ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN TP.HCM

HUỲNH NGỌC OANH

NGHIÊN CỨU Q TRÌNH CỐ ĐỊNH
VÀ CÁC ĐẶC TÍNH CỦA MỘT SỐ ENZYME
PHÂN GIẢI POLYSACCHARIDE

Chuyên ngành: Hóa Sinh
Mã số: 62 42 30 15

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC

PGS.TS Đồng Thò Thanh Thu

TP. Hồ Chí Minh – Năm 2010


i

Lời cam đoan

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi.
Những kết quả trong nghiên cứu này hoàn toàn chưa được công bố
bởi bất kỳ tác giả nào khác.
Huỳnh Ngọc Oanh

ii

Lời cảm ơn
Luận án được hoàn thành nhờ vào sự giúp đỡ của:
PGS.TS Đồng Thò Thanh Thu – Bộ môn Sinh Hoá, Trường Đại học Khoa
Học Tự Nhiên Tp. Hồ Chí Minh đã giảng dạy, truyền dạt kiến thức trong
suốt thời gian học và tận tình hướng dẫn, giúp đỡ, đóng góp nhiều ý kiến
quý báu, trong quá trình làm luận án này.
PGS.TS Nguyễn Đức Lượng – chủ nhiệm bộ môn Công nghệ Sinh học
Trường Đại học Bách khoa TPHCM – đã tạo điều kiện thuận lợi, động viên
và góp nhiều ý kiến giúp tôi hoàn thành tốt luận án này.
PGS.TSKH Lưu Duẩn, PGS.TS Phạm Thành Hổ, PGS.TS Phạm Thò
Ánh Hồng, PGS.TS Bùi Văn Lệ, PGS.TS Nguyễn Xích Liên, PGS.TS Lê
Văn Việt Mẫn, TS. Lê Phi Nga … đã đóng góp nhiều ý kiến quý báu giúp
tôi hoàn thành tốt bản luận án.
Ban chủ nghiệm khoa Sinh học, Ban Giám Hiệu, Phòng Sau Đại học
Trường Đại học Khoa học Tự nhiên TP HCM. Ban chủ nghiệm khoa Kỹ
thuật Hóa học, Ban Giám Hiệu Trường Đại học Bách khoa đã tạo mọi
điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt thời gian làm luận án.
Các Thầy Cô Khoa Sinh học, Bộ môn Sinh Hóa Trường Đại học Khoa
học Tự nhiên đã dạy đỗ tận tình và truyền đạt cho tôi nhiều kiến thức và
kinh nghiệm q báu trong suốt thời gian tôi học tại giảng đường đại học.
Các Thầy Cô ở Bộ môn Công nghệ Sinh học Trường Đại học Bách khoa
Tp.HCM đã tạo điều kiện thuận lợi và hỗ trợ tôi trong suốt thời gian làm
luận án.
Mẹ tôi đã có công sinh thành dạy dỗ tôi nên người và gia đình là những
người luôn ở cạnh tôi, là nguồn động viên tinh thần cho tôi trong học tập và
cuộc sống.
Xin nhận ở tôi một sự biết ơn chân thành và sâu sắc nhất.


NCS Huỳnh Ngọc Oanh


iii

Mục lục
Lời cam đoan .......................................................................................................i
Lời cảm ơn ........................................................................................................ ii
Mục lục ............................................................................................................. iii
Danh mục các ký hiệu, các chữ viết tắt ............................................................vi
Danh mục các bảng ..........................................................................................vii
Danh mục hình ..................................................................................................xi
Danh mục sơ đồ ................................................................................................ xv
MỞ ĐẦU ............................................................................................................ 1
Chương 1- TỔNG QUAN .................................................................................. 4
1.1- Enzyme cố đònh ........................................................................................... 4
1.1.1- Sơ lược về enzyme cố đònh ...................................................................... 4
1.1.2- Các phương pháp cố đònh enzyme ........................................................... 7
1.1.3- Chất mang .............................................................................................. 14
1.2- Enzyme thủy phân carbohydrate .............................................................. 30
1.2.1- Enzyme - amylase............................................................................... 30
1.2.2- Glucoamylase-GA ................................................................................. 32
1.2.3- Cellulase................................................................................................ 34
1.2.4- Pectinase ................................................................................................ 35
Chương 2- VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP ............................................... 38
2.1- Vật liệu và hoá chất .................................................................................. 38
2.1.1- Enzyme thương mại................................................................................ 38
2.1.2- Hóa chất ................................................................................................ 39
2.2- Các phương pháp tiến hành thực nghiệm ................................................. 39



