ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP. HỒ CHÍ MINH
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

ISBN: 978-604-82-1375-6

TOÀN VĂN KỶ YẾU HỘI NGHỊ
Conference Proceeding Fulltext

TP. HCM – 21/11/2014
www.hcmus.edu.vn


TOÀN VĂN BÁO CÁO NÓI
ORAL
Tiểu ban SINH HỌC và CÔNG NGHỆ SINH HỌC


Báo cáo toàn văn Kỷ yếu hội nghị khoa học lần IX Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQG-HCM
IV-O-1.1

PHÂN TÍCH TÍNH ĐA DẠNG DI TRUYỀN VÀ THÀNH PHẦN ALKALOID CỦA MỘT SỐ
CÂY THUỘC HỌ THỦY TIÊN (AMARYLLIDACEAE)
Trần Thị Thu Ngân, Văn Hồng Thiện, Trịnh Ngọc Nam
Viện Công nghệ sinh học và thực phẩm, Trường Đại học Công nghiệp Tp. Hồ Chí Minh
Email:
TÓM TẮT
Trinh nữ hoàng cung (Crinum latifolium L.) là cây thuốc quý, được sử dụng phổ biến trong y học
để điều trị các bệnh u sơ. Hiện nay ở Việt Nam, ngoài giống Trinh nữ hoàng cung dùng làm dược liệu
thì còn nhiều loài khác cùng chi Crinum, rất giống về hình thái thực vật nhưng không có dược tính dễ
gây nhầm lẫn, ảnh hưởng đến sức khỏe người tiêu dùng. Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã phân
tích tính đa dạng di truyền và thành phần hợp chất alkaloid của 11 mẫu cây Trinh nữ hoàng cung

được thu thập tại 11 tỉnh thành miền Trung và miền Nam. Khuếch đại vùng ITS1- 5,8S- ITS2 từ DNA
tổng số với cặp mồi ITS1, ITS4 và giải trình tự, chúng tôi đã xây dựng được cây phát sinh loài của các
mẫu Trinh nữ hoàng cung. Kết quả phân tích cho thấy tất cả các mẫu đều thuộc họ Amaryllidaceae,
trong đó có 9 mẫu Trinh nữ hoàng cung (Crinum latifolium L.), 1 mẫu Náng hoa trắng (Crinum
asiaticum L.) và 1 mẫu Bạch trinh biển (Hymenocallis littoralis). Phân tích định tính alkaloid bằng thuốc
thử và sắc ký bản mỏng với thuốc hiện màu ammonium cerium (VI) sulfate đã xác định được các
alkaloid đặc trưng vincristine, vinblastine, vidoline và ajmalincine có trong một số mẫu Trinh nữ hoàng
cung. Tóm lại, những kết quả của nghiên cứu góp phần xây dựng một phương pháp chuẩn trong nhận
diện, xác định cây thuốc ở Việt Nam.
Từ khóa: alkaloid, cây thuốc, Crinum latifolium, ITS, sắc ký bản mỏng
ĐẶT VẤN ĐỀ
Amaryllidaceae là một họ thực vật rất lớn với khoảng 90 chi và 1310 loài phân bố khắp mọi nơi [1]. Ngoài
một số chi mọc hoang ở Châu Âu như Galanthus, Leucojum, Narcissus thì đa số các chi khác rất được trồng làm
cảnh vì cho hoa đẹp, như các chi Amaryllis, Haemanthus, Clivia, Valotta, Crinum, Hymenocallis... Theo Y học
cổ truyền thì Trinh nữ hoàng cung (Crinum latifolium L.) thuộc chi Crinum còn là một loại thuốc quý và ngày
càng được quan tâm chú ý nhiều hơn vì các dược tính của nó như kháng u, giảm đau, kháng virus, chống sốt rét,
hoạt động kháng khuẩn và kháng nấm. Đã có nhiều công trình nghiên cứu về nuôi trồng, thu hái và chứng minh
các tác dụng của cây thuốc này [2, 3, 4]. Hiện nay ở Việt Nam, ngoài giống Trinh nữ hoàng cung dùng làm dược
liệu thì còn nhiều loài khác cùng chi Crinum, rất giống về hình thái thực vật nhưng không có dược tính dễ gây
nhầm lẫn, ảnh hưởng đến sức khỏe người tiêu dùng.
Sự phân loại, định danh thực vật thường được thực hiện dựa trên các đặc điểm hình thái và cấu trúc của
mẫu thực vật. Tuy nhiên, phương pháp này đòi hỏi nhiều thời gian và kỹ thuật cao của chuyên gia định danh.
Bên cạnh đó, sự phân loại thường gặp khó khăn khi mẫu vật thu thập không có đầy đủ các giai đoạn của quá
trình phát triển. Do đó, một vài phương pháp phân tử dùng để định danh đã được phát triển dựa vào việc sử dụng
các cặp mồi chuyên biệt cho một vài vùng trình tự chuyên biệt của bộ gen như các DNA vệ tinh gen mã hoá
proten sốc nhiệt, gen topoisomerase I và vùng ITS (internal transcribed spacer) của DNA ribosome (rDNA) [5,
6]. Vùng ITS nằm giữa chuỗi lặp lại 18S, 5.8S, and 28S của gen RNA ribosome trong nhân và có khoảng 100200 bản sao mỗi bộ gen. Những vùng này tiến hoá nhanh và thường được sử dụng để xác định phát sinh loài của
một số lượng lớn các loài sinh vật trong đó có các cây thuộc họ Amaryllidaceae. Trong chi Crinum, sự đa dạng
trong loài của vùng ITS được dùng để nghiên cứu cấu trúc di truyền của nhiều cây thu thập khắp nơi trên thến
giới thông qua việc giải tình tự [7].

Trong nghiên cứu này, các mẫu cây thuộc họ Amaryllidaceae được phân tích tương quan di truyền thông
qua việc khuếch đại và giải trình tự vùng gen ITS. Bên cạnh đó, một số alkaloid có dược tính quan trọng trong
cây Trinh nữ hoàng cung như vincristine, vinblastine, vidoline và ajmalincine cũng được xác định. Những kết
quả của nghiên cứu góp phần xây dựng một phương pháp chuẩn trong nhận diện, xác định các cây thuộc chi
Trinh nữ hoàng cung.
VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP
Vật liệu
Cây Trinh nữ hoàng cung thuộc họ Thủy Tiên (Amaryllidaceae) được thu tại 11 tỉnh: Quảng Nam, Đắk
Lắk, Bình Thuận, Đồng Nai, Tây Ninh, TP. Hồ Chí Minh, Long An, Tiền Giang, Cần Thơ, Hậu Giang, Bạc
Liêu. Mẫu được thu nhận cả cây, trồng tại TP.Hồ Chí Minh và sử dụng cho tất cả các thí nghiệm trong nghiên
cứu này.
ISBN: 978-604-82-1375-6

3


Báo cáo toàn văn Kỷ yếu hội nghị khoa học lần IX Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQG-HCM
Phương pháp nghiên cứu
Phương pháp tách chiết DNA tổng số
Khoảng 1 g mẫu lá non của 11 mẫu cây Trinh nữ hoàng cung được thu nhận và tách chiết DNA. DNA tổng
số được tách chiết bằng bộ Kit GeneJET Plant Genomic DNA Purification Mini Kit (Thermo, Mỹ). Nồng độ và
độ tinh khiết của DNA được xác định bằng máy quang phổ Genesys 10S UV-Vis (Thermo, Mỹ). Mẫu DNA có
nồng độ >35 ng/μl, với OD260/280 1,8-2 được sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo.
Phản ứng PCR khuếch đại vùng gen ITS
Trong nghiên cứu này chúng tôi dùng cặp mồi ITS1 và ITS4 [8] để khuếch đại toàn bộ khu vực ITS1-5.8S
- ITS2 dao động từ 565-800 bp. Thành phần phản ứng PCR gồm PCR Taq mastermix 2X 12,5 μl, mồi ITS1 10
μM 1,25 μl, mồi ITS4 10 μM 1,25 μl, nước khử ion 9,5 μl, DNA khuôn 0,5 μl với chu trình nhiệt theo trình tự
biến tính mạch ban đầu tại : 96oC trong 3 phút; lặp lại 30 chu kỳ nhiệt (94oC trong 1 phút, 44oC trong 1 phút,
72oC trong 2 phút); hoàn tất kéo dài mạch tại 72oC trong10 phút. Kích thước sản phẩm của các phản ứng PCR
được phân tích bằng điện di trên gel agarose 1,2%. Sau phản ứng khuếch đại, sản phẩm PCR được tinh sạch

bằng bộ Kit column – pure PCR Clean – up (abm, Canada).
Giải trình tự và xây dựng cây phát sinh loài
Sản phẩm PCR của 11 mẫu cây Trinh nữ hoàng cung thuộc họ Thủy Tiên (Amaryllidaceae) được giải trình
tự tại trung tâm đo đạc quốc gia về quản lí môi trường (NICEM) của Đại học Quốc gia Seoul (Hàn Quốc) với
cặp mồi ITS1 (hoặc ITS4) theo phương pháp dideoxy của Sanger et al. [9]. Kết quả giải trình tự được hiệu chỉnh
trình tự bằng phần mềm Snapgene viewer. Trình tự hoàn chỉnh được BLAST trên NCBI để đánh giá mức độ
tương đồng của vùng ITS1-5.8S-ITS2 và từ đó tìm ra loài tương đồng nhất với trình tự cần nghiên cứu. Cây phát
sinh loài của 11 mẫu được xây dựng bằng các phần mềm Annhyb, Clustal X2 và được thể hiện bằng TreeView.
Mối tương quan di truyền được thể hiện bằng cây tiến hóa.
Ly trích alkaloid tổng và định tính alkaloid
Alkaloid trong lá và củ được tách chiết theo quy trình của Mai Đình Trị và cộng sự [10] có hiệu chỉnh.
Alkaloid được định tính bằng ba loại thuốc thử: Dragendorf, Mayer và Wagner. Thành phần alkaloid được xác
định bằng phương pháp sắc ký bản mỏng trên bản silica gel 60 F254 (Merck millipore, Đức) trong hệ dung môi
khai triển chloroform- methanol- amoniac (50:9:1 theo thể tích) [11] với thuốc hiện màu ammonium cerium (VI)
sulfate, sấy 100oC trong 30 phút và quan sát dưới tia UV [12].
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
Kết quả tách chiết DNA
Sau khi tách chiết, chất lượng DNA từ mẫu lá Trinh nữ hoàng cung được kiểm tra bằng kỹ thuật điện di
trên gel agarose 1%. Hình 1 cho thấy DNA tổng số của các mẫu có độ đồng đều cao, các vạch DNA sắc nét,
không bị phân mảnh.

Hình 1. Điện di phân tích DNA tổng số của 11 mẫu cây Trinh nữ hoàng cung. LD: DNA marker 25 kb.
Kết quả phản ứng PCR khuếch đại
Sản phẩm khuếch đại vùng gen ITS được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1,2%. Sản phẩm PCR cho
thấy các mẫu đều có 1 vạch sáng đậm, rõ nét, không có vạch phụ và có kích thước khoảng 700-800 bp (Hình 2).
Theo Sahare [13], toàn bộ vùng ITS1-5.8S-ITS2 có kích thước dao động từ 600-1000 bp, tùy thuộc vào loài thực
vật. Trong hầu hết các thực vật hạt kín, kích thước dao động từ 565-700 bp. Như vậy, kích thước vùng gen ITS
được khuếch đại là phù hợp.

ISBN: 978-604-82-1375-6


4


Báo cáo toàn văn Kỷ yếu hội nghị khoa học lần IX Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQG-HCM

Hình 2. PCR khuếch đại vùng ITS 11 mẫu cây Trinh nữ hoàng cung. LD: DNA marker 3 kb.
Xây dựng cây phát sinh loài
Sản phẩm khuếch đại vùng gen ITS của 11 mẫu Trinh nữ hoàng cung được giải trình tự theo phương pháp
của Sanger và cộng sự [9]. Cây phát sinh loài được xây dựng bằng các phần mềm Annhyb, ClustalX2, TreeView
với trình tự cây Trinh nữ hoàng cung (Crinum latifolium L.) (accession: AY139137) thu nhận từ NCBI (The
National Center for Biotechnology Information) được sử dụng làm trình tự chuẩn.

