SẢN XUẤT PROTEIN G-CSF
Granulocyte-colony stimulating factor

Nhóm 3


Nội dung

I

Giới thiệu về GCSF và các đặc điểm

II

III

IV

Tạo dòng vi sinh vật biểu hiện GCSF tái tổ hợp

Quy trình lên men

Tinh chế


I/ Giới thiệu G-CSF và các đặc điểm
1/ Giới thiệu



G-CSF(Granulocyte-Colony Stimulating Factor) chức năng kích thích nguyên bào tủy tái sinh, phát triển và

biệt hóa tạo bạch cầu hạt trung tính.



Bối cảnh:

Hóa trị (điều trị ung

Bạch cầu giảm (Bệnh

thư)

Neutropania)

Cần nghiên cứu!

Nhu cầu sản xuất quy
mô CN

Ngưng hóa trị

Cần sử dụng GCSF


I/ Giới thiệu G-CSF và các đặc điểm

G-CSF giúp tế bào gốc máu biệt hóa thành tế bào bạch cầu hạt trung tính


I/ Giới thiệu G-CSF và các đặc điểm

1. Đặc điểm gen
Thuộc locut q21-22

NST 17

Gồm 5 exon và 4 intron
Kích thước: 2.5 Kb

Gen

Mã hóa cho hai mRNA khác nhau

mRNA

Chiếm ưu thế và có hoạt tính
mạnh hơn
Protein
G-CSF 174 acid amin

G-CSF 177 acid amin


I/ Giới thiệu G-CSF và các đặc điểm
2. Đặc điểm protein
a. Cấu trúc chuỗi polipeptide

G-CSF 177 acid amin có
thêm
Glu, Ser, Val


G-CSF 174 acid amin
- Tồn tại ở dạng glycoprotein
- Trọng lượng 18,7 kDa


I/ Giới thiệu G-CSF và các đặc điểm
2. Đặc điểm protein

1 cysteine tự do ở vị trí Cys17

a. Cấu trúc chuổi polipeptide

17

36

Cys36 - Cys42

42

64

Hai cầu nối disulfide

Cys64 - Cys74
74

Vị trí O-glycosyl hóa tại Thr
133


133


I/ Giới thiệu G-CSF và các đặc điểm

b. Cấu trúc không gian ba chiều

Cấu trúc protein G-CSF.
A. Mô hình cấu trúc phẳng

B. Cấu trúc không gian

- 4 xoắn α đối song và xoắn trái
- Một xoắn phụ nhỏ nằm trong vùng vòng nối giữa xoắn A và xoắn B.


I/ Giới thiệu G-CSF và các đặc điểm
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

17

35

46

172 173 174


II/ Nghiên cứu tạo dòng vi sinh vật biểu hiện G-CSF tái tổ hợp



1/ Hệ thống tế bào chủ



Hệ thống TB chủ nào phù hợp?

Tiêu chí trong sản xuất G-CSF tái tổ hợp
Hiệu quả kinh tế

E. coli

P. pastoris

x

x

_ Tốc độ tăng trưởng tb chủ cao

x

x

_ Dễ kiểm soát quy trình uôi cấy

x

x


_ Lượng G-CSF được tạo ra lớn

x

Không đạt

Không đạt

x

x (*)

x

Quy trình tạo dòng tb chủ đơn giản

x

x

Độ ổn định của gene mục tiêu trong tb

x

x (*)

Mức độ biểu hiện

Cao


Thấp - Cao

Quy trình sản xuất:

Biến đổi G-CSF sau dịch mã
_ O-glycosyl hóa
_ Cầu nối disulfide


1/ Hệ thống tế bào chủ



Tại sao không chọn các chủng chủ khác như động vật hữu nhũ hoặc tế bào côn trùng?

Kinh tế

•

Năng suất thấp hơn

•

Nuôi cấy tốn kém

Kỹ thuật

•

Tế bào chuyển gen không ổn đinh.


•

Glycolsyl hóa không ảnh hưởng tới hoạt tính GCSF không cần sử dụng tế bào ĐV

•

Quá trình nuôi cấy và chuyển gene phức tạp.

•

Thời gian nuôi cấy lâu


1/ Hệ thống tế bào chủ

Các chiến lược biểu hiện

Dạng tiết ra chu chất

E. coli

Dạng tan trong tế bào chất

Dạng thể vùi trong tế bào chất

P. pastoris

Dạng tiết ra ngoại bào



2/ Tối ưu hóa và dung hợp gen với các phần phụ
2.1/ Tối ưu hóa gen mục tiêu
Trình tự gen G-CSF người được lấy từ ngân hàng gen trên NCBI
-> cần tối ưu hóa để có thể biểu hiện trên E. coli và P. pastoris.

o

Dùng phần mềm tin sinh học để phân tích, thay đổi vài codon dựa theo tần số sử dụng codon ở tế bào chủ
biểu hiện:

•
•
o

g-csfmE : tế bào chủ biểu hiện gene là E. coli
g-csfmY : tế bào chủ biểu hiện gene là P. pastoris

Đánh giá độ tương đồng của protein G-CSF được dịch mã so với protein ban đầu.


