axít lactic, vi khuẩn axít axêtic
Dựa trên các thử nghiệm chuyên biệt để tuyển chọn các vi sinh vật tham gia trong quá trình lên men
cacao.
+ Nấm men: đánh giá khả năng lên men ethanol, hoạt tính phân hủy pectin, tannin
- Đánh giá khả năng lên men ethanol: Các dòng nấm men phân lập được kiểm tra khả năng lên men
đường (glucose, sucrose và sacharose) dựa trên lượng khí CO2 sinh ra trong quá trình lên men rượu. Sau
24 giờ phát triển sinh khối trong môi trường PGY ở 300C, 1ml dung dịch nấm men được chủng vào chai
Durham chứa 9ml dung dịch glucose 2% (đã được khử trùng ở 1150C trong 10 phút), lắc đều cho dịch
đường tràn đầy vào ống thủy tinh úp ngược nằm bên trong chai Durham, ủ ở 300C. Chiều cao cột khí
CO2 sinh ra trong ống thuỷ tinh úp ngược được ghi nhận tại các thời điểm 6, 12 và 14 giờ.
- Đánh giá khả năng phân hủy pectin và tannin: dựa vào phương pháp cấy điểm trên môi trường chứa
cơ chất enzyme (pectin, tannin), đánh giá kết quả dựa vào đường vòng thủy phân, vòng thủy phân có

đường kính càng lớn chứng tỏ chủng nấm men có khả năng phân hủy pectin, tannin càng cao.
+ Vi khuẩn axít lactic: đánh giá khả năng lên men tạo axít lactic
Trong đó chú trọng vào các nhóm vi sinh vật tạo hương được tham khảo từ các nghiên cứu thành công ở
các nước Ghana, Bỉ và New South Wales.
Định tính axít lactic
Định tính axít lactic bằng các KIT sinh hóa
Định lượng axít lactic: dựa trên phản ứng trung hòa acid có trong mẫu bằng dung dịch kiềm NaOH
0,1 N với chất chỉ thị là phenolphtalein. Từ lượng NaOH trung hòa trên, ta tính được lượng axít tổng số
có trong mẫu.
- Phương pháp tiến hành
Chuẩn bị dịch tăng sinh: Cấy vi khuẩn vào bình tam giác chứa 100 ml môi trường MRS, ủ ở nhiệt độ
phòng (28 - 30oC) trong 24 giờ.
Lấy 100 ml nước cất (đã tách khí bằng cách đun sôi, làm nguội) cho vào bình tam giác 250 ml, và cho
1 ml dung dịch chỉ thị phenolphtalein. Đặt bình tam giác lên máy khuấy từ và khuấy đều.
Đặt nhẹ đầu cực đo của máy pH vào dung dịch (tránh va chạm với cánh khuấy từ) và dùng dung dịch
NaOH 0,1N chuẩn tới pH=8,2 (có xuất hiện màu hồng nhạt bền trong khoảng 1 phút.
Cho 5 ml dịch lên men vi khuẩn (đã lắc đều trong khoảng 5 phút để loại bỏ CO2) vào bình và tiếp tục
chuẩn bằng dung dịch NaOH 0,1 N cho đến khi đạt pH=8,2 (có màu hồng nhạt bền trong khoảng 1 phút).
Định lượng axít mỗi ngày một lấn, thực hiện trong 5 ngày liên tiếp.
+ Vi khuẩn axít axêtic: đánh giá khả năng lên men tạo axít axêtic
Định tính axít axêtic tạo thành
Nuôi các chủng khảo sát trên môi trường lên men định tính (ethanol, glucose; pH= 4,5) ở nhiệt độ
phòng trong 4 ngày. Cho vào ống nghiệm 3ml dung dịch lên men và 1ml dung dịch NaOH 20%, nhỏ vào
ống nghiệm vài giọt dung dịch FeCl3 5%. Lắc đều ống nghiệm và đun nóng trên ngọn đèn cồn. Nếu
dung dịch có axít axêtic thì sẽ có màu đỏ thẫm do sắt acetate tạo thành. Đối chứng dương là ống dựng
axít acetic, đối chứng âm là môi trường không nuôi cấy vi khuẩn.
Định lượng axít axêtic tạo thành theo phương pháp xác định axít tổng
Nuôi cấy các chủng khảo sát trên môi trường dùng định lượng axít axêtic (ethanol, glucose, nước cất,
pH=4,5) sinh ra trong 15 ngày.
Xác định hàm lượng axít tổng trong các mẫu giấm thu được bằng phương pháp chuẩn độ dùng NaOH 0,1