Hình 3. Cây phát sinh loài của 11 mẫu nghiên cứu và mẫu cây Trinh nữ hoàng cung (Crinum latifolium L.)
(accession: AY139137) thu nhận từ NCBI (National Center for Biotechnology Information)
Theo sơ đồ cây phát sinh loài (Hình 3) cho thấy có sự phân nhóm của các mẫu nghiên cứu thành 3 nhóm
riêng biệt. Nhóm I có mẫu 2 gồm cây Bạch trinh biển (Hymenocallis littoralis) cùng họ Amaryllidaceae nhưng
khác chi với các mẫu còn lại và có khoảng cách di truyền so với gốc là 0,30. Nhóm II gồm hai mẫu là mẫu cây
Trinh nữ hoàng cung (Crinum latifolium L.) (accession: AY139137) thu nhận từ NCBI và mẫu 8. Từ kết quả này
có thể xác định rằng mẫu 8 là mẫu giống với mẫu chuẩn nhất vì hai mẫu này đứng rất gần nhau trên cây phát
sinh loài, có độ tương đồng với nhau là 99% và đều cách gốc một khoảng gần bằng nhau (mẫu 8= 0,32; NCBI=
0,42). Nhóm III gồm 9 mẫu còn lại và được chia thành 2 phân nhóm: (1) Phân nhóm A gồm 3 mẫu 4, 1 và 3.
Trong đó hai mẫu 1 và 3 nằm rất gần nhau có độ tương đồng với mẫu chuẩn là 99% và có khoảng cách di truyền
so với gốc là 0,32. Còn mẫu 4 thì nằm trên một nhánh riêng cách biệt vì mẫu 4 là cây Náng hoa trắng (Crinum
asiaticum L.) cùng chi Crinum với hai mẫu 1 và 3 và cũng có khoảng cách di truyền so với gốc là 0,32; (2) Phân
nhóm B gồm 6 mẫu được chia thành 2 tiểu nhóm B1 và B2. Tiểu nhóm B1 gồm 3 mẫu 9, 5 và 10. Trong đó mẫu
9 nằm trên một nhánh riêng biệt có độ tương đồng so với mẫu chuẩn là 99% và khoảng cách di truyền so với gốc
là 0,32. Còn hai mẫu còn lại độ tương đồng từ 91-94% và cách gốc một khoảng bằng nhau là 0,32. Tiểu nhóm
B2 gồm 3 mẫu 11, 6 và 7. Trong đó mẫu 11 nằm trên một nhánh riêng biệt có độ tương đồng của mẫu chuẩn là
97% và khoảng cách di truyền cách gốc là 0,32. Mẫu 6 và 7 cùng nằm trên cùng một nhánh có độ tương đồng so

với mẫu chuẩn là 99% và có khoảng cách di truyền so với gốc là 0,33.

ISBN: 978-604-82-1375-6

5


Báo cáo toàn văn Kỷ yếu hội nghị khoa học lần IX Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQG-HCM
Bảng 1. Định danh 11 mẫu Trinh nữ hoàng cung bằng giải trình tự vùng ITS
Mẫu

Tên khoa học

1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11

Crinum latifolium L.
Hymenocallis littoralis
Crinum latifolium L.
Crinum asiaticum L.
Crinum latifolium L.

Crinum latifolium L.
Crinum latifolium L.
Crinum latifolium L.
Crinum latifolium L.
Crinum latifolium L.
Crinum latifolium L.

Độ tương đồng so với mẫu chuẩn trên NCBI
(accession: AY139137)
99 %
99 %
99 %
99%
91 %
99 %
99 %
99 %
99 %
94 %
97 %

Ly trích và định tính alkaloid
Thực hiện ly trích alkaloid từ 11 mẫu lá và củ thu được 2 dịch trích pH=7,3 (nhóm A) và pH=9 (nhóm B).
Alkaloid toàn phần trong dịch trích nhóm A và B được xác định bằng phương pháp hiện màu thuốc thử. Kết quả
cho thấy tất cả các mẫu đều có sự hiện diện của alkaloid thông qua hiện tượng tủa với 3 loại thuốc thử
Dragendorf, Mayer và Wagner.

Hình 4. Kết quả định tính alkaloid bằng 3 loại thuốc thử. (a) Mẫu alkaloid, (b) Thử bằng thuốc thử Dragendorf,
(c) Thử bằng thuốc thử Mayer, (d) Thử bằng thuốc thử Wagner
Thành phần alkaloid tiếp tục được xác định bằng phương pháp sắc ký bản mỏng trên bản gel silica với

thuốc hiện màu ammonium cerium (VI) sulfate và quan sát dưới tia UV (Hình 5). Kết quả phân tích cho thấy đã
xác định được 4 loại alkaloid vincristine, vinblastine, vidoline, ajmalincine trong dịch trích nhóm A và alkaloid
ajmalincine trong dịch trích nhóm B.

Hình 5. Kết quả định tính alkaloid mẫu lá 5 (pH=7,3) bằng sắc ký bản mỏng và phun thuốc hiện màu
ammonium cerium (VI) sulfate

ISBN: 978-604-82-1375-6

6


Báo cáo toàn văn Kỷ yếu hội nghị khoa học lần IX Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQG-HCM
Bảng 2. Thành phần alkaloid của 11 mẫu cây thuộc họ Thủy Tiên (Amaryllidacea)
Nhóm
A

Mẫu
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11


B

1,2,3,4,5,6,7,8,9,10 và
11

Lá
Củ
Lá
Củ
Lá
Củ
Lá
Củ
Lá
Củ
Lá
Củ
Lá
Củ
Lá
Củ
Lá
Củ
Lá
Củ
Lá
Củ

Alkaloid
Vinblastine

Ajmalincine
Vidoline
Ajmalincine
Ajmalincine
Ajmalincine
Vidoline
Ajmalincine
Vincristine và vindoline
Ajmalincine
Vinblastine và vindoline
Ajmalincine
Ajmalincine
Ajmalincine
Ajmalincine
Ajmalincine
Vinblastine, vindoline và ajmalincine
Ajmalincine
Vincristine và vindoline
Ajmalincine
Vincristine, vindoline và ajmalincine
Ajmalincine

Lá và củ

Ajmalincine

KẾT LUẬN
Kết quả từ nghiên cứu này cho thấy vùng gen ITS của cây Trinh nữ hoàng cung có thể khuếch đại bằng cặp
mồi ITS1 và ITS4 với kích thước sản phẩm khoảng 700-800 bp. Giải trình tự vùng gen này cho phép phân tích
được sự đa dạng di truyền của các cây thuộc họ Amaryllidaceae. Nghiên cứu cũng cho thấy có sự hiện diện của

một vài loại alkaloid tiêu biểu trong cây Trinh nữ hoàng cung. Tóm lại, nghiên cứu hiện tại góp phần xây dựng
một phương pháp chuẩn trong nhận diện, xác định cây thuốc ở Việt Nam.
Lời cám ơn: Nghiên cứu này nhận được sự tài trợ của ThS. Văn Hồng Thiện và TS. Trịnh Ngọc
Nam tại Trường Đại học Công Nghiệp Thành phố Hồ Chí Minh. Nghiên cứu này cũng nhận được sự
hỗ trợ về trang thiết bị của Viện Công nghệ Sinh học và Thực phẩm Trường Đại học Công Nghiệp
Thành phố Hồ Chí Minh.

STUDIES GENETIC VARIATION AND ALKALOID COMPONENTS OF SOME
MEDICINAL PLANTS IN AMARYLLIDACEA FAMILY
Tran Thi Thu Ngan, Van Hong Thien, Trinh Ngọc Nam
Institute of Biotechnology and Food technology, Industrial University of HoChiMinh City
Email:
ABSTRACT
Crinum latifolium are widely used in folk medicine as an anticancer in different geographical
regions around the world. In Vietnam, many species of Amaryllidacea family have strong phenotypic
similarities to Crinum latifolium but do not have pharmaceutical value for tumor treatment. In this study,
we examined the genetic variation and analyzed alkaloid components of eleven medicinal plant
samples, which was collected at eleven Provinces in Middle- and South Vietnam. Amplification and
sequencing of ITS1-5.8S-ITS2 region from total DNA extracted from the plant samples by using ITS1
and ITS4 primer, we built phylogenetic tree of the medicinal plant samples. The result indicated all the
plant samples are belong Amaryllidaceae family, in which nice samples are Crinum latiforlium, one
sample is Crinum asiaticum and the other is Hymenocallis littoralis. Qualitative analysis of alkaloid
components by thin-layer chromatography with ammonium cerium (VI) sulfate reagent, we determined
some specific alkaloids as vincristine, vinblastine, vidoline and ajmalincine in some medicinal plant

ISBN: 978-604-82-1375-6

7



Báo cáo toàn văn Kỷ yếu hội nghị khoa học lần IX Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQG-HCM
samples. Taken together, these results may provide a method for determination medicinal plant in
Vietnam.
Key words: alkaloid, Crinum latifolium, ITS, medicinal plant, thin-layer chromatography
TÀI LIỆU THAM KHẢO
[1]. John Refaat, Mohamed S. Kamel, Mahmoud A. Ramadan and Ahmed A. Ali. 2012. Crinum; an endless
source of bioactive principles: review. Part 1- Crinum alkaloid: lycorine-type alkaloid. International
journal of pharmaceutical sciences and research. Vol. 3 (07). P.1883-1890.
[2]. Ghosal S. 1986. Chemical constituents of Amaryllidaceae. Crinafoline and crinafolidine. two antitumor
alkaloids from Crinum latifolium. Journal of Chemical Research (S). Vol 24. P.312-313.
[3]. Ghosal S, Unnikrishnan SG and Singh SK. 1989. Occurrence of two epimeric alkaloids and metabolism
compared with lycorine in Crinum latifolium, Phytochemistry. Vol 28(9). P.2535–2537.
[4]. Nguyen Thi Ngoc Tram, E.Z., E. Nikolova, E. Katzarova, G. Kostov, I. Yanchev, O. Baicheva. 1999. A
novel in vitro and invio T-lymphocyte activating factor in Crinum latifolium L. aqueous extracts.
Experimental Pathology and Parasitology 3: 21-26.
[5]. Cao AX, Liu XZ, Zhu SF and Lu BS. 2005. Detection of the pinewood nematode, Bursaphelenchus
xylophilus, using a real-time polymerase chain reaction assay. Phytopathology 95: 566-571.
[6]. Takeuchi Y, Kanzaki N and Futai K. 2005. A nested PCR-based method for detecting the pine wood
nematode, Bursaphelenchus xylophilus, from pine wood. Nematology 7: 775-782.
[7]. Yakandawala DMD. and Samarakoon TM. 2006. An empirical study on the taxonomy of Crinum
zeylanicum (L.) L. and Crinum latifolium l. (Amaryllidaceae) cccurring in Sri Lanka.Cey. J. Sci. (Bio.
Sci.) 35 (1): 53 -72.
[8]. White TJ, Bruns T, Lee S, Taylor J. 1990. Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA
genes for phylogenetics. In: Innis MA, Gelfand DH, Sninsky JJ, White TJ (eds) PCR Protocols: a Guide
to methods and Applications, Academic Press, New York, USA. P.315–322.
[9]. Sanger, F., Nicklen, S., and Coulson, A. R. 1977. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors,
Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 74, 5463-5467.
[10]. Mai Đình Trị, Lê Tiến Dũng, Phạm thị Nhật Trinh, Nguyễn Công Hào. 2001. Nghiên cứu thành phần Hóa
học trong phân đọan không phân cực từ lá cây Trinh nữ hoàng cung (Crinum latifolium L.). Tuyển tập
các công trình Hội nghị Khoa học và công nghệ Hóa hữu cơ toàn quốc lần thứ 2. Tr. 366-371.

[11]. Trần Thị Văn Thi, Trần Thanh Minh. 2011. Nghiên cứu phân lập và nhận dạng cấu trúc alkaloid trong
dịch chiết từ lá Vông nem (Erythrina orientalis L. Fabaceae) Thừa Thiên Huế. Tạp chí khoa học. Đại học
Huế. Số 65. Tr. 225-230.
[12]. Magagula N.L., Mohanlall V. and Odhav B. 2012. Optimized Thin Layer Chromatographic Method for
Screening Pharmaceutically Valuable Alkaloids of Catharanthus roseus (Madagascar Periwinkle).
International Journal of Sciences.
[13]. Sahare P. 2013. Highly conserved nucleotide sequence in ITS-region of plants from family Fabaceae.
International journal of innovative research and studies 2(6): 210-215

ISBN: 978-604-82-1375-6

8


Báo cáo toàn văn Kỷ yếu hội nghị khoa học lần IX Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQG-HCM
IV-O-1.4

NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG CÂY CỎ LẠC (ARACHIS PINTOI KRABOV & W.C.GREGORY)
LÀM NGUỒN NGUYÊN LIỆU THU NHẬN RESVERATROL
Vũ Thị Bạch Phƣợng, Trần Quốc Tân, Phạm Công Thủy Tiên, Quách Ngô Diễm Phƣơng, Bùi Văn Lệ
Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQG-HCM
TÓM TẮT
Resveratrol là hợp chất biến dưỡng thứ cấp thuộc nhóm phytoalexin, được biết đến với những
hoạt tính sinh học nổi bật như kháng oxy hóa, kháng viêm, ngăn ngừa ung thư, các bệnh tim mạch và
lão hóa. Nhu cầu sử dụng và thương mại hóa resveratrol ngày càng tăng trong khi đó hàm lượng
resveratrol trong tự nhiên lại rất thấp. Vì vậy, việc tìm kiếm và phát triển các nguồn nguyên liệu mới có
chứa resveratrol là một việc cần thiết và quan trọng. Hiện nay, cây Cỏ lạc (Arachis pintoi Krabov & W.
C. Gregory) chỉ được trồng trang trí và tạo thảm ở công viên, đồng ruộng. Cỏ lạc cũng cùng chi với
cây Đậu phộng (Arachis hypogaea L.)-một nguồn nguyên liệu để thu nhận resveratrol đã được nghiên
cứu bởi Chen và cộng sự (2001). Rễ của cây Cỏ lạc được chứng minh rõ ràng có sự hiện diện của

resveratrol thông qua phương pháp sắc ký bản mỏng, đo độ hấp thu UV 308nm và HPLC-UV. Với
hàm lượng resveratrol ở rễ tương đối cao, cây Cỏ lạc có thể được sử dụng như một nguồn nguyên
liệu để thu nhận resveratrol. Ngoài ra, để chủ động tăng sinh nguồn nguyên liệu là rễ, kỹ thuật cảm
ứng rễ tơ từ mẫu cấy lớp mỏng in vitro và từ cá thể in vivo kết hợp thủy canh đã được thực hiện thông
qua khai thác khả năng tạo rễ tơ của vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes ATCC 15834.
Từ khóa: Cỏ lạc (Arachis pintoi Krabov & W. C. Gregory), resveratrol, rễ tơ, Agrobacterium
rhizogenes ATCC 15834
MỞ ĐẦU
Resveratrol (3, 4‟, 5- trihydroxystilbene) được xác định như một phytoalexin tự nhiên được sinh tổng hợp ở
một số cây như nho, lạc... khi đáp ứng với stress, vết thương, tia cực tím (UV), sự xâm nhiễm của nấm mốc và
vi khuẩn (Aggarwal và cộng sự, 2004). Resveratrol là hoạt chất mang lại cho con người nhiều lợi ích về mặt sức
khỏe như kháng oxy hóa, kháng viêm, ngăn ngừa ung thư, ngăn ngừa các bệnh tim mạch và lão hóa...
(Aggarwal, Shishoda, 2006). Vì vậy, hiện nay nhu cầu sử dụng và thương mại hóa resveratrol tăng lên nhanh
chóng nhưng hàm lượng của nó trong tự nhiên thì rất thấp. Do đó, ngoài việc tăng năng suất thu nhận resveratrol
từ các nguồn có sẵn thì việc tìm kiếm và phát triển các nguồn nguyên liệu mới là việc làm cần thiết và quan
trọng.
Trước đây, Chen và các cộng sự (2001) đã đưa ra nhận định rằng rễ đậu phộng (Arachis hypogaea L.) là
một nguồn nguyên liệu có thể sử dụng để thu nhận resveratrol. Các nghiên cứu về cảm ứng, tăng sinh rễ tơ đậu
phộng nhằm thu nhận resveratrol cũng đã được nghiên cứu trên thế giới. Chúng tôi nhận thấy rằng cây Cỏ lạc
cũng cùng chi với cây Đậu phộng, theo hóa-thực vật thì những cây cùng chi có thể có những hoạt chất giống
nhau. Tuy nhiên, cây Cỏ lạc (Arachis pintoi Krabov & W. C. Gregory) hiện nay chỉ được sử dụng làm cây trang
trí ven đường, trong công viên, trồng xen phủ cây nông nghiệp mà chưa có các nghiên cứu về hoạt chất hay dược
tính của nó. Vì vậy, đề tài này đã ra đời với mục đích chứng minh sự hiện diện của resveratrol có trong rễ cây Cỏ
lạc Arachis pintoi và chủ động tăng sinh nguồn rễ loài cây này thông qua phương pháp chuyển gen cảm ứng tạo
rễ tơ.
VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP
Vật liệu
Cây cỏ lạc (Arachis pintoi Krapov. and W.C. Gregory) được thu hái tại trường Đại học Khoa học Tự nhiên
(Thủ Đức, TP. HCM), được sử dụng cho các thí nghiệm sinh hóa.
Hạt Cỏ lạc (Arachis pintoi) giống PS144 được cung cấp bởi Đại học Florida thông qua trang web

www.pintoyseeds.com.
Chủng vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes ATCC 15834 được mua từ tổ chức RIKEN-BRC thông qua dự
án MEXT, Nhật Bản.
Phương pháp
Tạo cây con in vitro
Hạt cỏ lạc giống PS144 được tách vỏ, rửa bẳng xà phòng trong 5 phút sau đó được rửa sạch lại bằng nước
cất cho sạch xà phòng. Mẫu được chuyển vào tủ cấy, tiếp tục lắc với cồn 80% trong 30 giây. Sau đó, hạt được
ngâm và lắc trong Javel 10% (v/v) trong 10 phút. Cuối cùng, hạt được rửa lại bằng nước cất vô trùng tối thiểu 5
ISBN: 978-604-82-1375-6

9


Báo cáo toàn văn Kỷ yếu hội nghị khoa học lần IX Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQG-HCM
lần. Các hạt được cấy lên môi trường MS (Murashige & Skoog, 1962) có bổ sung đường (30 g/l), agar (8 g/l) với
pH môi trường là 5,7. Hạt nảy mầm sau 10 ngày với điều kiện chiều sáng 16 giờ/ngày, cường độ sáng khoảng
1500 lux, nhiệu độ phòng 22-24oC.
Điều chế cao chiết từ các bộ phận
Rễ, thân và lá của cây cỏ lạc được tách riêng và sấy khô ở nhiệt độ 50oC. Sau đó, các mẫu khô được xay
nhuyễn thành bột. Ngâm dầm bột khô trong ethanol 80% ở nhiệt độ phòng, sau mỗi 24 giờ đem lọc thu dịch lọc.
Dịch lọc tổng cộng sau nhiều lần ngâm chiết (cho đến khi dịch lọc trong gần như trong suốt) được cô quay chân
không và để bay hơi tự nhiên để tạo thành cao ethanol 80%.
Sắc ký bản mỏng kiểm tra sự hiện diện của resveratrol
Tiến hành định tính resveratrol bằng phương pháp sắc ký bản mỏng trên bản sắc ký silica gel (Merck). Hòa
tan chất chuẩn resveratrol (Sigma, 99%), cao chiết của 3 loại bộ phận bằng dung môi ethanol 80% sao cho nồng
độ chất chuẩn là 50 µg/ml và nồng độ của cao chiết 5mg/ml. Chấm chất chuẩn và dịch chiết cao lên bản sắc ký,
để bản khô, đặt bản vào bể sắc ký với hệ dung môi giải ly chloroform : ethyl acetate : acid formic (5:4:1). Vị trí
các vết được quan sát dưới đèn UV 254 nm và so sánh với vệt của chất chuẩn.
Bán định lượng stilbene bằng độ hấp thu UV 308nm
Các loại cao chiết được hòa tan vào ethanol 80% để được nồng độ là 5 mg/ml. Dịch hòa tan cao được đem

đi đo hộ hấp thu UV 308nm. Hàm lượng stilbene được nội suy dựa vào đường chuẩn.
Định lượng resveratrol trong rễ Cỏ lạc bằng HPLC
Các mẫu rễ tươi, rễ khô và cao ethanol 80% của rễ được tiến hành phân tích HPLC ở phòng thí nghiệm
phân tích trường Đại học Khoa học Tự nhiên Tp. Hồ Chí Minh. Quy trình tiến hành HPLC của Nuno và cộng sự
(2004) được sử dụng và thay đổi một số thông số: chất chuẩn resveratrol của Sigma có độ tinh sạch 99,9% , cột
C18 (250 x 4,6 mm), pha động là hệ dung môi nước : methanol (65:35), tốc độ dòng chảy 1,0 ml/phút, đầu dò
phát hiện ở bước sóng 308 nm, thời gian lưu là 25 phút, nhiệt độ cột bằng nhiệt độ phòng.
Cảm ứng tạo rễ tơ
Rễ tơ được tạo thành thông qua sự chuyển gen của vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes vào tế bào thực vật.
Nuôi cấy dịch vi khuẩn A. rhizogenes, sao cho dịch khuẩn đạt được giá trị OD600 = 0,5-0,6. Mẫu được tạo vết
thương và được nhúng vào dịch khuẩn A. rhizogenes trong thời gian là 15 phút. Sau đó, các mẫu cấy được đặt
lên giấy thấm vô trùng, để khô bề mặt và chuyển sang môi trường MS không bổ sung chất điều hòa sinh trưởng
thực vật để đồng nuôi cấy và thời gian đồng nuôi cấy là 72 giờ. Sau thời gian thời gian đồng nuôi cấy, mẫu được
xử lý khử khuẩn bằng kháng sinh cefotaxime (500mg/l). Sau 2-3 tuần, quan sát sự hình thành rễ ở vị trí vết
thương so với đối chứng không xâm nhiễm khuẩn.
Khảo sát khả năng cảm ứng rễ tơ từ các bộ phận cây Cỏ lạc in vitro
Trước đây, Hoàng Thị Thanh Minh và cộng sự (2011) đã từng khảo sát khả năng cảm ứng rễ tơ từ các bộ
phận của cây đậu phộng (Arachis hypogaea L.) với kết quả là khả năng cảm ứng của từng bộ phận của cây là
khác nhau. Ngoài ra, Veena và Christopher (2007) cũng có kết luận rằng hiệu quả chuyển gen thì phụ thuộc vào
sự tương tác giữa vi khuẩn A. rhizogenes với từng loại mô, từng loại tế bào. Vì vậy, thí nghiệm được tiến hành
nhằm tìm ra bộ phận nào thích hợp để cảm ứng rễ tơ. Quy trình thực hiện giống với nghiên cứu trước đây của
Karthikeyan (2007) và Kim (2008) cùng các cộng sự. Lá, cuống lá, thân, trụ thượng diệp, trụ hạ diệp, tử diệp và
rễ của cây in vitro 20 ngày tuổi được sử dụng làm nguồn vật liệu ban đầu. Chỉ tiêu theo dõi là tỷ lệ phần trăm
mẫu cảm ứng và số rễ tơ mỗi mẫu sau 21 ngày nuôi cấy.
Kết hợp thủy canh trên mô hình cảm ứng rễ tơ cây Cỏ lạc in vivo
Thí nghiệm được tiến hành nhằm xác định phương pháp xâm nhiễm vi khuẩn thích hợp cho việc cảm ứng
tạo rễ tơ từ cây con trong điều kiện nuôi thủy canh. Hai phương pháp được thử nghiệm là:
(1) tiêm khuẩn: dùng kim tiêm tiêm trực tiếp khoảng 100 µl dịch khuẩn Agrobacterium rhizogenes ATCC
15834 vào trụ hạ diệp. Sau đó, cây được chuyển sang môi trường thủy canh MS với nồng độ khoáng đa lượng
giảm xuống còn 1/4.

(2) tạo vết thương kết hợp đồng nuôi cấy: sử dụng dao cấy rạch tạo vết thương ở trụ hạ diệp, rồi chuyển
sang môi trường thủy canh MS như đối với phương pháp tiêm khuẩn có bổ sung thêm vi khuẩn A. rhizogenes để
bắt đầu quá trình đồng nuôi cấy. Sau 7 ngày, chuyển cây sang môi trường thủy canh mới để loại bỏ khuẩn.
Các hạt Cỏ lạc giống PS144 được gieo trên cát ẩm, cây con nảy mầm được 20 ngày tuổi sẽ được tiến hành
cảm ứng rễ tơ theo hai phương pháp. Mẫu đối chứng là cây con 20 ngày tuổi được chuyển sang nuôi thủy canh
với MS 1/4 khoáng đa lượng như trên nhưng không xâm nhiễm vi khuẩn. Môi trường thủy canh bổ sung 5 ngày
1 lần. So sánh chiều dài rễ, khối lượng tươi và khô của bộ rễ sau 20 ngày nuôi thủy canh giữa hai phương pháp.