iv

2.2.1- Các phương pháp đònh lượng ................................................................. 39
2.2.2- Phương pháp cố đònh enzyme ................................................................ 45
2.2.3- Phương pháp tính toán ............................................................................ 51
Chương 3- KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ........................................................ 54
3.1- Quá trình cố đònh -amylase .................................................................... 54
3.1.1- Sự cố đònh Termamyl (-amylase thương mại) trên alginate ............... 54
3.1.2- Sự cố đònh Termamyl trên CMC – alginate .......................................... 58
3.1.3- Sự cố đònh Termamyl trên chitosan-BC ................................................ 62
3.1.4- Sự cố đònh Termamyl trên polyacrylamide ........................................... 65
3.1.5- Sự cố đònh Termamyl trên celite ........................................................... 67
3.2- Quá trình cố đònh AMG (glucoamylase thương mại) ............................... 74
3.2.1- Sự cố đònh AMG trên vật liệu alginate-chitosan ................................... 74
3.2.2- Sự cố đònh AMG trên polyacrylamide .................................................. 76
3.2.3- Sự cố đònh AMG trên Celite .................................................................. 77
3.2.4- Sự cố đònh AMG bằng phương pháp nhốt bởi quá trình tạo mạng silica gel . 81
3.2.5- Sự cố đònh AMG theo phương pháp CLEA ........................................... 82
3.3- Quá trình cố đònh Cellusoft (cellulase thương mại) ................................. 87
3.3.1.- Sự cố đònh Cellusoft trên alginate ........................................................ 87
3.3.2- Sự cố đònh Cellusoft trên polyacrylamide ............................................. 89
3.3.3- Sự cố đònh Cellusoft theo phương pháp CLEA ..................................... 92
3.4- Quá trình cố đònh Pectinex Ultra SPL (pectinase thương mại) ................ 94
3.4.1- Sự cố đònh Pectinex trên alginate .......................................................... 94
3.4.2- Sự cố đònh Pectinex trên vật liệu chitosan ............................................ 98
3.4.3- Sự cố đònh Pectinex trên polyacrylamide ............................................ 104
3.4.4- Sự cố đònh Pectinex trên celite ............................................................ 108
3.4.5- Sự cố đònh Pectinex trên silica gel ...................................................... 111



v

3.4.6- Sự cố đònh Pectinex theo phương pháp CLEA .................................... 117
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .......................................................................... 120
Kết luận ......................................................................................................... 120
Đề nghò ........................................................................................................... 122
DANH MỤC CÔNG TRÌNH....................................................................... 123
TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................... 124
PHỤ LỤC


vi

Danh mục các ký hiệu, các chữ viết tắt
acry

:

Acrylamide

alg

:

Alginate

AMG, GA

:


Glucoamylase

APTES

:

Aminopropyltriethoxysilane

BC

:

Bacterial cellulose

bđ

:

Ban đầu

bis

:

Bisacrylamide

cđ

:


Cố đònh

CLEA

:

Cross-linked enzyme aggregates

CMC

:

Carboxymethyl cellulose

CP E

:

Chế phẩm enzyme

CT

:

Công thức

dd

:


Dung dòch

E

:

Enzyme

glu

:

Glutaradehyde

h

:

Giờ

HL

:

Hàm lượng

Hđ

:


Hoạt độ

HS

:

Hiệu suất

PEI

:

Polyethylenimine

pp

:

Phương pháp

tb

:

Trung bình

td

:


Tự do

V

:

Thể tích

VSV

:

Vi sinh vật

UI

:

Đơn vò hoạt độ (của enzyme)



:

Tổng số


vii


Danh mục các bảng

Bảng 1.1: Khả năng chòu nhiệt của các enzyme tự do và enzyme dạng CLEA11
Bảng 1.2: Kết quả hoạt độ và hiệu quả cố đònh của lipase lên các chất mang28
Bảng 2.1: Tiến hành khảo sát các enzyme cố đònh và chất mang trong thực
nghiệm ............................................................................................................53
Bảng 2.2: Khảo sát các thông số và giá trò biểu thò trong thực nghiệm ..........53
Bảng 3.1: Một số yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất cố đònh Termamyl trên
alginate ...........................................................................................................55
Bảng 3.2: nh hưởng của nhiệt độ đến hoạt độ dạng Termamyl cố đònh ......56
Bảng 3.3: Ảnh hưởng nồng độ alginate, CMC đến khả năng cố đònh enzyme 58
Bảng 3.4: nh hưởng nhiệt độ, pH đến hoạt độ dạng Termamyl cố đònh trên
CMC-alginate ................................................................................................59
Bảng 3.5: nh hưởng thời gian bảo quản đến hoạt độ dạng Termamyl cố
đònh. ...............................................................................................................60
Bảng 3.6: Khả năng phân cắt một số cơ chất bởi dạng Termamyl cố đònh trên
gel CMC- alginate ..........................................................................................61
Bảng 3.7: Kết quả hiệu suất cố đònh Termamyl trên BC và chitosan ............62
Bảng 3.8: nh hưởng nồng độ chitosan đến hiệu suất cố đònh Termamyl trên
BC-chitosan ...................................................................................................63
Bảng 3.9: nh hưởng nhiệt độ đến hoạt độ dạng Termamyl cố đònh trên BCchitosan ...........................................................................................................64
Bảng 3.10: nh hưởng tỉ lệ acrylamide, bis acrylamide đến hiệu suất cố đònh
Termamyl trên polyacrylamide ......................................................................65


viii

Bảng 3.11: nh hưởng pH, nhiệt độ đến hoạt độ dạng Termamyl cố đònh trên
polyacrylamide .............................................................................................. 66
Bảng 3.12: Khảo sát phương pháp hoạt hóa celite .........................................67