N với phenolphthalein 1% mL chỉ thị màu.
18


Kết quả: tuyển chọn được các dòng vi sinh vật có đặc tính tốt có thể ứng dụng để cải tiến quá trình lên
men cacao đạt chất lượng cao.
Về nội dung 3: Nghiên cứu sản xuất chế phẩm vi sinh khởi động (starter cultures)
Xây dựng quy trình sản xuất chế phẩm nấm men
Xác định điều kiện nhân giống thích hợp cho từng chủng nấm men với các nhân tố: môi trường nhân
sinh khối, pH, nhiệt độ, thời gian và tốc độ lắc (Gra và cs, 2002).
Xác định thành phần và chất phụ gia (chất mang và prebiotic), lượng dịch ép màng nhầy cacao sử
dụng.
Định lượng nấm men trong chế phẩm: xác định theo phương pháp đếm khuẩn lạc trên môi trường
đặc trưng.
Tạo chế phẩm nấm men ở dạng dung dịch và dạng sấy khô (sấy phun/sấy khay)
Xây dựng quy trình sản xuất chế phẩm vi khuẩn lactic
Xác định điều kiện nhân giống thích hợp cho từng chủng vi khuẩn bằng phương pháp tối ưu hóa các
nhân tố: môi trường nhân sinh khối, pH, nhiệt độ và thời gian.
Xác định thành phần và chất phụ gia (chất mang và prebiotic).
Định lượng vi khuẩn trong chế phẩm: xác định theo phương pháp đếm khuẩn lạc trên môi trường
đặc trưng.
Tạo chế phẩm vi khuẩn ở dạng dung dịch và dạng sấy khô (sấy phun/sấy khay)
Xây dựng quy trình sản xuất chế phẩm vi khuẩn acetic
Thực hiện tương tự như xây dựng quy trình sản xuất chế phẩm vi khuẩn lactic.
Xây dựng tiêu chuẩn của chế phẩm vi sinh vật khởi động
- Mật độ của các chủng nấm men và vi khuẩn trong chế phẩm đạt ≥ 104 Cfu/g
- Ẩm độ: 13-14%
Đánh giá chất lượng chế phẩm sau sản xuất và thời hạn sử dụng
- Kiểm tra mật độ nấm men và vi khuẩn có trong sản phẩm theo định kỳ 30 ngày/lần.
- Kiểm tra chất lượng vệ sinh an toàn của sản phẩm bằng kiểm tra mức độ nhiễm vi khuẩn lạ và nấm

mốc bằng phương pháp nuôi cấy trên môi trường chọn lọc.
Trên cơ sở kiểm tra chất lượng sản phẩm từ đó xác định được thời hạn sử dụng tối đa của chế phẩm.
Các chủng nấm men và vi khuẩn đã được tuyển chọn (ở nội dung 1) được nhân sinh khối trên môi
trường đã được tối ưu từ các thí nghiệm (mục a, b, c, d) để sản xuất chế phẩm vi sinh khởi động (starter
cultures) có chất lượng ổn định cho lên men (mật độ vi sinh ≥ 104 Cfu/g, không tạp nhiễm).
Về nội dung 4: Đánh giá việc bổ sung các chủng vi sinh vật (chế phẩm vi sinh khởi động/starter
cultures) trong quá trình lên men cacao
Tiến hành thí nghiệm lên men cacao có bổ sung vi sinh ở quy mô phòng thí nghiệm. Các phương pháp
nghiên cứu sử dụng như sau:
Lên men quy mô phòng thí nghiệm
+ Chuẩn bị mẫu hạt cacao
Lượng mẫu sử dụng trong thí nghiệm là 5 kg hạt cacao (tương đương 20 kg trái cacao), trái cacao chín
sau khi thu hoạch ở vườn, tồn trữ 5 ngày trước khi đập, tách hạt.
+ Nghiên cứu sự ảnh hưởng của phương pháp tiền xử lý khi lên men đến chất lượng hạt cacao. Đánh giá