ISBN: 978-604-82-1375-6

10


Báo cáo toàn văn Kỷ yếu hội nghị khoa học lần IX Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQG-HCM
Kiểm tra gen chuyển với các mẫu rễ tơ cảm ứng in vitro và in vivo
Phương pháp PCR được tiến hành nhằm xác định sự chuyển gen rolB từ vi khuẩn vào tế bào thực vật.
DNA bộ gen từ các mẫu rễ cảm ứng và đối chứng được tách chiết theo phương pháp CTAB của Stewart và Via
(1993). Khuẩn lạc của Agrobacterium rhizogenes ATCC 15834 được sử dụng để thu nhận plasmid theo quy trình
PCR khuẩn lạc nhằm làm chứng dương để so sánh với sản phẩm PCR bộ gen của các mẫu rễ. Gen rolB sẽ được
khuếch đại bằng cặp mồi đặc hiệu, rolBF (5‟-GCTCTTGCAGTGCTAGATTT-3‟) và rolBR (5‟GAAGGTGCAAGCTACCTCTC-3‟). Mỗi mẫu phản ứng PCR DNA được thực hiện với tổng thể tích là 25 µl
gồm các thành phần sau: 1 µl DNA bộ gen các mẫu rễ; 1,5 µl dNTPs 2 mM; 1,25 µl DreamTaq DNA
polymerase (1 unit/µl); 1 µl mỗi mồi với nồng độ 10 µM; 1,5 µl DreamTaq buffer và bổ sung nước siêu sạch để
đủ thể tích. Phản ứng PCR gen rolB được thiết lập với chương trình như sau: biến tính ban đầu ở 95oC trong 5
phút, 35 chu kỳ (95oC trong 30 giây, 54oC trong 30 giây,và 72oC trong 60 giây) và 5 phút kéo dài ở 72oC. Sản
phẩm khuếch đại PCR được phân tích và kiểm tra kích thước với thang 100bp bằng phương pháp điện di trên gel
agarose 1% trong đệm TAE 1X. Gel sau đó được ngâm vào dung dịch Ethidium bromide và quan sát dưới đèn
UV.
KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN
Điều chế cao chiết từ các bộ phận
Sau khi để khô tự nhiên, hút ẩm đến khi cao đạt khối lượng không đổi. So sánh về phần trăm độ ẩm, thân là

bộ phận có lượng nước trong sinh khối cao nhất. Xét về năng suất thu cao so với khối lượng khô thì rễ và lá là
các bộ phận cho năng suất cao tương đương nhau, cao hơn thân.
Bảng 1. Phần trăm độ ẩm và năng suất thu cao từ khối lượng khô của các bộ phận cây Cỏ lạc Arachis pintoi
Krapov. and W.C. Gregory.
Bộ phận

Khối lượng khô (g)

Độ ẩm (%)

Khối lượng cao (g)

Rễ
Thân
Lá

121,98
171,41
131,13

66,76
78,35
72,21

17,73
17,65
19,49

Năng suất thu cao so
với khối lượng khô (%)

14,53
10,30
14,86

Sắc ký bản mỏng kiểm tra sự hiện diện của resveratrol
Sau khi chấm bảng bằng chất chuẩn là resveratrol và các chất thử nghiệm là cao chiết ethanol 80% của 3
bộ phận, chúng tôi tiến hành giải ly trong bể sắc ký với hệ dung môi chloroform : ethyl acetate : acid
acetic(5:4:1). Kết quả sắc ký được thể hiện ở hình 1 cho thấy ở cả ba loại cao đều cho 1 vết tối nằm ngang hàng
với nhau, có vị trí gần với vạch chất chuẩn, được nghi ngờ là vệt của resveratrol hiện diện trong 3 mẫu cao chiết.
Tuy nhiên, có sự chênh lệch nhỏ về Rf giữa các vệt này so với chất chuẩn nên chưa thể khẳng định sự hiện diện
của resveratrol trong cây Cỏ lạc. Chúng tôi tiến hành thêm các thí nghiệm bán định lượng bằng UV 308 nm và
định lượng bằng HPLC để kiểm chứng sự hiện diện resveratrol có trong 3 loại cao chiết.

Hình 1. Kết quả sắc ký bản mỏng. (A). Resveratrol – chất chuẩn, (B). Cao rễ, (C). Cao thân, (D). Cao lá. Thanh
dọc tương ướng với một cm.
Bán định lượng stilbene bằng độ hấp thu UV 308nm
Kết quả xây dựng đường chuẩn được trình bày ở hình 2.

ISBN: 978-604-82-1375-6

11


Báo cáo toàn văn Kỷ yếu hội nghị khoa học lần IX Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQG-HCM

Hình 2. Đường chuẩn của resveratrol.
Đường chuẩn xây dựng có hệ số tương quan giữa nồng độ resveratrol với mật độ quang (OD = 308 nm) là
R2 ≈ 1, một giá trị đáng tin cây: cho thấy mối quan hệ tuyến tính giữa nồng độ resveratrol (mg/ml) với độ hấp thu
UV 308 nm. Mối quan hệ đó được thể hiện thông qua phương trình: y = 113,76x – 0,0678. Kết quả đo được thể
hiện trong bảng 2. Trước khi tiến hành đo, khối lượng (M) các mẫu cao là 0,05 g, thể tích dung môi (V) pha

loãng là 10 ml và độ pha loãng (ĐPL) là 5 lần.
Bảng 2. Kết quả hàm lượng stilbene (mg/g) trong cao chiết thông qua độ hấp thu UV 308 nm.
Các chỉ số theo dõi

Cao rễ

Cao thân

Cao lá

Y: độ hấp thụ bước sóng 308nm

2,783± 0,027

2,409 ± 0,034

2,987 ± 0,077

Hàm lượng stilbene =
(mg/g)

24,947b ± 0,234

21,645c ± 0,274

26,748a ± 0,676

Kết quả ở bảng 2 cho thấy, cả ba bộ phận của cây Cỏ lạc đều có sự hiện diện của nhóm hợp chất stilbene.
Lá là bộ phận có hàm lượng stilbene cao nhất (26,748 ± 0,676) so với hai bộ phận còn lại. Rễ là bộ phận chứa
hàm lượng stilbene cao thứ hai sau lá (24,947 ± 0,234) nhưng vẫn đánh giá là một nguồn nguyên liệu có tiềm

năng cao vì có thể áp dụng kỹ thuật nuôi cấy rễ tơ kết hợp kỹ thuật tăng sinh hợp chất đang được dùng rộng rãi
trên thế giới. Do đó, chúng tôi vẫn chọn rễ là nguồn nguyên liệu khai thác cho mục tiêu thu nhận resveratrol.
Định lượng resveratrol trong rễ Cỏ lạc bằng HPLC
Với những nhận định trên, chúng tôi tiến hành phân tích hàm lượng resveratrol bằng phương pháp HPLCUV đối với mẫu rễ tươi, rễ khô và mẫu cao chiết rễ của cây Cỏ lạc. Kết quả được thể hiện ở bảng 3 và hình 3.
Bảng 3. Kết quả định lượng Resveratrol của 3 mẫu rễ tươi, rễ khô và cao chiết bằng phương pháp HPLC-UV.
Tên mẫu
Rễ tươi
Rễ khô
Cao chiết rễ

Đơn vị
µg/g
µg/g
µg/g

Kết quả phân tích
10,75
18,80
50,53

Kết quả ở bảng 3 đã chứng minh rõ ràng có sự hiện diện của resveratrol trong rễ cây Cỏ lạc A. pintoi. Ở kết
quả của mẫu rễ tươi và khô, chúng tôi so sánh hàm lượng của mẫu rễ với các số liệu báo cáo về hàm lượng
resveratrol ở các nguồn thực vật chưa cải tao gene của Zhang và cộng sự (2011). Trong đó, sự dao động hàm
lượng resveratrol ở mẫu tươi là 0,01 đến 9,30 µg/g (quy đổi tương ứng từ mg/kg mẫu thành µg/g mẫu) và ở mẫu
khô là 0,83 đến 1.330 µg/g. Đối với kết quả cao chiết, chúng tôi so sánh với kết quả của Chen và cộng sự (2001),
với hàm lượng resveratrol trong cao chiết rễ đậu phộng A. hypogaea L. được thu hái vào mùa xuân từ 15 đến
63µg/g. Thông qua sự so sánh với các số liệu từ các báo cáo trên, chúng tôi thấy rằng rễ Cỏ lạc thực sự là một
nguồn nguyên liệu có nhiều tiềm năng cho việc thu nhận resveratrol với hàm lượng khá cao.

Hình 3. Sắc ký đồ HPLC của (A) resveratrol chuẩn, (B) mẫu rễ tươi, (C) mẫu rễ khô và (D) mẫu cao chiết

rễ. (Mũi tên chỉ mũi hấp thu của resveratrol).
ISBN: 978-604-82-1375-6

12


Báo cáo toàn văn Kỷ yếu hội nghị khoa học lần IX Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQG-HCM
Khảo sát khả năng cảm ứng rễ tơ từ các bộ phận cây Cỏ lạc in vitro
Các bộ phận của cây Cỏ lạc in vitro 20 ngày tuổi bao gồm lá, cuống lá, thân, trụ thượng diệp, trụ hạ diệp,
tử diệp, và rễ được cảm ứng tạo rễ tơ, sau 2-3 tuần, phần trăm mẫu tạo rễ tơ và số rễ tơ trên mỗi mẫu cấy được
ghi nhận ở bảng số 4. Kết quả cho thấy mỗi bộ phận khác nhau thì khả năng cảm ứng cũng khác nhau. Trong các
bộ phận thì chỉ có lá, cuống lá và trụ hạ diệp có khả năng cảm ứng tạo rễ tơ. Phần trăm cảm ứng tạo rễ tơ và số rễ
tơ ở trụ hạ diệp là cao nhất. Mẫu cuống lá tuy có tỷ lệ cảm ứng tạo rễ cao hơn mẫu lá nhưng số rễ tơ ở cả hai mẫu
gần bằng nhau. Tất cả các mẫu đối chứng không hình thành rễ.
Hình thái rễ tơ quan sát được giống với mô tả của Mediana-Bolivar (2007), Hoàng Thị Thanh Minh và
cộng sự (2011). Chiều dày rễ trung bình khoảng 1 mm, không có lông tơ rõ ràng, có nhiều nhánh, phát triển
nhanh trên môi trường không bổ sung chất điều hòa sinh trưởng, ngoài ra rễ còn tiết nhiều phenol.
Bảng 4. Tỉ lệ tạo rễ tơ và số rễ tơ cảm ứng được từ các bộ phận khác nhau
Bộ phận

% tạo rễ tơ

Số rễ tơ

Lá

26,30c ± 12,20

2,00b ± 0,00


Cuống lá

40,95b ± 1,64

2,00b ± 1,73

Trụ hạ diệp

100,00a ± 0,00

7,33a ± 0,57

Từ những kết quả thu được, chúng tôi thấy được rằng cây Cỏ lạc có khả năng cảm ứng tạo rễ tơ với vi
khuẩn A. rhizogenes ATCC 15834. Trụ hạ diệp có khả năng cảm ứng là 100% với số rễ mỗi mẫu là 7,33, trong
khi đó Karthikeyan và cộng sự (2007) và Hoàng Thị Thanh Minh và cộng sự (2011) ghi nhận tỷ lệ cảm ứng và
số rễ từ mẫu trụ hạ diệp của cây lạc A. hypogaea L cao nhất là 73.5%; 6,77 và 75,927%; 6,676. Dựa vào những
kết quả trên, chúng tôi thấy rằng khả năng cảm ứng tạo rễ tơ bởi A. rhizogenes ATCC 15834 lên cây Cỏ lạc A.
pintoi có hiệu quả và nhiềm tiềm năng cho ứng dụng khai thác sinh khối rễ sau này.

Hình 4. Từ trái sang phải: Đối chứng, Mặt trước dĩa cảm ứng rễ tơ và Mặt sau dĩa cảm ứng rễ tơ. Mỗi thanh
ngang tương ứng với 2 cm.

Hình 5. Từ trái sang phải: Rễ tơ cảm ứng từ lá, cuống lá và trụ hạ diệp. Mỗi thanh ngang tương ứng 1 cm.

ISBN: 978-604-82-1375-6

13


Báo cáo toàn văn Kỷ yếu hội nghị khoa học lần IX Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQG-HCM

Kết hợp thủy canh trên mô hình cảm ứng rễ tơ cây Cỏ lạc in vivo
Sau khi nuôi thủy canh 20 ngày, chúng tôi tiến hành thu mẫu và ghi nhận các số liệu về chiều dài, khối
lượng tươi và khối lượng khô của bộ rễ cây Cỏ lạc được xâm nhiễm khuẩn trong điều kiện nuôi cấy thủy canh.
Kết quả được trình bày ở bảng 5.
Bảng 5. Số liệu chiều dài, khối lượng tươi và khô của mẫu rễ đối với từng phương pháp xâm nhiễm.
Nghiệm thức

Chiều dài rễ (cm)

Khối lượng tươi (g)

Khối lượng khô (g)

Đối chứng

16,52c ± 4,34

0,161c ± 0,045

0,030c ± 0,010

21,46b ± 4,31

0,694a ± 0,190

0,072a ± 0,019

24,71a ± 3,50

0,372b ± 0,187


0,044b ± 0,013

Tạo vết thương kết hợp
đồng nuôi cấy
Tiêm khuẩn

Hình 6. Rễ của các nghiệm thức (A) Đối chứng, (B) Phương pháp tạo vết thương kết hợp đồng nuôi cấy, (C)
Phương pháp tiêm khuẩn. Mỗi thanh dọc tương ứng 20 cm.
Kết quả về ba chỉ tiêu theo dõi ở bảng 5 cho thấy, cả hai phương pháp cảm ứng rễ trên cây Cỏ lạc A. pintoi
được nuôi cấy trong điều kiện thủy canh đều cho số liệu cao hơn hẳn đối chứng. Cụ thể, xét về chiều dài thì
phương pháp tiêm khuẩn cho chiều dài rễ cao nhất là 24,71 ± 3,50 cm. Tuy xét về chiều dài thì phương pháp tạo
vết thương kết hợp đồng nuôi cấy đứng sau phương pháp tiêm khuẩn nhưng ở chỉ tiêu khối lượng tươi và khối
lượng khô ở phương pháp này lại cho hiệu quả cao nhất với các số liệu lần lượt là 0,072 ± 0,019 g; 0,694 ± 0,190
g. Ngoài ra, quan sát ở hình số 6, ta có thể thấy hiệu quả tạo rễ từ hai phương pháp rất tốt, bộ rễ ở hai phương
pháp sau 20 ngày nuôi cấy đều phát triển hơn bộ rễ ở mẫu đối chứng. Ở vùng trụ hạ diệp của cây đồng nuôi cấy
với dịch khuẩn sau khi tạo vết thương, rễ mọc ra nhiều hơn và dài hơn ở cây được tiêm khuẩn. Các phương pháp
tạo vết thương kết hợp đồng nuôi cấy hiện đang được sử dụng rộng rãi trên thế giới. Sanghamitra Khandual và
cộng sự (2014) đã cho thấy phương pháp xâm nhiễm Agrobacterium rhizogenes bằng dao ở vùng trụ hạ diệp cây
Phaseolus vulgaris cho hiệu suất tạo rễ tơ là 100% và xác suất biểu hiện gen chuyển là 100% trong khi đó
phương pháp tiêm khuẩn cho hiệu suất cảm ứng từ 60 đến 80%, biểu hiện gen chuyển chỉ từ 20 đến 60%. Từ đó,
ta có thể ứng dụng phương pháp xâm nhiễm tạo rễ tơ này với mục đích thu nhận một lượng lớn sinh khối rễ
trong thủy canh, cũng như tạo ra các chế phẩm vi sinh phục vụ cho mục đích này.