2/ Tối ưu hóa và dung hợp gen với các phần phụ
2.2/ Dung hợp gen với các phần phụ
Các gen sẽ được dung hợp thêm với các thành phần đề phù hợp với 4 chiến lược biểu hiện:


2/ Tối ưu hóa và dung hợp gen với các phần phụ

Chiến lược


Thành phần

Plasmid bổ sung

6HIS: thẻ tinh chế
Thể vùi

TEV: trình tự nhận biết của TEV
protease

Tan trong tế bào chất

Tiết ra chu chất

Tiết ra ngoại bào

FTNH: cải thiện tính tan của
protein trong E. coli

SP: chuỗi tín hiệu tiết (ra ngoài
chu chất)

αMF: giúp GCSF được tiết ra
ngoại bào

plasmid pDnaK: chứa gen
mã hóa cho chaperone
DnaK hỗ trợ gấp cuộn



2/ Tối ưu hóa và dung hợp gen với các phần phụ
a. Thể vùi: Do E. coli không có chaperon gấp cuộnprotein không tantạo thể vùi.
Việc loại bỏ thẻ HIS ảnh hưởng tới hiệu suất thu nhận protein
Tiến hành nghiên cứu theo hai hướng:
 Có thẻ HIS
 Không có thẻ HIS
b. Tan trong tế bào chất:


2/ Tối ưu hóa và dung hợp gen với các phần phụ
c. Tiết ra chu chất:

Chức
Chức năng
năng của
của SP
SP

•
•

Giúp protein được nhận diện bởi hệ thống vận chuyển màng
Giúp protein giữ được cấu trúc sơ cấp trong suốt qúa trình vận chuyển.

Vai
Vai trò
trò của
của họ
họ protein
protein Dsb

Dsb
Oxi hóa: hình thành cầu nối disulfide giữa các cysteine
Đồng phân hóa: sửa chữa các cầu nối không chính xác


2/ Tối ưu hóa và dung hợp gen với các phần phụ

Các vector và các chủng tế bào chủ

Chiến lược

Vector lưu trữ

Dạng thể vùi

Tan trong tế bào chất

TB tạo dòng/TB biểu hiện

pET28b

pUC57

Tiết ra chu chất

Tiết ra ngoại bào

Vector biểu hiện

pET28a, pDnaK


E. Coli DH5α/E. coli BL21
(DE3)

pET28b

pZERO

pPICZαA (Invitrogen)

E. Coli DH5α/ P. pastoris
GS115


III. QUY TRÌNH LÊN MEN

1. Quy mô


III. QUY TRÌNH LÊN MEN
Tiến hành đo và so sánh các dạng biểu hiện:

Các dạng biểu hiện
Thể vùi

Tan trong TB chất

Tiết ra chu chất

Tiết ra ngoại

bào

Thể tích lên men

1L

1L

1L

1L

Thời gian lên men

24g

24g

24g

96g

50,1

33,1

11,0

31,8


Lượng G-CSF (g/L)

1,831

0,289

0,158

0,109

Hiệu quả thu nhận G-CSF (%)

19,86

8,17

2,5

0,16

Mật độ tế bào
Sinh khối thô (g/L)
%G-CSF/protein tổng
Tổng lượng protein thu được trong các pha chưa GCSF của 1 lít dịch lên men (g)

 Kết quả: xác định được dạng biểu hiện G-CSF ở thể vùi trong tế bào chất) là tối ưu nhất.


III. QUY TRÌNH LÊN MEN


2. Phương pháp thu và phá vỡ tế bào, thu nhận chu chất

a. Phương pháp thu tế bào

Hai phương thức thu sinh khối đối với E.coli được dùng rộng rãi:



ly tâm



lọc tiếp tuyến.

 lọc tiếp tuyến giảm thể tích ở giai đoạn ban đầu và ly tâm thu nhận sinh khối ở giai đoạn sau.


III. QUY TRÌNH LÊN MEN

Phương thức thu sinh khối bằng phương pháp lọc tiếp tuyến (bên phải)


III. QUY TRÌNH LÊN MEN
b. Phá vỡ tế bào và thu nhận chu chất
Các phương pháp phá màng: máy phá tế bào, sử dụng dung môi, sử dụng các loại enzyme …
Nhược điểm: giá thành cao, chỉ áp dụng cho mẫu nhỏ!
Phương pháp tối ưu: công nghệ bơm dịch treo tế bào dưới áp lực qua một khe nhỏ.
Thu nhận chu chất: sử dụng sốc thẩm thấu.



III. QUY TRÌNH LÊN MEN

Thu nhận G-CSF ở chu chất bằng sốc thẩm thấu

•

Tế bào chỉ bị phá vỡ lớp màng ngoài (outer
membrane)

•

Màng trong (plasma membrane) vẫn không bị vỡ 
chỉ protein ở chu chất (periplasmic space) được giải
phóng

Chu chất của vi khuẩn gram âm (hình dưới)