19


ảnh hưởng của thành phần dinh dưỡng trong lớp cơm nhầy đến chất lượng hạt cacao lên men
Ép tách một lượng nước trong cơm nhầy để giảm độ chua của hạt:
- Bố trí thí nghiệm như sau:
+ Thí nghiệm về lượng cơm nhầy bị ép tách: 15, 20 và 25%.
+ Chuẩn bị các chủng vi sinh vật
- Dựa vào kết quả phân lập và tuyển chọn (dựa trên các thử nghiệm đặc tính sinh hóa) các chủng nấm
men, vi khuẩn ở thí nghiệm 1 và tham khảo các nghiên cứu về len men cacao có bổ sung vi sinh (Hugh
Douglas Dircks, 2009; Sanchez và cs, 1985; Buamah và cs, 1997; Schwan, 1998; Dzogbefia và cs,
1999) để tuyển chọn các chủng nấm men và vi khuẩn phù hợp cho thí nghiệm.
+ Bố trí thí nghiệm
- Thí nghiệm có nghiệm thức đối chứng (không bổ sung vi sinh vật/starter cultures) và một số
nghiệm thức có bổ sung nấm men, vi khuẩn với thành phần các chủng phối hợp khác nhau.

- 5 kg hạt cacao/nghiệm thức, mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần.
- Thời gian lên men: 144 giờ, lấy mẫu định kỳ 24 giờ/lần (bắt đầu từ 0 giờ đến 144 giờ).
- Bố trí thí nghiệm như sau:
+ Thí nghiệm về thời điểm bổ sung chế phẩm: 0, 12, 24 và 48 giờ lên men
+ Thí nghiệm về tỉ lệ chế phẩm vi sinh bổ sung: 0,5%, 1%, 1,5% và 2%
+ Thí nghiệm về thời gian lên men: 4, 5, 6 và 7 ngày
- Chỉ tiêu theo dõi: thành phần và mật số nấm men, vi khuẩn; thành phần lý học (pH, ẩm độ của vỏ
nhày, hạt, nhân hạt (phôi nhũ)) và hóa học ( ethanol, tannin, polyphenol, axít lactic, axít axêtic) và một
số chỉ tiêu khác: nấm mốc, vi khuẩn E. coli, coliforms.
- Đánh giá cảm quan sản phẩm hạt cacao sau lên men: màu sắc, vị đắng, chát, mùi hương.
Về nội dung nghiên cứu phương pháp lên men trong thùng inox đến chất lượng hạt cacao
+ Phương pháp ủ thùng ảnh hưởng đến chất lượng hạt cacao
- Khối lượng hạt lên men, kích thước thùng (Dài x Rộng x chiều cao), chiều cao/bề dạy lớp hạt lên
men ảnh hưởng đến chất lượng hạt cacao.
- Kết cấu thùng lên men: cách nhiệt/duy trì nhiệt xung quanh theo yêu cầu để ổn định nhiệt độ lên
men bên trong, sử dụng hệ thống cánh khuấy đảo
Về nội dung nghiên cứu sự ảnh hưởng của phương pháp sấy đến chất lượng hạt cacao
+ Khảo sát phương pháp sấy tự nhiên (phơi dưới ánh nắng mặt trời) và sử dụng máy sấy năng
lượng mặt trời (nhà kiếng sử dụng năng lượng mặt trời) đến chất lượng hạt cacao sau khi được lên men
bằng phương pháp bổ sung vi sinh trong bồn inox.
Lên men quy mô pilot (100 kg hạt/mẻ)
Từ kết quả ở thí nghiệm lên men quy mô phòng thí nghiệm chọn ra nghiệm thức đạt kết quả tốt
nhất để thực hiện lên men quy mô pilot (100 kg hạt/mẻ). Các bước thực hiện tương tự như thí nghiệm 1
từ chuẩn bị nguyên liệu hạt cacao, sử dụng chế phẩm vi sinh (starter cultures), sử dung dụng thùng ủ
inox, bố trí thí nghiệm và các chỉ tiêu đánh giá.
Về nội dung 5: Tổ chức chuyển giao quy trình kỹ thuật lên men định hướng cacao Đồng Nai
Phối hợp tổ chức chuyển giao cho Trung tâm Ứng dụng Công nghệ sinh học Đồng Nai (Địa chỉ: Ấp 2,
xã Xuân Đường, huyện Cẩm Mỹ, tỉnh Đồng Nai) để làm cơ sở chuyển giao cho các hộ nông dân sản xuất
có nhu cầu trên địa bàn tỉnh Đồng Nai.