Bảng 3.13: Khảo sát tỉ lệ enzyme:celite đến hiệu suất cố đònh Termamyl ...68
Bảng 3.14: Ảnh hưởng của nồng độ 3-APTES đến hiệu suất cố đònh ............68
Bảng 3.15: Yếu tố nhiệt độ và pH ảnh hưởng đến hoạt độ dạng Termamyl cố
đònh trên celite ...............................................................................................69
Bảng 3.16: Sự biến đổi hoạt độ dạng Termamyl cố đònh theo điều kiện bảo
quản ...............................................................................................................70
Bảng 3.17: Khả năng tái sử dụng chất mang celite ......................................70
Bảng 3.18: Hiệu suất cố đònh enzyme sau khi bọc alginate so với enzyme cố
đònh trên celite không bọc alginate ................................................................71
Bảng 3.19: So sánh hiệu suất cố đònh trên các dạng chất mang chitosan và
alginate cố đònh AMG ....................................................................................75
Bảng 3.20: Một số yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất cố đònh AMG trên celite77
Bảng 3.21: nh hưởng pH, nhiệt độ đến hoạt độ dạng AMG cố đònh trên
celite .............................................................................................................. 78
Bảng 3.22: nh hưởng nồng độ alginate và thời gian cố đònh đến hiệu suất cố
đònh AMG trên celite-alginate .......................................................................79
Bảng 3.23: nh hưởng nhiệt độ, pH đến hoạt độ AMG cố đònh trên celitealginate ..........................................................................................................80
Bảng 3.24: Hiệu suất cố đònh AMG bởi quá trình tạo mạng silica gel ...........82
Bảng 3.25: Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất cố đònh AMG
theo phương pháp CLEA ................................................................................84
Bảng 3.26: nh hưởng nồng độ alginate và tỉ lêï enzyme đến hiệu suất cố
đònh Cellusoft trên alginate ............................................................................88


ix

Bảng 3.27: Ảnh hưởng thời gian bảo quản đến hoạt độ dạng Cellusoft cố đònh
trên alginate ...................................................................................................89
Bảng 3.28: nh hưởng của nồng độ polyacrylamide đến hiệu suất cố đònh
Cellusoft .........................................................................................................90

Bảng 3.29: nh hưởng của nhiệt độ đến hoạt độ dạng Cellusoft cố đònh trên
polyacrylamide ..............................................................................................91
Bảng 3.30: Một số yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất cố đònh Cellusoft theo
phương pháp CLEA ........................................................................................92
Bảng 3.31: Ảnh hưởng nồng độ alginate đến sự cố đònh Pectinex ...............94
Bảng 3.32: nh hưởng nhiệt độ, pH đến hoạt độ dạng Pectinex cố đònh trên
alginate ...........................................................................................................95
Bảng 3.33: Ứng dụng pectinase cố đònh trong xử lý dòch chanh dây .............96
Bảng 3.34: Một số yếu tố nh hưởng đến hiệu suất cố đònh Pectinex trên
chitosan ..........................................................................................................98
Bảng 3.35: Ảnh hưởng nồng độ alginate đến hiệu suất cố đònh Pectinex trên
dạng phức chitosan bọc alginate...................................................................100
Bảng 3.36: nh hưởng thời gian bảo quản đến hoạt độ dạng Pectinex cố đònh
trên chitosan bọc alginate.............................................................................100
Bảng 3.37: So sánh hiệu suất cố đònh Pectinex trên dạng phức chất mang
chitosan-alginate .........................................................................................101
Bảng 3.38: Ảnh hưởng thời gian cố đònh và kích thước tạo hat gel đến hiệu
suất cố đònh Pectinex trên chitosan-carrageenan ........................................102
Bảng 3.39: Khảo sát ảnh hưởng điều kiện bảo quản đến hoạt độ dạng
Pectinex cố đònh trên chiosan-carrageenan .................................................103
Bảng 3.40: nh hưởng tỉ lệ bis : acrylamide và tỉ lệ enzyme đến hiệu suất cố
đònh Pectinex ................................................................................................104


x

Bảng 3.41: Ảnh hưởng của phương pháp hoạt hóa đến hiệu suất cố đònh
Pectinex trên celite ......................................................................................108
Bảng 3.42: Ảnh hưởng một số yếu tố đến hiệu suất cố đònh Pectinex trên
celite ............................................................................................................109

Bảng 3.43: Một số yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất cố đònh Pectinex theo
phương pháp 1 ..............................................................................................112
Bảng 3.44: Ảnh hưởng chất hoạt hóa silica gel và tỉ lệ enzyme đến hiệu suất
cố đònh Pectinex ..........................................................................................114
Bảng 3.45: Ảnh hưởng pH, nhiệt độ đến hoạt độ dạng Pectinex cố đònh trên
silica gel....................................................................................................... 115
Bảng 3.46: Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng sự cố đònh Pectinex theo
phương pháp CLEA ......................................................................................117


