BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN HÀN LÂM
KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
----------------

TRẦN THỊ HỒNG HÀ

NGHIÊN CỨU CHIẾT TÁCH CÁC CHẤT CÓ HOẠT TÍNH KHÁNG U
VÀ ĐIỀU BIẾN MIỄN DỊCH TỪ HAI LOÀI NẤM HẦU THỦ (Hericium erinaceus)
VÀ NẤM HƯƠNG (Lentinula edodes) NUÔI TRỒNG Ở VIỆT NAM

Chuyên ngành: Hóa hợp chất thiên nhiên
Mã số: 62.44.01.17

TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC

Hà Nội, 2015


Công trình được hoàn thành tại: Viện Hóa học các Hợp chất thiên nhiên, Viện Hàn lâm Khoa
học và Công nghệ Việt Nam

Người hướng dẫn khoa học: 1. PGS.TS. Lê Mai Hương
2. TS. Lưu Văn Chính

Phản biện 1: GS.TSKH Phan Tống Sơn
Phản biện 2: GS.TS Phạm Văn Ty
Phản biện 3: PGS.TS Vũ Đình Hoàng

Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án cấp Học viện họp tại
.......................................................................................................................................
vào hồi

giờ

ngày

tháng

năm

Có thể tìm hiểu luận án tại thư viện: Thư viện quốc gia, Thư viện Học viện Khoa học và
Công nghệ


1

I.

GIỚI THIỆU LUẬN ÁN

1. Đặt vấn đề
Nấm lớn có khoảng 140.000 loài, trong đó có 14.000 loài đã được biết, và khoảng 50%
trong số đó được cho là có thể ăn được, hơn 2.000 loài là an toàn với người và khoảng
700 loài có hoạt tính sinh học có thể dùng cho ngành y dược. Khoa học đã chứng minh
nấm dược liệu có tác dụng tốt đối với sức khỏe con người, chữa các bệnh ung thư, tim
mạch, tiểu đường, mỡ máu, béo phì, suy giảm miễn dịch do virus (HIV), chống viêm
nhiễm, bệnh tổn thương thần kinh v.v… (Wasser, 2002; Chang và cs., 2004). Các hoạt

chất trong nấm có thể là các phân tử nhỏ như triterpenoids (hơn 130 loại) ở nấm linh
chi G. lucidum (Huie và cs., 2004), các hericinone (8 loại) và erinapyron của nấm hầu
thủ H. erinaceus (Arnone và cs., 1994), và đặc biệt là hoạt tính chữa bệnh chính là nhờ
các chất phân tử lượng lớn như polysaccharide và glycoprotein. Phần nhiều,
polysaccharide ở nấm có hoạt tính điều hòa đáp ứng sinh học (biological response
modifiers, BRM) với vai trò ngăn chặn và tiêu diệt tế bào lạ (ung thư, vi sinh vật
v.v…) mà không hây hại tế bào chủ.
Hiện nay chưa có loại thuốc đặc hiệu chữa ung thư. Các phương pháp điều trị ung thư
chủ yếu là áp dụng liệu pháp miễn dịch nhờ sử dụng các chất từ thiên nhiên (đặc biệt
beta-glucan từ nấm) kích hoạt, điều hòa hệ thống miễn dịch (đại thực bào, tế bào đơn
nhân …) của cơ thể tiêu diệt tế bào lạ (ung thư, vi sinh vật).
2. Đối tượng nghiên cứu và nội dung của luận án
Đối tượng nghiên cứu của luận án là nấm hầu thủ (Hericium erinaceus) và nấm hương
(Lentinula edodes), với những nội dung chủ yếu sau:
Tách chiết một số hợp chất trao đổi thứ cấp, các polysaccharide giàu glucan từ
quả thể nấm.
Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào, khả năng ức chế sự hình thành khối u trên
thạch mềm của các chất đã phân lập.
Tạo chế phẩm thử nghiệm trên động vật thực nghiệm.
Đánh giá độ an toàn và hiệu lực của chế phẩm trên động vật thực nghiệm (khả
năng kháng u và điều biến miễn dịch, khả năng bảo vệ, phục hồi chức năng gan của
sản phẩm)
3. Những đóng góp mới của luận án
3.1. Lần đầu tiên nghiên cứu có hệ thống 2 loài nấm (Hericium erinaceus, Lentinula
edodes) ở Việt Nam theo định hướng hoạt tính ức chế tạo u in vitro trong môi trường
thạch.
3.2. Lần đầu tiên đánh giá hoạt tính gây độc tế bào trên dòng ung thư gan (HepG2),
ung thư mô liên kết (RD) và hoạt tính ức chế tạo u in vitro trong môi trường thạch của
các polysaccharit phân lập từ 2 loài nấm (Hericium erinaceus, Lentinula edodes).



2

3.3. Là công trình đâu tiên chiết tách các hoạt chất từ nấm hương (Lentinula edodes)
và đánh giá hoạt tính gây độc tế bào và ức chế tạo u in vitro trong môi trường thạch.
3.4. Là công trình đầu sử dụng β-1,3/1,6-glucan tách từ nấm hầu thủ để bao curcumin
tạo ra sản phẩm Cur-Glu có kích thước nano (50 nm) và tan tốt trong nước. Sản phẩm
Cur-Glu có hiệu quả ức chế rõ rệt và phức gắn đựợc vào tế bào ung thư làm cho tế bào
phát quang. (Kết quả này đã được công bố trên tạp chí quốc tế Chemistry Letter,
vol.40, No8, p. 846-848)
4. Bố cục của luận án
Luận án gồm 174 trang với 41 bảng số liệu, 54 hình-sơ đồ, 187 tài liệu tham khảo và
11 phụ lục. Bố cục của luận án: Mở đầu (2 trang), Chương 1: Tổng quan tài liệu (41
trang), Chương 2: Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu (9 trang), Chương 3: Thực
nghiệm (20 trang), Chương 4: Kết quả và thảo luận (74 trang), Kết luận (3 trang), Các
công trình đã công bố (2 trang), Tài liệu tham khảo (22 trang), Danh mục các phụ lục
(1 trang).
II.
NỘI DUNG LUẬN ÁN
MỞ ĐẦU
Phần mở đầu đề cập đến ý nghĩa khoa học và thực tiễn của luận án.
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
Phần này tổng hợp các nghiên cứu trên Thế giới và trong nước về các nghiên cứu hóa
học và hoạt tính sinh học của nấm dược liệu.
CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tượng nghiên cứu
2.1.1. Nấm hương
Chủng nấm hương (Lentinula edodes (Berk.) Sing.) được lưu giữ tại Phòng Sinh
học thực nghiệm, Viện Hóa học các Hợp chất thiên nhiên.
Nấm nấm hương khô được cung cấp bởi Viện Di truyền Nông nghiệp.

2.1.2. Nấm hầu thủ
Chủng nấm hầu thủ (Hericium erinaceus (Bull.:Fr.) Pers) được lưu giữ tại
Phòng Sinh học thực nghiệm, Viện Hóa học các Hợp chất thiên nhiên.
Nấm hầu thủ khô được cung cấp bởi Viện Di truyền Nông nghiệp.
2.2. Các phương pháp phân lập các hợp chất
Sắc ký lớp mỏng (TLC)
Phương pháp sắc ký bản mỏng (TLC) hợp chất đường.
Sắc ký lớp mỏng điều chế
Sắc ký cột (CC)
2.3. Phương pháp tinh sạch β-glucan từ nấm hương và nấm hầu thủ
2.3.1. Phương pháp tinh sạch β-1,3-glucan từ nấm hương
Theo phương pháp của Chihara và cs, 1970.
2.3.2. Phương pháp tinh sạch β-1,3-glucan từ nấm hầu thủ
Theo phương pháp của Mizuno và cs., 1999


3

2.3. Các phương pháp xác định cấu trúc hoá học
Phương pháp chung để xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất là sự kết hợp xác
định giữa các thông số vật lý với các phương pháp phổ hiện đại bao gồm:
 Phổ khối lượng (MS)
 Điểm nóng chảy (MP)
 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR)
2.6. Phương pháp xác định hàm lượng polysaccharide
Theo phương pháp của Dubois và cs., 1956.
2.7. Phương pháp thủy phân không hoàn toàn β-1,3-glucan từ nấm hầu thủ bằng
-1,3-glucanase
2.8. Nghiên cứu bao curcumin (Cur) bằng β-1,3/1,6-glucan
2.9. Phương pháp đánh giá hoạt tính sinh học

2.9.1. Phương pháp thử khả năng gây độc tế bào (cytotoxicity)
Nuôi tế bào ung thư in vitro theo Skehan và cs. Xác định hoạt tính gây độc các dòng tế
bào ung thư theo phương pháp SRB của Likhiwitayawuid và cs đang được tiến hành
tại Viện Nghiên cứu Ung thư Quốc gia của Mỹ (NCI). Phương pháp này đã được
phòng Sinh học Thực nghiệm thuộc Viện Hoá học các Hợp chất Thiên nhiên áp dụng
từ năm 1996.
2.9.2. Phương pháp ức chế hình thành khối u 3 chiều trên thạch mềm (anti-tumor
promoting assay) in vitro
Theo tác giả Jong Bin Kim (2005) và Huiyuan Gao và cs. (2007), hiện đang được
triển khai thực hiện tại phòng Sinh học thực nghiệm, Viện Hóa học các Hợp chất thiên
nhiên.
2.10. Các phương pháp thử dược lý
2.10.1. Phương pháp đánh giá độc tính cấp
Nghiên cứu tính độc cấp theo phương pháp của Abrham (1978) và Turner (1965).
Được thử nghiệm tại Bộ môn Dược lý – Học viện Quân y.
2.10.2. Phương pháp đánh giá độc tính bán trường diễn
Phương pháp được mô tả bởi Abrham W.B. (1978) và theo quy định của WHO (2000)
và Bộ Y tế về hiệu lực và an toàn trong nghiên cứu thuốc có nguồn gốc thiên nhiên.
Được thử nghiệm tại Bộ môn Dược lý – Học viện Quân y.
2.10.3. Phương pháp đánh giá một số tác dụng của sản phẩm
Được thử nghiệm tại Bộ môn Dược lý – Học viện Quân y.
2.10.3.1. Nghiên cứu tác dụng bảo vệ gan của HG1 trên mô hình gây độc gan bằng
carbon tetracholorid
2.10.3.2. Nghiên cứu tác dụng của HG1 đến quá trình tổng hợp protein trên động
vật khi dùng bán trường diễn
Phương pháp được mô tả bởi Irwin Samuel (1967).
2.10.3.3. Nghiên cứu tác dụng trên hệ miễn dịch của HG1 thực nghiệm
Theo phương pháp của Santos G.W., Mansour H. (1968) và Phạm Mạnh Hùng (1984)