20


Về nội dung 6: Tuyển chọn các chủng nấm men thích hợp lên men rượu từ phụ phẩm dịch cơm
nhầy hạt cacao Đồng Nai
Thực hiện theo các tiếp cận và phương pháp thí nghiệm đã được mô tả trong phần liên quan đến nội
dung 2.
Bên cạnh đánh giá các chủng nấm men được phân lập từ cacao Đồng Nai sẽ thử nghiệm thêm 1-2 men
giống thương phẩm để sản xuất rượu vang đang được bày bán. Loại men tối ưu sẽ được sử dụng để
nghiên cứu sản xuất rượu vang và nước trái cây lên men cacao.
Về nội dung 7: Tối ưu hóa qui trình chế biến rượu và nước cacao lên men từ dịch cơm nhầy hạt
cacao Đồng Nai
Phương án sản phẩm lên men từ dịch trích ép màng nhầy cacao bao gồm:
 Rượu vang cacao
 Nước trái cây lên men cacao
 Ưu, nhược điểm của sản phẩm:
 Rượu vang cacao: Thời gian lên men dài (tối thiểu 2 tháng). Trong thời gian lên men phụ
cần tiến hành ở nhiệt độ thấp thì sản phẩm sẽ tốt hơn. Độ cồn đạt từ 8– 12%. Thời gian bảo quản
lâu, không cần bảo quản lạnh.
 Nước trái cây lên men cacao: thời gian lên men ngắn (24 – 48 giờ). Sản phẩm có vị ngọt,
độ cồn thấp (3- 5%). Khi uống có cảm giác hơi tê ở lưỡi do vẫn còn CO2 trong quá trình lên men.
Sản phẩm được đóng chai rồi thanh trùng. Nên để lạnh trước khi sử dụng.
Quy trình công nghệ chung để lên men dịch cacao
Công đoạn 1: Xử lý nguyên liệu:
Công đoạn 2: Lên men chính
Bổ sung đường từ 20 – 25 oBx, điều chỉnh pH dịch lên men đạt pH 4,5. Thêm 5% v/v nấm men
Saccharomyces cerevisiae (mật độ tế bào đạt 108 tế bào/ml men giống). Lên men trong bình ở điều
kiện yếm khí 10 ngày. Nhiệt độ lên men chính dao động 30 – 33 oC.
Công đoạn 3: Lên men phụ (để sản xuất rượu vang cacao)
Sau thời gian lên men chính, tiến hành gạn bỏ cặn lần 1. Đây là giai đoạn ổn định sản phẩm. Nhiệt độ