xi

Danh mục hình

Hình 1.1: Mô tả enzyme cố đònh .................................................................. 4
Hình 1.2: Phương pháp nhốt enzyme............................................................. 8
Hình 1.3: Enzyme nhốt trong hệ sợi ............................................................. 8
Hình 1.4: Enzyme hấp phụ lên chất mang..................................................... 9
Hình 1.5: Enzyme liên kết ion với chất mang ............................................... 9
Hình 1.6: Enzyme gắn lên chất mang bằng liên kết đồng hóa trò ...............10
Hình 1.7: Enyme cố đònh bằng liên kết chéo ..............................................10
Hình 1.8: Kỹ thuật CLEA ............................................................................11
Hình 1.9: Các khối tủa CLEA của lipase ở nấm Candida Antarctica A/B, mỗi
khối tủa CLEA chứa hơn 8 triệu phân tử enzyme (x 3500) .........................12
Hình 1.10: Sự bố trí không gian của enzyme cố đònh ..................................12
Hình 1.11: Các cách khắc phục về bố trí không gian cố đònh enzyme ........13
Hình 1.12: Mô tạo enzyme liên hợp cố đònh ...............................................14
Hình 1.13: Đơn phân tạo nên alginate .........................................................16
Hình 1.14: Liên kết tạo gel khi alginate tiếp xúc với Ca2+ ..........................17
Hình 1.15: Cấu trúc mạng lưới gel alginate khi alginate tiếp xúc với Ca2+ .17

Hình 1.16: Cấu trúc của cellulose vi khuẩn và thực vật ..............................19
Hình 1.17: CMC trong dung dòch AlCl3 .......................................................20
Hình 1.18: Cấu tạo của carrageenan ...........................................................21
Hình 1.19: Sự tạo chitosan bằng quá trình deacetyl hóa chitin ...................22
Hình 1.20: Quá trình polymer hóa của polyacrylamide ..............................24
Hình 1.21: Một vài chất mang vô cơ thông dụng trong cố đònh enzyme .....25


xii

Hình 1.22: Cấu trúc chất mang silica gel .....................................................27
Hình 1.23: Sự hình thành nhóm hydroxyl diễn ra trên bề mặt của silica gel 27
Hình 1.24: Vò trí tấn công của -amylase ...................................................30
Hình 1.25: -amylase từ các nguồn khác nhau ...........................................31
Hình 1.26: Vò trí phân cắt tinh bột bằng -amylase và GA .........................32
Hình 1.27: Enzyme GA từ các nguồn khác nhau ..........................................33
Hình 1.28: Sự tác động của phức hợp cellulase lên cellulose ......................34
Hình 1.29: Cấu trúc phân tử enzyme -1,4-D-Glucanohydrolase ................34
Hình 1.30: Cấu trúc và cơ chế xúc tác của endo-PG II của Asp. niger ........36
Hình 1.31: Enzyme polygalacturonase từ các nguồn khác nhau .................36
Hình 2.1: Quá trình tạo hạt gel calcium alginate nhốt enzyme ...................45
Hình 3.1: Hạt gel bảo quản ở 50oC và nhiệt độ phòng ................................54
Hình 3.2: Lượng maltose tạo thành theo thời gian phản ứng bởi dạng
Termamyl cố đònh trên alginate .................................................................. 57
Hình 3.3: Khả năng tái sử dụng của Termamyl cố đònh trên alginate .........57
Hình 3.4: Termamyl cố đònh lên gel CMC- alginate ...................................58
Hình 3.5: Khả năng tái sử dụng của dạng Termamyl cố đònh trên CMCalginate ........................................................................................................61
Hình 3.6: Hạt gel chitosan ...........................................................................62
Hình 3.7: Khả năng tái sử dụng của dạng Termamyl cố đònh trên BC-chitosan
......................................................................................................................64

Hình 3.8: Khả năng tái sử dụng của dạng Termamyl cố đònh trên
polyacrylamide ............................................................................................66
Hình 3.9: Celite hoạt hóa chưa cố đònh (1) và Termamyl cố đònh trên celite (2)67

Hình 3.10: Khả năng tái sử dụng của dạng Termamyl cố đònh trên celite ..70
Hình 3.11: Termamyl cố đònh trên celite bọc alginate ................................71


xiii

Hình 3.12: Khả năng tái sử dụng của dạng Termamyl cố đònh trên celitealginate ........................................................................................................72
Hình 3.13: AMG cố đònh trên polyacrylamide ............................................76
Hình 3.14: Khả năng tái sử dụng của dạng AMG cố đònh trên celite..........78
Hình 3.15: Hạt gel AMG cố đònh trên celite-alginate .................................79
Hình 3.16: Khả năng thủy phân tinh bột và dextrin bởi dạng AMG cố đònh
trên celite-alginate ......................................................................................80
Hình 3.17: Khả năng tái sử dụng của dạng AMG cố đònh trên celite-alginate ở
các nhiệt độ khác nhau .................................................................................81
Hình 3.18: AMG kết tủa (dạng CLEA) khi dùng NaCl bão hòa và glutaraldehyde
......................................................................................................................83
Hình 3.19: nh hưởng lượng PEI đến sự cố đònh AMG ..............................85
Hình 3.20: Lượng glucose tạo thành theo thời gian thủy phân tinh bột của
AMG cố đònh dạng CLEA ............................................................................85
Hình 3.21: Khả năng tái sử dụng của AMG cố đònh dạng CLEA .................86
Hình 3.22: nh hưởng pH đến hoạt độ dạng Cellusoft tự do và dạng cố đònh
trên alginate .................................................................................................88
Hình 3.23: nh hưởng nhiệt độ đến hoạt độ dạng Cellusoft tự do và dạng cố
đònh trên alginate .........................................................................................88
Hình 3.24: Sự tạo gel polyacryacrylamide bởi đệm khác nhau ...................90
Hình 3.25: Hạt gel Cellusoft cố đònh trên polyacrylamide...........................90