Hình 7. Bộ phận trụ hạ diệp của (A) Đối chứng, (B) Phương pháp xâm nhiễm kết hợp đồng nuôi cấy, (C)
Phương pháp tiêm khuẩn. Mỗi thanh dọc tương ứng với 1 cm.

ISBN: 978-604-82-1375-6

14



Báo cáo toàn văn Kỷ yếu hội nghị khoa học lần IX Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQG-HCM
Kiểm tra gen chuyển với các mẫu rễ tơ cảm ứng in vitro và trong điều kiện nuôi cấy thủy canh
Các mẫu DNA sau khi tách chiết được tiến hành chạy PCR với cặp mồi đặc hiệu rolBF và rolBR, nhằm
khuếch đại trình tự 423bp của gen rolB. Kết quả điện di trên bảng gel cho thấy ngoại trừ giếng của sản phẩm
PCR từ rễ in vitro và rễ đối chứng in vivo, các giếng nạp mẫu các sản phẩm rễ cảm ứng đều xuất hiện 1 vạch
phát quang ở vị trí 423bp cùng vị trí với mẫu chứng dương. Rõ ràng, trình tự mục tiêu của gen rolB với chiều dài
423bp đã được khuếch đại ở mẫu chứng dương (Ri-plasmid của vi khuẩn A. rhizogenes ATCC 15834) và các
mẫu rễ tơ từ trục hạ diệp (bộ phận cho tỷ lệ cảm ứng rễ tơ cao nhất), mẫu rễ cảm ứng từ phương pháp tiêm khuẩn
và phương pháp tạo vết thương kết hợp đồng nuôi cấy mà không khuếch đại ở các mẫu rễ không được biến nạp.
Từ đó, ta có thể kết luận rằng gen rolB từ Ri-plasmid của vi khuẩn đã sáp nhập vào bộ gen của rễ tơ in vitro và
rễ nuôi thủy canh của cây Cỏ lạc A. pintoi Krabov & W.C.Gregory..

Hình 8. Kết quả điện di sản phẩm PCR của cặp mồi rolBF và rolBR. Giếng 1: sản phẩm PCR bộ gen rễ tơ cảm
ứng từ trụ hạ diệp; Giếng 2: sản phẩm PCR của Ri-plasmid 15834; Giếng 3: sản phầm PCR của mẫu nước;
Giếng 4: Thang 100bp; Giếng 5: sản phẩm PCR của mẫu rễ in vitro đối chứng; Giếng 6: sản phẩm PCR của mẫu
rễ in vivo thủy canh đối chứng; Giếng 7: sản phẩm PCR của mẫu rễ tơ từ phương pháp tạo vết thương kết hợp
đồng nuôi cấy; Giếng 8: sản phẩm PCR của mẫu rễ tờ từ phương pháp tiêm khuẩn.
KẾT LUẬN
Thông qua nghiên cứu này, chúng tôi thấy rằng cây Cỏ lạc Arachis pintoi Krabov & W.C.Gregory. hoàn
toàn có thể sử dụng như một nguồn nguyên liệu để thu nhận resveratrol. Cả ba bộ phận đều chứa stilbene, trong
đó lá là bộ phận chứa hàm lượng stilbene cao nhất. Rễ của cây Cỏ lạc được chứng minh rõ ràng có sự hiện diện
của resveratrol với hàm lượng khá cao. Vì vậy ngoài những lợi ích về mặt mỹ quan và nông học, cây Cỏ lạc còn
có thể có ích đối với sức khỏe con người. Chúng tôi cũng đã chứng minh được khả năng cảm ứng rễ tơ của cây
Cỏ lạc. Cụ thể, đối với thí nghiệm cảm ứng rễ tơ từ các bộ phận, lá, cuống lá và trụ hạ diệp đều có khả năng cảm
ứng, trong đó trụ hạ diệp là bộ phận có tỷ lệ cảm ứng và số rễ tơ trên mỗi mẫu cao nhất. Phương pháp xâm
nhiễm tạo vết thương kết hợp đồng nuôi cấy với vi khuẩn A. rhizogenes ATCC 15834 trong thủy canh trên các
cá thể Cỏ lạc cho hiệu quả cao nhất, khối lượng tươi và khô của bộ rễ của phương pháp này cao hơn hẳn so với
phương pháp tiêm khuẩn. Rễ tơ cảm ứng từ các nguồn cho thấy tín hiệu khuếch đại dương tính khi thực hiện

phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu gen rolB. Các kết quả trên cho thấy, chúng tôi có thể chủ động tạo ra và
tăng sinh sinh khối rễ tơ Cỏ lạc và nguồn cây này lại có nhiều tiềm năng có thể được sử dụng để thu nhận
resveratrol.

RESEARCH OF USING PINTO PEANUT (ARACHIS PINTOI KRABOV & W.C.GREGORY)
AS A SOURCE FOR RESVERATROL PRODUCTION.
Vũ Thị Bạch Phƣợng, Trần Quốc Tân, Phạm Công Thủy Tiên, Quách Ngô Diễm Phƣơng, Bùi Văn Lệ
Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQG-HCM
ABSTRACT
Resveratrol, a compound belonging to the group of secondary metabolites - phytoalexin, is best
known for outstanding biological activities such as antioxidant, anti-inflammatory, cancer, heart
disease and aging prevention. The demand forresveratrol use and commercialization is increasing
everyday, while the amount of natural resveratrol extract is extremely low. Finding and developing new
ISBN: 978-604-82-1375-6

15


Báo cáo toàn văn Kỷ yếu hội nghị khoa học lần IX Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQG-HCM
sources containing resveratrol istherefore necessary and important. Pinto peanut (Arachis pintoi
Krabov & W.C. Gregory) is currently only planted as decorative lawns in parks and fields. Pinto peanut
shares the same family with Groundnuts (Arachis hypogaea L.)-a source to obtain resveratrol that has
been studied by Chen et al (2001). The presence of resveratrol in roots of Pinto peanut is
demonstratedusing the Thin Chromatography, UV 308nm absorbance measurements and HPLC-UV.
As resveratrol content is relatively high in roots, Pinto peanut can be used as a material to obtain
resveratrol. Also, to actively proliferate roots as materials, hairy roots induction technique from in vitro
thin layer explantsand in vivo hydroponicsindividualsis conducted through the exploitation of the ability
to produce hairy roots of Agrobacterium rhizogenes ATCC 15834.
Key words: Pinto peanut (Arachis pintoi Krabov & W. C. Gregory), resveratrol, hairy roots,
Agrobacterium rhizogenes ATCC 15834

TÀI LIỆU THAM KHẢO
[1.] Hoàng Thị Thanh Minh, Quách Ngô Diễm Phương, Bùi Văn Lệ, Nghiên cứu quy trình chuyển gen tạo rễ
tơ in vitro cây đậu phộng (Arachis hypogaea L.) nhờ vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes nhằm thu nhận
resveratrol. Tạp chí Công nghệ Sinh học 9(4A), (2011): tr. 665-672.
[2.] Aggarwal B.B. and Shishodia S., Resveratrol in Heath and Disease. Taylor and Fancis Gourp, (2006),
USA.
[3.] Aggarwal B.B., Bhardwaj A., Aggarwal R.S., Seeram N.P., Shishodia S. and Takada Y, Role of
Resveratrol in Peventiion and Therapy of Cancer: Preclinical and Clinical Sttudies, Anticancer Research,
24(2004): pp. 1-60.
[4.] Chen R.S., Wu P.L and Chiou R. Y. Y, Peanut Roots as a Rourse of Resveratrol, Journal of Agricultural
and Food chemistry, 50 (2002): pp. 1665-1667.
[5.] FurnernI.J., Huffman G.A, Amaasino R.M., Garfinkel D.J., Gordon M.P., And Nester E.W., An
Agrobacterium transformation in the evolution of the genus Nicotiana, Nature,319 (1986): pp. 422-428.
[6.] Karthikeyan A., Palanivel S., and Bhakyaraj R., Hairy root induction from hypocotyls segments of
groundnut (a = Arachis hypogaea L.), African Journal of Biotechnology 6 (2007): pp.1817-1820.
[7.] Kim JS, Lee SY, Park SU, Resveratrol production in hairy root of peanut, Arachis hypogaea L.
transformed with different Agrobacterium rhizogenes strains. African Journal of Biotechnology 7 (2008):
pp. 3788-3790.
[8.] Krapovickas, A. and Gregory, W.C. Taxonomia of th genus Arachis (Leguminosae), Bonplandia, VIII
(1994): p. 81-83.
[9.] Lan X., Quan H., Hairy root culture of Przewalskia tanguitia for enhanced production of pharmaceutical
tropane alkaloids, Journal of Medicinal Plant Research 4 (2010): pp. 1477-1481.
[10.] Media-Bolivar F, Condori J, Rimando AM, Hubstenberger J, Shelton K, O‟Keefe SF, Benett S and Dolan
MC, Production and secretion of resveratrol in hairy root culturesof peanut, Phytochemistry, 68 (2007):
pp. 1992-2003
[11.] Nuno Ratola, Joaquim Luís Faria and Arminda Alves, Analysis and Quantification of trans- Resveratrol
in Wines from Alentejo Region (Portugal), Food Technol, Biotechnol 42(2) (2004): pp. 125-130.
[12.] Sanghamitra Khandual, Pallavolu Maheswara Reddy, Rapid, Efficient and High-Performance Protocol for
Agrobacterium rhizogenes-Mediated Hairy Root Transformation of the Common Bean Phaseolus
vulgaris, Scientific research (2014): pp. 332-339.

[13.] Sinkar VP, White FF, Gordon MP, Molecular biology of Ri-plasmid, J Biosci – Indian Acad Sci 11
(1987): pp. 47-57.
[14.] Stewart C.n Jr and Via L.E., A rapid CTAB DNA isolation technique useful for RAPD fingerprinting and
other PCR application, Biotechniques, 14 (1993): pp. 748-751.
[15.] Veena V. and Christopher G. T, Review.Agrobacterium Rhizogenes: recent developmens and promising
applications, In vitro Cellular & Developmental Biology- Plant, 43 (2007): pp. 383-403.
[16.] Zhang, A., et al, Occurrence and estimation of trans- resveratrol in one-year-old canes from seven major
Chinese grape producing regions, Molecules, 16(4) (2011): pp. 2846-61.