lên men phụ 25 oC. Thời gian lên men phụ tối thiểu 1 tháng.
Công đoạn 4: Làm trong
Bổ sung enzyme pectinase (Vinzozym Process, Trelonin Mash DF, Rohavin LX…) để hỗ trợ quá
trình lắng trong sản phẩm.
Công đoạn 5: Lọc
Công đoạn 6: Thanh trùng sản phẩm.
Công đoạn 7: Đóng chai (Có thể đóng chai trước rồi thanh trùng sau).
Các giá trị độ brix, pH, loại men và hàm lượng men giống sẽ được thí nghiệm quanh các giá trị trong quy
trình sản xuất rượu vang cacao chuẩn bên trên.
Thời gian theo dõi để sản phẩm được ổn định từ 3 đến 6 tháng (tùy thuộc vào từng nhóm sản phẩm).
Về nội dung 8: Tổ chức chuyển giao quy trình kỹ thuật chế biến rượu cacao và nước cacao lên men
tại Đồng Nai
Đối với sản xuất rượu vang cacao và nước cacao lên men ở quy mô pilot: Từ kết quả ở thí nghiệm chế
biến rượu vang cacao và nước cacao lên men quy mô pḥng thí nghiệm chọn ra nghiệm thức đạt kết quả
tốt nhất để thực hiện sản xuất quy mô pilot (từ nguồn dịch ép của 100kg hạt/mẻ). Các bước thực hiện
tương tự như thí nghiệm 1 từ chuẩn bị nguyên liệu hạt cacao, sử dụng nấm men, bố trí thí nghiệm và các
chỉ tiêu đánh giá.
Về việc chức chuyển giao quy trình chế biến rượu vang cacao và nước cacao lên men: Phối hợp tổ chức
chuyển giao cho Trung tâm Ứng dụng Công nghệ sinh học Đồng Nai (Địa chỉ: Ấp 2, xã Xuân Đường,
21


huyện Cẩm Mỹ, tỉnh Đồng Nai) để làm cơ sở chuyển giao cho các hộ nông dân sản xuất có nhu cầu trên
địa bàn tỉnh Đồng Nai.
Về phương pháp phân tích thống kê và xử lý số liệu
Đánh giá kết quả dựa vào các trắc nghiệm thống kê sinh học sử dung các phần mềm thống kê Stat
Easy, GMP, và Statgraphics.
19

Phương án phối hợp với các tổ chức nghiên cứu và cơ sở sản xuất trong nước


Đơn vị nghiên cứu chính là Khoa CNTP – Trường Đại học Nông Lâm TP.HCM.
Đơn vị phối hợp nghiên cứu là Trung tâm Ứng dụng Công nghệ sinh học Đồng Nai
Đơn vị sử dụng kết quả nghiên cứu:
Trung tâm Ứng dụng Công nghệ sinh học Đồng Nai hiện đang cộng tác với một đơn vị sản xuất và lên
men hạt cacao đó là: Cty Nguyên Lộc TNHH Đầu Tư Phát Triển Nông Nghiệp - Địa chỉ: Ấp Hàng Gòn,
Quốc Lộ 56, X. Hàng Gòn, TX. Long Khánh, Đồng Nai
Phương án chuyển giao kết quả nghiên cứu có nhiều phương án phối hợp với các tổ chức nghiên cứu và
cơ sở sản xuất :
- Kết quả đề tài sẽ được chuyển giao cho Trung tâm Ứng dụng Công nghệ sinh học Đồng Nai để làm đơn
vị sản xuất chế phẩm vi sinh cung cấp cho nông dân để lên men cacao trong tỉnh Đồng Nai.
- Trung tâm Ứng dụng Công nghệ sinh học Đồng Nai cũng là đơn vị tiếp nhận quy trình công nghệ lên
men và sản xuất rượu cacao, nước cacao lên men. Đây là cơ sở để đơn vị có thể tiếp tục xin hỗ trợ dự án
sản xuất ở quy mô công nghiệp.
20