Hình 3.26: Khả năng tái sử dụng của dạng Cellusoft cố đònh trên
polyacrylamide ............................................................................................91
Hình 3.27: Khả năng tái sử dụng của Cellusoft cố đònh dạng CLEA .......... 93
Hình 3.28: Ảnh hưởng điều kiện bảo quản đến hoạt độ dạng Pectinex cố đònh
trên alginate .................................................................................................95
Hình 3.29: Khả năng phân cắt pectin trong nước chanh dây bởi pectinase 96
Hình 3.30: Khả năng phân cắt pectin trong dòch nho bởi Pectinex cố đònh..96


xiv

Hình 3.31: Khả năng tái sử dụng của dạng Pectinex cố đònh trên alginate 97
Hình 3.32: Khả năng tái sử dụng của dạng Pectinex cố đònh trên chitosan bọc
alginate .......................................................................................................101
Hình 3.33: Khả năng tái sử dụng của dạng Pectinex cố đònh trên chitosancarrageenan ...............................................................................................103
Hình 3.34: Hạt gel Pectinex cố đònh trên polyacrylamide .........................105
Hình 3.35: Ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt độ dạng Pectinex cố đònh trên
polyacrylamide ...........................................................................................105
Hình 3.36: Ảnh hưởng pH đến hoạt độ dạng Pectinex cố đònh trên
polyacrylamide ...........................................................................................106
Hình 3.37: Khả năng tái sử dụng của dạng Pectinex cố đònh trên
polyacrylamide ..........................................................................................106
Hình 3.38: Khả năng phản ứng liên tục bởi dạng Pectinex cố đònh trên
polyacrylamide ..........................................................................................107
Hình 3.39: Pectinex cố đònh trên celite .....................................................108
Hình 3.40: So sánh ảnh hưởng của nhiệt độ phản ứng đến hoạt độ dạng
Pectinex cố đònh và tự do trên celite .........................................................110
Hình 3.41: So sánh ảnh hưởng pH phản ứng đến hoạt độ dạng Pectinex cố
đònh và tự do trên celite .............................................................................110
Hình 3.42: Khả năng tái sử dụng của dạng Pectinex cố đònh trên celite .. 111

Hình 3.43: Pectinex cố đònh trong quá trình tạo silica gel từ thủy tinh lỏng112
Hình 3.44: Khả năng tái sử dụng của dạng Pectinex cố đònh trên silica gel theo
phương pháp 1 ...........................................................................................113
Hình 3.45: Khả năng tái sử dụng của dạng Pectinex cố đònh trên silica gel theo
phương pháp 2 ............................................................................................116
Hình 3.46: Các mẫu Pectinex cố đònh bởi glutaraldehyde và PEI (1%) ....117
Hình 3.47: Khả năng tái sử dụng của Pectinex dạng CLEA ......................118


xv

Danh mục sơ đồ
Sơ đồ 1.1: Các phương pháp cố đònh enzyme ..................................................... 7
Sơ đồ 1.2: Phân loại chất mang .......................................................................... 16
Sơ đồ 2.1: Các bước cố đònh enzyme trên alginate ........................................... 45
Sơ đồ 2.2: Cố đònh AMG trên alginate theo phương pháp hấp phụ .................... 45
Sơ đồ 2.3: Cố đònh enzyme trên gel CMC-alginate ........................................... 46
Sơ đồ 2.4: Cố đònh enzyme trên chitosan đã hoạt hóa bởi glutaraldehyde ........ 46
Sơ đồ 2.5: Quá trình tạo hạt (chitosan-enzyme) + alginate ................................. 46
Sơ đồ 2.6: Quá trình tạo hạt (alginate-enzyme) + chitosan ................................ 46
Sơ đồ 2.7: Quá trình tạo hạt chitosan + (alginate-enzyme) ................................ 47
Sơ đồ 2.8: Cố đònh enzyme trên phức chitosan- carrageenan ............................ 47
Sơ đồ 2.9: Cố đònh enzyme trên BC ................................................................... 47
Sơ đồ 2.10: Cố đònh enzyme lên chất mang BC-chitosan .................................. 48
Sơ đồ 2.11: Cố đònh enzyme trên polyacrylamide ............................................. 48
Sơ đồ 2.12: Quá trình hoạt hóa celite bằng cồn, acid nitric, glutaradehyde ....... 48
Sơ đồ 2.13: Cố đònh enzyme trên celite ............................................................. 49
Sơ đồ 2.14: Cố đònh enzyme lên celite hoạt hóa bằng H2O2, APTES ................ 49
Sơ đồ 2.15: Cố đònh enzyme trên phức hợp celite-alginate ............................... 49
Sơ đồ 2.16: Cố đònh enzyme trong quá trình tạo mạng silica gel ....................... 50

Sơ đồ 2.17: Cố đònh enzyme trong quá trình taọ mạng silica gel và alginate .... 50
Sơ đồ 2.18: Các bước hoạt hóa silica gel ............................................................. 50
Sơ đồ 2.19: Cố đònh enzyme trên silica gel đã hoạt hoá .................................... 51
Sơ đồ 2.20: Cố đònh enzyme theo phương pháp CLEA ...................................... 51


