Seminar

Hệ enzym pectinase

MỤC LỤC:
•

I. Enzyme ...................................................................................................... 2
I.1.Khái niệm ................................................................................................ 2
I.2 . Phân loại enzyme................................................................................... 2
II. Pectin ........................................................................................................ 3
II.1. Giới thiệu ............................................................................................... 3
II.2 . Phân loại ............................................................................................... 4
II.3. Cấu tạo .................................................................................................. 6
II.4. Tính chất chung của pectin .................................................................... 7
III. Pectinase ................................................................................................. 7
III.1 . Giới thiệu ............................................................................................ 7
III.2 . Khái niệm ............................................................................................ 8
III.3. Trung tâm hoạt động của enzyme pectinase ....................................... 8
III.4. Phân loại .............................................................................................. 8
IV. Cơ chế tác dụng .................................................................................... 10
IV.1 . Pectinesterase (PE) ........................................................................... 10
IV.2 . Polygalacturonase (PG)..................................................................... 12
IV.3. Pectate lyase (PEL)............................................................................ 18
IV.4. Ý nghóa về mặt kỹ thuật của các endo-enzyme ................................. 19
V. Nguồn thu nhận enzyme pectinase ........................................................ 23
V.1.Thực vật................................................................................................ 23
V.2.Vi sinh vật ............................................................................................ 25
VI. Các phương pháp thu nhận enzyme pectinase:..................................... 30
VI.1. Thu nhận chế phẩm pectinase từ canh trường bề mặt ................. 30
VI.2. Thu nhận chế phẩm pectinase từ canh trường bề sâu .................. 30

VI.2.1 Phương pháp hiếu khí................................................................. 30
VI.2.2 Phương pháp yếm khí................................................................. 31
VI.3. .Phương pháp ni cấy các chủng nấm mốc và tách chiết enzyme
pectinase từ mơi trường ni cấy ....................................................................32
VII.Xác định hoạt tính enzyme pectinase .......................................................33
VII.1.Phương pháp xác định hoạt độ enzim pectinaza ..............................33
VII.2.Phương pháp khảo sát điều kiện thu nhận và đặc tính của enzyme
pectinase ( tác nhân tủa , nhiệt độ , pH tối ưu) ................................................35
VII.3.Phương pháp tinh sạch enzyme pectinase........................................35
VIII. Vai trò và ứng dụng của enzyme pectinase ...................................... 36
Tài liệu tham khảo ...................................................................................... 44

-1-


Seminar

Hệ enzym pectinase

I.TỔNG QUAN VỀ ENZYME

•
•
•
•
•

I.1.Khái niệm:[1]
_Enzym là một loại protein được sinh vật tổng hợp nên và tham gia vào các
phản ứng sinh học.

_Đặc tính sinh học chung của enzym:
* Được tạo ra trong tế bào sinh vật
* Tham gia phản ứng cả trong tế bào sống và cả khi enzyme được tách khỏi
tế bào sống.
*Tham gia phản ứng trong điều liện nhiệt độ ôn hoà.
*Có thể tham gia xúc tác các phản ứng các phản ứng trong và ngoài cơ thể
từ giai đoạn đầu đến giai đoạn giải phónghoàn toàn năng lượng dự trử trong
các hợp chất hoá học.
* Có thể thực hiện 1 phản ứng.
* hản ứng enzym là những phản ứng tiêu hao năng lượng rất ít.
* Enzym chòu sự điều khiển bởi gen và các điều kiện phản ứng.
I.2 . Phân loại enzyme:[1]
• Lớp
• Phản ứng xúc tác
• 1. Oxidoreductase
• nhận và loại H
• 2. Transferase
• Chuyển vò các nhóm
• 3. Hydrolase
• Phản ứng thuỷ phân
• 4. Lyase
• Phản ứng phân cắt
• 5. Isomerase
• Phản ứng đồng phân hoá
• 6. Ligase
• Tạo thành liên kết sử dụng ATP
•
Bảng 1: Phân loại enzyme
Dựa vào sự phân lớp này mà ngưới ta có mã số cho từng loại enzyme
Ví dụ: Enzym pctinesterase có mã số là E.C.3.1.1.11 nghóa là enzym thuộc

lớp hydrolase, có liên kết este
Một số nguồn enzyme và enzym quan trọng:
Nguồn ĐV: Catalase, Chymotrypsin, Lipase, Trypsin…
Nguồn TV: amylase, ficin…
Nguồn VK: Asparaginase, Protease …
Nguồn nấm sợi: Lactase, Lipase,…
Nguồn nấm men: Invertase, Lactase,…

-2-


Seminar

Hệ enzym pectinase

II. PECTIN
II.1. Giới thiệu:[1+2+8]
_Pectin là cơ chất của enzyme pectinase. Pectin là polysaccharide dò thể. Về
bản chất hoá học, pectin là polygalacturonic được phân bố rộng rãi trong các
mô thực vật, hoà tan trong dòch thực vật. Có nhiều trong các loại quả, củ,
đặc biệt là trong cùi trắng của bưởi, cam, chanh.
_Pectin là hợp chất cao phân tử mạch thẳng, mạch chính của phân tử do các
acid galacturonic kết hợp với nhau bằng liên kết α-1,4-glucosid tạo nên.
_Pectin khác với các carbonhydrate thông thường vì thành phần chủ yếu của
nó không phải là đường đơn mà là một acid có tên là acid galacturonic.
_Pectin gồm một mạch chính có thay đổi nhưng có tỷ lệ lớn các đơn vò acid
D-galacturonic đã được methyl hoá và được gọi là acid pectic (acid
polygalacturonic).

Hình 1: Mạch pectin


Hình 2: Hai phân tử D-galcturonic acid nối với nhau bằng liên kết glucoside
-3-


Seminar

Hệ enzym pectinase

II.2. Phân loại:[1]
_ Pectin là tên gọi chung bao gồm: protopectin, acid pectic, acid pectinic,
pectin hoà tan.
Trong quá trình tìm hiểu thì thấy có nhiều cách phân loại:
Cách 1:
_Pectin có nhiều ở phần vỏ của quả, củ hay thân cây, trong thực vật pectin
tồn tại 2 dạng:
• Dạng protopectin: không tan trong nước, tồn tại chủ yếu ở thành tế bào,
thường ở dạng liên kết với polysaccharide khác như araban, tinh bột,
cellulose…
Protopectin tạo cho quả xanh, có độ cứng nhất đònh. Không thể tách
protopectin ở trạng thái chưa biến đổi.
Người ta cho rằng protopectin là hợp chất giữa pectin với araban, galactan,
hay tinh bột. Protopectin là thành phần quan trọng của chất gian bào, làm
nhiệm vụ liên kết giữa các tế bào thực vật với nhau.
Trong thành phần protopectin có các phân tử pectin, phân tử cellulosase, các
ion Ca2+, Mg2+, các gốc acid photphoric, acid acetic và đường. Dưới tác dụng
của acid, bazơ, t0 hoặc enzyme protopectinase thì protopectin giải phóng ra
pectin hoà tan.
• Dạng pectin hoà tan: chủ yếu ở dòch tế bào.
Là este methylic của acid polygalacturonic cao phân tử. Khoảng 2/3 nhóm

cacboxyl của acid polygalacturonic được este hoá bằng methanol.
A. pectinic: là acid polygalacturonic cao phân tử trong đó 1 phần nhỏ
nhóm cacboxyl được este hoá bằng methanol.
A.pectic: là acid polygalacturonic cao phân tử đã phân tử đã hoàn toàn giải
phóng khỏi nhóm metoxyl, nghóa là trong 1 đơn vò acid galacturonic có 1
nhóm cacboxyl tự do.