ISBN: 978-604-82-1375-6

16


Báo cáo toàn văn Kỷ yếu hội nghị khoa học lần IX Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQG-HCM
IV-O-1.8

ẢNH HƢỞNG CỦA N, P, K, CYTOKININ VÀ STRESS NƢỚC LÊN THỜI GIAN RA HOA
CỦA DENDROBIUM SONIA
Trần Hà Tƣờng Vi, Nguyễn Du Sanh
Trường Đại học học Khoa học Tự nhiên, ĐHQG – HCM
TÓM TẮT
Lan Dendrobium Sonia thường được sử dụng như hoa cắt cành và trồng trong chậu do màu sắc
đẹp tuy nhiên quá trình tăng trưởng thường kéo dài 13 tháng sau khi được trồng ngoài vườn. Các tỷ lệ
N: P: K khác nhau, kết hợp với benzyladenin (BA) và ngưng tưới nước được khảo sát để rút ngắn thời
gian ra hoa của Dendrobium Sonia. Những cây lan sau khi trồng 6 tháng với nền phân bón (PB) N,P,K
theo nồng độ tăng P có thể rút ngắn thời gian ra hoa nhưng sớm hơn đối chứng không nhiều. Với nền
phân có chứa 50 mg/l N, 100 mg/l P, 50 mg/l K kết hợp phun 100 mg/l BA cây lan cho chồi hoa sớm
(sau 30 ngày xử lý) tuy nhiên tỷ lệ cây mang chồi hoa thấp (20%). Với nền phân có chứa 50 mg/l N,
100 mg/l P, 50 mg/l K, kết hợp xử lý ngưng tưới nước 2 tuần và phun 100 mg/l BA, cây ra hoa sớm

(sau 30 ngày xử lý) và tỷ lệ cây mang chồi hoa cao (73,3%). Những cây đối chứng phun N, P, K theo
nồng độ 50 mg/l N, 100 mg/l P, 50 mg/l K chỉ cho 13,3% chồi hoa sau 120 ngày xử lý.
Từ khóa: Dendrobium Sonia, BA, N,P,K, stress nước
MỞ ĐẦU
Dendrobium là một loại cây cảnh được nhiều người ưa chuộng do giá thành hợp lý, màu sắc và hình dạng
phong phú. Hoa màu trắng, vàng, hồng hay tím và các màu sắc khác của cây lai. Số lượng loài được phát hiện
của giống lan này đã hơn 1.200 loài. Hiện nay Dendrobium Sonia được trồng như một loại cây cho hoa cắt cành
theo quy mô công nghiệp cho hiệu quả kinh tế cao. Tuy nhiên, Dendrobium Sonia có thời kỳ ấu niên kéo dài
thông thường đến 13 tháng. Vì vậy, rút ngắn thời gian sinh trưởng của lan, kích thích cho cây lan ra hoa sớm và
theo chủ đích của người trồng là một việc làm cần thiết.
VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP
Vật liệu
Cây Dendrobium Sonia lấy ra từ chai nuôi cấy mô được bó trong các thanh xơ dừa dài khoảng 4 cm, đặt
trong chậu nhựa dài 4 cm, đường kính 4 cm. Cây được trồng 6 tháng ngoài vườn có 3 lá, 2 thân được dùng làm
vật liệu thí nghiệm.
Phương pháp
Sử dụng phương pháp thí nghiệm ngoài đồng theo bố trí khối hoàn toàn ngẫu nhiên (Randomized
Complete Block Design RCBD).
Phân tích thống kê: các số liệu được xử lý bằng chương trình Statistical Program Scientific System (SPSS)
11,5 cho Windows.
Thí nghiệm 1. Ảnh hưởng của N, P, K lên thời gian ra hoa của Dendrobium Sonia
Thí nghiệm ảnh hưởng của N, P, K ở các nồng độ khác nhau. Với công thức PB1 (100 mg/l N, 50 mg/l P,
100 mg/l K), PB2 (30 mg/l N, 50 mg/l P, 100 mg/l K), PB3 (30 mg/l N, 100 mg/l P, 100 mg/l K), PB4 (50 mg/l
N, 100 mg/l P, 50 mg/l K) được khảo sát.
Từ thí nghiệm 1, công thức PB4 (50 mg/l N, 100 mg/l P, 50 mg/l K) được sử dụng cho các thí nghiệm tiếp
theo.
Thí nghiệm 2. Ảnh hưởng của BA lên th
ời gian ra hoa của Dendrobium Sonia
Thí nghiệm ảnh hưởng v ới các nồng độ BA khác nhau (0, 100, 200, 300 mg/l) phối hợp với nền phân bón
của công thức PB4 (50 mg/l N, 100 mg/l P, 50 mg/l K) được khảo sát.

Từ thí nghiệm 2, BA ở nồng độ 100 mg/l được dùng cho các thí nghiệm về sau.
Thí nghiệm 3. Ảnh hưởng của N , P, K, 100 mg/l BA và stress nước lên th ời gian ra hoa của Dendrobium
Sonia
Thí nghiệm ảnh hưởng của công th ức PB4 (50 mg/l N, 100 mg/l P, 50 mg/l K) hay công thức PB4 (50 mg/l
N, 100 mg/l P, 50 mg/l K) phối hợp 100 mg/l BA; stress nước phối hợp với công thức PB4 (50 mg/l N, 100 mg/l
P, 50 mg/l K); stress nước phối hợp 100 mg/l BA và với các công thức phân bón khác nhau (PB1, PB2, PB3,
PB4).

ISBN: 978-604-82-1375-6

17


Báo cáo toàn văn Kỷ yếu hội nghị khoa học lần IX Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQG-HCM
Điều kiện xử lý: địa điểm thí nghiệm có cường độ ánh sáng 21.000 ± 200 lux, độ ẩm 70 ± 3%, nhiệt độ 30
± 2oC (đo lúc 11 giờ sáng).
Nước được tưới bằng hệ thống tự động 1 lần/ngày vào 4 giờ chiều.
Tưới phân: tưới dung dịch phân vào 8-9 giờ sáng. Sau khi mặt lá ráo nước (khoảng 15 phút), tưới lại bằng
nước sạch. Tưới 2 lầ n/tuần trong 2 tuần liên tiếp theo các nghiê ̣m thức , sau đó tư ới 100 mg/l N, 50 mg/l P, 100
mg/l K các tuần tiếp theo.
Xử lý BA: phun dung dịch BA vào lúc 5 giờ chiều, phun 1 lầ n/tuầ n, liên tiế p trong 4 tuầ n, phun 15 ml cho
mỗi chậu.
Điều kiện stress nước: đặt cây vào nhà lưới có mái che với cường độ ánh sáng 20.000 lux, độ ẩm 65%,
không tưới hoàn toàn trong 2 tuần. Sau đó, ngâm cây trong nước 10 phút và bố trí theo từng nghiệm thức.
Quan sát thời gian xuất hiện phát hoa, ghi nhận % cây có chồi hoa nhú 2 mm.
Giải phẫu mô học
Chồi cây trong giai đoạn sinh trưởng được dùng để giải phẫu mô phân sinh ngọn chồi (SAM). Chồi nhú ra
khoảng 2 mm từ bề mặt giả hành được dùng làm mẫu giải phẫu mô phân sinh phát hoa.
Cường độ quang hợp và hô hấp
Lá ở gần phát hoa khi phát hoa phát triển được 15 ngày và lá thứ nhất (tính từ trên xuống) ở những cây đối

chứng được dùng để đo cường độ quang hợp và hô hấp.
Cường độ quang hợp và hô hấp của mẫu được đo bằng áp kế Warburg, ở 25oC, ánh sáng 2.000 lux (đo
quang hợp) hoặc trong tối (đo hô hấp). Cường độ quang hợp có đơn vị đo là µlO2/cm2/giờ, cường độ hô hấp có
đơn vị đo là µlO2/g/giờ (Nguyễn Du Sanh và csv, 2013).
Hoạt tính các chất điều hòa tăng trưởng thực vật
Lá thứ nhất tính t ừ trên xuống ở những cây đối chứng và lá ở gần phát hoa lúc cây xuất hiện phát hoa sau
15 ngày được dùng để xác định hoạt tính các chất điều hòa tăng trưởng nội sinh. Sắc ký bản mỏng, diệp tiêu lúa,
tử diệp dưa leo và cây mầm xà lách được dùng làm sinh trắc nghiệm (Nguyễn Du Sanh và csv, 2013).
Hàm lượng đường và tinh bột
Lá thứ nhất tính từ trên xuống ở những cây đối chứng. Lá ở gần phát hoa lúc cây xuất hiện phát hoa sau 15
ngày được dùng để xác định hàm lượng đường và tinh bột.
Xác định đường chuẩn: các ống nghiệm chứa dung dịch đường saccharose ở các nồng độ khác nhau (10,
20, 30, 40, 50, 60, 70 µg/l) có chứa phenol 5% và acid sunfuric đậm đặc. Dịch phản ứng được so màu bằng
quang phổ kế ở bước sóng 490 nm (Phạm Thị Ánh Hồng và csv, 2004).
Hàm lượng đường và tinh bột được ly trích và đo theo Combs và csv, 1987.
KẾT QUẢ
Thí nghiệm 1. Ảnh hưởng của N, P, K ở các nồng độ khác nhau lên thời gian ra hoa của Dendrobium Sonia.
Sau 30 ngày kể từ ngày đầu tiên xử lý, cây thuộc các nghiệm thức không phát sinh chồi hoa. Tuy nhiên, sau
120 ngày xử lý có 13,3% cây cho chồi hoa khi xử lý phân bón theo công thức PB4 (50 mg/l N, 100 mg/l P, 50
mg/l K), trong khi ở lô đối chứng PB1 (100 mg/l N, 50 mg/l P, 100 mg/l K) thì sau 210 ngày mới có 13,3% cây
cho chồi hoa (bảng 1).
Bảng 1. N, P, K ảnh hưởng đến thời gian ra hoa của Dendrobium Sonia

PB1

% chồi hoa hình
thành sau
30 ngày
0


PB2

0

13,3

13,3

PB3

0

26,7

26,7

Nghiệm thức

% chồi hoa hình
thành sau
120 ngày

% chồi hoa hình
thành sau
150 ngày

% chồi hoa hình
thành sau
210 ngày
13,3


13,3
13,3
13,3
PB4
0
PB1 (100 mg/l N, 50 mg/l P, 100 mg/l K), PB2 (30 mg/l N, 50 mg/l P, 100 mg/l K), PB3 (30 mg/l N, 100 mg/l P,
100 mg/l K), PB4 (50 mg/l N, 100 mg/l P, 50 mg/l K)
N, P, K không có hiệu quả khi cảm ứng gợi chồi hoa sớm ở cây Dendrobium Sonia 6 tháng tuổi. Cây xử lý
với công thức PB4 (50 mg/l N, 100 mg/l P, 50 mg/l K) thì sau 120 ngày mới cho 13,3% cây mang chồi hoa. Sự
ra hoa này sớm hơn so với cây đối chứng (công thức PB1) đến 90 ngày. Vì vậy, công thức PB4 sẽ được sử dụng
cho các thí nghiệm tiếp theo.
ISBN: 978-604-82-1375-6

18


Báo cáo toàn văn Kỷ yếu hội nghị khoa học lần IX Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQG-HCM
Thí nghiệm 2. Ảnh hưởng của BA lên th ời gian ra hoa của Dendrobium Sonia.
BA có tác dụng trong việc kích thích lan Dendrobium Sonia ra hoa sớm. Với các nghiệm thức có sử dụng
BA, cây đều cảm ứng cho ra hoa sớm sau 30 ngày xử lý, trong khi ở lô đối chứng PB4 (50 mg/l N, 100 mg/l P,
50 mg/l K) sau 120 ngày xử lý mới xuất hiện chồi hoa ở tỷ lệ 13,3%. Dù sử dụng BA ở những nồng độ khác
nhau (100 mg/l, 200 mg/l hay 300 mg/l) đều cho tỷ lệ cây ra hoa tương tự nhau (20%) sau 30 ngày xử lý. Sau
120 ngày, các nghiệm thức xử lý với BA đều đồng loạt cho thêm 13,3% cây ra hoa (bảng 2).
Bảng 2. Ảnh hưởng của BA lên thời gian ra hoa của Dendrobium Sonia
Nghiệm thức
PB4

% chồi hoa hình
thành sau

30 ngày
0

% chồi hoa hình
thành sau
120 ngày
13,3

PB4 + 100 mg/l BA
20
PB4 + 200 mg/l BA
20
PB4 + 300 mg/l BA
20
PB4 (50 mg/l N, 100 mg/l P, 50 mg/l K)

33,3
33,3
33,3

Thí nghiệm 3. Ảnh hưởng của N, P, K, BA và stress nước lên thời gian ra hoa của Dendrobium Sonia.
Nghiệm thức stress nước kết hợp với phân bón công thức PB4 (50 mg/l N, 100 mg/l P, 50 mg/l K) và BA ở
nồng độ 100 mg/l có hiệu quả tốt nhất khi cảm ứng cho ra 73,3% cây ra hoa sau 30 ngày xử lý. Còn với nghiệm
thức phân bón PB4 (50 mg/l N, 100 mg/l P, 50 mg/l K) phối hợp với dung dịch 100 mg/l BA chỉ cho 20% cây ra
hoa. Trong khi đó những cây chỉ phun phân bón với công thức PB4 cho 13,3% cây ra hoa sau 120 ngày (bảng 3,
hình 1).
Bảng 3. Ảnh hưởng của N, P, K, BA và stress nước đến thời gian ra hoa của Dendrobium Sonia

PB4


% chồi hoa hình
thành sau
30 ngày
0,0

% chồi hoa hình
thành sau
120 ngày
13,3

PB4+100 mg/l BA

20,0

33,3

Stress nước+PB4

Nghiệm thức

20,0

20,0

Stress nước+PB1+100 mg/l BA

53,3

53,3


Stress nước+PB2+100 mg/l BA

66,7

66,7

Stress nước+PB3+100 mg/l BA

66,7

66,7

Stress nước+PB4+100 mg/l BA
73,3
73,3
PB1 (100 mg/l N, 50 mg/l P, 100 mg/l K), PB2 (30 mg/l N, 50 mg/l P, 100 mg/l K), PB3 (30 mg/l N, 100 mg/l P,
100 mg/l K), PB4 (50 mg/l N, 100 mg/l P, 50 mg/l K)

Hình 1. Các cây ở nghiệm thức đối chứng (a) và nghiệm thức stress nước (b) sau 50 ngày xử lý

ISBN: 978-604-82-1375-6

a

19

b


Báo cáo toàn văn Kỷ yếu hội nghị khoa học lần IX Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQG-HCM

Như vậy, sự stress nước kết hợp với phân bón có chứa 50 mg/l N, 100 mg/l P, 50 mg/l K và 100 mg/l BA
phù hợp để xử lý lan Dendrobium Sonia ra hoa sớm (sau 30 ngày xử lý) và cho tỷ lệ cây mang chồi hoa cao
(73,3%).
Giải phẫu mô học
Sự chuyển tiếp ra hoa bắt đầu bởi sự tăng kích thước của mô phân sinh ngọn chồi. Đỉnh chồi trở nên dày,
rộng hơn và kéo dài thành dạng hình vòm rộng, sinh ra các phác thể lá bắc ở vùng viền của đỉnh và các tế bào
trong các mô có phân biệt rõ các vách tế bào trơn, nhỏ, chứa đầy tế bào chất (hình 2).

Hình 2. Sự khác biệt của mô phân sinh ngọn chồi (SAM) (a)
và mô phân sinh hoa (b) lan Dendrobium Sonia
Cường độ quang hợp, hô hấp
Cường độ hô hấp ở cây trong giai đoạn sinh sản cao hơn so với cây vẫn trong thời kỳ sinh trưởng. Cường
độ quang hợp giữa 2 giai đoạn này khác biệt không có ý nghĩa về mặt thống kê (bảng 4).
Bảng 4. Sự thay đổi cường độ quang hợp và cường độ hô hấp trong giai đoạn sinh dưỡng và sinh sản
Nội dung đo

Sinh dưỡng

Sinh sản

Cường độ quang hợp (µlO2/cm2/giờ)

0,45 ± 0,04

0,76 ± 0,03

Cường độ hô hấp (µlO2/g/giờ)

5,08 ± 0,53


9,23 ± 0,41(*)

(*): sự khác biệt có ý nghĩa ở mức 95%
Hoạt tính các chất điều hòa tăng trưởng thực vật
Khi chuyển từ giai đoạn sinh dưỡng sang sinh sản, hàm lượng ABA giảm dần, GA3 tăng dần, hàm lượng
IAA giảm nhẹ trong khi hàm lượng zeatin tăng nhẹ (bảng 5).
Bảng 5. Sự thay đổi các chất điều hòa tăng trưởng thực vật trong giai đoạn sinh dưỡng và sinh sản
Nội dung đo
Sinh dưỡng
Sinh sản
GA3 (mg/l)
0,20 ± 0,08b
1,50 ± 0,08a
IAA (mg/l)
0,73 ± 0,03a
0,13 ± 0,007b
b
Zeatin (mg/l)
0,42 ± 0,02
0,56 ± 0,02a
b
ABA (mg/l)
0,48 ± 0,09
0,14 ± 0,00c
Các số trung bình trong hàng với các mẫu tự khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa ở mức p=0,05
Hàm lượng đường và tinh bột
Khi chuyển từ giai đoạn sinh dưỡng sang sinh sản, hàm lượng đường và tinh bột đều tăng đáng kể (bảng 6).
Bảng 6. Hàm lượng đường và tinh bột trong 1 g trọng lượng tươi (TLT) lá giai đoạn sinh dưỡng và sinh sản
Nội dung đo
Hàm lượng Glucose (mg/g TLT)

Hàm lượng Tinh bột (mg/g TLT)
(*): sự khác biệt có ý nghĩa ở mức 95%

Sinh dưỡng
0,67 ± 0,01
0,03 ± 0,008

Sinh sản
1,14 ± 0,02(*)
0,19 ± 0,03(*)

THẢO LUẬN
Tác động của N, P, K lên việc ra hoa ở lan Dendrobium Sonia: dinh dưỡng là một yếu tố thường được sử
dụng để kích thích ra hoa ở thực vật trưởng thành trên nguyên lý tỷ lệ C/N thích hợp. Đối với những cây
Dendrobium Sonia còn trong giai đoạn ấu niên thì việc sử dụng N, P, K để cảm ứng ra hoa có hiệu quả chậm.
Trong thực tế, thực vật phải hoàn tất chu trình sinh trưởng hoặc chúng phải đạt được một kích thước nhất định
ISBN: 978-604-82-1375-6

20


Báo cáo toàn văn Kỷ yếu hội nghị khoa học lần IX Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQG-HCM
mới có khả năng phát sinh hoa (Pfeifer và csv, 2006). Tuy nhiên khi hàm lượng N cao (100 mg/l N), sự cạnh
tranh giữa sinh dưỡng và sinh sản làm ức chế quá trình ra hoa cho nên sau 210 ngày xử lý mới có 13,3% cây
mang chồi hoa. Khi các cây đã thành thục, quá trình cảm ứng có lẽ không bị chi phối bởi sự cạnh tranh giữa giai
đoạn sinh dưỡng và sinh sản nhiều nữa mà chủ yếu phụ thuộc vào môi trường (ánh sáng, nhiệt độ, độ ẩm...). Yếu
tố dinh dưỡng được xem là không có tác động nhiều lên quá trình ra hoa của thực vật so với các yếu tố môi
trường khác (nhiệt độ, ánh sáng, độ ẩm...) (Salisbury, 1955).
P giúp điều hòa hoạt động sinh lý thực vật, đóng vai trò quan trọng trong quá trình chuyển tiếp ra hoa.
Những nghiệm thức có nồng độ P cao (50 mg/l) hoặc cho cây ra hoa sớm (120 ngày sau ngày đầu tiên xử lý)

hoặc cho tỷ lệ chồi hoa cao (26,7%) sau 150 ngày xử lý so với P thấp (bảng 1). Tuy nhiên, P cao lại không cần
thiết đối với những cây Dendrobium đã thành thục (Bichsel và Starman, 2008).
Tác động của BA lên việc ra hoa ở lan Dendrobium Sonia: BA có hiệu quả khi cảm ứng gợi chồi hoa sớm
trên Dendrobium Sonia. Xử lý với BA (100 mg/l) có 20% cây ra hoa so với đối chứng (không phun BA) sau đó
90 ngày mới cho chồi hoa. Các kết quả này cũng tương tự trên Dendrobium Angel White (Nambiar và csv, 2012)
với 85% cây ra hoa sau 53 ngày, Dendrobium Louisae (Goh, 1979) với 80% cây ra hoa sau 7-9 ngày xử lý. BA
ngoại sinh có thể đã làm tăng hoạt tính cytokinin nội sinh (bảng 5) để tác động lên đỉnh sinh trưởng của lan
Dendrobium Sonia, chính vì vậy mà khả năng cảm ứng chuyển tiếp từ SAM sang mô phân sinh hoa mới diễn ra
nhanh chóng. Một mặt khác BA có thể làm kích thích hoạt động của các gen quang hợp, làm tăng cường độ
quang hợp thông qua tăng cường tổng hợp diệp lục tố và làm mở rộng diện tích lá (Eng và Lian, 2001). Tuy
nhiên cường độ quang hợp giữa 2 giai đoạn này lại không có sự khác biệt mang tính thống kê. Điều này có thể
do quá trình stress nước trước đó đã ức chế phần nào khả năng quang hợp.
Tác động của stress nước và BA lên việc ra hoa ở lan Dendrobium Sonia: stress nước làm cản tăng trưởng
thực vật (Bùi Trang Việt, 2002), làm chậm quá trình phát sinh chồi mới trên lan Dendrobium Sonia (kết quả
không được nêu ra). Stress nước trên lan Dendrobium Sonia được xem như một tác nhân tương tự như mùa khô
tuyệt đối để cảm ứng ra hoa theo mong muốn có thể đã kích thích sinh ra prolin, một loại acid amin có liên quan
đến việc ra hoa (Mattioli và csv, 2009).
Stress nước làm cho các cây phát triển chậm lại và “đón” đúng thời điểm phun BA nên hiện tượng gợi hoa
diễn ra. Nếu BA được xử lý khi đỉnh sinh trưởng đang phát triển mạnh hay lúc đỉnh sinh trưởng đã ngừng (khi
này auxin trong giả hành giảm thì đều không thích hợp cho việc cảm ứng ra hoa (Goh, 1979)). Như vậy, quá
trình phát triển của chồi hoa cũng phải được điều hòa bởi các chất điều hòa tăng trưởng thực vật trong đó có
IAA. IAA có thể di chuyển từ lá đến phát hoa nên trong phát hoa có hoạt tính IAA tăng dần qua các giai đoạn
phát triển (Trịnh Cẩm Tú và Bùi Trang Việt, 2006). ABA được biết đến như hormon ức chế tăng trưởng ở thực
vật, điều khiển quá trình ngủ ở thực vật (Öpik và Rolfe, 2005). Có thể do đó mà ABA giảm ở những cây đang
trong giai đoạn sinh sản. Giberelin có vai trò kích thích sự tăng trưởng chồi được huy động về lá và sau đó được
chuyển đến chồi hoa nên trong giai đoạn sinh sản có hoạt tính giberelin trong lá cao hơn trong giai đoạn sinh
dưỡng. Bên cạnh đó, hàm lượng đường và tinh bột trong lá tăng cũng phù hợp khi cường độ hô hấp tăng trong
thời kỳ cây mang phát hoa. Đường được xem như là nguyên liệu của quá trình hô hấp, thông qua quá trình hô
hấp được chuyển hóa tạo nên năng lượng cần thiết cho quá trình sinh sản ở thực vật.
Như vậy quá trình ra hoa được điều khiển bởi nhiều hormon khác nhau, BA là một trong số đó. Stress nước

cũng có hiệu quả trong quá trình cảm ứng ra hoa trên Dendrobium Sonia. Khi kết hợp stress nước với BA sẽ làm
tăng hiệu quả ra hoa sớm trên Dendrobium Sonia.
KẾT LUẬN
Dung dịch BA ở nồng độ 100 mg/l và stress nước có hiệu quả cảm ứng ra hoa sớm ở lan Dendrobium
Sonia khi được xử lý riêng lẽ (sau 30 ngày xử lý), tuy nhiên tỷ lệ cây mang chồi hoa thấp (20%).
Stress nước kết hợp với phân bón có chứa 50 mg/l N, 100 mg/l P, 50 mg/l K và BA ở nồng độ 100 mg/l
cho tỷ lệ cây có chồi hoa cao nhất, đạt 73,3% sau 30 ngày xử lý ở lan 6 tháng tuổi.
Với việc xử lý P cao cũng hiệu quả cảm ứng ra hoa sớm trên lan Dendrobium Sonia tuy nhiên thời gian
sớm hơn so với đối chứng không đáng kể.

ISBN: 978-604-82-1375-6

21


Báo cáo toàn văn Kỷ yếu hội nghị khoa học lần IX Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQG-HCM
EFFECT OF N, P, K, CYTOKININ AND WATER STRESS ON THE FLOWERING TIME
OF DENDROBIUM SONIA
Tran Ha Tuong Vi, Nguyen Du Sanh*
Faculty of Biology, University of Science, VNU-HCM
ABSTRACT
Dendrobium Sonia is commonly used as flowers cutting and planted in pots because of beautiful
color, however the process of growth usually lasts 13 months after planting at garden. Different ratio
N: P: K, in combination with benzyl adenine (BA) and stress water were investigated to shorten
flowering time of Dendrobium Sonia. Dendrobium Sonia plants (planted at garden 6 months), which
treated with N, P, K with high concentration of P, could shorten flowering time but not much earlier
than control plants. Dendrobium Sonia which sprayed N 50 mg/l + P 100 mg/l + K 50 mg/l and BA
100 mg/l had flower buds early (after 30 days), however the rate of flowering plant was low (20%).
Orchids, which were stopped watering in 2 weeks, sprayed the N 50 mg/l + P 100 mg/l + K 50 mg/l
and BA 100 mg/l, had flower buds early (after 30 days) and the rate of flowering plant was high

(73,3%). Control plants which sprayed N, P, K at 50 mg/l N+ 100 mg/l P+ 50 mg/l K had 13,3%
flowering plants after 120 days.
Keywords: Dendrobium Sonia, BA, N,P,K, water stress
TÀI LIỆU THAM KHẢO
[1]. Phạm Thị Ánh Hồng, Trần Mỹ Quan, Nguyễn Thị Huyên, Nguyễn Quang Tâm (2004), Thực tập sinh hóa
cơ sở, Nxb Đại học Quốc gia TP. Hồ Chí Minh.
[2]. Nguyễn Du Sanh , Võ Thị Bạch Mai, Phan Ngô Hoang, Đỗ Thường Kiê ̣t, Trịnh Cẩm Tú (2013), Thực tập
chuyên ngành sinh lý thực vật, Nxb Đại học Quốc gia TP. Hồ Chí Minh.
[3]. Trịnh Cẩm Tú, Bùi Trang Việt (2006), Áp dụng các chất điều hòa tăng trưởng thực vật nhằm làm tăng số
nụ hoa và chất lượng hoa lan Dendrobium sp., Tạp chí KHKT Nông Lâm Nghiệp, Số 3 23-26.
[4]. Bùi Trang Việt (2002), Sinh lý thực vật đại cương, phần I - Dinh dưỡng, Nxb Đại học Quốc gia Thành
phố Hồ Chí Minh, 349 trang.
[5]. Bichsel R.G., Starman T.W. and Wang Y-T. (2008), Nitrogen, phosphorus, and potassium requirements
for optimizing growth and flowering of the Nobile Dendrobium as a potted orchid, HortScience, 43:328332.
[6]. Combs J., Hind G., Leegood R.C.,Tieszen L.L. and Vonshak A. (1987), Measurement of starch and
sucrose in leaves, Edited by J. Combs, D.O. hall. S.P. Long, J.M.O. Scurlock, Pergamon Press, pp. 219228.
[7]. Goh C.J. (1979), Hormonal regulation of flowering in a sympodial orchid hybrid Dendrobiun Louisae,
The New Phytologist, 82: 375-380.
[8]. Öpik H. and Rolfe S. (2005), The physiology of flowering plants, Cambridge, 4th Edition, 404 pp.
[9]. Pfeifer M., Heinrich W. and Jetschke G. (2006), Climate, size and flowering history determine flowering
pattern of an orchid, Botanical Journal of the Linnean Society, 151:511-526.

ISBN: 978-604-82-1375-6

22


Báo cáo toàn văn Kỷ yếu hội nghị khoa học lần IX Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQG-HCM
IV-O-1.9


VI NHÂN GIỐNG CÂY BẪY KẸP DIONAEA MUSCIPULA
Hồng Vũ Thúy Uyên(1), Nguyễn Hữu Trọng(1), Trần Hoàng Phúc(2), Bùi Văn Lệ(1)
(1) Khoa Sinh học, Trường ĐH KHTN, ĐHQG-HCM
(2) Trung tâm Kỹ thuật và Công nghệ Sinh học Tiền Giang
TÓM TẮT
Quy trình vi nhân giống loài này được chúng tôi xây dựng hoàn thiện dựa trên các khảo sát trong
3 giai đoạn: nhân chồi, cảm ứng tạo rễ và ra vườn ươm. Trên môi trường MS (Murashige và Skoog,
1962) với hàm lượng khoáng đa lượng giảm đi một nửa bổ sung kinetin 0,5mg/l cho hiệu quả nhân
chồi cao nhất (20,44 ± 2,14 chồi/mẫu); sử dụng NAA 0,5mg/l giúp tạo rễ tốt nhất (5,33 ± 0,44 rễ/chồi).
Những cây con hoàn chỉnh đạt kích thước 4-5cm được chọn để bước vào giai đoạn chuyển tiếp trong
2 tuần: trồng trên giá thể gồm dớn và đá perlite tỉ lệ 1:1, đặt dưới điều kiện chiếu sáng nhân tạo, chế
độ tưới 3 ngày/lần, sử dụng bọc nilon có đục lỗ để giữ độ ẩm. Sau đó, cây con được chuyển ra vườn
ươm, giữ nguyên giá thể và chế độ tưới. Tỉ lệ sống sót đạt gần 100%.
Từ khóa: Dionaea muscipula, Venus Flytrap, cây bẫy kẹp, chất điều hòa sinh trưởng thực vật, vi
nhân giống, môi trường MS.
Chữ viết tắt : BA Benzyladenine, IBA indole-3-butyric acid, NAA α-Naphthaleneacetic acid.
MỞ ĐẦU
Dionaea muscipula thuô ̣c ho ̣ Droseracea nhưng vùng phân bố tự nhiên của chúng không rô ̣ng kh ắp trên
thế giới như m ột số loài cùng h ọ khác mà chúng ch ỉ xuấ t hiê ̣n duy nhấ t ở khu vực bang B ắc Carolina, Hoa Kỳ .
Chúng có hình dáng lá biến dạng thành bẫy kẹp có thể chuyể n đô ̣ng, bắ t đươ ̣c các loa ̣i côn trùng nhỏ nên thu hút
được rất nhiều người chơi cây kiểng trên thế giới. Hiê ̣n nay không chỉ ở Mỹ mà Ú c mỗi năm sản xuấ t hàng triê ̣u
cây và xuât khẩ u đi nhiề u nơi với giá từ 5-20 Đô la Mỹ (100.000 – 400.000 đồng). Ngoài ra, nghiên cứu của
Pakulski (1996) phát hiện trong loài cây này nhiề u hơ ̣p chấ t thứ cấ p như naphthoquinone , plumbagin, ellagic
acid, 3-O-methylellagic acid... có giá trị dược tính. Tuy nhiên, Dionaea khó nhân giống bằng cách truyền thống ,
vì vậy việc nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật vi nhân giống trong việc nhân nhanh cây với số lươ ̣ng lớn cung cấ p
cho mu ̣c đích nghiên cứu và thương ma ̣i là vô cùng c ần thiết. Các nghiên cứu trên đối tượng trên thế giới có
Hutchinson và cộng sự (1984) đã hoàn thiện quy trình vi nhân giống từ hạt trên môi trường LS (Linsmaier &
Skoog), nhân chồi tốt nhất với kinetin 10 μM + NAA 0.5 μM, không cần bổ sung auxin để tạo rễ, NAA ức chế
hoàn toàn cảm ứng tạo rễ của chồi non; và gần nhất là Jang (2003) đã hoàn thiện quy trình vi nhân giống trên
môi trường 1/3MS, nhân chồi tốt nhất với kinetin 2.3 μM, tạo rễ tốt nhất với IBA 0.5 μM.

VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP
Vâ ̣t liêụ
Lá non cây Dionaea muscipula ex vitro đươ ̣c khử trùng bằng cồn ethanol 70o và calcium hypochlorite 5%.
Chồi sau khi khử trùng được cảm ứng sau 8 tuần trên môi trường MS (Murashige & Skoog, 1962) có bổ sung
Kinetin là nguồn mẫu ban đầu cho các thí nghiệm. Môi trường nuôi cấy được sử dụng là MS với nồng độ khoáng
đa lượng giảm đi một nửa (MS ½) bổ sung 30g/l sucrose, agar 8g/l, than hoạt tính 0,5g/l, pH 5.5 ± 0.1; nhiệt độ
nuôi cấy 25 ± 2oC, quang kì 16 giờ/ngày. Mỗi thí nghiệm được lặp lại 3 lần, số liệu được xử lý bằng phần mềm
SAS 9.1, phân nhóm các giá trị bằng phương pháp Duncan với p = 0,05.
Phương pháp
Các chồi non in vitro được nuôi trong 6 tuần trên môi trường chứa cytokinin (Kinetin, BA, Adenine
sulfate) ở những nồng độ khác nhau, đồng thời có hoặc không kết hợp bổ sung NAA 0,1mg/l. Các chồi dài 23cm ở thí nghiệm trước được chuyển lên môi trường chứa auxin (IBA, NAA) ở những nồng độ khác nhau để tạo
rễ, kết quả được ghi nhận sau 6 tuần nuôi cấy. Các cây non kích thước 4-5cm, có đủ chồi, lá, rễ được bước vào
giai đoạn chuyển tiếp trong 2 tuần, sau đó chuyển ra vườn ươm, khảo sát các yếu tố về độ ẩm, giá thể để đảm
bảo tỉ lệ cây con sống sót đạt cao nhất.

ISBN: 978-604-82-1375-6

23


Báo cáo toàn văn Kỷ yếu hội nghị khoa học lần IX Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQG-HCM
KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN
Kết quả khảo sát quá trình nhân chồi

Hình 1. Kết quả nhân chồi Dionaea muscipula sau 6 tuần
Bảng 1. Sự nhân chồ i của Dionaea muscipula trên các môi trường bổ sung cytokinin và auxin
Nồng độ hormone
(mg/l)

Số chồ i


Chiề u cao
chồ i (mm)

Nồng độ
hormone (mg/l)

0

9,66 ± 0,58ee

28,77 ± 1,18ab

Kinetin 0,5

20,44 ± 2,14a

24,54 ± 1,64cd

Kinetin 0,5 + NAA
0,1

15,26 ±
1,60bc
16,26 ±
1,05bb
16,96 ±
3,42bb

Kinetin 1,0

Kinetin 1,0 + NAA
0,1

Số chồ i

Chiề u cao
chồ i (mm)

Adenine sulfate
80
Adenine sulfate
80 + NAA 0,1

13,96 ± 1,17bcd

26,22 ± 2,26 bc

12,63 ± 0,40cde

25,72 ± 1,70bc

24,99 ± 2,73cd

BA 0,5

9,33 ± 0,55e

29,55 ± 0,56aa

25,77 ± 1,43bc


BA 0,5 + NAA
0,1

12,48 ± 2,68cde

27,54 ± 1,23abc

22,47 ± 1,93d

BA 1,0

10,70 ± 1,65d

28,34 ± 0,68ab

BA 1,0 + NAA
0,1

10,73 ± 2,10ee

27,32 ± 1,77abc

*Những chữ cái a, b, c… biểu thị mức phân hạng Duncan với p = 0,05

Sau 7 ngày nuôi cấy các mẫu có bổ sung hormone bắt đầu cảm ứng tạo chồi , sau 14 ngày các mẫu đều nảy
chồ i, chồ i phát sinh từ gố c . Với môi trường không bổ sung hormone cây nảy chồ i châ ̣m hơn , cần khoảng 10
ngày. Hê ̣ số nhân chồ i cao nhấ t là 20,44 ± 2,14 và chiều dài chồi là 24,54 ± 1,64mm ở môi trư ờng sử du ̣ng
kinetin 0,5mg/l. Trong thí nghiê ̣m này khi kế t hơ ̣p kinetin , BA với NAA ở cùng nồ ng đô ̣ , BA không có tác du ̣ng
kích thích ta ̣o chồ i, kinentin cho kế t quả ta ̣o chồ i tố t nhấ t . Adenine sulfate có tác du ̣ng kích thích ta ̣o chồ i nhưng

yế u. Kế t quả nhân chồi có sự tương đồng tuy nhiên chiều dài chồi trong nghiệm thức tốt nhất chưa đạt được bằng
với kết quả thí ngh iê ̣m của Gi -Won Jang và cô ̣ng sự th ực hiện năm 2003. Điều này chứng tỏ kinetin là loại
cytokinin thích hợp nhất cho quá trình nhân chồi của Dionaea muscipula và chồi từ nghiê ̣m thức sử du ̣ng kinetin
0,5mg/l không có sự hiện diện của NAA được sử dụng làm vật liệu cho thí nghiệm tiếp theo.

ISBN: 978-604-82-1375-6

24


Báo cáo toàn văn Kỷ yếu hội nghị khoa học lần IX Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQG-HCM
Kết quả khảo sát quá trình tạo rễ
25
20
Số rễ

15
10

Chiều dài rễ (mm)

5
0
0

NAA 0,1

NAA 0,5

IBA 0,1


IBA 0,5

IBA 1,0

Nồng độ auxin (mg/l)
Biểu đồ 1. Kế t quả ảnh hưởng của auxin lên sự hình thành rễ Dionaea muscipula
Trên môi trường MS ½ đối chứng, chồi vẫn có thể tạo rễ nhưng số lượng rễ ít và có kích thước ngắn. Môi
trường có bổ sung IBA kích thích tạo nhiều rễ hơn nhưng chiều dài không tăng, giữa các nồng độ thí nghiệm
không cho thấy sự khác biệt nhiều có thể được giải thích là do quá trình hấp khử trùng môi trường làm hormone
có độ bền nhiệt thấp như IBA giảm hoạt tính. Với môi trường bổ sung NAA rễ to hơn , có nhiều lông tơ . Ở nồ ng
đô ̣ NAA 0,5mg/l thu đươ ̣c số rễ cao nhấ t 5,33 ± 0,44. Kế t quả này khác biệt với kết quả của Gi-Won Jang (2003)
và Hutchinson (1984) sự hình thành rễ tố t nhấ t trên môi trường bổ sung IBA còn NAA ức chế sự tạo rễ, điều này
có thể được giải thích là do một số khác biệt về điều kiện vật lý, hóa học trong quá trình thực hiện nội dung
nghiên cứu giữa các nhóm tác giả. Vì vậy, cần nhìn nhận trong điều kiện môi trường tại Việt Nam, có thể không
cần phải sử dụng IBA cho quá trình ra rễ của Dionaea muscipula như các nghiên cứu khác trên thế giới.
Kết quả khảo sát giá thể và độ ẩm trong giai đoạn chuyển tiếp và vườn ươm
Các cây con đạt kích thước 4-5cm từ thí nghiệm tạo rễ được bước vào giai đoạn chuyển tiếp tại phòng sáng
trong 2 tuần trước khi được chuyển ra điều kiện vườn ươm sử dụng ánh sáng trực tiếp. Quá trình xử lý từ môi
trường in vitro sang môi trường ex vitro bao gồm: rửa sạch agar, trồng vào vỉ nhựa trên các loại giá thể khác
nhau (kết quả được ghi nhận trong biểu đồ 2) với chế độ tưới khác nhau bằng nước máy loại clo (kết quả ghi
nhận trong biểu đồ 3).
12
Tỉ lệ cây sống (/10)

10
8

Số lá mới


6
Chiều dài lá tăng trưởng (mm)

4
2
0
Đá perlite

1 đá perlite :
1 dớn

Dớn

1 dớn : 1 cát

Cát

Biểu đồ 2. Kết quả khảo sát loại giá thể trồng Dionaea muscipula ex vitro sau 4 tuần

ISBN: 978-604-82-1375-6

25