Phương án hợp tác quốc tế (nếu có)
(Trình bày rõ phương án phối hợp: tên đối tác nước ngoài; nội dung đã hợp tác- đối với đối tác đã
có hợp tác từ trước; nội dung cần hợp tác trong khuôn khổ đề tài; hình thức thực hiện. Phân tích rõ
lý do cần hợp tác và dự kiến kết quả hợp tác, tác động của hợp tác đối với kết quả của Đề tài )

21 Tiến độ thực hiện

1
1

Các nội dung, công việc
chủ yếu cần được thực hiện;
các mốc đánh giá chủ yếu


Kết quả phải đạt

Thời
gian

Cá nhân,
tổ chức
thực hiện*

Dự kiến
kinh phí

2

3

4

5

6

Nội dung 1: Khảo sát điều kiện
môi trường lên men và đánh giá
sự ổn định của nguyên liệu cacao
Đồng Nai
Công việc 1: Khảo sát điều kiện khí
hậu, thời tiết ở các vùng trồng cacao
Đồng Nai


40.000.000

- Nhiệt độ trung
bình ở các thời
điểm thu hoạch và
lên men cacao tại
Đồng Nai
- Báo cáo
22

1/2014 – N.T. Hoàng
2/2014

10.000.000


Công việc 2: Khảo sát nguồn
nguyên liệu và chất lượng nguyên
liệu cacao tại Đồng Nai.

2

1/2014 – N.Q.Tuấn
3/2014

30.000.000

Nội dung 2: Sàng lọc hệ vi sinh
thích hợp lên men hạt cacao Đồng
Nai

Công việc 1: Phân lập, định danh và - Các chủng nấm 1/2014 – V.T.L An
tuyển chọn các chủng nấm men
men tiềm năng
6/2014
N.M Hiền
- Báo cáo

480.000.000

Công việc 2: Đánh giá sự đa dạng
và diễn biến của các chủng nấm men
qua các giai đoạn trong quá trình lên
men
Công việc 3: Đánh giá sự biến đổi
vật lý, hóa học của hạt ca cao trong
quá trình lên men
Công việc 4: Phân lập, định danh và
tuyển chọn các chủng vi khuẩn
lactic

- Thống kê các
giống và chất lượng
cacao đang trồng
đại trà, tìm hiểu độ
ổn định nguyên liệu
cacao Đồng Nai
- Báo cáo

60.000.000


Báo cáo

1/2014 – V.T.L An
N.M Hiền
6/2014

50.000.000

- Báo cáo

1/2014 – P.T Huân
6/2014

50.000.000

- Các chủng vi 1/2014 –
khuẩn lactic tiềm 6/2014
năng
- Báo cáo chuyên
đề 6
Công việc 5: Đánh giá sự đa dạng - Báo cáo
1/2014 –
và diễn biến của các chủng vi khuẩn
6/2014
lactic qua các giai đoạn trong quá
trình lên men
Công việc 6: Đánh giá sự biến đổi - Báo cáo
1/2014 –
vật lý, hóa học của hạt ca cao trong
6/2014

quá trình lên men

V.T.L An
N.M Hiền

60.000.000

V.T.L An
N.M Hiền

50.000.000

P.T Huân

50.000.000

Công việc 7: Phân lập, định danh và - Các chủng vi
tuyển chọn các chủng vi khuẩn khuẩn axêtic tiềm
axêtic
năng
- Báo cáo
Công việc 8: Đánh giá sự đa dạng - Báo cáo
và diễn biến của các chủng vi khuẩn
axêtic qua các giai đoạn trong quá
trình lên men

1/2014 – V.T.L An
N.M Hiền
6/2014


60.000.000

1/2014 – V.T.L An
N.M Hiền
6/2014

50.000.000

Công việc 9: Đánh giá sự biến đổi - Báo cáo
vật lý, hóa học của hạt ca cao trong
quá trình lên men

1/2014 – P.T Huân
6/2014

50.000.000

23