Hình 3: Galacturonic acid
-4-


Seminar

Heọ enzym pectinase

Hỡnh 4: acid pectic

Hỡnh 5: Acid pectic vụựi cau muoỏi Mg vaứ Ca

Hỡnh 6: a) Galacturonic acid b) Pectic acid
-5-


Seminar

Hệ enzym pectinase

Cách 2: chia là 3 loại
_ High metyl este pectin (HM pectin): tỷ lệ các gốc este metilic cao (>50%).
_Low metyl este petin (LM pectin): tỷ lệ các gốc este metilic thấp hơn

(<50%). Việc thay đổi quy trình chiết tách, hay gia tăng việc xử lý các gốc
aicd galactuonric sẽ tạo ra LM pectin.
_Amidared pectin (pectin amin): trong quá trình sản xuất, khi xử lý pectin
cùng với ammoniac sẽ tạo thành pectin amin. Pectin amin có thuận lợi đặc
biệt trong nhiều quy trình ứng dụng.
II.3. Cấu tạo:
_Khối lượng phân tử pectin dao động từ 20.000-200.000 dal phụ thuộc vào
nguồn pectin.
_Cấu tạo pectin chủ yếu là 1 mạch chính, gồm các gốc acid α-Dgalacturonic liên kất với nhau bằng liên kết 1,4-glucosid, còn gọi là acid
polygalacturonic hay acid pectic. Pectic hoà tan trong tự nhiên là este
methylic của pectic.
_Công thức nguyên của galacturoic: C6H10O7
_Trong thực tế, không phải bao giờ tất cả các nhóm –COOH ở C6 của acid
galcturonic cũng bò methyl hoá tạo este methylic, mà đôi khi 1 số nhóm –
COOH bò decacboxyl hoá (khử CO2), 1 số nhóm COOH được thay thế bằng
kim loại, cũng có lúc nguyên dạng –COOH.
II.4. Tính chất chung của pectin:
_Pectin là 1 dạng glucid cao phân tử có cấu trúc mạch xoắn và có phân tử
lượng rất cao.
_Pectin mang tính keo nhầy, nhưng khác với 1 số chất nhầy khác như
gelatin, pectin chuyển sang thể keo chỉ khi có đường và acid hay kim loại
hoá trò cao.
_Pectin được tách từ thân thực vật, vỏ quả. Pectin ở dạng khô có màu trắng
ngà hay màu nâu, điều đó còn tuỳ thuộc vào từng loại nguyên liệu.
_Pectin là chất bột màu trắng xám nhạt, tan trong nước, không khử oxy.
_Pectin không tan trong rượu và các dung môi hữu cơ khác. Pectin tan trong
nó, ammoniac, kiềm, cacbonat natri, etylendiamin và trong glycerin nóng.
_Đặc tính quan trọng của pectin khi có mặt acid và đường tạo thành chất keo
hay nói cách khác pectin được este hoá cao sẽ tạo ra gel đặc khi ở trong
dung dòch đường và trong môi trường acid có nồng độ 65%. Vì vậy đặc tính

này được ứng dụng trong sản xuất mứt kẹo.
_Pectin hoà tan, dưới tác dụng của liềm loãng hay enzyme pectinase sẽ giải
phóng nhóm metoxyl tạo thành rượu methylic và acid pectic tự do.

-6-


Seminar

Hệ enzym pectinase

_Pectin tan trong nước, nhất là nước nóng, được tủa nhờ rượu và những chất
tan hữu cơ khác.
_Khi tăng mức độ este hoá bằng methanol hay giảm khối lượng thì độ hoà
tan ở trong nước tăng lên. Khi đó độ nhớt của dung dòch pectin sẽ tăng lên.
_Một tính chất cũng rất hay của pectin là acid pectic khi kết hợp với ion Ca2+
sẽ tạo thành Canxipectat kết tủa. Tính chất này được ứng dụng để đònh
lượng pectin.
_Pectin dễ dàng bò kết tủa, hay bò đông đặc bởi etanol, isopropanol, acetone,
sunfatamon, clorua nhôm, muối Cu, muối Ca…
_Tính chất đặc biệt của pectin là dung dòch pectin bò làm đông đặc bởi 1 loại
men đặc biệt là pectat, pectase có trong dòch của carot. Pectin dưới tác dụng
của pectase sẽ biến thành acid pectic. Acid pectic tan trong kiềm, các muối
tan, riêng pectat Canxi không tan. Enzym pectinase có trong lúa mạch lại có
tác dụng ngược lại với pectat nghóa là nếu có pectinase thì pectat không làm
pectin đông đặc nữa, pectinase còn có thể hoà tan kết tủa của acid do pectat
gây nên, và hiện tượng này kèm theo sự giải phóng các đường khử oxy.
_Tuỳ theo thời gian và nhiệt độ pectin được tách hoàn toàn hay 1 phần khỏi
cellulose hay hemicellulose mà ta có tính chất khác nhau. Muốn loại pectin
khỏi hemicellulose ta tác dụng lên nguyên liệu dung dòch oxalate

ammonium và dung dòch này chỉ hoà tan được pectin mà thôi.
_Pectin giữa vai trò quan trọng trong quá trình chín của quả khi quả còn
xanh và đang phát triển. Protopectin phân tán ở thành tế bào, và có tỷ lệ khá
cao có tác dụng làm quả cứng, khi quả bắt đầu chín thì protopectin chuyển
sang dạng pectin hoà tan dưới tác dụng của acid hữu cơ và enzyme
protopectinase có trong quả. Quả càng chín càng mềm, pectin hoà tan tăng
cao, và ngược lại protopectin không tan sẽ giảm dần.
_Độ bền vững của pectin trước các enzyme sẽ được tăng lên khi có mặt
cation, đặc biệt là Al3+ và Fe3+. Tăng nhiệt độ lên 1000C pectin bò phân tách,
nếu có thêm ion Cl- thì quá trình đó tiến hành nhanh hơn.

III.PECTINASE:
•III.1.Giới thiệu:
•_1840 E.Fremi phát hiện ra enzym pectase trong nước ép cà rốt.
•_ Sau đó G. Bertrand và A. Mallevre tìm thấy trong nước ép cà chua
•_Enzym pectinase do E. Poourquelot và H. Herisseu phát hiện trong đại mạch
nảy mầm vào khoảng năm 1898.
•
-7-


Seminar

Hệ enzym pectinase

III.2. Khái niệm:
_Enzym pectinase là enzyme xúc tác sự phân huỷ các polyme pectin. Sản
phẩm tạo thành: acid galacturonic, galactose, arabinose, metanol…
Là nhóm enzyme được ứng dụng rộng rãi sau protease và amylase.
_Enzym pectinase có ở thực vật bậc cao và các sản phẩm của VSV.