4

2.10.3.4. Phương pháp thử hiệu lực kháng u thực nghiệm
Theo phương pháp của Irina G. Agafonova và cs., 2008 và được thử nghiệm tại Viện
Hàn lâm Khoa học Nga
2.10.4. Xử lý số liệu
Theo phương pháp thống kê dùng trong y-sinh-dược học. Sử dụng phần mềm
Microsoft Excel (Nguyễn Xuân Phách và cs, 1995)
CHƯƠNG III. THỰC NGHIỆM
3.1. Nghiên cứu hóa học và hoạt tính sinh học của nấm hương
Phần này trình bày cụ thể cách thức phân lập các chất từ nấm hương theo định hướng
hoạt tính ức chế sự hình thành khối u trong môi trường thạch.
3.1.1. Phân lập các hợp chất từ quả thể nấm hương
Nấm hương khô
(2 kg)
Chiết siêu âm với EtOH 95%

Dịch
Bã nấm
0

Làm lạnh ở 4-10 C

Kết tinh

Cất loại
dm
Cặn chiết EtOH
(65 g)


NH1
(6g)

Nước (100C)
Dịch chiết
nước

Cặn
nấm I
1% NH4 oxalate

EtOH

- Bổ sung nước
- Bổ sung n-hexan

(100C)

P1
(76,8g)

Lớp n-hexan

Dịch chiết
axit
Cặn n-hexan
(22 g)

Cặn
II

NaOH
(5%), 60C

EtOH

Bổ sung EtOAc
P2
(50g)

Lớp etyl axetat

Lớp nước
Chiết BuOH

Cặn etyl axetat
(15g)

Cặn BuOH
(18 g)

Dịch chiết
kiềm
EtOH

P3
(221,6g)

Sơ đồ 3.1. Sơ đồ chiết phân đoạn mẫu nấm hương

Cặn

III


5

Cặn n-hexan
(22g)
Silica gel CC

NH-A1

n-hexan/axeton
NH-A249/11/1 NH-A3

(1,5g)Silica gel CC

(1.3g)

(900mg)

NH2nNH3
hexan/axeton:
(150mg)
(50mg)
3/1-1/1

Sơ đồ 3.2. Sơ đồ phân lập các hợp chất NH2 và NH3
3.1.2. Tách polysaccharide từ dịch lên men nấm hương
Dịch lên men nấm
hương (1 lít)


- Ly tâm 5000v/phút
- Loại bỏ cặn

Dịch
- Bổ sung EtOH 95% (tỉ lệ 3:1)
- Ủ 4C
- Ly tâm 10000v/phút

Cặn P4
(5,2 g)

Sơ đồ 3.3. Sơ đồ tách chiết polysaccharide từ dịch lên men nấm hương
3.1.3. Tinh sạch β-1,3/1,6 glucan (lentinan) từ nấm hương
P1 (25,2 g)
2L nước, khuấy. Tủa với CTAOH 0.2M
K. tủa
20% acetic acid
K. tủa CTA-OH
50% acetic acid
K. tủa
Hòa tan trong 6% NaOH
Dịch tan
Ethanol, 3 v
K. tủa
Loại protein bằng phương pháp Sevag
Polysaccharide tinh sạch (15,2 g)

NH-GL


Sơ đồ 3.4. Sơ đồ tinh sạch β-1,3/1,6 glucan từ nấm Hương


6

3.2. Nghiên cứu hóa học và hoạt tính sinh học của nấm hầu thủ
Phần này trình bày cụ thể cách thức phân lập các chất từ nấm hầu thủ
3.2.1. Phân lập các hợp chất từ quả thể nấm hầu thủ
Nấm hầu thủ khô
(2 kg)
Chiết siêu âm với EtOH 95%

Dịch

Cặn nấm
Nước (100C)

Cất loại
dm
Cặn chiết EtOH
(25 g)
- Bổ sung nước

Cặn
I

Dịch chiết
nước

1% NH4 oxalate

(100C)

EtOH

- Bổ sung n-hexan

Lớp nước

Lớp n-hexan

P1
(120g)
Dịch chiết
axit

Cặn n-hexan
(15 g)

Bổ sung EtOAc

Lớp etyl axetat

EtOH

P2
(30g)

Lớp nước

NaOH

(5%),
60C
Dịch chiết
kiềm

Cặn
III

EtOH

Chiết BuOH
Cặn etyl axetat
(7g)

Cặn
II

P3
(320g)

Cặn BuOH
(3 g)

Sơ đồ 3.5: Sơ đồ chiết phân đoạn mẫu nấm Hầu thủ
Cặn n-hexan
(15g)

Cặn etyl
axetat
(7 g)


Silica gel CC

Silica gel pha
thường
và pha đảo

nHT-A3
HT-A1
HT-A2hexan/axeton
(900mg)
(4,5g)
9/11/1
Làm lạnh, kết Sephadex
tinh lại

HT2 Silica gel CC
HT1
- Lọc rửa nhiều
(52mg)
(500mg)
nlần bằng aceton
lạnh

HT3
(8 mg)

HT4
(20 mg)


HT5
(125 mg)

hexan/axeton
Sơ đồ 3.6:
Sơ đồ phân lập các hợp chất từ nấm hầu thủ
4/1

HT6
(15 mg)


7

3.2.2. Tách polysaccharide từ dịch lên men nấm hầu thủ
Dịch lên men nấm hầu
thủ (1 lít)
- Ly tâm 5000v/phút
- Loại bỏ cặn
Dịch
- Bổ sung EtOH 95% (tỉ lệ 3:1)
- Ủ 4C
- Ly tâm 10000v/phút

Cặn P4
(3,6 g)

Sơ đồ 3.7. Sơ đồ tách chiết polysaccharide từ dịch lên men nấm hầu thủ
3.2.3. Tinh sạch β-1,3/1,6 glucan từ nấm hầu thủ
P3

(160 g)
Cột
DEAE cellulose (Cl -)

Tinh sạch 1
(40g)
Cột
Sapharose CL6B

Tinh sạch 2, β-1,3/1,6 glucan
(14,54g)

Sơ đồ 3.8. Sơ đồ tinh sạch β-1,3/1,6 glucan từ nấm hầu thủ
3.2.4. Thủy phân không hoàn toàn β-1,3-glucan từ nấm hầu thủ bằng -1,3glucanase
Dịch -Glucan
5% beta glucan (5mg/ml) trong đệm citric 25mM
enzyme
5’
D1

15’

120’

60’

D2

D3


D4

Bất hoạt enzyme, 100C

Tủa EtOH tới 25%

Dịch

HT-GL1

Tủa EtOH tới 40%
Dịch

HT-GL2

Tủa EtOH 70%
HT-GL3

Dịch

Sơ đồ 3.9. Sơ đồ Thủy phân β-1,3/1,6 glucan từ nấm hầu thủ bằng emzyme


8

3.2.6. Sử dụng β-1,3/1,6-glucan từ nấm hầu thủ làm chất mang curcumin
 glucan

Curcumin tinh khiết


H O trao đổi ion (tỉ

EtOH tuyệt đối (tỉ
lệ 1:1)

2

lệ 1:1)

Dịch  glucan

Dịch Curcumin

Khuấy đều trên máy khuấy từ trong
o

điều kiện chân, t phòng, 48 giờ

Hỗn hợp A
Làm bay hơi từ từ dung môi ở nhiệt độ
trong phòng trong thời gian 24 h

DD B
Ly tâm 3 lần dung dịch Cur-Glucan rồi lọc và loại
bỏ phần Cur không được bao lắng xuống

Dung dịch Cur-Glu
Đông khô

Bột Cur-Glu


Sơ đồ 3.10 Sơ đồ tạo hỗn hợp β-1,3/1,6 glucan từ nấm hầu thủ và curcumin
3.3. Tạo chế phẩm thử nghiệm
Tạo ra 01 sản phẩm thử nghiệm (HG1) có thành phần gồm: 35 % β-1,3/1,6-glucan (từ
phân đoạn polysaccharide P3 của nấm hầu thủ); 0,1 % là các chất có hoạt tính khác
trong nấm hầu thủ; 64,9 % chất mang.
3.4. Thử dược lý chế phẩm
3.4.1. Nghiên cứu độc tính cấp
Thí nghiệm được tiến hành với các nhóm chuột nhắt trắng, trọng lượng trung bình là
20 ± 2,0 g. Trước khi cho chuột uống HG1, chuột được chuẩn bị trước 16 giờ. Chế
phẩm nghiên cứu HG1 được cho uống với các mức liều tăng dần. Trong số các mức
liều đem thử, khoảng cách giữa mức liều cao nhất chưa gây chết một con chuột nào và
mức liều thấp nhất gây chết 100% số chuột trong nhóm được sử dụng để tính toán. Sau
khi cho uống HG1, chuột được nuôi dưỡng và theo dõi chu đáo, ăn thức ăn tổng hợp
do xưởng sản xuất thức ăn động vật thí nghiệm cung cấp, nước uống ad libitum. Thời
gian theo dõi liên tục trong 72 giờ. Số chuột chết được đếm theo nhóm.
Tính toán: theo phương pháp cải tiến của Livschitz (1986)