1

MỞ ĐẦU

Trong tế bào sống của sinh vật luôn xảy ra các quá trình chuyển hóa hết sức
phức tạp và luôn theo những qui luật nhất đònh. Các quá trình chuyển hóa này
đều được thực hiện và điều khiển bởi rất nhiều enzyme khác nhau. Enzyme
không chỉ tham gia các phản ứng hóa học trong tế bào mà còn thực hiện các phản
ứng ngoài tế bào. Các enzyme được khai thác và ứng dụng ngày càng rộng rãi
trong đời sống và sản xuất. Những sản phẩm tạo thành từ polysaccharide bởi sự
xúc tác của nhóm enzyme thủy phân polysaccharide có một giá trò thực tiễn rất
lớn. Chính vì thế, đã từ lâu loài người đã biết sử dụng chúng trong sản xuất rượu
bia, tương , chao … Việc nghiên cứu nhóm enzyme này vẫn được tiến hành ở
nhiều nước vàø ứng dụng trong nhiều lónh vực khác nhau.
Một trong những hướng nghiên cứu về enzyme đang được phát triển mạnh
là nghiên cứu cố đònh chúng trên các chất mang nhằm tăng khả năng ứng dụng, từ
đó làm tăng giá trò kinh tế của enzyme. Phần lớn các enzyme khi tách khỏi tế bào
thường tồn tại ở trạng thái tự do, hòa tan trong nước. trạng thái này chúng rất
dễ bò phá hủy dưới tác động của các yếu tố bên ngoài như pH, nhiệt độ và các
yếu tố khác. trong tế bào, chúng được bảo vệ bởi cả một hệ thống vật chất và
các cơ quan như mạng vi sợi, vi ống... Bao quanh là màng nguyên sinh chất,
thành tế bào. Dựa trên những hiện tượng tự nhiên đó, các nhà khoa học đã tìm ra
được nhiều phương pháp khác nhau để cố đònh enzyme tự do. Cố đònh enzyme là



2

gắn hoặc nhốt enzyme vào một chất mang phù hợp để nhằm mục đích chuyển
enzyme từ trạng thái hòa tan sang trạng thái không hòa tan, để sử dụng chúng
được nhiều lần. Ngày nay, kỹ thuật cố đònh enzyme đã được thực hiện trong các
nghiên cứu khoa học và cả trong các ứng dụng thực tế.
Các kết quả nghiên cứu cũng cho thấy rằng: không một enzyme nào lại
phù hợp với tất cả các loại chất mang và cũng không một chất mang nào lại phù
hợp với tất cả các enzyme. Điều này cho thấy cố đònh enzyme không phải là một
công việc đơn giản nếu xét về mặt khoa học và thực tiễn của nó.
Ở Việt Nam tình hình nghiên cứu cố đònh một số enzyme cũng đang được
nghiên cứu ở qui mô phòng thí nghiệm, tuy nhiên chưa có hệ thống và chưa áp
dụng enzyme cố đònh vào qui mô công nghiệp rộng rãi. Công trình nghiên cứu
của chúng tôi là một đóng góp nhỏ cho sự phát triển kỹ thuật cố đònh enzyme nói
riêng và các vật liệu sinh học nói chung để có thể đáp ứng khả năng mở rộng và
tính kinh tế trong việc khai thác các enzyme để ứng dụng trong công nghiệp, mơi
trường, dược phẩm ... và trong sự phát triển của các thiết bò hiện đại như các cảm
biến sinh học...
Một trong những nhóm enzyme được nghiên cứu thu nhận, tinh sạch và ứng
dụng rộng rãi nhất là nhóm enzyme phân giải polysaccharide. Đã có những
nghiên cứu cố đònh một vài enzyme trong nhóm này nhưng nhìn chung chưa có
một công trình nào nghiên cứu hoàn chỉnh làm sáng tỏ về sự phù hợp giữa chất
mang và enzyme khi cố đònh và về sự cố đònh đồng thời enzyme trên nhiều chất
mang khác nhau để tăng hiệu quả gắn.
Chính vì những vấn đề và đặc biệt ý nghóa khoa học và thực tiễn trên, chúng
tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu qui trình cố đònh và các đặc tính
của một số enzyme phân giải polysaccharide”. Với mục tiêu là: Khảo sát khả



3

năng cố đònh của 4 enzyme thuộc nhóm thủy phân carbohydrate trên các chất
mang khác nhau và khảo sát một số đặc tính của enzyme dạng cố đònh tạo được.
Để đạt được mục tiêu trên, chúng tôi đã đưa ra những nội dung nghiên cứu
cần thực hiện như sau:
- Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng cố đònh các enzyme: amylase, glucoamylase, cellulase và pectinase - trên nhiều loại chất mang khác
nhau: hữu cơ và vô cơ, tự nhiên và tổng hợp, dạng kết hợp để làm chất mang cố
đònh enzyme. Từ đó đưa ra những kỹ thuật cố đònh cho mỗi enzyme trên mỗi chất
mang cố đònh
- Xác đònh một số đặc tính của enzyme cố đònh thông qua một số yếu tố: t0,
pH… điều kiện bảo quản, khả năng tái sử dụng và ứng dụng qua hệ thống cột
phản ứng
Qua quá trình thực hiện đề tài, chúng tôi cố gắng làm rõ một số điểm mới
trong những nghiên cứu trước đây như:
- Mỗi enzyme có khả năng cố đònh trên các vật liệu khác nhau.
- Mỗi vật liệu làm chất mang có khả năng cố đònh enzyme khác nhau. Mỗi
một vật liệu đều có tính chất rất riêng biệt mà thiên nhiên “ban tặng” và chúng ta
có thể sử dụng trong nhiều lónh vực khác nhau trong đó có lónh vực sinh học.
+ Vật liệu vô cơ ‘háo nước’ như celite, silica gel là rất có tiềm năng để cố
đònh enzyme
+ Vật liệu ghép: kết hợp vật liệu vô cơ và hữu cơ, “layer by layer” đã cải
thiện được một số tính chất của enzyme cố đònh trong môi trường phản ứng
- Kết hợp nhiều kỹ thuật cố đònh để tăng hiệu suất cố đònh enzyme như kết
hợp bẫy, nhốt và liên kết, kết hợp hấp phụ và liên kết… và có một số thành công
khi sử dụng kỹ thuật CLEA tạo liên kết chéo giữa các enzyme.


4


Chương 1- TỔNG QUAN

1.1- Enzyme cố đònh
1.1.1- Sơ lược về enzyme cố đònh

Mô hình hai pha của enzyme cố đònh
Hình 1.1: Mô tả enzyme cố đònh
1.1.1.1- Đònh nghiã: Enzyme không hòa tan (insoluble enzyme) hay enzyme cố
đònh (immobilized enzyme): là enzyme được gắn lên chất mang tạo dạng không
hoà tan trong dung dòch phản ứng. [9],[14],[54]
1.1.1.2- Đặc điểm của enzyme cố đònh
Enzyme cố đònh có các ưu và nhược điểm sau đây [9],[52]:
Ưu điểm:
 Có thể tái sử dụng nhiều lần, hoạt tính ít thay đổi trong những lần tái sử
dụng. Đặc điểm này có ý nghóa lớn trong kó thuật, nhờ đó mà có thể giảm
chi phí cho việc sản xuất enzyme và sử dụng.


5

 Không lẫn vào sản phẩm cuối của phản ứng nên không phải chi phí cho
việc tách enzyme ra khỏi sản phẩm. Sản phảm cuối có thể có độ tinh sạch
tương đối cao.
 Có độ bền cao hơn, bảo quản tốt hơn enzyme tự do, vì thế trong nhiều
trường hợp có thể cho enzyme cố đònh hoạt động ở những điều kiện nhiệt
độ, pH không bình thường do chúng được bảo vệ bởi chất mang. Điều này
rất có lợi trong các quy trình sản xuất công nghiệp (có thể cơ khí hóa và tự
động hóa).
 Sử dụng được dễ dàng cho việc cơ khí hoá và tự động hoá trong quá trình
sản xuất.

Nhược điểm: Hoạt tính của enzyme cố đònh thường nhỏ hơn hoạt tính của
enzyme hòa tan cùng loại, do khi enzyme gắn vào chất mang cấu trúc của
enzyme có thể thay đổi ở mức độ nhất đònh. Do sự thay đổi cấu trúc không gian
của enzyme có thể làm cho sự tương tác của enzyme và cơ chất chậm lại, phản
ứng xảy ra yếu hơn. Hoặc do khi ta nhốt enzyme vào trong gel, gel sẽ bao lấy
enzyme tạo thành vật cản đối với cơ chất, vì vậy sự tiếp xúc giữa cơ chất và trung
tâm hoạt động của enzyme gặp khó khăn hơn so với enzyme tự
do.[9],[18],[39],[82]
1.1.1.3- Các yếu tố ảnh hưởng đến enzyme cố đònh
Hoạt tính enzyme cố đònh phụ thuộc vào bản chất và tính chất hóa học của
chất mang: tính chất vật lý (tính hòa tan, tính bền, độ trương, tính ưa nước hay kỵ
nước) và bản chất hóa học của chất mang đều có ảnh hưởng đến khả năng liên
kết, tính bền, hoạt tính sinh học của enzyme cố đònh. Enzyme cố đònh thường bền
nhiệt so với enzyme tan, chất mang cũng có tác dụng làm giảm sự biến tính của
enzyme. [9],[18]


6

Khi bò giới hạn trong không gian nhất đònh, sẽ có nhiều kiểu tương tác khác
của chất mang polymer lên môi trường bao xung quanh phân tử enzyme cố đònh:
 Kiểu thứ nhất: chất mang nhờ các tính chất đặc trưng của mình sẽ kéo hoặc
đẩy các cơ chất, sản phẩm và các chất khác sẽ làm thay đổi nồng độ các
chất ở môi trường vi mô sát với enzyme.
 Kiểu thứ hai: chất mang ngăn cản sự khuếch tán tự do theo hướng đến cũng
như đi khỏi enzyme làm thay đổi hiệu quả xúc tác của enzyme.
- Hoạt tính enzyme cố đònh phụ thuộc vào sự khuếch tán của cơ chất, sản phẩm
và các chất khác. Tốc độ khuếch tán phụ thuộc vào các yếu tố:
 Kích thước lỗ gel của chất mang polymer
 Trọng lượng phân tử của cơ chất

 Sư chênh lệch nồng độ giữa vùng môi trường vi mô xung quanh enzyme và
dung dòch tự do
- Ảnh hưởng của pH lên enzyme cố đònh: Điện tích chất mang có ảnh hưởng đáng
kể đến pH tối ưu của enzyme cố đònh. pH tối ưu này có thể chuyển sang phía
kiềm hay acid so với pH tối ưu của enzyme hòa tan cùng loại.
Sự ảnh hưởng này là do trường tónh điện của chất mang tạo nên. Khi lực ion
thấp thì nồng độ H+ gần chất mang điện tích âm cao hơn, còn gần các chất mang
điện tích dương thì nồng độ H+ thấp hơn, như vậy pH bò dòch chuyển về phía kiềm
và ngược lại. Còn khi lực ion lớn điện tích chất mang được trung hòa bởi các ion
trái dấu và pH tối ưu của enzyme cố đònh cũng giống như enzyme hòa tan.
[34],[73],[78]
Thực hiện đề tài sẽ giúp chúng tôi tìm hiểu biết rõ hơn những đặc điểm của
enzyme cố đònh.


7

1.1.2- Các phương pháp cố đònh enzyme
Enzyme cố đònh thường là những enzyme hòa tan được gắn vào chất mang
bằng nhiều kỹ thuật khác nhau.
Các phương pháp cố đònh enzyme

Các phương pháp cho
enzyme hòa tan

Phương pháp tạo
liên kết

Tạo liên
kết chất

mang

Phương pháp nhốt
enzyme

Tạo liên kết
chéo
(crossing)

Các phương pháp cho
enzyme không hòa tan

Tạo dẫn xuất

Không dẫn
xuất

Nhốt enzyme trong khuôn gel
(gel entrapment)
Nhốt enzyme trong hệ sợi
(fiber) entrapment)

Hấp phụ vật lý
Liên kết ion
Liên kết kim loại
Liên kết đồng hóa trò

Tạo vi nang
(microapsulation)


Sơ đồ 1.1: Các phương pháp cố đònh enzyme [52],[54]
1.1.2.1- Phương pháp nhốt enzyme
a- Phương pháp nhốt enzyme trong gel
Dựa trên cơ sở tạo ra một màng bao bọc hay một polymer, các chất tham
gia phản ứng và sản phẩm của cả phản ứng có thể thẩm thấu vào trong hoặc ra
ngoài thông qua màng bao bọc này nhưng enzyme sẽ được giữ lại trong hạt gel.
Nguyên liệu tạo gel để nhốt enzyme như polyacrylamide, alginate,
-carrageenan, gelatin…


8

E

E
E

Nhốt enzyme trong vi nang

Nhốt enzyme trong gel

Hình 1.2: Phương pháp nhốt enzyme[69],[120]
b- Phương pháp nhốt enzyme trong hệ sợi
Phương pháp nhốt enzyme trong hệ sợi có khả năng xúc tác phản ứng tốt
hơn phương pháp nhốt enzyme trong gel. Các sợi sử dụng để nhốt enzyme thường
là vật liệu cellulose, dẫn xuất cellulose, những sợi nhân tạo, có độ bền với acid,
kiềm, các loại ion và các dung môi hữu cơ hòa tan... [52]

Hình 1.3: Enzyme nhốt trong hệ sợi [54],[111]
c- Nhốt enzyme trong cấu trúc mạng lưới

Nhốt phân tử enzyme trong mạng lưới polymer mà không có liên kết đồng
hóa trò giữa chất mang và phân tử enzyme. Trong các chất mang vô cơ thì chỉ có
silica gel là áp dụng được phương pháp này. Kỹ thuật sol-gel dựa trên mạng lưới
silica nhờ sự tham gia của tiền chất ban đầu (như Na2SiO3). Trong phương pháp
này người ta có thể bổ sung các chất hữu cơ để thúc đẩy sự trùng ngưng như
polypeptide,

polyamine,

polyamine.[72],[97], [99]

dẫn

xuất

polypeptide

hoặc

dẫn

xuất


9

1.1.2.2- Phương pháp tạo liên kết enzyme với chất mang
a- Phương pháp hấp phụ

Hình 1.4: Enzyme hấp phụ lên chất mang [54]

Nhược điểm của phương pháp này là enzyme không tan dễ dàng hòa tan trở
lại (nhả hấp phụ) khi thay đổi pH hoặc lực ion của dung dòch chung quanh.[111]
b- Phương pháp liên kết hóa học
Đây là phương pháp cố đònh enzyme đảm bảo liên kết vững chắc giữa
enzyme với chất mang.
Liên kết trực tiếp: Nối đồng hóa trò liên kết giữa các phân tử enzyme riêng biệt
thành một liên hiệp các phân tử enzyme không hòa tan.
Liên kết trực tiếp chất mang và enzyme không cần chất hoạt hóa (chất trung
gian), trường hợp này ít phổ biến.
Liên kết gián tiếp: Liên kết phân tử enzyme với chất mang thông qua một chất
trung gian (chất hoạt hóa). Cách này được sử dụng phổ biến. [4],[111]
* Phương pháp tạo liên kết ion

Hình 1.5: Enzyme liên kết ion với chất mang [111]