Ở thực vật bậc cao: có nhiều trong lá, khoai tây, chanh, cỏ chẻ ba, trong các
loại qủa thường có enzyme pectinesterase.
_Trong tự nhiên có nhiều ở nấm mốc, vi khuẩn phân giải pectin.
_Sự phân huỷ pectin trong tự nhiên thường xảy ra khi trái cây chín .
Vì vậy enzyme pectinase có vai trò hết sức quan trọng trong qúa trình bảo
quản trái cây và rau qủa.
Việc kiểm soát enzyme này trong cà chua chuyển gen là 1 ví dụ điển hình
trong việc ứng dụng RNA chuyển gen đối mã để thao tác sự biểu hiện gen.
Enzyme pectinase được ứng dụng nhiều trong qúa trình chế biến thực phẩm,
đặc biệt là khả năng làm trong nước hoa qủa.
(Việc kiểm soát hoạt động của enzym pectinase cũng có thể điều chỉnh bằng
độ nhớt của sản phẩm)
III.3. Trung tâm hoạt động của enzym pectinase:
E.pectinase chứa vùng có 8-10 vòng xoắn β kép về phía phải với hai vòng
tạo thành khe liên kết với cơ chất
• Trung tâm hoạt động của enzym này chứa a.a Aspartate và Lysine.Có 1
Histidine nằm gần trung tâm hoạt động sẽ ảnh hưởng đến khả năng xúc tác
của enzym.
Nhiệt đđộ tối ưu của enzym pectinase khoảng từ 45-55oC
III.4.Phân loại:
Dựa vào tính đặc hiệu, cơ chế tác dụng, kiểu phản ứng, pH tối ưu của enzym,
1966 Koller và Neukom phâân loại chia pectinase thành hai nhóm chính:
Hydrolase và transeliminase .
- Nhóm thứ nhất: Hydrolase (xúc tác cho quá trình thủy phân) gồm
• Pectinesterase (PE) có tên hệ thống là pectin-petihydrolase
(E.C.3.1.1.11)

-8-



Seminar

Hệ enzym pectinase

Hình 7: Pectinesterase
• Polygalaturonase (PG) có tên hệ thống là poly
– 1,4 galaturonitglucanohydrolase, mã số (E.C.3.2.1.15). Dựa vào tính đặc hiệu và cơ chế tác
dụng lên cơ chất, H.Deuel và E.Stulz (1958) đã chia polygalacturonase thành
2 nhóm nhỏ. Mỗi nhóm có 2 kiểu :
•
Polymethylgalacturonase (PMG): có tên hệ thống là poly α-1,4galactunonic-methylsteglucanohydrolase(E.C.3.2.1.11). PMG tacù dụng lên
acid polymethyulgalacturonic đã được methyl hoá (tức là pectin). PMG được
phân thành 2 kiểu:
* Kiểu 1: endo glucosidase-polymethylgalacturonase (viết tắt là endoPMG-I)
* Kiểu 3: enxo glucosidase-polymethylgalacturonase (viết tắt là endoPMG-III)
•
Polygalacturonase (PG) tác dụng lên acid pectic hoặc pectinic, gồm 2
kiểu:
* Kiểu 2: endo glucosidase-polygalacturonase (viết tắt là endo-PG-II)
* Kiểu 4: enxo glucosidase-polygalacturonase (viết tắt là enxo-PG-IV)
- Nhóm thứ hai: Transeliminase (T.E), gồm:
•
Pectin-transeliminase (PTE): có tên hệ thống là poly- -1,4-galcturonicmethylesteglucanoliase (E.C.4.2.99.8). Các enzyme này lại được chia làm 2
loại:
* Endo-pectintraseliminase kiểu I (viết tắt là endo-PTE-I)
* Exo-pectintraseliminase kiểu III (viết tắt là endo-PTE-II)
-9-


Seminar


•

Hệ enzym pectinase

Polygalacturonate-transeliminase (PGTE): Có tên hệ thống là poly- 1,4-D-galacturonic-glucanoliase (E.C.4.2.99.3). PGTE này được chia làm 2
loại:
* Endo-polygalacturonate-transeliminase kiểu II (Endo-PGTE-II)
* Endo-polygalacturonate-transeliminase kiểu IV (Endo-PGTE-IV)

Hình 8: Polygalacturonase

IV.CƠ CHẾ TÁC DỤNG CỦA ENZYM PECTINASE:
IV.1. Enzym pectinesterase (E.C.3.1.1.11) (PE):
_Enzym này xúc tác sự thủy phân liên kết ester phức tạp của pectin và
protopectin, sản phẩm tạo thành là rượu methylic và acid pectinic hay acid
polygalacturonic. Người ta nhận thấy rằng PE chỉ phân cách liên kết ester
giữa các nhóm metoxyl và COOH tự do. PE có ái lực với nhóm metoxyl ở vị
trí thứ 5 lớn với các nhóm ở vị trí thứ 3 và 7. Như vậy sự phân cách nhóm
metoxyl sẽ xảy ra một cách tuần tự bắt đđầu từ nhóm COOH tự do. Kết quả là
tạo thành acid pectic hoặc acid pectinic và rượu methanol.
_Nghiên cứu cơ chế tác dụng pectinesterase, người ta thấy rằng metoxyl bị
xà phòng hoá, sau đđó thủy phân tiếp liên kết ester tiến hành dọc theo phân
tử pectin.
_Pectinesterese tách gốc methyl khỏi phân tử pectin làm lộ ra các nhóm
carboxyl rất hoạt đđộng, dễ kết hợp với các ion kim loại (ví dụ Ca2+)đđể tạo
thành các muối không hoà tan, kết lắng lại và có thể tách ra dễ dàng.

- 10 -



Seminar

Hệ enzym pectinase

Hình 9 :

Các PE ở thực vật tấn công vào hoặc đầu không khử hoặc gần với nhóm
carboxyl tự do và tiến dọc theo phân tử bằng cơ chế chuỗi đơn, tạo ra các
khối galacturonic acid không bò ester hoá rất mẫn cảm với calcium. Các cấu
trúc khác nhau của chuỗi galacturonan, chẳng hạn như các monomer acetyl
hoá, các nhóm ester bò chuyển đổi thành amide hay bò khử đến rượu bậc
một, hay sự tồn tại của các vùng có nhiều mạch nhánh, ức chế hoạt động
của PE.

Hình 10: Vò trí tác dụng của enzyme pectinesterase
PE có tính đặc hiệu cao đối với nhóm methylester của polygalacturonic acid.
Các ester khác chỉ bò tấn công rất chậm, còn các nhóm methylester của
- 11 -


Seminar

Hệ enzym pectinase

polymanuronic acid thì không hề bò tấn công. Tốc độ đề ester hoá trên mạch
pectin phụ thuộc vào độ dài của mạch; trimethyl trigalacturonate không bò
tấn công. Các PE của nấm khác với PE của thực vật theo cơ chế đa mạch,
các nhóm methoxyl bò lấy đi một cách ngẫu nhiên.
Các PE thu được từ các nguồn nguyên liệu khác nhau có pH tối ưu khác

nhau.
Ví dụ: PE vi sinh vật có pH tối ưu từ 4,5 – 5,5; từ thực vật có pH tối ưu từ
5,0 – 8,0
PE của nấm mốc có nhiệt đđộ tối ưu từ 30- 50oC và bị vô hoạt ở 55 –
62oC. PE thường được hoạt hoá bởi các ion Ca2+ và Mg2+.
IV.2.Enzym Polygalacturonase (E.C.3.2.1.15) (PG):
_Tham gia quá trình thuỷ phân liên kết -1,4–glucosid của acid pectic và
các polygalacturonic khác, tách gốc acid D – galacturonic thành các phân
tử D – galacturonic tự do. PG ít gặp trong cây, PG chủ chủ yếu ở vi sinh
vật. _PG là một phức hệ enzym gồm nhiều cấu từ và thường có tính đđặc
hiệu cao đối với cơ chất.
_Hầu hết các nghiên cứu về PG đều trên cơ sở các nguồn VSV. PG
thường được tìm thấy trong các phần tiết ngoại bào của các loài nấm và vi
khuẩn gây bệnh, chẳng hạn như Sacchromyces gragilis, Aspergillus niger,
Lactobacillus plantarum, Cochiliobolus carbonum, Neurospora crassa, các
loài Ascomycete, Phizopus arrchizus, và Fusarium osyporum. Tuy nhiên,
trong thực tế, PG của thực vật bậc cao được nghiên cứu rất nhiều ở cà chua
chín.
_Các enzyme trong cà chua chín: Các enzyme PG trong cà chua chín tồn
tại dưới hai dạng, và cả hai đều là endo-enzyme. PG1 có khối lượng phân tử
84kD và có khoảng 50% bò bất hoạt ở nhiệt độ 78oC. PG2 có khối lượng
phân tử 44kD và có khoảng 50% bò bất hoạt ở 57oC. PG1 có độ ổn đònh tối
đa ở pH 4,3, trái lại PG2 ổn đònh tối đa ở pH 5,6. Sự phân tích sử dụng SDSPAGE cho rằng PG1 là một dimer của PG2, tuy nhiên các nghiên cứu khác
lại cho rằng PG1 hình thành là do sự kết hợp của PG2 với một β–subunit.
Các chuỗi polypeptide của PG đều bò glycosyl hoá. PG2 chứa 4,6 đường
trung tính (Dmannose, L-gucose, D-xylose) liên kết với nhau thông qua cầu
nối Nacetylglucosaminylasparaginyl.
_Có sự khác nhau chút ít về khối lượng phân tử, chẳng hạn các isoenzyme
của PG2, PG2A va PG2B có khối lượng phân tử tương ứng là 43 và 46kD. Sự
khác nhau này có thể là do quá trình sửa sai hoặc quá trình glycosyl hoá sau

dòch mã. Trong thực tế, các nghiên cứu sau đó cũng đã chứng minh được

- 12 -


Seminar

Hệ enzym pectinase

rằng PG2A và PG2B là các dạng glycosyl hoá khác nhau của cùng các
polypeptide.
_Trình tự amino acid: Các trình tự amino acid được suy luận trên cơ sở
các nucleotic của cDNA phân lập không những từ trái cà chua mà còn từ
phấn của các loài Pseudomonas solanacearum, Oenothera organesis, phấn
hoa bắp, và từ trái bơ. Gen của PG2 phân lập từ trái cà chua mã hoá cho
protein hoàn chỉnh có 373 amino acid, với khối lượng phân tử là 40 279.
Enzyme này được tổng hợp từ một tiền chất, sau đó đi qua quá trình sửa
chửa sau dòch mã, gồm cả các quá trình loại bỏ các peptide tín hiệu, bò
glycosyl hoá tại bốn điểm có khả năng glycosyl, và sửa chữa ở đầu C cuối.
Các gen PG đơn mã hoá cho các loại isoenzyme khác nhau, dẫn đến kết
luận rằng PG1 và PG2 đều xuất phát từ cùng một chuỗi polypeptide, và rằng
PG1 được tạo thành nhờ sự kết hợp của PG2 với β-subunit.
β-subunit. Sự chuyển đổi PG2 và PG1 trong quá trình chín của cà chua
là một vấn đề gây được nhiều chú ý. β-subunit, một yếu tố bền nhiệt, đầu
tiên được phân lập từ cà chua xanh, có khả năng chuyển đổi PG2 thành PG1
trong ống nghiệm. Yếu tố này sau đó được xác minh là một glycoprotein rất
đặc trưng với polypeptide PG về mặt miễn dòch. Phân tử PG1 được tạo thành
từ một phân tử PG2 và một phân tử β-subunit; tuy nhiên, chỉ có polypeptide
PG có hoạt tính enzyme.
cDNA mã hoá cho β–subunit có trong cà chua là một tiền chất có kích

thước phân tử lớn (69kD, 630 amino acid). Trong phân tử này, thêm vào
phân tử protein hoàn chỉnh là một trình tự tín hiệu kò nước (30 amino acid),
moat polypeptide chứa đầu cuối N-(78 amino acid), và một tiền peptide chứa
đầu cuối C-(233 amino acid). Protein hoàn chỉnh chứa glycosyl hoá là chứa
289 amino acid nặng 31,5 kD, điểm đẳng điện 4,9. Protein này chứa lượng
lớn amino acid gly, tyr, phe, và một motif lặp có cấu trúc liên ứng
FTNYGxxGNGGxxx, trong đó “x” phần lớn là các amino acid phân cực.
Chức năng của motif này trong protein vẫn chưa được biết rõ.
Vai trò của PG trong quá trình làm chín trái cây: Hoạt độ của enzyme
trong giai đoạn đầu của quá trình làm chín chủ yếu là nhờ PG1. PG1 tiếp tục
tăng trong quá trình chín, và có mặt trong tất cả các giai đoạn của quá trình
chín. PG2 có khối lượng phân tử thấp hơn và ít bền nhiệt, PG2 xuất hiện
trong giai đoạn cuối của quá trình, và chiếm lượng lớn trong giai đoạn chín.
Sự xuất hiện kế tiếp nhau của hai enzyme này là kết quả của hoạt động điều
hoà của β–subunit, yếu tố này được tìm thấy với lượng ít trong cà chua xanh,
sau đó tăng lên trong giai đoạn chín.
PG2 được coi như một endo-enzyme trong cà chua chín, PG1 được hình
- 13 -


Seminar

Hệ enzym pectinase

thành trong suốt quá trình chín khi β–subunit được sinh ra để phản ứng với
PG2. Bằng cách điều chỉnh những thay đổi trong các phân tử PG trong các
dòch chiết khác nhau có các nồng độ khác nhau của NaCl và pH đệm khác
nhau.
Trên thực tế gen mã hoá cho polypeptide PG trong một số nghiên cứu trước
đây đã chứng minh điều này. Gần đây, các nghiên cứu về các kiểu biểu hiện

gen của β–subunit và các phân tử PG cho thấy mRNA của β–subunit xuất
hiện sớm trong quá trình phát triển của trái cây(10 ngày sau khi thụ phấn) và
tăng đến mức tối đa trong 30 ngày, cũng là lúc trái cây chín. Sau đó, lượng
mRNA của β-subunit giảm nhanh chóng, trong khi lượng mRNA của PG tăng
một cách đáng kể.
Vì tất cả các kết quả nghiên cứu đạt được ở trên, ta có thể cho rằng
endo-enzyme PG2 được hình thành trong các giai đoạn sớm của quá trình
chínphải được chuyển về PG1 do sự có mặt của β–subunit. Sự tích lũy của
PG2 trong các giai đoạn sau của quá trình chín là do β–subunit bò cạn kiệt.
Vai trò của quá trình chuyển đổi này là nhằm điều hoà hoạt động của PG
trong các giai đoạn của quá trình chín. β–subunit phản ứng và neo phân tử
PG2 vào thành tế bào, tạo ra phân tử PG1 dưới dạng hoạt động để phân hủy
pectin. Một số nghiên cứu khác cũng chứng minh được rằng PG1, chứ không
phải PG2 có chức năng trong việc làm phân huỷ và ổn đònh polyuronide, có
nghóa là sự phân hủy của polyuronide dưới tác động của enzyme PG là
nguyên nhân dẫn đến quá trình mềm của cà chua.Tuy nhiên, khi nghiên cứu
về sự xen đoạn và biểu hiện của gen PG trong cà chua chuyển gen thì kết
quả cho thấy polyuronide bò phân hủy nhưng không làm cho trái cà chua
mềm đi.
_Cơ chế và kiểu tác dụng:
Exo-PG thủy phân các đầu không khử của chuỗi polygalacturonic, tạo ra
galacturonic acid là sản phẩm thủy phân chiếm ưu thế(H.6.8). Sự thủy phân
polymer này bò gián đoạn của sự tồn tại của các mạch nhánh trong cơ chất.
Mức độ thuỷ phân tăng tỉ lệ với kích thước cơ chất, đạt tối đa với mức
polymer hoá 20 đối với các exo-PG ở cà rốt và đào. Hoạt động của các exoenzyme làm tăng nhanh sự tạo thành các nhóm khử và làm tăng chậm độ
nhớt của dung dòch cơ chất. Sự phân hủy polyuronide trong quá trình chín
không gây ra sự tích lũy galacturonic acid, và chỉ có endo-enzyme PG là có
liên quan.
Các endo-PG phân hủy pectic acid từ bên trong mạch, làm giảm nhanh độ
nhớt của dung dòch cơ chất. Tính đặc hiệu và kiểu tác dụng của endoenzyme


- 14 -


Seminar

Hệ enzym pectinase

được xác đònh bởi trạng thái của điểm hoạt động. Mức độ thủy phân của
endo-PG ở nấm men giảm cùng với sự giảm độ dài mạch cơ chất. Vò trí liên
kết của endo-PG ở Aspergillus niger được cấu thành từ 4 điểm và sự phân
cắt xảy ra giữa các điểm 1 và 2(H.6.9). Một cơ chất tetramer chòu sự phân
cắt(3+1) thành trigalacturonic acid galacturonic. Một cơ chất pentamer cho
ra hai sản phẩm phức tạp hơn, cả hai đều đáp ứng sự chiếm giữ hoàn toàn
của 4 điểm liên kết, tạo sự phân cắt (4+1) và (3+2). Cũng tương tự, đối với
cơ chất là hexagalacturonic acid, sản phẩm sẽ tạo thành lối phân cắt (5+1),
(4+2) và (3+3). Trigalacturonic acid bám vào điểm hoạt động để tạo thành
các phức hợp hữu ích hoặc không hữu ích. Liên kết hữu ích trong trường hợp
này làm sinh ra sự phân cắt (2+1). Liên kết không hữu ích được tạo thành
khi ba đơn vò đơn lẽ bám vào ba điểm 2, 3 và 4, là không hề tương tác với
các nhóm xúc tác đònh vò bên trong điểm 1 và 2. Cơ chất trong trường hợp
này đóng vai trò là một chất ức chế cạnh tranh (K = 0,67mM).

Hinh11: Sử dụng PG nghiên cứu ở cây cà chua
Năm 1958, H.Deuel và E.Stutz đã chia ra 4 kiểu polygalacturonic dựa vào
tính đặc hiệu và cơ chế tác dụng:
IV.2.1.polymethylgalacturonic(PMG): là enzyme tác dụng trên acid
polygalactyronic đã được metoxyl hoá (tức là pectin). Enzyme này có tên hệ
thống là poly –
– 1,4 – galacturonic – methylesterglucanohydrolase

(E.C.3.2.1.41), lại đđựoc chia thành 2 nhóm nhỏ .

- 15 -


Seminar

Hệ enzym pectinase

Endo – glucosidase – polymethylgalacturonase kiểu 1 (Endo PMG I):Là
enzyme dịch hoá, pectin có mức độ metoxyl hoá càng cao thì bị thuỷ phân
bởi enzyme này càng nhanh và càng có hiệu quả cao. Trong dung dịch, khi
có mặt enzyme pectinesterase thì hoạt độ của enzym này thường bị giảm.
Enzym này phổ biến ở nấm mốc như: Aspergillus niger, Aspergillus awamori,
Botrytis cinerea, Neurospora crassa

Hình 12:
Exo – glucosidase – polymethylesterase kiểu III(Exo-PMG-III): Là enzyme
đđường hoá, enzyme này có thể cắt từng acid galacturonic ra khỏi acid
pectinic hay pectin. Exo- PMG III có ái lực với các gốc acid galacturonic đã
được metoxyl hoá nghĩa là phân cắt liêên kết -1,4 glucosid ở đđầu mạch nằm
giữa hai gốc acid galacturonic có nhóm COOCH3

Hình 13:

- 16 -


Seminar


Hệ enzym pectinase

IV.2.2. Polygalacturonase ( PG ):
Là enzyme tác dụng trên acid pectic hoặc pectinic. PG lại đđựợc chia thành 2
nhóm nhỏ.
Endo – glucosidase – polygalacturonase kiểu II( Endo – PG II): Là enzyme
dòch hoá, enzyme này có thể thuỷ phân acid pectinic hay acid pectic và chỉ
tác dụng khi có mặt nhóm COOH tự do.
Hoạt đđộ của Endo–PG II sẽ tăng lên nhiều khi cơ chất đđược xử lý sơ bộ bằng
Pectinesterase. Đa số vi khuẩn và nấm mốc là những vi sinh vật tổng hợp
đđược enzyme này.

Hình 14:
Exo – glucosidase – polygalacturonase kiểu IV (Exo-PG-IV): Enzyme này
thường có ái lực mạnh đối với các liêên kết glucosid ở cuối mạch của phâân tử
acid pectinic hay acid pectic nhưng bên cạnh đó không có nhóm methyl.
Có lẽ để tạo nêên đđược phức enzyme-cơ chất thì trong phân tử cơ chất phải có
nhóm Carboxyl tự do kề liền liêên kết bị đđứt.

Hình 15:

- 17 -


Seminar

Hệ enzym pectinase

IV.3.Enzyme Pectate lyase:
Năm 1960, P.Abersheim lần đầu tiên đưa ra thông báo về phân hủy phân

tử pectin không bằng con đường thủy phân. Enzym tham gia vào quá trình đó
gọi là pectate lyase. Enzym này xúc tác phá vỡ mối liên kết - 1,4 –
glucosid, tiến tới làm mất hoạt tính nguyên tử hydro ở nguyên tử carbon thứ
5, tạo thành mối liên kết đôi giữa nguyên tử thứ 4 và thứ 5.
Dựa trên cơ chế tác dụng của pectate lyase, người ta chia nó ra thành hai
nhóm:
- Nhóm undo-pectatelyase: Tham gia thủy phân phân tử polygalacturonic ở
chỗ khác nhau của dãy tạo nên acid galacturonic.
- Nhóm exo-pectatelyase: Tham gia phân hủy thành phần mạch vòng của
acid digalacturonic
Pectate lyase (PEL) là các enzyme VSV ngoại bào. Các enzyme của
giống Erwina và Bacillus được biết đến là tác nhân gây ra triệu chứng softrod
ở thực vật. Tuy nhiên, chúng cũng được tìm thấy phổ biến ở Aeromonas,
Pseudomonas, Xanthomonas, Aspergillus và Fusarium.
Erwinia chrysanthemi sinh ra các enzyme pectate lyase ở dạng
isoenzyme có thể được phân thành các nhóm trên cơ sở điểm đẳng điện của
chúng: acid (pH 4-5), trung hoà (pH 7-8,5) và kiềm (pH 9-10). Số lượng các
isoenzyme trong mỗi nhóm có thể thay đổi tùy theo loài. Đa số các loài được
nghiên cứu cho năm hay ít nhất bốn isoenzyme: một acid (PELA), hai trung
hoà (PELA và C), hai kiềm (PELD và E). Tất cả các isoenzyme này đều cần
Ca++ để làm tăng độ hoạt động và có pH tối ưu 8-10. Các nghiên cứu trên
chủng EC16 cho thấy rằng tất cả 4 isoenzyme trên đều là endo-enzyme
(PEL A(pI 4,2), PEL A (pI 8,8), PEL C (pI 9,0), và PEL D (pI 10,0)). Các
PEL kiềm rất đặc hiệu trong việc gây ra sự giầm nước của các mô thực vật,
tiếpntheo là các isoenzyme trung hoà, trái lại các PEL acid không gây ảnh
hưởng gì.
Ở các chủng Erwinia carotovara, có ít nhất ba PEL được tiết ra, tất cả
đều có điểm đẳng điện ở pH kiềm: PEL I (pI 9,7), PEL II (pI 10,2), và PEL
III (pI 10,35). Cả ba isoenzyme này đều có pH tối ưu là 9,0. Nhiệt độ tối ưu
cho hoạt động của PEL II và PEL III là 50 và 60oC, theo thứ tự. PEL I có độ

bean nhiệt thấp. Ở chủng GIR726, có bốn loại endo-PEL isoenzyme với các
điểm đẳng điện ở các pH rất kiềm (10,0, 10,6, 10,3 và 10,9) và khối lượng
phân tử nằm trong khoảng từ 28-33 kD. pH tối ưu cho hoạt động là 9,3 cho
PEL II 9,5 cho PEL IV và 9,7 cho PEL I và III. Cũng như với các PEL từ các
nguồn khác, những isoenzyme này được kích hoạt bởi Ca++. Hoạt độ
- 18 -


Seminar

Hệ enzym pectinase

enzyme tăng 50-70% khi có mặt của Ca++ nồng độ 0,5mM. Isoenzyme với
pI>10 chứa 2,5-4.8% đường trung tính. Các PEL từ một số loài Bacillus cũng
có khả năng gây ra sự giảm nước ở mô thực vật.

Hình 16

IV.4. Ý nghóa về mặt kỹ thuật của các endo-enzyme
1) Pectinesterase: Ethanol có mặt trong phần chưng cất được từ thòt quả lên
men là do pectin methylester bò phân cắt bởi endo-enzyme PE. Trong suốt
quá trình lên men, ethanol được sinh ra và các đơn vò sản xuất cần phải
thanh trùng thòt quả trước khi lên men để nồng độ ethanol có mặt trong sản
phẩm không vượt quá giới hạn cho phép. Sự có mặt của PE trong trái cây họ
citrus lànguyên nhân gây ra các vấn đề cần được giải quyết trong công
nghiệp thực phẩm, tức là sự mất đi của các vết vẫn đục trong dòch ép. Nếu
PE không bò ức chế trực tiếp sau khi tách chiết dòch quả bằng cách bất hoạt
bởi nhiệt hay làm đông, các phân tử pectin sẽ bò đề ester hoá và sẽ bò đông
tụ bởi sự có mặt của các ion Ca++ trong dòch ép. Để ngăn điều này, nước ép
được tách thành phần cặn và phần trong. Nếu nước ép quá đặc, gel pectate

sẽ được hình thành và do đó nước ép sẽ không được hoàn nguyên lại nữa.
Những vấn đề này làm giảm chất lượng sản phẩm một cách nghiêm trọng.
Các chất tạo hương của trái cây họ citrus cực kỳ mẫn cảm với nhiệt, vì thế
các phương pháp sản xuất sản phẩm trái cây đông lạnh đang rất cần thiết.
Phức hợp của ion Ca++ có thể ngăn ngừa sự biến mất của các đám mây vẫn
đục do hoạt động của PE, nhưng lại làm phát sinh các vấn đề mang tính chất
pháp lý. Polyphenol có thể ức chế hoạt động của PE nhưng lai gây ảnh
hưởng đến vấn đề cảm quan, chẳng hạn về vò trí và tính đồng nhất của sản
phẩm. PE đồng thời là một chất ức chế sản phẩm cuối, nhưng nếu thêm
pectic acid vào lại làm nước ép bò phân lớp, thế là lại tạo ra một vấn đề
không mong muốn khác. Tuy nhiên, việc thủy phân pectic acid, đến mức
polymer hoá 8-10, có ảnh hưởng ức chế của các chế phẩm polymer cao phân
tử nhưng lại không đông tụ với Ca++. Việc thêm các chế phẩm như thế sẽ
- 19 -


Seminar

Hệ enzym pectinase

không ngăn ngừa được nhưng sẽ trì hoãn được quá trình tự phân lớp, có lẽ đủ
lâu để phân phối nhanh các loại nước ép trái cây tươi được làm tan giá. Một
khả năng khác là việc thêm các exo-enzyme (H.17): PG làm phân hủy
pectin có mức ester thấp hình thành trước khi sự đông tụ với Ca++ xảy ra, hay
PL phân hủy các pectin trong nước ép trái cây đến các sản phẩm có khối
lượng phân tử thấp hơn, là các hợp chất không mẫn cảm với Ca++, dù là đề
ester hoá và thực tế cũng có thể hiện chức năng ức chế PE.
Hoạt động phân hủy pectin bởi enzyme như thế đã được ứng dụng trong việc
àm giảm độ nhớt trong nước trái cây, vì thế làm tăng nồng độ của các thành
phần chất chiết đến các giá trò Brix cao hơn như bình thường có thể. Cũng

cần hải lưu ý việc sử dụng các giai đoạn bay hơi nhiều lần nhằm tối ưu hoá
quá trình xử lý nhiệt và khôi phục hương vò sản phẩm, kết hợp với việc bảo
quản trong điều kiện đông lạnh và vận chuyển sản phẩm nước ép cô đặc
giúp tránh được phần lớn PE bò bất hoạt do tác động của nhiệt độ.Tuy nhiên,
đối với các nước đang phát triển, vẫn đang tồn tại vấn đề này trong công
nghiệp sản xuất nước ép trái cây họ citrus và các loại nước ép vẩn đục khác
có hoạt lực PE cao và các chất tạo hương rất mẫn cảm với nhiệt, chẳng hạn
như ổi và xoài.
PL
Pectin hòa tan →

Các ester oligogalactorunic acid

↓ PE

PG
Pectin có hàm lượng metholxyl thấp → Các oligogalacturonic acid tan
↓ M++
Các pectate không tan

Hình 17: Ngăn ngừa sự đông tụ của đông tụ của Ca++ với pectin bò đề ester
hóa bởi PE trong serum cam
Các PE được phân lập từ cam có hình thức khác nhau và có ái lực khác hau
đối với pectin và pectate. Mặt khác, chúng cũng khác nhau về độ bền hiệt,
và cũng dễ hiểu rằng chúng đóng vai trò khác nhau trong hiện tượng àm
trong dòch quả ép. Một loại được phân biệt bởi khối lượng phân tử của nó rất
cao, chỉ chiếm khoảng 5% hoạt tính toàn phần và mang một số đặc điểm nổi
bật. Loại này bền nhiệt và vì thế đóng vai trò chính yếu trong việc làm trong

- 20 -



Seminar

Hệ enzym pectinase

dòch quả ép đã thanh trùng với lượng nhiệt không đủ. Enzyme này cũng hoạt
động ở nhiệt độ thấp và pH thấp và do đó được coi là có vai trò quan trọng
trong quá trình tự tách lớp của nước chanh trong và nước ép từ quả chanh thu
được bằng cách để lắng nước ép trong tank có chất bảo quản là sulfur
dioxide. Những dòch trong từ quả ép như thế vẫn đang là những sản phẩm có
giá trò thương mại được sản xuất với việc ứng dụng các chế phẩm pectinase
thương mại.
Trong số hai isoenzyme, chỉ có isoenzyme PE loại I có khả năng làm tách
lớp. PE loại II không có khả năng này; lượng methanol tự do được thoát ra ít
hơn so với methanol tạo ra bởi các enzyme tách lớp. Bảng 6 cho thấy khả
năng ức chế rất cao của pectate có lẽ đã ức chế sự hoạt động của enzyme ở
một mức nhất đònh trong quá trình ester hoá. nh hưởng này được tăng lên
bởi sự đóng góp của các nhóm acid tạo thành. Hình 6.11 cho thấy, nếu thêm
PG vào thì khối pectate lại bò phân hủy tiếp và trên thực tế tốc độ phản ứng
mà tại đó methanol tự do hình thành trong nước cam ép có PE hoạt
độngđược tăng lên bởi PG. Các sự khác nhau về mặt động học như thế cũng
có thể giải thích tính ức chế không hoàn toàn bởi oligogalacturonate. Một
loại PE khác trong nước cam ép không gây ra sự tự phân lớp, thậm chí ngay
cả sau khi giải phóng một lượng methanol bằng với lượng methanol mà PE
phóng thích.
Các kiểu tấn công của enzyme phải được giả đònh sao đó để pectin với hàm
lượng ester thấp được sinh ra mà có tính mẫn cảm với Ca++ giảm đi, có lẽ
bởi sự phân bố ngẫu nhiên của các nhóm carboxyl tự do. Cơ chế này thường
thấy ở các PE của nấm, chẳng hạn như ở A. japonicus, enzyme này được sử

dụng để sản xuất pectin có mức ester hoá thấp dùng trong chế biến mức ít
đường. Những pectin như vậy thường được sản xuất nhờ quá trình thủy phân
nhờ acid.
Pectinesterase của nấm cũng được sử dụng để tách lớp rượu táo Pháp. Hai
isoenzyme với đặc tính làm tách lớp nước cam này được tìm thấy trong tất cả
các thành phần của quả cam. Có đến 12 loại PE được tìm thấy trong quả cam
trồng và các loại quả họ citrus khác và chúng được tách trên cơ sở ái lực của
chúng đối với pectate. Điều cần chú ý là hoạt động của các PE bò ức chế bởi
nồng độ cao của đường để tạo nước ép cô đặc đến 60oBx, tại đó các enzyme
này không hoạt động nhưng lại có thể hoạt động sau khi hoàn nguyên (pha
loãng trong nước).
Hiện tượng đông tụ với calcium của pectin bò đề ester hoá bởi PE được khai
thác khi sấy khô vỏ trái cây họ citrus sau khi ép làm thức ăn cho gia súc.
Chất vữa calcium hydroxide được thêm vào khối vỏ trong khi nghiền để đưa
- 21 -


Seminar

Hệ enzym pectinase

pH về giá trò trung tính hay cao hơn. pH cao, và nồng độ ion Ca++ cao, làm
kích hoạt PE, quá trình đề ester hoá xảy ra nhanh và sự đông tụ của pectate
với calcium xảy ra. Chất lỏng được tiết ra và được ép, để chỉ có một phần ít
nước còn lại cần được loại bỏ nhờ quá trình sấy bởi nhiệt. Phần nước ép có
thành phần tương tự như nước ép từ quả được cô thành mật và cũng được
làm thức ăn cho gia súc. Dó nhiên, vỏ trái cây họ citrus khô được sử dụng
làm nguyên liệu thô để trích chiết pectin, do đó cần phải ngăn chăn hoạt tính
của PE bằng cách tẩy trắng vỏ ngay lập tức, nếu không, pectin được chiết ra,
cho dù bò đề ester hoá ít thôi, sẽ chứa các khối galacturonic acid tự do và sẽ

rất mẫn cảm với Ca++ và vì vậy không sử dụng được để làm yếu tố tạo
đông.
Endo-PE cũng được khai thác để bảo vệ và cải tạo kết cấu và độ chắc của
nhiều loại rau quả chế biến, như táo cắt lát, cà chua đóng hộp, súp lơ, cà rốt,
khoai tây và đậu. Quá trình làm trắng ở nhiệt độ thấp, thời gian dài kích hoạt
PE, làm cho pectin bò đề ester hoá một phần, sau đó pectin bò đề ester hoá
này phản ứng với Ca++, tạo nên sự kết dính nội bào mạnh hơn.
Sự kích thích mạnh hơn đối với PG và mạnh hơn trong thí nghiệm b, trong đó
enzyme, esterase bò ức chế mạnh hơn bởi sản phẩm cuối so với trong thí
nghiệm a. Rõ ràng PL (----) không phân hủy được các vùng ức chế đề ester
hoá nên không có ảnh hưởng gì.
2) Pectinesterase và polygalacturonase:
Hai enzyme này có mặt cùng nhau rất nhiều trong cà chua, có ảnh hưởng rất
lớn trong quá trình chế biến cà chua. Việc gây bất hoạt các enzyme này bởi
nhiệt ngay lập tức là cần thiết để có được nước ép có độ nhớt cao như người
tiêu dùng mong muốn hay nước ép dạng paste, sử dụng làm nước chấm,
soup, nước sốt cà chua nấm và một số sản phẩm tương tự. Những loại nước
quả này được xử lý nhiệt trong một thiết bò đặc biệt mà trong đó cà chua
được nghiền trực tiếp thành cà chua nóng dạng nhão. Rõ ràng, quá trình xử
lý nhiệt tạo ra một số các hương vò đặc trưng cho sản phẩm cà chua chế
biến. Trong trường hợp các thành phần cà chua được sử dụng để tạo màu và
hương vò, còn phần chính của sản phẩm là do các thành phần khác, như tinh
bột tạo nên thì nguyên liệu nước ép phải ở trạng thái nguội hơn, đồng thời
phải có một thời gian nghỉ giữa hai giai đoạn nghiền ép và xử lý nhiệt để
pectin có thể bò phân hủy nhiều hơn nhờ tác động kết hợp của PG và PE.
Còn trong những trái cà chua được cải tạo gen để giảm hàm lượng PG, phần
rắn và độ chắc cũng như độ nhớt của quả được tăng lên.

- 22 -



Seminar

Hệ enzym pectinase

3) Hoạt tính pectinase từ nguồn VSV gây nhiễm:
PG từ nấm men và PAL từ vi khuẩn cùng với các endo-PE đều có liên
quan đến quá trình làm chín dưa chuột và ô liu ngâm trong nước muối. Sự
hao hụt về chất lượng này có thể tránh được bằng cách sử dụng các chất ức
chế, chẳng hạn như các polyphenol rò rỉ ra từ lá nho vào trong nước muối.
Nước muối có thể được sử dụng để thanh trùng nấm mốc bền nhiệt
Byssochlamysfulva. Nấm mốc này sinh enzyme làm hỏng dâu tây trong sirô
(syrup) hay mứt.
Một loại PG bền nhiệt có từ loài Rhizobium có thể làm hỏng kết cấu
của thòt quả mơ đóng hộp. Sự nhiễm nấm có thể gây ra hiện tượng tách lớp
của nước cam vô khuẩn và đã đóng chai, không rõ là do tác động của PE,
PG hay cả hai, nhưng một lượng lớn methanol tự do được tìm thấy trong loại
nước quả phân lớp này. PG nấm men có thể phân hủy pectin trong quá trình
lên men bột táo nghiền, làm cho bã táo bò mất đi một lượng lớn pectin nếu
được đem làm nguyên liệu thô để sản xuất pectin.
Lên men cà phê và cacao là một lónh vực ứng dụng nhiều triển vọng
của enzyme pectinase có từ nguồn VSV. Trong quá trình len men, lớp chất
nhầy xung quanh các hạt này bò phân hủy nhanh hơn và bò rửa khỏi hạt trước
khi hạt được sấy khô. Một ứng dụng khác là sự tạo hương đặc biệt cho sản
phẩm rượu do sự hình thành các sản phẩm trao đổi chất của nấm mốc nhiễm
vào trái nho chín có hàm lượng đường cao bằng cách đâm thủng vỏ trái nho
và để nước trong nho bay hơi, và để nho bò nhiễm nấm.

V.NGUỒN THU NHẬN ENZYME PECTINASE:
V.1 Thực Vật:

Pectinase có nhiều trong lá, củ khoai tây, trong chanh, cà chua, cỏ chẻ ba,
trong 1 số loại qủa. Thường là có nhiều enzyme pectinesterase.
Đặc điểm của pectinesterase thực vật:
_Bên cạnh pectineaterase (PE) VSV, hầu hết các loại cây cho trái đều chứa
enyme PE. Enzyme này thường tồn tại dưới nhiều hình thức khác nhau, nằm
trong phần vỏ tế bào. PE ở thực vật nói chung có hoạt độ tối ưu trong khoảng
pH hơi kiềm. Các cation kim loại ở nồng độ thấp, như Ca2+ chẳng hạn, có
khuynh hướng làm tăng nồng độ hoạt động của enzyme.
_Cà chua chứa ít nhất hai loại PE. Cả PE1 và PE2 đều tăng trong giai đoạn
đầu của quá trình chín. Khi bước vào giai đoạn chín, nồng độ enzyme PE1
giảm xuống, nhưng PE2 tích luỹ dần cho đến khi trái cây có màu đặc trưng
của trái chín. PE2 có khối lượng phân tử 23kD, pH tối ưu 7,6. Enzyme này bò

- 23 -


Seminar

Hệ enzym pectinase

bất hoạt 50% sau 5 phút đun ở 67oC. Các ion Ca2+ và Na+ làm tăng hoạt độ
của enzyme lên tối đa ở các nồng độ 0,005Mvà 0,05M, theo thứ tự. PE của
đậu nành là protein có khối lượng phân tử 33kD, hoạt động tối ưu tại pH gần
8. Polygalacturonic acid, sản phẩm hình thành do quá trình đề methyl hoá, là
một chất ức chế cạnh tranh.
_Trong thòt quả chuối có hai isoenzyme PE. Cả hai có cùng khối lượng phân
tử là 30kD, nhưng có điểm đẳng điện khác nhau: 8,8 và 9,3. Các enzyme
này hoạt động ở pH tối đa là 7,5. Hoạt độ enzyme tăng lên khi thêm vào
dung dòch NaCl ở nồng độ 0,2M, và đưa pH của dung dòch về 6,0. Các
enzyme này bò ức chế bởi nhiều loại polyol có khối lượng phân tử thấp, như

glycerol, sucrose, glucose, maltose và galactose.
PE trong quả cam có hai loại: đó là hai isoenzyme PE1 và PE2 có khối lượng
phân tử 36 kD, nhưng có điểm đẳng điện khác nhau là 10,05 và ≥ 11,0 theo
thứ tự. pH tối ưu của PE1 là 7,6 , còn của PE2 là 8,0.
_Thòt quả cũng chứa hai isoenzymem, một trong hai enzyme này có tính bền
nhiệt hơn, còn enzyme kia thì ít mẫn cảm hơn khi bò tác động của protease.
Độ ổn đònh của enzyme có thể liên quan đến mức độ glycosyl hoá của các
phân tử enzyme. Enzyme bền nhiệt hơn và enzyme còn lại có khối lượng là
51kD và 36kD, theo thứ tự.
_Cả táo và kiwi cũng chứa hai loại isoenzyme. Các isoenzyme của kiwi có
cùng khối lượng phân tử là 57kD và cùng điểm đẳng điện là 7,3. Tuy nhiên,
chúng khác nhau về mức độ bền nhiệt. Một điểm đáng lưu ý là tất cả
enzyme vi sinh vật đều không phải là protein kiềm. PE của Trichoderma
reerei có điểm đẳng điện nằm trong khoảng 8,3-9,5 và pH tối ưu là 7,6. Tuy
nhiên, PE của Aspergillus có điểm đẳng điện và pH tối ưu trong khoảng acid.
Hoạt động của enzyme PE sinh ra bởi A. niger đạt tối đa ở pH 4,5 ở 40oC.
Các PE acid và kiềm có thể đề methyl hoá cơ chất pectin theo cùng một
kiểu. PE kiềm làm hình thành các pectin được đề ester hoá và pectin này có
thể tạo gel yếu với ion calcium; PE acid tạo ra pectin bò đề ester hoá có khả
năng tạo gel mạnh với ion calcium.
Trình tự amino acid: Cấu trúc bậc một của PE cà chua chứa 305 amino
acid với khối lượng phân tử 33 239. Enzyme này có chứa hai cầu nối
disulfide (Cys98-Cys125 và Cys166-Cys200). Cys 166 có mặt trong tất cả
các enzyme pectinesterase. Trình tự amino acid suy luận trên cơ sở các
nucleotide cDNA cho thấy sự không nhất quán, 18 trong 27 vò trí khác nhau,
có thể làm thay đổi điện tích của protein. Mặt khác, chỉ có khoảng 94% trình
tự amino acid trong một phần chuỗi amino acid có tính đồng dạng với toàn
bộ trình tự của cDNA. Sự không nhất quán này có thể phản ánh sự tồn tại
- 24 -



Seminar

Hệ enzym pectinase

của các isoenzyme, mặc dù chỉ có hai isoenzyme trong cà chua được biết
đến. Một số gen mã hoá cho các enzyme PE đã được tách dòng và nghiên
cứu đặc điểm. Gen tách dòng từ
Pseudomonas mã hoá cho PE có chứa 396 amino acid với khối lượng phân tử
là41 004.
_Cơ chế đề methyl hoá: PE loại bỏ các nhóm methoxyl trong phân tử
pectin bằng tương tác ái nhân của enzyme lên ester, làm hình thành hợp chất
trung gian acyl-enzyme và phóng thích methanol. Tiếp theo sau là phản ứng
deayl hoá, là phản ứng thủy phân của hợp chất trung gian acyl-enzyme, để
giải phóng enzyme và carboxylic acid(H.6.7).
Các PE có nguồn gốc thực vật phản ứng theo kiểu làm hình thành các khối
pectin chứa các nhóm carboxylate dọc theo mạch pectin. Enzyme của
Trichoderma reesei là một protein cơ bản cho kiểu phản ứng tương tự.
Enzyme của các loài Asperillus với pH tối đa trong vùng acid, xúc tác phản
ứng từ bên trong.
nh hưởng của các ion kim loại khi kích hoạt enzyme pectinesterase có thể
có liên quan đến tương tác của nó với cơ chất. Polygalacturonic acid là một
chất ức chế cạnh tranh trong phản ứng thủy phân nhờ sự xúc tác của PE.
Pectin chứa các nhóm cacboxylate được sắp xếp như hình khối có thể tác
dụng theo cách tương tự. Sự liên kết của các ion kim loại vào các nhóm
carboxylate trong trường hợp này có khuynh hướng trung hoà ảnh hưởng ức
chế của cơ chất pectin lên enzyme. Tuy nhiên. Lượng dư các ion này trên
thực tế gây ra sự bất hoạt của PE vì các ion kim loại bò vây quanh bởi các
nhóm carboxylate nằm kế cận với các liên kết ester cần thiết cho phản ứng
thủy phân xảy ra.

V.2 .Vi Sinh Vật:
_ Nhiều VSV sống trong đất, trong nước, có khả năng phân giải pectin.
Chúng có ý nghóa quan trọng không những đối với vòng tuần hoàn 2 cacbon
trong tự nhiên mà còn đối với 1 số ngành sản xuất công nghiệp, thủ công
nghiệp (ngâm đay, gai, làm bìa, làm giấy…).
_Những vi sinh vật có khả năng phân giải pectin mạnh mẽ nhất:
+ Nấm mốc: Asp. ficuum, Asp.niger, Asp.oryzae, Asp.awamori, Asp.terrus,
Asp.saitoi, Pen.glaucum, Pen.chrlichii, Mucor mucedo, Rhizopus tritici,…
Trong số các biến chứng của nấm mốc đáng chú ý là Asp.niger và
Asp.awamori
+ Nấm men: Sac.fragilis, Sac.ellipsoideus, Sac.ludwigii,…
+ Vi khuẩn: Bac.polymyxa,.felseneus, Clostridium roserum, Pseudomonas
flurescens,…
- 25 -