9

3.4.2. Nghiên cứu độc tính bán trường diễn
Căn cứ vào kết quả LD50 dùng phép ngoại suy cho liều dùng trên động vật, chúng tôi
sử dụng cho uống chế phẩm bán trường diễn 2 mức liều thấp và cao.
Nghiên cứu ảnh hưởng của HG1 khi cho động vật uống bán trường diễn đối với trọng
lượng cơ thể và khối lượng gan, lách, thận
Dùng các nhóm chuột nhắt trắng khỏe mạnh, đủ điều kiện thí nghiệm, có trọng lượng
trung bình 20 ± 2,0g. Nhóm chứng cho uống dung môi (không chứa HG1) x 0,2mL
mỗi con một lần trong ngày. Nhóm HG1 thử cho uống 2 mức liều căn cứ vào LD50 của
HG1, liên tục trong 42 ngày. Theo dõi bằng các chỉ tiêu: tập tính động vật, lượng thức

ăn tiêu thủ, lượng nước uống được theo dõi theo từng nhóm. Kết thúc đợt uống HG1,
động vật thí nghiệm được giết, phẫu tích bóc tách các tạng gan, lách, thận, đánh giá
các tổn thương đại thể bằng kính lúp. Khối lượng mỗi tạng được cân bằng cân phân
tích. Xử lý số liệu theo nghiệm pháp t-Student; so sánh từng cặp và test trước-sau. Sự
khác biệt có ý nghĩa khi p < 0,05.
Nghiên cứu ảnh hưởng của HG1 với các chỉ tiêu huyết học của động vật thí nghiệm
cho uống trường diễn
Các lô chuột nhắt trắng khỏe mạnh, trọng lượng 20 ± 2,0 g được dùng cho thí nghiệm
này. Cho uống HG1 liều 3,0 g/kg thể trọng, liên tục trong 42 ngày. Trước thí nghiệm
và sau khi thí nghiệm, lấy máu xét nghiệm. Số lượng hồng cầu, lượng haemoglobin, số
lượng bạch cầu, tiểu cầu được định lượng trên máy xét nghiệm tự động tại lab cận lâm
sàng - Viện Bỏng Quốc gia - Học viện Quân y. Đánh giá ảnh hưởng của HG1 đối với
các tế bào máu. So sánh giữa các nhóm thử và nhóm chứng. Xử lý theo nghiệm pháp tStudent, trước và sau dùng HG1 trong từng nhóm và giữa các nhóm với nhau.
Nghiên cứu ảnh hưởng của HG1 khi cho uống dài ngày đối với chức năng gan, thận
qua các thông số hóa sinh
Dùng các nhóm chuột, cho uống liên tục HG1, liều 3,0 g/kg thể trọng, nhóm chứng
dùng dung môi. Tại các thời điểm trước và sau thí nghiệm, các nhóm chuột được lấy
máu xét nghiệm. Định lượng các enzym transaminase (AST, ALT, gamma GT), định
lượng creatinin để đánh giá chức năng gan, thận theo phương pháp của Bergmeyer
H.U. (1986) trên máy xét nghiệm tự động tại lab cận lâm sàng - Viện Bỏng Quốc gia Học viện Quân y.
Nghiên cứu tác dụng của HG1 đối với các biến đổi mô bệnh học ở gan, thận, lách
động vật thí nghiệm
Các mẫu gan, thận, lách được lấy trước và sau khi cho động vật uống HG1 bằng cách
giết chuột, phẫu tích các mẫu gan, thận, lách, cố định bằng formol, đúc chuyển qua các
dung dịch để loại nước, rồi đúc trong khối parafin, cắt lát dày 56 µm bằng máy
Microtome Sartorius Werke. Nhuộm tiêu bản bằng phương pháp Hematoxylin - Eosin
(HE). Đọc tiêu bản bằng kính hiển vi quang học với độ phóng đại 100200 lần. Chụp
ảnh qua kính hiển vi huỳnh quang ở độ phóng đại 200400 lần. Đánh giá các tổn
thương theo từng nhóm và so sánh. Xử lý số liệu thu được bằng phương pháp mô tả



10

hình thái giải phẫu bệnh lý trên mẫu tiêu bản và trên ảnh chụp được từ các tiêu bản
trên.
3.4.3. Nghiên cứu một số tác dụng của sản phẩm HG1 trên động vật thực nghiệm
Nghiên cứu tác dụng bảo vệ gan của HG1 trên mô hình gây độc gan bằng carbon
tetracholorid
Chuột nhắt trắng được chia thành 3 nhóm:
Nhóm 1: Nhóm chứng sinh học (không gây độc gan)
Nhóm 2: Chỉ gây độc gan đơn thuần bằng cách tiêm carbon tetrachlorid
Nhóm 3: Dùng chế phẩm HG1 điều trị dự phòng 7 ngày liên tục liều 3,0 g/kg
TLCT theo đường uống, sau đó gây độc bằng cách tiêm carbon tetrachlorid.
Gây độc gan cấp bằng tetrachlorid
Chuột nhóm 2 và 3 được tiêm phúc mạc carbon tetrachlorid liều 4,2 mL/kg TLCL.
Các chỉ tiêu đánh giá mức độ tổn thương tế bào gan và hiệu quả điều trị dự phòng của
HG1:Hoạt độ enzym AST, ALT và γGT trong huyết thanh chuột, khối lượng gan tính
theo 10 g TLCT chuột.
Phương pháp nghiên cứu tác dụng của HG1 đến quá trình tổng hợp protein trên động
vật khi dùng bán trường diễn
Các nhóm chuột nhắt trắng nuôi trong cùng điều kiện. Các nhóm nghiên cứu và nhóm
chứng thức ăn tổng hợp như nhau, nhóm nghiên cứu cho uống hàng ngày 3,0 g/kg
TLCT /24 h chế phẩm HG1 sau 6 tuần dùng, các nhóm động vật được lấy máu định
lượng protein toàn phần trên máy xét nghiệm hóa sinh tự động.
Tính toán: Lượng protein toàn phần được so sánh trước và sau thử nghiệm (nghiệm
pháp trước - sau).
Nghiên cứu tác dụng trên hệ miễn dịch của HG1 thực nghiệm
Động vật thí nghiệm: CNT 68 tuần tuổi, trọng lượng 20,0g ± 2,0 g được dùng cho thí
nghiệm này.
Các nhóm động vật thí nghiệm gồm: CNT được gây suy giảm miễn dịch (SGMD) thực

nghiệm bằng cách chiếu xạ bằng nguồn chiếu xạ telecobalt 60 (60Co) suất liều 7,0 Gy
và được điều trị bằng chế phẩm HG1 cho uống trước để dự phòng.
Gồm các nhóm:
Đối chứng sinh học (ĐCSH): CNT được nuôi trong điều kiện phòng thí nghiệm
(20C, 12/12 giờ sáng/tối, yên tĩnh).
Đối chứng SGMD: CNT được gây SGMD bằng cách chiếu xạ 7,0 Gy, sau đó
không dùng gi, nuôi như ĐCSH.
Nhóm NC: được gây SGMD thực nghiệm, cho uống HG1 với 2 mức liều ngoại
suy căn cứ vào kết quả nghiên cứu độc tính cấp và bán trường diễn.
Các chỉ tiêu đánh giá:
Tỷ lệ (%) chuột sống/chết trong vòng 30 ngày kể từ sau khi chiếu xạ.
Khối lượng trung bình của tuyến ức, hạch lympho vùng nách và khối lượng của
lách so với trọng lượng cơ thể (TLCT). Đánh giá sự thay đổi mô học của tuyến ức,
hạch lympho và lách.
Số lượng tế bào tủy, bạch cầu, coloni lách ở chuột nhắt trắng.


11

Số lượng bạch cầu, hồng cầu, tiểu cầu máu ngoại vi.
Tỷ lệ thực bào và chỉ số thực bào.
Phản ứng quá mẫn với kháng nguyên (KN) đặc hiệu: gây mẫn cảm chuột nhắt
bằng kháng nguyên albumin lòng trắng trứng (OVA). 4 ngày sau khi gây mẫn cảm, thử
thách với kháng nguyên OVA bằng cách tiêm kháng nguyên vào dưới da gan bàn chân
chuột nhắt trắng. Đánh giá đáp ứng quá mẫn muộn với kháng nguyên OVA tại các thời
điểm 24 h, 48 h, 72 h và 96 h sau thời điểm tiêm.
3.4.4. Nghiên cứu thử hiệu lực kháng u thực nghiệm trên động vật của sản phẩm
HG1
−
Động vật thí nghiệm

Chuột nhắt trắng trọng lượng 20,0  2,0 g đạt tiêu chuẩn nghiên cứu.
Động vật thí nghiệm được nuôi dưỡng theo quy định trong phòng thí nghiệm chuyên
dụng dược lý 1 tuần trước khi làm thí nghiệm.
−
Nghiên cứu thử hiệu lực kháng u thực nghiệm của HG1
Đánh giá hoạt tính tan huyết trên tế bào ung thư cổ trướng Ehrlich
Chuẩn bị dịch tế bào hồng cầu:
Thu máu từ chuột dòng CD1 (20 g): Chuột được gây mê bằng diethyl ether, nhanh
chóng mổ ngực của chúng và lấy máu bằng cách chọc nóng trong dung dịch đệm PBS
10 mM pH 7,4 lạnh (4C) - không dùng thuốc chống đông máu. Hồng cầu được rửa 3
lần với PBS, dùng ít nhất 10 lần thể tích dung dịch rửa, ly tâm 5 phút ở tốc độ 1500
rpm. Nồng độ hồng cầu đạt mức OD 1,0 ở 700 nm ở những mẫu chưa cho tan huyết.
Với thử nghiệm tan huyết, 10 µL dung dịch mẫu thử nghiệm được pha với 90 µL dung
dịch hồng cầu 5% trên phiến 96 giếng trong 1 giờ (37C). OD được theo dõi liên tục
bằng spectrophotometer ở 700 nm (Specord UV-VIS).
Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào in vitro trên tế bào ung thư cổ trướng Ehrlich
(EAC)
Dòng tế bào 4N Ehrlich được sử dụng trong thí nghiệm này. Các tế bào ung thư EAC
được nuôi cấy trong ổ bụng của chuột bằng phương pháp tiêm vào khoang cơ thể
chúng. Dòng chuột CD1 được sử dụng trong thí nghiệm này.
Tế bào được thu lại sau 7 ngày nuôi cấy. Chuột được gây mê với diethyl ether và
nhanh chóng mổ ổ bụng để lấy các tế bào ung thư (bằng xi lanh). Các tế bào được rửa
3 lần với buffer muối (saline buffer) pH 7,4, dùng ít nhất 10 thể tích lần dung dịch rửa,
ly tâm 5 phút ở tốc độ 1000 rpm; sau đó tạo lại dung dịch tế bào với saline buffer
(nồng độ 2x106 tế bào/mL).
Với thử nghiệm gây độc tế bào, 10 µL dung dịch mẫu thử nghiệm trong DMSO được
pha với 90 µL dung dịch tế bào trên phiến 96 giếng trong 1 giờ (37C). Tổng tế bào và
số tế bào sống được đếm qua kính hiển vi với thuốc nhuộm Trypan Blue 0,17%.
Đánh giá hoạt tính chống u in vivo đối với tế bào ung thư biểu mô cổ trướng
Ehrlich (EAC)



12

Ung thư EAC được phát triển ở chuột dòng CD1. Chuột đực của dòng CD1 từ 68
tuần tuổi với cân nặng 20g được sử dụng. Trong thí nghiệm này có 40 động vật thử
nghiệm. Mỗi nhóm thí nghiệm gồm 10 động vật thử nghiệm.
Tế bào ung thư Ehrlich được tiêm vào khoang cơ thể của chuột với nồng độ 2x106 tế
bào/mL. Cho chuột dùng chế phẩm HGC1 bắt đầu 1 ngày sau khi cấy khối u. Hỗn hợp
pha trong 1% DMSO và dầu olive với các liều 100, 10 và 1 g/kg được thêm vào mỗi
chuột 1 ngày 1 lần, trong 5 ngày (5 liều). Nhóm đối chứng chỉ có 1% DMSO và dầu
olive.
Đánh giá hoạt tính chống u trên tế bào ung thư biểu mô cổ trướng Ehrlich (EAC)
bằng MRI
Chuột BALB/c đực 68 tuần (trọng lượng khoảng 26 g) tuổi được sử dụng. Tế bào
Ehrlich được cấy vào chuột ở dưới xương đòn vai phải với nồng độ 5x106 tế bào/mL.
Cho chuột dùng mẫu thử nghiệm 1 ngày sau khi cấy khối u.
Sử dụng kỹ thuật MRI để ước tính khả năng kiềm hãm khối u Ehrlich sau mỗi 2 ngày
kể từ ngày thứ 7 sau khi cấy với tế bào ung thư (ở nhóm đối chứng và nhóm thử
nghiệm). Chuột được gây mê với xylazine (13 mg/kg trọng lượng cơ thể).
CHƯƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. Nghiên cứu hóa học và hoạt tính sinh học của nấm hương
Phần này trình bày về cách phân lập và xác định cấu trúc theo đinh hướng hoạt tính ức
chế sự hình thành khối u trong môi trường thạch của các hợp chất từ nấm hương.
4.1.1. Tách các phân đoạn và đánh giá hoạt tính sinh học
Quả thể nấm hương khô được chiết và tách phân đoạn như miêu tả ở sơ đồ 3.1 (mục
3.1.1). Từ dịch chiết cồn đã tách được: 01 chất kết tinh NH1 và 3 phần chiết gồm: cặn
n-hexan, cặn ethyl axetat, cặn butanol. Từ bã nấm 03 phân đoạn polysaccharide (P1NH, P2-NH, P3-NH) được tách chiết (xem sơ đồ 3.1 ở mục 3.1.1). Ngoài ra, từ dịch
lên men nấm hương phân đoạn polysaccharide P4-NH được tách (xem mục 3.1.2).
Hàm lượng polysaccharide các phân đoạn tách từ nấm hương cũng được trình bày ở

bảng 4.1.
Bảng 4.1. Polysaccharide trong các phân đoạn tách chiết nấm hương
Dạng nguyên liệu

Polysaccharide*(**)

Chiết nước nóng
(P1)
3,84 (3,01)

100 g quả thể
Chiết axit (P2)
2,5 (1,95)

Chiết kiềm
(NaOH 1M) (P3)
11,08 (9,5)

Dịch thể (g/L)
(P4)
5,2 (3,94)

Lượng polysaccharide thô trong 100 g mẫu nấm khô (hoặc 1L dịch thể)
Số trong ngoặc: là hàm lượng polysaccharide trong 100 g mẫu nấm khô (hoặc 1L dịch thể)

Tất cả các phân đoạn chiết tách của nấm hương được đánh giá hoạt tính gây độc tế bào
và kháng u trên thạch. Kết quả cho thấy mẫu NH-hexan và P1- NH có hoạt tính gây
độc tế bào trên 2 dòng tế bào ung thư gan (HepG2) và ung thư mô liên kết (RD). Hơn
nữa cả 2 mẫu đó đều biểu hiện hoạt tính ức chế sự hình thành khối u trên thạch với mật



13

độ hình thành khối u giảm tương ứng là 58,56 và 54,09%, kích thước trung bình của
khối u giảm tương ứng là 52,01 và 35,36% so với đối chứng.
Chúng tôi lựa chọn ra 2 phân đoạn n-Hexan và P1-NH từ nấm hương để phân tách tiếp
theo sự dẫn đường của phép thử hoạt tính chống ung thư.
Phân đoạn n-Hexan được tách thành 3 phân đoạn nhỏ NH-A1, NH-A2, NH-A3. Kết
quả đánh giá hoạt tính chống ung thư thông qua thử nghiệm gây độc tế bào và ức chế
tạo u trên thạch của các phân đoạn. Kết quả cho thấy phân đoạn NH-A1 biểu hiện hoạt
tính gây độc tế bào và ức chế sự hình thành khối u trên thạch. Phân đoạn NH-A1 được
lựa chọn để nghiên cứu thành phần hóa học.
Từ phân đoạn NH-A1 sắc ký cột với hệ dung môi n-hexan/axeton theo tỉ lệ 3/1-1/1, thu
được 2 hợp chất ký hiệu là NH-2 (150 mg) và NH-3 (50 mg) (sơ đồ 3.2).
Từ phân đoạn polysaccharide P1-NH tinh sạch được β-1,3/1,6 glucan (GL-NH) (xem
mục 3.1.4)
1.1.2. Xác định cấu trúc các hợp chất NH1, NH2 và NH3
Hợp chất NH1: galactiol
Chất kết tinh màu trắng, điểm chảy 167-169C.
1
H-NMR (DMSO-d6, 500 MHz, ppm) δ 4,40 (d, J = 5,5 Hz, 1H-OH), 4,35 (t, J = 6
Hz, 1H –OH), 4,13 (d, J = 7 Hz), 1H-OH), 3,60 (m, 1H, H1a), 3,53 ( t, J = 7,5 Hz,1H, H3),
3,45 (m, 1H, H1b), 3,38 (m, 1H, H2).
13
C-NMR (DMSO-d6, 125 MHz, ppm) δ 71,5 (C2), 69,8 (C3), 63,9 (C1)
Hợp chất NH2: Ergosterol
Tinh thể hình kim màu trắng, Tnc: 168oC, ESI-MS: m/z 397,3 [M + H]+ (C28H44O, M = 396).
1
H-NMR (DMSO-d6, 500 MHz, ppm) δ: 5,75 (dd, J1=2Hz, J2=5,5Hz, 1H,H6), 5,38
(m,1H,H7), 5,23 (dd, J1=7Hz, J2=15Hz, 1H, H23), 5,17 (dd, J1=7Hz, J2=15Hz, H22), 3,64 (m,

H3), 2,47 (m, 1H), 2,28 (t, J = 12 Hz, 2H,H4), 2,04 (m, 1H, H20), 1,98 (1H, m, H9), 1,94 (1H,
m, H14), 1,90 (1H, m, H12b), 1,76 (2H, m, H2b, H24), 1,75 (1H, m, H1b), 1,73 (1H, m, H14), 1,67
(1H, m, H15), 1,28 (1H, m, H16a), 1,74 (1H, m, H16b), 1,25 (1H, m, H15a), 1,68 (m, 1H, H15b),
1,64 (m, 1H, H11), 1,50 (1H, m, H2a), 1,38 (m, 1H, H25), 1,34 (1H, m, H12a), 1,25 (m, 1H,
H1a), 1,78 (1H, m, H1b), 1,04 (d, J=6,5Hz, 3H21), 0,95 (s, 3H, H19), 0,92 (3H, d, J = 6,5 Hz,
H28) và 0,83 (t, J =7 Hz, 6H, H26-27), 0,63(s, 3H, H-18).
13
C-NMR (DMSO-d6, 125 MHz, ppm) δ: 141,7 (C-5), 139,9 (C-8), 135,6 (C-22),
131,9 (C-23), 119,60 (C-6), 116,50 (C-7), 70,49 (C-3), 55,79 (C-17), 54,59 (C-14), 46,29 (C9), 42,87 (C-24), 42,59 (C-13), 40,83 (C-40), 40,82 (C-20), 39,12 (C-12), 38,41 (C-1), 37,06
(C-10), 33,12 (C-25), 32,03 (C-2), 28,29 (C-16), 23,02 (C-15), 21,14 (C-4), 21,12 (C-21),
16,31 (C-19), 19,66 (C-26), 19,96 (C-27), 17,62 (C-28) và 12,07 (C-18).
Hợp chất NH3: Ergosterol peroxide
Chất tinh thể hình kim màu trắng, Tnc. 181-183oC, phổ khối lượng ESI-MS: m/z 429,3 [M +
H]+ (C28H44O3, M = 426).
1
H-NMR (CDCl3, 500 MHz, ppm) δ: 1,56 (1H, m, H1a), 1,85 (1H, m, H1b), 1,72 (1H,
m, H2a), 1,96 (1H, m, H2b), 3,97 (1H, m, H3), 1,27 (1H, m, H4a), 1,97 (1H, m, H4b), 6,24 (1H,
d, J = 8,5 Hz, H6), 6,50 (1H, d, J = 8,5 Hz, H7), 1,51 (1H, m, H9), 1,41 (1H, m, H11a), 1,62
(1H, m, Hb-11), 1,55 (1H, m, H12a), 2,11 (1H, m, H12b), 1,58 (1H, m, H14), 1,25 (1H, m, H15a),
1,53 (1H, m, H15b), 1,37 (1H, m, H16a), 1,78 (1H, m, H16b), 1,24 (1H, m, H17), 0,86 (3H, s,
H18), 0,88 (3H, s, H19), 2,03 (1H, m, H20), 1,01 (3H, d, J = 7,0 Hz, H21), 5,14 (1H, dd, J =


14

8,5, 15,5 Hz, H22), 5,22 (1H, dd, J = 8,5, 15,5 Hz, H23), 1,87 (1H, m, H24), 1,50 (1H, m, H25),
0,88 (3H, d, J = 6,6 Hz, H26), 0,83 (3H, d, J = 6,5 Hz, H27) và 0,91 (3H, d, J = 6,5 Hz, H28).
13
C-NMR (CDCl3, 125 MHz, ppm) δ: 30,09 (C-1), 34,71 (C-2), 66,49 (d, C-3), 39,37
(C-4), 82,17 (C-5), 135,22 (C-6), 130,75 (C-7), 79,44 (C-8), 51,12 (C-9), 36,99 (C-10), 20,64

(C-11), 39,91 (C-12), 44,58 (C-13), 51,70 (C-14), 23,42 (C-15), 28,65 (C-16), 56,23 (C-17),
12,88 (C-18), 18,18 (C-19), 39,73 (C-20), 20,89 (C-21), 135,44 (C-22), 132,33 (C-23), 42,79
(C-24), 33,08 (C-25), 19,65 (C-26), 19,96 (C-27) và 17,57 (C-28).
Hợp chất NH-GL: β-1,3/1,6 glucan
Kết quả phổ cho thấy, có 9 tín hiệu nguyên tử C chính. Tín hiệu tại C = 103 chỉ ra
nguyên tử C1; tín hiệu C = 86,1 chỉ ra nguyên tử C3; tín hiệu C = 76,7 chỉ ra C5; tín hiệu C
= 76,3 chỉ ra C3’; tín hiệu C = 73,7 chỉ ra C2; tín hiệu C = tín hiệu 70,3 chỉ ra C6s (thay
thế); tín hiệu C = 68,4 chỉ ra C4 và tín hiệu C = 61,2 chỉ ra C6.

Hợp chất NH1: galactiol
HO

CH2

Hợp chất NH-2: Ergosterol
28

OH
21

22

24

26

20

CH


CH

OH

2

3

HO

18

CH

17

11
1

25
27

13

19

CH

9
14


1

HO

23

10

H2C

OH

8

3

HO

Hợp chất NH3: Ergosterol peroxide

5

Chất NH-GL: β- 1,3/1,6 glucan

28
21

22


24

26

20
18
17

11

25
27

13

19
1

23

9
14
8

10
3

O

5


HO

O

1.1.3. Đánh giá hoạt tính sinh học của các hợp chất phân lập từ nấm hương
Các hợp chất phân lập được đánh giá hoạt tính gây độc tế bào và kháng u trên thạch
mềm. Kết quả thu được ở bảng 4.2, 4.3.
Bảng 4.2. Hoạt tính gây độc tế bào của các hợp chất phân lập từ nấm hương
Nồng độ
Dòng tế bào
ST Ký hiệu
mẫu
Phần trăm sống sót (%)
T
mẫu
(g/ml)
Hep-G2
Fl
RD
Lu
DMSO

100  0,0

100  0,0

100  0,0

100  0,0


1
2

Chứng (+)
NH1
NH2

5
10
10

2,1 0,07
92,70,8
61,10,4

1,7 0,4
96,31,2
72,80,2

0,3  0,02
94,40,5
79,51,1

5,20,4
99,71,8
92,50,3

3


NH3

10

26,50,7

32,91,1

42,20,4

48,90,6

4

NH-GL

20

91,30,7

93,21,1

86,50,9

90,41,4


15

STT


Dòng tế bào
Giá trị IC50 (g/ml)

Ký hiệu mẫu

Chứng (+)
NH3

1

Hep-G2
0,22
3,84

Fl
0,27
4,17

RD
0,16
7,61

Lu
0,31
9,21

Kết quả cho thấy, hợp chất NH3 biểu hiện hoạt tính độc tế bào cả 4 dòng tế bào thử
(ung thư gan – Hep G2, ung thư tử cung-Fl, ung thư mô liên kết-RD, ung thư phổi –
Lu) với giá trị IC50 lần lượt là 3.84, 4.17, 7.61, 9.21g/ml.

Bảng 4.3. Kết quả thử nghiệm hoạt tính ức chế tạo u tế bào ung thư gan HepG2
trên thạch mềm của các hợp chất
Kích thước trung bình của
Nồng độ
Độ giảm mật
khối u
mẫu thử
Kí hiệu mẫu
độ khối u
Đường kính % giảm so với
(% )
(g/mL)
(µm)
đối chứng
Chứng âm (DMSO 1%)
0
0
29,631,71
10
5,14
NH1
27,751,35
3,330,58
10
3,91
NH2
28,111,57
48,330,50
10
55,18

NH3
13,280,98
58,331,26
20
34,36
GL-NH
19,451,25
39,250,94
Kết quả bảng 4.3 cho thấy hợp chất NH3 và GL-NH ức chế sự hình thành khối u. Hợp
chất NH3 ức chế rõ rệt hơn cả, mật độ hình thành khối u giảm 58,33% và kích thước
trung bình của khối u giảm 55,18 % so với đối chứng.
4.2. Nghiên cứu hóa học và hoạt tính sinh học của nấm hầu thủ
4.2.1. Tách phân đoạn và đánh giá hoạt tính chống ung thư
Quả thể nấm hầu thủ khô được chiết và tách phân đoạn như miêu tả ở sơ đồ 3.4 (mục
3.2.1). Từ dịch chiết cồn đã tách được 3 phần chiết (cặn n-hexan, cặn etyl axetat, cặn
butanol). Từ bã nấm chiết tách được 03 phân đoạn polysaccharide (P1-HT, P2-HT,
P3-HT) . Ngoài ra, từ dịch lên men nấm hầu thủ tách được phân đoạn polysaccharide
P4-HT (xem mục 3.2.2).
Các phân đoạn polysaccharide thô cũng được xác định hàm lượng polysaccharide. Kết
quả được trình bày ở bảng 4.4.
Bảng 4.4. Polysaccharide trong các phân đoạn tách chiết nấm hầu thủ và nấm
hương
Nấm

Nấm hầu thủ

Dịch thể
(g/L)
(P4)
3,6 (1,52)


Chiết nước
nóng (P1)
6 (2,5)

100 g quả thể
Chiết axit (P2)
1,5 (1,2)

Chiết kiềm
(NaOH 1M) (P3)
16,0 (12,1)

Lượng polysaccharide thô trong 100 g mẫu nấm khô (hoặc 1L dịch thể)
Số trong ngoặc: là hàm lượng polysaccharide trong 100 g mẫu nấm khô (hoặc 1L dịch thể)


16

Tất cả các phân đoạn đó được đánh giá hoạt tính gây độc tế bào và kháng u trên thạch.
Kết quả cho thấy cho thấy cặn n-hexan và polysaccharide P3-HT biểu hiện khả năng
ức chế sự hình thành khối u với mật độ hình thành khối u giảm tương ứng là 47,93 và
30,35% và kích thước trung bình của khối u giảm tương ứng là 44,49 và 33,63% so
với đối chứng.
Cặn chiết n-hexan được tiến hành phân lập bằng sắc ký cột lặp lại trên silica gel pha
thường và sephadex với các hệ dung môi thích hợp (sơ đồ 3.5) thu được 2 hợp chất
HT1 và HT2.
Từ phân đoạn P3-HT tiến hành tinh chế theo sơ đồ 3.6 thu nhận được β-1,3/1,6 glucan
tinh sạch (GL-HT) (xem mục 3.2.4).
4.2.2. Cấu trúc các hợp chất phân lập từ nấm hầu thủ

Hợp chất HT1: axit stearic
Hợp chất HT1 thu được ở dạng rắn, tinh thể màu trắng, nhiệt độ nóng chảy 69,6C.
1
H-NMR (DMSO-d6, 500 MHz, ppm)  11,91 (1H, s (broad), COOH); 2,18 (2H, m,
H-2); 1,47 (2H, m, H-3); 1,23 (28H, s, H-4 – H17); 0,85 (3H, t, J = 6,5 Hz, H-18)
13
C-NMR (DMSO-d6, 125 MHz, ppm)  174,4 (C-1); 33,7 (C-2); 31,3 (C-3); 29,1 (C4, C-5, C-6, C-7, C-8, C-9, C-10, C-11); 29,0 (C-12); 28,9 (C-13), 28,8 (C-14); 28,6 (C-15);
24,5 (C-16); 22,1 (C-17); 13,9 (C-18)
Hợp chất HT2 - Ergosterol peroxide
Chất tinh thể hình kim màu trắng, điểm chảy 181-183oC, phổ khối lượng ESI-MS: m/z
429,3 [M + H]+ (C28H44O3, M = 426).
1
H-NMR (500 MHz, CDCl3, ppm) : 1,58 (1H, m, Ha-1), 1,86 (1H, m, Hb-1), 1,71
(1H, m, Ha-2), 1,96 (1H, m, Hb-2), 3,97 (1H, m, H-3), 1,27 (1H, m, Ha-4), 1,97 (1H, m, Hb-4),
6,24 (1H, d, J = 8,5 Hz, H-6), 6,50 (1H, d, J = 8,5 Hz, H-7), 1,51 (1H, m, H-9), 1,41 (1H, m,
Ha-11), 1,62 (1H, m, Hb-11), 1,55 (1H, m, Ha-12), 2,11 (1H, m, Hb-12), 1,58 (1H, m, H-14),
1,25 (1H, m, Ha-15), 1,53 (1H, m, Hb-15), 1,37 (1H, m, Ha-16), 1,78 (1H, m, Hb-16), 1,24
(1H, m, H-17), 0,86 (3H, s, H-18), 0,88 (3H, s, H-19), 2,03 (1H, m, H-20), 1,01 (3H, d, J =
7,0 Hz, H-21), 5,14 (1H, dd, J = 8,5, 15,5 Hz, H-22), 5,22 (1H, dd, J = 8,5, 15,5 Hz, H-23),
1,87 (1H, m, H-24), 1,50 (1H, m, H-25), 0,88 (3H, d, J = 6,6 Hz, H-26), 0,83 (3H, d, J = 6,5
Hz, H-27) và 0,91 (3H, d, J = 6,5 Hz, H-28)
13
C-NMR (125 MHz, CDCl3, ppm): 30,13 (C-1), 34,71 (C-2), 66,47 (C-3), 39,36 (C4), 82,16 (C-5), 135,21 (C-6), 130,75 (C-7), 79,43 (C-8), 51,12 (C-9), 36,98 (C-10), 20,64
(C-11), 39,71 (C-12), 44,57 (C-13), 51,70 (C-14), 23,41 (C-15), 28,64 (C-16), 56,22 (C-17),
12,88 (C-18), 18,18 (C-19), 39,71 (C-20), 20,88 (C-21), 135,42 (C-22), 132,33 (C-23), 42,78
(C-24), 33,07 (C-25), 19,64 (C-26), 19,94 (C-27), và17 ,56 (C-28).
Hợp chất HT3 - Cerebroside B.
Chất bột màu trắng, điểm chảy 180-190oC, phổ khối lượng ESI-MS: m/z 726,6 [MH]+, m/z 750,5 [M+Na]+, m/z 728,3 [M+H]+, m/z 710,5 [M-H2O+H]+, m/z 548,3 [Mglucose+H]+ (C41H77NO9, M = 727).
1
H-NMR (500 MHz, CD3OD, ppm) 3,73 (1H, Ha-1), 4,13 (1H, Hb-1), 4,01 (1H, H-2),

4,16 (1H, H-3), 5,50 (1H, dd, J = 7,0, 15,5 Hz, H-4), 5,76 (1H, dt, J = 15,5, 6,0 Hz, H-5),
2,07 (2H, H-6), 2,10 (2H, H-7), 5,17 (1H, t, J = 7,0 Hz, H-8), 2,00 (1H, H-10), 1,43 (1H, H11), 1,31 (2H, H-16), 1,33 (2H, H-17), 0,92 (3H, t, J = 7,0 Hz, H-18) 1,62 (3H, s, H-19), 4,01
(1H, H-2’), 1,57 (1H, Ha-3’), 1,74 (1H, Hb-3’), 1,44 (2H, H-4’), 1,31 (2H, H-14’), 1,33 (2H,


17

H-15’), 0,92 (3H, t, J = 7,0 Hz, H-16’), 4,29 (1H, d, J = 7,5 Hz, H-1”), 3,22 (1H, H-2”), 3,37
(1H, H-3”), 3,31 (1H, H-4”), 3,30 (1H, H-5”), 3,69 (1H, Ha-6”) và 3,89 (1H, dd, J = 2,0,
11,5 Hz, Hb-6”).
13
C-NMR (125 MHz, CD3OD, ppm) 70,13 (C-1), 55,01 (C-2), 73,29 (C-3), 131,51 (C4), 135,04 (C-5), 34,02 (C-6), 29,09 (C-7), 125,22 (C-8), 137,18 (C-9), 41,18 (C-10), 29,52
(C-11), 30,79-31,24 (C-12 đến 15), 33,49 (C-16), 24,15 (C-17), 14,86 (C-18), 16,53 (C-19),
177,60 (C-1’), 73,49 (C-2’), 36,28 (C-3’), 26,57 (C-4’), 30,79 (C-5’), 31,24 (C-13’), 33,49
(C-14’), 24, 15 (C-15’), 14,86 (C-16’), 105,13 (C-1”), 75,39 (C-2”), 78,31 (C-3”), 71,97 (C4”), 78,38 (C-5”) và 63,08 (C-6”).
Hợp chất HT4 - Hericenone D
Chất kết tinh màu trắng, điểm chảy 41-43oC, phổ khối lượng ESI-MS: m/z 599,2 [M +
H]+, m/z 597,4 [M - H]- (C37H58O6, M = 598).
1
H-NMR (500 MHz, CDCl3, ppm) H: 6,53 (1H, s, H-6), 5,32 (2H, s, H-7), 10,11 (1H,
s, H-8), 3,91 (3H, s, H-9), 3,40 (2H, d, J = 7,5 Hz, H-1’), 5,32 (1H, d, J = 7,5 Hz, H-2’), 3,00
(2H, s, H-4’), 6,09 (1H, t, J = 1,0, 1,5 Hz, H-6’), 1,84 (3H, d, J = 1,5 Hz, H-8’), 2,12 (3H, d,
J = 1,0 Hz, H-9’), 1,78 (3H, d, J = 0,5 Hz, H-10’), 2,33 (2H, d, J = 7,5 Hz, H-2”), 1,62 (2H,
m, H-3”), 1,25 (26H, m, H-4”-17”), 0,88 (3H, m, H-18”) và12,37 (1H, s, OH).
13
C-NMR (125 MHz, CDCl3, ppm) C: 138,70 (C-1), 112,91 (C-2), 162,94 (C-3),
117,33 (C-4), 163,49 (C-5), 105,55 (C-6), 62,90 (C-7), 193,10 (C-8), 55,93 (C-9), 21,62 (C1’), 126,27 (C-2’), 130,35 (C-3’), 55,55 (C-4’), 199,54 (C-5’), 122,85 (C-6’), 155,42 (C-7’),
27,66 (C-8’), 20,67 (C-9’), 16,41 (C-10’), 173,20 (C-1”), 34,25 (C-2”), 24,89 (C-3”), 29,13
(C-4’’), 31,94 (C-17”) và 14,12(C-18”).
Hợp chất HT5 - Ergosterol

Chất tinh thể hình kim màu trắng, điểm chảy 168oC, phổ khối lượng ESI-MS: m/z
397,3 [M + H]+ (C28H44O, M = 396)
1
H-NMR (500 MHz, CDCl3, ppm) H: 1,25 (1H, m, H-1a), 1,75 (1H, m, H-1b), 1,50
(1H, m, Ha-2), 1,78 (1H, m, Hb-2), 3,63 (1H, m, H-3), 2,28 (2H, t, J = 13,5 Hz, H-4), 5,56
(1H, dd, J = 2,0, 5,5 Hz, H-6), 5,38 (1H, m, H-7), 1,97(1H, m, H-9), 1,65 (1H, m, H-11),
1,34 (1H, m, Ha-12), 1,90 (1H, m, Hb-12), 1,92 (1H, m, H-14), 1,67 (1H, m, H-15), 1,28 (1H,
m, Ha-16), 1,74 (1H, m, Hb-16), 1,25 (1H, m, H-17), 0,63 (3H, s, H-18), 0,95 (3H, s, H-19),
2,05 (1H, m, H-20), 1,03 (3H, d, J = 6,5 Hz, H-21), 5,17 (1H, dd, J = 8,5, 15,5 Hz, H-22),
5,22 (1H, dd, J = 8,5, 15,5 Hz, H-23), 1,76 (1H, m, H-24), 1,38 (1H, m, H-25), 0,84 (3H, d, J
= 6,5 Hz, H-26), 0,82 (3H, d, J = 6,5 Hz, H-27) và 0,91 (3H, d, J = 6,5 Hz, H-28).
13
C-NMR (125 MHz, CDCl3, ppm) C: 38,39 (C-1), 32,02 (C-2), 70,47 (C-3), 40,83
(C-4), 141,36 (C-5), 119,60 (C-6), 116,30 (C-7), 139,80 (C-8), 46,27 (C-9), 37,04 (C-10),
21,13 (C-11), 39,11 (C-12), 42,41 (C-13), 54,57 (C-14), 23,01 (C-15), 28,29 (C-16), 55,76
(C-17), 12,06 (C-18), 16,30 (C-19), 40,82 (C-20), 21,11 (C-21), 135,60 (C-22), 131,99 (C23), 42,85 (C-24), 33,10 (C-25), 19,66 (C-26), 19,96 (C-27) và 17,62 (C-28).
Hợp chất HT6 - β-Adenosine
Chất tinh thể hình kim màu trắng, điểm chảy 234-235oC, phổ khối lượng ESI-MS: m/z
267,8 [M + H]+, 289,8 [M + Na]+ (C10H13N5O4, M = 267).
1
H-NMR (500 MHz, DMSO-d6, ppm) H: 8,14 (1H, s, H-2), 8,34 (1H, s, H-8), 5,88
(1H, d, J = 6,5 Hz, H-1’), 4,61 (1H, dd, J = 4,0, 10,5, H-2’), 4,15 (1H, br s, H-3’) 3,97 (1H,
dd, J = 3,5, 6,5 Hz, H-4’), 3,57 (1H, m, H-5’a), 3,68 (1H, m, H-5’b), 7,32 (2H, s, NH2), 5,42
(1H, OH-2’), 5,17 (1H, d, J = 3,0, OH-3’) và 5,43 (1H, OH-5’) ppm


18

C-NMR (125 MHz, DMSO-d6, ppm) C: 152,41 (C-2), 149,08 (C-4), 119,37 (C-5), 156,17
(C-6), 139,95 (C-8), 87,95 (C-1’), 73,47 (C-2’), 70,68 (C-3’), 85,92 (C-4’), 61,69 (C-5’).

Hợp chất GL-HT: β- 1,3/1,6 glucan
Qua hình phổ 13C-NMR cho thấy có 10 tín hiệu nguyên tử C chính: tín hiệu C = 103,4
và 103,1 biểu thị C1 chuỗi thẳng và C1’ của glucose nhánh, tín hiệu C = 86,3 biểu thị C3
(chuỗi thẳng) của chuỗi thẳng. Hai giá trị trên chứng tỏ có liên kết β-glucosidic trong
polymer, tín hiệu C = 61,1 biểu thị C6, tín hiệu C =68,57 biểu thị C4, tín hiệu C = 73,0 biểu
thị C2, C =76,9 biểu thị cho C5 của glucose trong chuỗi thẳng và C =70,2 biểu thị C6s
(substituted, thay thế).
13

Hợp chất HT1: axit stearic

Hợp chất HT2: Ergosterol peroxide
28
21
26
22

Hợp chất HT3 - Cerebroside B
OH

6" OH
4"

5

3

O

5"


HO

19

1

3"

6

4

2" OH
1"

15

13

11

9
8

14

12

10


14
1

3'

1'

O

2'

9'

7'

5'
4'

8'

6'

13'

11'
10'

12'


3

16'

22

9'

24

11

OH

5'

8

1'

3'

2

4
23

25

17


O

8'
1

27

9

13

19

7

10'

O

7'

26

20
18

O
6


Hợp chất HT4 - Hericenone D

28
21

O

4

HO

Hợp chất HT5 - Ergosterol

5

15

8

10

15'
14'

OH

1

9


2

27
16

18

16

NH

25

23

17

13

11

18

17

2

O

HO


7

12

24

20

19

2"

O

5

O

1"

7

(CH2)14
3"

18"

9


O

14
10

8

3

HO

5

Hợp chất GL-HT: β- 1,3/1,6 glucan

Hợp chất HT6 - β-Adenosine
NH2
N

6

7

5

9

4

N


N
1

8

2
3

N

HO
5'

O
H

4'

H

3'

OH

H
2'

1'


H

OH

4.2.3. Đánh giá hoạt tính sinh học của các hợp chất phân lập từ nấm hầu thủ
Các hợp chất phân lập từ nấm hầu thủ được đánh giá hoạt tính gây độc tế bào và khả
năng ức chế hình thành khối u in vitro. Kết quả được trình bày ở bảng 4.5 VÀ 4.6.
Bảng 4.5. Hoạt tính gây độc tế bào của các hợp chất phân lập từ nấm Hầu thủ
Nồng độ
Dòng tế bào
ST Ký hiệu
mẫu
Phần trăm sống sót (%)
T
mẫu
(g/ml)
Hep-G2
Fl
RD
Lu
DMSO
Chứng (+)

5

100  0,0

100  0,0

100  0,0


100  0,0

2,1 0,07

1,7 0,4

0,3  0,02

5,20,4


19

1
2

HT1
HT2

10
10

98,60,9
19,90,3

99,21,6
17,40,5

96,81,1

29,40,9

99,81,9
45,21,2

3

HT3

10

98,60,7

99,21,5

95,80,9

99,71,8

4

HT4

10

82,80,7

85,30,5

79,41,2


92,31,5

5

HT5

10

85,81,4

92,61,2

79,91,8

85,30,9

6

HT6

10

90,30,6

82,91,3

90,50,8

98,21,4


7

GL-HT

20

72,81,2

80,91,5

65,90,4

81,50,6

STT

1

Dòng tế bào
Gía trị IC50 (g/ml)

Ký hiệu mẫu

Chứng (+)
HT2

Hep-G2
0,22
4,82


Fl
0,27
5,13

RD
0,16
8,79

Lu
0,31
9,11

Kết quả cho thấy, hợp chất HT2 biểu hiện hoạt tính độc tế bào cả 4 dòng tế bào thử
(ung thư gan-Hep G2, ung thư tử cung, ung thư mô liên kết-RD, ung thư phổi-Lu) với
giá trị IC50 lần lượt là 4,82; 5,13; 8,79 và 9,11g/ml.
Bảng 4.6. Kết quả thử nghiệm hoạt tính ức chế tạo u tế bào ung thư gan HepG2
trên thạch mềm của các hợp chất
Kích thước trung bình của
Nồng độ
Độ giảm mật
khối u
mẫu thử
Kí hiệu mẫu
độ khối u
Đường kính % giảm so với
(% )
(g/mL)
(µm)
đối chứng

Chứng âm (DMSO 1%)
0
0
30,450,67
10
HT1
8,03
27,250,96
11,561,12
10
HT2
52,31
14,131,06
55,781,75
HT3
10
28,111,25
7,68
14,70,76
HT4
10
22,820,94
16,30,54
25,06
HT5
10
21,951,34
18,51,26
27,91
HT6

10
24,660,58
19,15
16,90,98
GL-HT
20
17,221,15
45,280,64
43,45
Kết quả bảng 4.6 cho thấy mẫu HT2 ức chế rõ rệt sự hình thành khối u với mật độ hình
thành khối u giảm là 55,78 so với đối chứng và kích thước trung bình của khối u giảm
tương ứng là 52,31% so với đối chứng.


20

4.3. Nghiên cứu biến đổi β-1,3-glucan từ nấm hầu thủ thành hoạt chất dễ tan hơn
và đánh giá hoạt tính của chúng
4.3.1. Thủy phân bằng enzyme -1,3-glucanase
Enzyme β-1,3 glucanase chuẩn dùng cắt ngắn mạch của - glucan từ nấm hầu thủ thu
được 3 phân đoạn (HT-GL1, HT-GL2, HT-GL3 ). (xem mục 3.2.5 phần thực nghiệm)
3 phân đoạn trên được kiểm tra qua cột Sephadex G-100, thấy có 3 đỉnh
polysaccharide riêng rẽ. Điều đó chứng tỏ chúng khác biệt về độ dài mạch polymer.
Các β-1,3/1,6-glucan với trọng lượng phân tử khác nhau gồm HT-GL1, HT-GL2 và
HT-GL3 được dùng đánh giá hoạt tính gây độc tế bào và khả năng ức chế sự hình
thành khối u trên thạch mềm. Kết quả được trình bày tại bảng 4.7 và 4.8.
Bảng 4.7. Hoạt tính gây độc tế bào của các β-1,3/1,6-glucan với trọng lượng phân tử
khác nhau.
STT


Ký hiệu mẫu

1
2
3

DMSO
Chứng (+)
HT-GL1
HT-GL2
HT-GL3

Nồng độ
mẫu
(g/ml)
5
20
20
20

STT
Ký hiệu mẫu

1
2
3

Chứng (+)
HT-GL1
HT-GL2

HT-GL3

Hep-G2
0,31
13,56
15,73
>20

Dòng tế bào
Phần trăm sống sót (%)
Hep-G2
Lu
RD
100  0,0
100  0,0
100  0,0
0,5  0,04
0,9  0,0
0,2  0,1
75,71,1
39,30,4
35,20,7
62,30,07
44,71,1
38,90,3
52,80,2
69,30,1
50,70,9
Dòng tế bào
Giá trị IC50 (g/ml)

Lu
0,34
>20
>20
>20

RD
0,17
14,25
17,68
>20

Kết quả cũng cho thấy mẫu HT-GL1 và HT-GL2 biểu hiện hoạt tính gây độc với 2
dòng tế bào ung thư gan (Hep-G2) và ung thư mô liên kết (RD) với giá trị IC50 lần lượt
là 13,56 và 14,25 g/mL, 15,73 và 17,68 g/mL
Bảng 4.8. Kết quả thử nghiệm hoạt tính ức chế tạo u trên thạch mềm của β-1,3/1,6glucan có trọng lượng phân tử khác nhau
Kích thước trung bình của khối u Độ giảm mật
Nồng độ mẫu
Kí hiệu mẫu
% giảm so với độ khối u so với
thử (g/ml) Đường kính (µm)
đối chứng(% )
đối chứng
Đối chứng âm
0
0
30,450,67
(DMSO 1%)
HT-GL1
20

12,270,92
59,70
59,721,58
HT-GL2
20
13,451,21
55,83
56,121,67
HT-GL3
20
15,170,56
50,18
49,420,62


21

Kết quả bảng 4.8 cho thấy cả 3 mẫu đều biểu hiện hoạt tính ức chế sự hình thành khối
u trên thạch mềm. Tuy nhiên, 2 mẫu GL1 và GL2 ức chế rõ rệt sự hình thành khối u
với mật độ hình thành khối u giảm tương ứng là 59,72 và 56,12% so với đối chứng và
kích thước trung bình của khối u giảm tương ứng là 59,70 và 55,83 % so với đối
chứng. Đáng chú ý hơn cả là 2 sản phẩm này có độ tan và hoạt tính tốt hơn so với sản
phẩm ban đầu.
4.3.2. Dùng β-1,3/1,6-glucan từ nấm hầu thủ làm chất mang curcumin
Nghiên cứu chế tạo hệ Cur-Glu nhằm làm tăng độ tan của glucan và curcumin trong
nước. Sản phẩm curcumin β-1,3/1,6-glucan khi hòa tan trong nước thể hiện tính tan tốt
và tạo thành dung dịch có màu vàng trong suốt, kích thước hạt 50 nm.
Hiệu suất của phản ứng mang Cur bởi Glu là 100-20/100 = 80%
Phần dung dịch Cur-Glu thu được được đem đi đông khô sẽ thu được Cur Glu dạng
bột có kích thước 50 nm.

Cấu trúc, hình thái học của Cur-Glu
Đo phổ hấp thụ điện tử của Cur-Glu bằng máy VARIAN spectrophotometer Carry
5000 UV-Vis-NIR và phổ huỳnh quang cho thấy có sự tương tác giữa curcumin với
polysacaride β-1,3 D-glucan. Trên các phân tử Cur và Glu đều có nhiều nhóm OH- nên
các phân tử này có thể tương tác với nhau theo liên kết hydro.
Ảnh FeSEM cho thấy kích cỡ của Glu khá lớn (khoảng 6–10µm), chứng tỏ mạch khá
dài. Cur tồn tại ở dạng hình que, kích thước khoảng 800 nm. Khi tương tác với nhau,
Glu mang Cur tạo thành những hạt kích thước chỉ còn 50 nm. Với kích thước này, sự
hấp thụ của Cur-Glu vào cơ thể sẽ trở nên dễ dàng hơn. Hình ảnh huỳnh quang của
Cur và Cur-Glu cho thấy những hạt Cur và Cur-Glu đều cho độ phát quang mạnh, độ
tương phản và độ phân giải cao. Tính chất phát quang của vật liệu gợi ý khả năng ứng
dụng vật liệu này không những trong việc chữa trị ung thư mà còn có thể cho quá trình
đánh dấu sinh học.
Hoạt tính của β-1,3 D-glucan bao curcumin
Thử nghiệm gây độc tế bào của các sản phẩm Cur, glucan và hỗn hợp phối trộn giữa
Cur-Glu đều không biểu hiện hoạt tính gây độc tế bào ung thư gan (HepG2) khi nuôi
cấy in vitro. Tuy nhiên, trong thử nghiệm khả năng ức chế sự hình thành u thì có sự
khác biệt rõ rệt giữa các sản phẩm về khả năng ức chế hình thành u cũng như kích
thước các khối u. Các kết quả được tổng kết trong bảng 4.9.
Bảng 4.9. Kết quả thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào và hoạt tính ức chế tạo u
trên thạch mềm của các sản phẩm trên dòng tế bào HepG2
Mẫu thử Nồng HT gây độc tế bào Tỷ lệ tạo u trên
Kích thước khuẩn lạc
độ ban
(% tế bào sống
thạch mềm so với
trung bình giảm so
đầu
sót)
đối chứng (%)

với đối chứng (%)
Cur
8mg/ml
99,3 ± 0,5
80,0 ± 1,3
20-30
Glu
8mg/ml
93,3 ± 0,9
75,5 ± 1,1
23-30
Cur-Glu 8mg/ml
90,7 ± 0,7
30,2 ± 1,5
40-50


22

Hình ảnh sự hình thành khối u 3 chiều trên thạch mềm cho thấy hiệu quả ức chế rõ rệt
của hỗn hợp Cur-glu với tỷ lệ 4:1 lên sự hình thành khối u của dòng tế bào này trên
thạch mềm và đáng chú ý hơn là nó đã gắn đựợc vào tế bào làm cho tế bào phát quang
Mặc dù các sản phẩm curcumin, β-glucan và Cur-Glu đều không biểu hiện hoạt tính
gây độc tế bào trên dòng Hep-G2, nhưng hiệu quả ức chế rõ rệt của Cur-Glu với tỷ lệ
4:1 lên sự hình thành khối u của dòng tế bào này trên thạch mềm.
4.4. Thử nghiệm tác dụng dược lý chế phẩm HG1 trên động vật thực nghiệm
Từ β-glucan của nấm hầu thủ chúng tôi đã tạo ra được sản phẩm HG1 (xem mục 3.3 ở
phần thực nghiệm). Các sản phẩm được thử nghiệm trên động vật. Kết quả cho thấy:

Độc tính cấp diễn: Với mức thể tích lớn nhất có thể đưa vào dạ dày chuột nhắt

trắng tương đương liều 24 g/kg TLCT chuột, chưa gây chết bất kỳ một chuột nào.

Độc tính bán trường diễn: Với mức liều 1.0 và 30.0 g/kg/24h khi dùng uống liên
tục trong 6 tuần trên chuột nhắt: không ảnh hưởng đến trọng lượng cơ thể cũng như
khối lượng các cơ quan gan, lách, thận; Không tác động độc đối với tế bào máu;
Không ảnh hưởng đến chức năng gan, thận; Không ảnh hưởng đến các thông số điện
tim trên thỏ. Được coi là an toàn trên động vật thử nghiệm.

Tác dụng bảo vệ gan: Với các mức liều 1,0 g/kg TLCT/24h trên chuột nhắt,
HG1 có tác dụng làm giảm hoạt độ enzym gan AST, ALT và γGT, so sánh nhóm thử
và nhóm chứng, sự khác biệt có ý nghĩa thống kê với p>0.05.

Tác dụng trên hệ miễn dịch: Với các mức liều 1,0 g và 3,0 g/kg TLCT/24h trên
chuột nhắt:
Có tác dụng tăng cường quá trình tổng hợp protein trên động vật thực nghiệm.
Đặc biệt với liều thấp 1,0 g/kg TLCT dùng bán trường diễn, sự khác biệt trước và sau
thí nghiệm có ý nghĩa thống kê (p<0.05).
Sử dụng 24h cho chuột nhắt trắng uống có tác dụng: Tăng tỷ lệ sống sót chuột
nhắt thí nghiệm, kích thích tăng sinh tế bào tủy, tế bào bạch cầu máu ngoại vi và
coloni tế bào lách nội sinh, tăng sức đề kháng, tăng tỷ lệ thực bào và chỉ số thực bào;
Mức liều 1,0 g/kg HG1 làm tăng khối lượng các tuyến có chức năng miễn dịch; Trên
chuột nhắt thí nghiệm HG1 làm tăng số lượng bạch cầu đa nhân; Số lượng hồng cầu,
tiểu cầu và lượng hemoglobin thay đổi không có ý nghĩa thống kê (p>0.05); Phản ứng
quá mẫn muộn ở các nhóm chuột nhắt trong trường hợp chiếu xạ sau khi đã cho uống
HG1 liều 1.0g/kg TLCT, so sánh giữa nhóm chứng và nhóm thử sau 24h, 48h, 72h và
96h, sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (p<0.05);
HG1 khi được sử dụng ở liều 10 mg/kg như biện pháp phòng chống trước khi
tiêm tế bào ung thư vào chuột đã cho thấy hiệu quả ngăn chăn sự phát triển ung thư
Ehrlich. Sự phát triển của khối u đã bị kìm hãm khoảng 23,84% so với đối chứng.
Kích cỡ của mọi cơ quan và khối tế bào Ehrlich bên trong cơ thể chuột được chụp

quét, quan sát và đo lại bằng kỹ thuật MRI và chọn ROI của chương trình PharmaScan
Thêm vào đó, kích cỡ của các cơ quan liên quan đến hệ miễn dịch (tuyến ức, lá lách,
gan) được chụp quét và tính toán. Kích cỡ của tất cả cơ quan của chuột đều giữ
nguyên.


23

KẾT LUẬN
1. Hóa học và hoạt tính sinh học của nấm hương
- Từ nấm hương (L.edodes), 3 hợp chất phân tử lượng nhỏ được phân lập, gồm:
galactiol (NH1), ergosterol (NH2), ergosterol peroxide (NH3); và 01
polysaccharide là β-1,3/1,6-glucan (GL-NH).
- Hoạt tính gây độc tế bào và kháng u trên thạch của các hợp chất phân lập đã
được đánh giá. Kết quả cho thấy: chất NH3 có hoạt tính gây độc tế bào trên cả 4
dòng tế bào thử (Hep-G2, Fl, RD, Lu) với giá trị IC50 lần lượt là 3,84; 4,17;
7,61; và 9,21 µg mL1; Hợp chất NH3 và GL-NH ức chế sự hình thành khối u
trên thạch của tế bào ung thư gan Hep-G2 với mật độ hình thành khối u giảm lần
lượt là 58,33; 39,25% và kích thước trung bình của khối u giảm lần lượt là
55,18; 20,09% so với đối chứng. (Đây cũng là kết quả đầu tiên đánh giá những
hoạt tính những dòng tế bào này của polysaccharide từ nấm hương).
2. Hóa học và hoạt tính sinh học của nấm hầu thủ
- Từ nấm hầu thủ (H. erinaceus), 6 hợp chất đã được phân lập, gồm: stearic acid
(HT1), ergosterol peroxide (HT2), cerebroside B (HT3), hericenone D
(HT4), ergosterol (HT5), β-adenosine (HT6) và 01 polysaccharide là β1,3/1,6-glucan (GL-HT).
- Hoạt tính gây độc tế bào và kháng u trên thạch của các hợp được đánh giá. Kết
quả cho thấy: hợp chất HT2 có hoạt tính gây độc tế bào trên cả 4 dòng tế bào
thử (tế bào ung thư gan –Hep- G2, ung thư tử cung -Fl, ung thư mô liên kết -RD
và ung thư phổi -Lu) với giá trị IC50 lần lượt là 4,82; 5,13; 8,79; 9,11µg mL1;
Hợp chất HT2 và GH-HT ức chế sự hình thành khối u trên thạch của dòng tế

bào ung thư gan Hep-G2 với mật độ hình thành khối u giảm lần lượt là 55,78;
45,28% và kích thước trung bình của khối u giảm lần lượt là 52,31; 43,45% so
với đối chứng.
3. Các sản phẩm chuyển hóa polysaccharide phân lập từ nấm hầu thủ
- β-1,3/1,6-glucan từ nấm hầu thủ được làm ngắn mạch bởi enzyme đặc hiệu (β1,3-glucanase), thu được 3 phân đoạn glucan cắt ngắn mạch hơn, dễ tan trong
nước, gồm: HT-GL1, HT-GL2, và HT-GL3. Sản phẩm HT-GL1 và HT-GL2
có hoạt tính gây độc với 2 dòng tế bào ung thư gan (Hep-G2) và ung thư mô liên
kết (RD) với giá trị IC50 lần lượt là 13,56 và 14,25 g.mL1, 15,73 và 17,68 g
mL1. 2 mẫu HT-GL1 và HT-GL2 ức chế rõ rệt sự hình thành khối u với mật độ
khối u giảm tương ứng là 59,72 và 56,12% so với đối chứng và kích thước trung
bình của khối u giảm tương ứng là 59,70 và 55,83 % so với đối chứng.
- β-1,3/1,6-glucan từ nấm hầu thủ được sử dụng để bao curcumin, tạo hệ nano
Cur-Glu. Sản phẩm này có kích thước nano (50 nm) và tan tốt trong nước. Hệ
Cur-Glu có hiệu quả ức chế rõ rệt khối u của dòng tế bào ung thư gan (Hep-G2)
và có thể gắn đựợc vào tế bào ung thư làm cho tế bào phát quang. .
4. Thử nghiệm dược lý sản phẩm từ polysaccharide
Từ polysaccharide của nấm hầu thủ (phân đoạn P3-HT) , 01 sản phẩm thử
nghiệm (HG1) được tạo thành. Sản phẩm này được thử nghiệm trên động vật,
kết quả như sau: