MỤC LỤC


PHẦN 1. ĐẶT VẤN ĐỀ
Ngày nay khoa học kỹ thuật ngày càng phát triển, cùng với đó trình độ
cũng như nhận thức của con người ngày càng nâng cao, chất lượng cuộc sống và
bữa ăn càng ngày càng được chăm lo. Họ không chỉ muốn ăn no mà còn ăn
ngon, đầy đủ và cân đối các chất dinh dưỡng. Trong mỗi loại thức ăn có thành
phần các chất dinh dưỡng khác nhau. Do đó để cân đối được bữa ăn cho cả gia
đình và phù hợp với từng đối tượng cụ thể thì chúng ta cần phải biết được các
chất dinh dưỡng có trong thức ăn và thành phần của mỗi chất trong từng loại
thức ăn. Để làm được điều đó chúng ta cần phân tích thành phần các chất có
trong thực phẩm bằng những phương pháp khác nhau, tùy vào bản chất của chất
mình cần phân tích. Trong thức ăn có protein, lipid, glucid và nhiều thành phần
quan trọng khác. Và một trong những thành phần quan trọng không thể thiếu
trong bữa ăn là vitamin. Vitamin có thể được chia làm hai loại là vitamin hòa tan
trong chất béo (vitamin A, D) và vitamin hòa tan trong nước (các vitamin B và
C). Trong các loại thịt, cá, trứng, sữa có đầy đủ các loại vitamin, trong ngũ cốc
chứa nhiều vitamin nhóm B, trong rau quả chứa nhiều các vitamin C. Vitamin
có vai trò rất quan trọng đối với cơ thể nó không chỉ giúp cơ thể hấp thu thức ăn
mà còn tham gia vào các quá trình sinh hóa trong cơ thể. Nếu thiếu vitamin
chúng ta có thể mắc một số bệnh như bệnh quáng gà do thiếu vitamin A,bệnh
còi xương và loãng xương do thiếu vitamin D,... Vì vậy để biết được thành phần
các vitamin có trong thực phẩm và lựa chọn các thực phẩm sao cho phù hợp với
cơ thể để tránh tình trạng thừa vitamin người ta sử dụng nhiều phương pháp
khác nhau. Sau đây chúng tôi xin giới thiệu một số phương pháp xác định
Caroten,Vitamin A, Vitamin C, Vitamin B1, B2 và vitamin D.

1

PHẦN 2. NỘI DUNG
2.1. Phân tích -định lượng vitamin hòa tan trong dầu
2.1.1. Caroten và vitamin A
* Vai trò và chức năng sinh học
Vitamin A chỉ tồn tại chủ yếu ở
các sản phẩm động vật như gan cá và
các sản phẩm khác từ cá, mỡ bò, trứng,
gan các động vật ở biển.Cơ thể bị thiếu
vitamin A chống nhiễm, giảm ơ thể bị
thiếu vitamin A sẽ bị ngừng lớn, giảm
tính chống nhiễm trùng và bị một bệnh
mắt đặc trưng gọi là khô mắt,…
Hình 2.1. Vitamin A
Caroten là chất tiền thân của vitamin A hay gọi là provitamin.Sản phẩm
giàu caroten như cà rốt, bí đỏ, gấc,hành lá,…Ở thực vật,nếu có đủ lượng caroten
có trong tế bào thì quá trình thụ phấn, thụ tinh mới diễn ra bình thường.
Caoroten và vitamin A chỉ được tổng hợp trong cơ thể người từ caroten
của thực vật do thức ăn đưa vào cơ thể. Dưới tác dụng của men carotenaza,
caroten tạo nên vitamin A. Trong thực vật caroten tồn tại cả ba loại đồng phân α,
β và γ–caroten, trong đó quan trọng nhất là β–caroten.
Do tác dụng của vitamin A và caroten đối với cơ thể rất giống nhau nên
khi phân tích cần xác định caroten riêng hoặc xác định tổng kượng caroten và
vitamin A. Thông thường đối với thực phẩm nguồn gốc thực vật người ta quy
hoàn toàn ra caroten, đói với thực phẩm có nguồn gốc động vật thì quy hoàn
toàn ra vitamin A trên cơ sở 3 caroten bằng 1 vitamin A.
2.1.1.1. Xác định caroten bằng phương pháp sắc ký cột
a. Nguyên tắc
Tách caroten ra khỏi lương thực phẩm bằng phương pháp sắc ký cột rồi
đem so màu.Ái lực giữa pha động và pha tĩnh khác nhau nên dựa vào

tốc độ của từng môi chất để tách.
2


b. Dụng cụ hóa chất
- Cân phân tích
- Bình định mức V = 50ml, 100ml
- Cối sứ
- Máy so màu
- Cột sắc ký: dài 30cm, ϕ = 1cm
- Cát tinh chế: đổ cát qua rây có đường kính lỗ 4-5mm. Rửa cát qua rây
bằng nước máy, rồi dùng HCl (tỷ lệ 1/1) cho vào cát, khuấy kĩ, ngâm 1
đêm. Rửa cát cho đến hết acid. Rửa lại bằng nước cất, sấy khô.
- Benzin: nhiệt độ sôi 70-80̊̊C.
Chất hấp phụ: Nhôm oxyt(Al2O3) loại dùng cho sắc ký, sấy ở 200 Ctrong
1 giờ, bảo quản trong bình làm khô có chất chống ẩm silicagen.
Natrisunfat khan (Na2SO4)
Dung dịch azobenzen tiêu chuẩn: Cân chính xác 0,145g azobenzen cho
vào bình định mức dung tích 100ml, thêm rượu etylic 96% đến vạch mức, lắc kĩ.
Khi thí nghiệm đem dung dịc này pha loãng gấp 10 lần bằng rượu etylic 96%.
Dung dịch này để ở chỗ tối, màu sẽ không biến đổi.
c. Cách tiến hành
Cân 5g mẫu lương thực, thực phẩm khô cho vào cối sứ nghiền kĩ với 5
gam cát sạch trong 30 phút. Để làm khô kĩ ta cho thêm vào cối sứ 10 gam
Na2SO4 khan nghiền tiếp hỗn hợp trong 30 phút nữa.
Phần dưới của cột sắc ký được nhồi bông thấm nước. Sau đó cột được
nhồi nhôm oxyt khoảng 2/3 cột. Dùng đũa thủy tinh nén nhôm oxyt cho chặt.
Trên cùng lại đặt một lớp bông dày 1cm.
Bột khô từ cối được chuyển vào phần trên của cột sắc ký. Cho benzin vào
cột đến khi thấy lớp bột không thấm benzin nữa. Sau đó dùng bơm hút nhẹ để

lớp bột được rửa bằng benzin đến khi không còn thấy những giọt màu vàng chảy
ra khỏi cột sắc ký vào bình hứng. Cần chú ý cho benzin phủ ngập lớp bột vì
caroten dễ bị oxy hóa bởi không khí.
Chuyển toàn bộ caroten từ bình hứng vào bình định mức 50ml hoặc
100ml (tùy theo thể tích nước hứng được) và cho thêm benzin đến vạch mức lắc
nhẹ. Dung dịch caroten này được đem đi so màu với dung dịch azobenzen tiêu

3


chuẩn (đã pha loãng 10 lần). Trong 1ml dung dịch có màu giống màu dung dịch
azobenzen tiêu chuẩn chứa 0,00235 mg carotenA.
d. Tính kết quả
Hàm lượng caroten (tính theo mg trong 100 g sản phẩm) được tính bằng
công thức:
X=
Trong đó:
V- là dung tích bình định mức chứa dung dịch carotene trong
benzin, ml;
G- là lượng mẫu cân, g;
D tc- mật độ quang, hoặc chiều cao thước (trên máy Dubot) của
dung dịch azobenzen tiêu chuẩn, mm
Dm- mật độ quang, hoặc chiều cao thước (trên máy Dubot) của
dung dịch carotene, mm.
e. Ưu, nhược điểm
Ưu điểm :
- Có thể phân tích đồng thời nhiều hợp chất
- Không cần làm bay hơi mẫu
- Độ phân giải cao nhờ quá trình tách trên cột
- Thể tích mẫu phân tích nhỏ

Nhược điểm :
- Phương pháp này ít chọn lọc do không loại trừ ảnh hưởng của nền mẫu.

2.1.1.2. Xác định vitamin A bằng phương pháp so màu
4


a. Nguyên tắc
Vitamin A là một ancohol cao cấp chưa no có công thức hóa học như sau
và thường kết hợp với acid béo (palmitic và stearic) tạo thành este phức tạp. Vì
vậy khi muốn xác định vitamin A ta phải xà phòng hóa các sản phẩm, rồi xác
định vitamin A trong phần không xà phòng hóa.

Vitamin A được tách ra khỏi dung dịch không xà phòng hóa bằng
chloroform khan và nó cho phản ứng với atimon (III) clorua tạo sản phẩm màu
xanh rồi đem đi so màu với dung dịch tiêu chuẩn.
b. Dụng cụ hóa chất:
- Cân phân tích;
- Bình nón dung tích 250ml;
- Phễu chiết;
- Ống làm lạnh;
- Nồi cách thủy, cốc thủy tinh dung tích 250ml, bình định mức dung tích
25ml, 500ml;
- Dung dịch màu tiêu chuẩn được chuẩn bị như sau: cân 75g đồng sunfat
(CuSO4.5H2O) và 3,5g coban nitrat Co(NO3)2 cho vào bình định mức dung dịch
500ml, thêm nước đén vạch mức, lắc kĩ cho tan hết. Từ dung dịch này tạo dãy
màu tiêu chuẩn theo bảng sau:
Giấy quỳ, natri sunfat khan: đã sấy ở 100̊C trong 1giờ
Cloroform (CHCl3): Rửa 5 lần bằng nước cất tỷ lệ 2 nước : 1 cloroform
trong phễu chiết rồi làm khô bằng natri sunfat khan sau đó chưng cất để thu dịch

tinh chế. Dung dịch antimony (III) clorua (SbCl 3) bão hòa: SbCl3 được rửa bằng
cách khuấy trong chloroform đến khi nước rửa không màu, SbCl 3 đã rửa được
5


để trong bình làm khô (có chứa axit sunfuric đặc) qua 2 ngày, sau đó hòa tan
SbCl3 trong chloroform đến bão hòa.
- Ete etylic tinh khiết
- Kaly hyđroxit dung dịch 20% trong rượu etylic .
c. Cách tiến hành
Cân 10 đến 20 g mẫu cho vào bình nóng dung tích 250ml them 20ml dung
dịch kali hyđroxit 20% rượu etylic. Đậy bình bằng nút bấc có gắn ống làm lạnh
và đun hồi lưu trên nồi cách thủy ở nhiệt độ 85 - 90̊C trong 2 giờ để xà phòng
hóa. Dung dịch đã xà phòng hóa được pha loãng bằng 20ml nước cất rồi chuyển
vào phễu chiết. Thêm vào phễu chiết 50ml ete etylic và lắc kỹ (để tránh tạo
huyền phù, cần chiếc dịch lúc nguội và lắc mạnh) chiết phần không xà phòng
hóa ra (lớp trên) vào một phễu chiết thứ hai. Lại them 25ml ete etylic vào phân
xà phòng hóa , tiếp tục lắc và chiết lấy lớp trên vào phễu chiết thứ 2. Rửa dịch
chiết bằng nước cất trogn 3-4 lần mỗi lần 20ml nước cất cho đến khi nước rửa
có phản ứng trung tính (thủ bằng giấy quỳ). Làm khô nước chiết đã rửa bằng 6
gam natrisunfat khan trong 30 phút. Chuyển cả dung dịch vào cốc, sau đó đun
sôi ete trên nồi cách thủy.
Hòa tan cặn không xà phòng hóa thu được bằng chloroform (sau khi đã
đuổi hết ete) và chuyển vào bình định mức dung tích 25ml, them chloroform cho
đến vạch, lắc nhẹ.
Cho vào 1 ống nghiệm ( khô,sạch, cùng màu, cùng kích thước như ống
nghiệm chứa dung dịch tiêu chuẩn ) đúng 0,2ml dung dịch trong bình định mức
trên, thêm vào 1-3 giọt anhyđric axetic , 2ml dung dịch SbCl 3 bão hòa lắc nhanh
và để không quá 10 giây đem đo màu với ống tiêu chuẩn trong 20 giây.
d. Tính kết quả

Hàm lượng vitamin A tính theo đơn vị màu của ống tiêu chuẩn có màu
trùng với màu của ống nghiệm chứa dung dịch mẫu. Nếu màu của ống mẫu nằm
giữa màu của 2 ống tiêu chuẩn thì lấy trị số trung bình. Cuối cùng hàm lượng
vitamin A (mg trong 100g sản phẩm) tính bằng công thức:

6


Trong đó:
n- Số đơn vị màu tìm được khi so màu;
V- Dung tích bình đựng múc chứa dung dịch không xà phòng hóa trong
chloroform, ml;
G- Lượng mẫu cân, g;
4- Hệ số thực nghiệm để tính ra mg%
2.1.1.3. Xác định Vitamin A trong thực phẩm bằng phương pháp sắc
ký lỏng hiệu năng cao.
a.Nguyên tắc
Sắc ký lỏng hiệu năng cao là một phương pháp chia tách trong đó pha
động là chất lỏng và pha khí trong cột là chất rắn đã được phân chia dưới dạng tiểu
phân hoặc một chất lỏng phủ lên một chất mang rắn, hay một chất mang đã được
biến đổi bằng liên kết hóa học với các chất hữu cơ. Qúa trình sắc ký lỏng dựa trên cơ
chế hấp phụ, phân bố, trao đổi ion hay phân loại theo kích cỡ.
b. Chuẩn bị dụng cụ
- Hệ thống máy HPLC, Shimadzu
- Cột Purospher Star RP-18e( 150x4.6mm,5um)
- Cân phân tích có độ chính xác 0.1mg
- Bộ chưng cất có ống sinhhàn hồi lưu
- Bình định mức 10ml
- Pipet các loại : 0.1ml, 0.5ml,1ml, 2ml, 5ml, 10ml,...
- Ống Hatch

- Dụng cụ thủy tinh các loại: Becher, erlen.
c. Chuẩn bị hóa chất
Hóa chất phải là loại tinh khiết được sử dụng để phân tích , gồm:
- Nước cất loại dùng cho HPLC
- Dietyl ete tinh khiết không có Peroxit
- Etanol
7


- Dung dịch Kalihydroxyde( KOH) 2M trong cồn : hòa tan 11.2g KOH
trong 100ml cồn 96o
- Dung dịch Kalihydroxyde ( KOH) 2% trong nước : Hòa tan 2g KOH
trong 100ml nước cất
- Acetonnitrile, HPLC
- Na2SO4 khan.
d. Cách tiến hành
Xây dựng đường chuẩn: Nếu dùng chuẩn vitamin A thì phân tích ngay trên
thiết bị HPLC. Nếu Dùng vitamin A dưới dạng este, thí dụ như vitamin A acetat,
vitamin A palmitat,...thì phải tiến hành xà phòng hóa để giải phóng vitamin A ra
thể tự do rồi mới tiến hành phân tích bằng HPLC. Xây dựng đường chuẩn dùng
Vitamin A palmitat.
* Quá trình xà phòng hóa
Cân 18.32mg vitamin A palmitat tương ứng với 10mg vitamin A (phân
lượng của Vitamin A là 286, phân tử lượng của vitamin A Palmitat là 524) cho
vào bình cầu có cổ nhám, thêm 20-40ml dung dịch KOH 2M trong etanol và
0.5natri ascorbat. lắp ống sinh hàn hồi lưu . Đặt trên nồi cách thủy, xà phòng hóa
ở nhiệt độ 70oC trong 30 phút.Chuyển dung dịch còn nóng vào một bình lóng,
rửa bình cầu nhiều lần bằng H2O cất và tập trung nước rửa vào bình lóng.
Gộp tất cả lốp ete vào bình quả lê. Cô quay đến cạn. Cặn còn lại hòa tan
trong acetonitrile, chuyển sang bình định mức 10ml. Định mức đến vạch bằng

acetonitrile. Dung dịch này dùng để làm dung dịch vitamin A chuẩn gốc
(1000mg/l).
Dung dịch chuẩn 100ug/ml: hút chính xác 1ml dung dịch vitamin A chuẩn
gốc 1000ug/ml vào bình định mức 10ml. Định mức tới vạch bằng ACN.
* Chuẩn bị mẫu thử
Cân khoảng 10g mẫu thử đã được nghiền nhỏ ( nếu cần) cho vào bình cầu
thuỷ tinh có cổ nhám và tiến hành xà phòng hoá như đã ghi ở phần trên.
Sau khi rửa dịch chiết ete bằng 15ml KOH 2% và nhiều lần với nước cất
( mỗi lần 50ml) cho đến khi không còn vết kiềm ( thử với phenoltalein) . Loại
8


nước trong dung dịch chiết ete bằng cách lọc qua lớp NaSO4 khan , rửa lớp
Na2SO4 ba lần, mỗi lần với 10ml ete.
Gộp tất cả lớp ete vào bình quả lê. Cô quay đến cạn . Hoà tan phần còn lại
bằng chính xác 1ml dung dịch pha động ( vortex 15giây và siêu âm 3 phút) . Lọc
dịch đục qua màng lọc 13mm, 0.45um và thu dịch lọc và tiến hành phân tích
trên HPLC.
* Chuẩn bị mẫu kiểm tra hiệu suất thu hồi
Cho thêm 0.5ml dung dịch chuẩn 10ng/ml vào 10g mẫu trắng . đồng nhất
mẫu bằng chách siêu âm khoảng 1 phút. tiến hành chuẩn bị mẫu giống như
chuẩn bị đối với mẫu thử.
* Tiến hành phân tích trên HPLC
* Điều kiện phân tích
- Pha động
- Tốc độ dòng
- Detector UV, λ= 325nm tiêm các dung dịch mẫu thử nghiệm theo thứ tự
sau:
+ Các dịch chuẩn. Dựng đừơng chuẩn giữa nồng độ các chuẩn vitamin A và
diện tích của các chuẩn Vitamin A. Tính toán hệ số tương quan hồi quy tuyến tính.

+ Dung dịch mẫu trắng
+ Dung dịch mẫu kiểm soát. tính hàm lượng các vitamin A trong dịch
chiết. và trong mẫu thông qua đường chuẩn xây dựng ở bước trên .Tính độ thu
hồi mẫu kiểm soát (R).
+ Các dung dịch mẫu thử nghiệm. tính hàm lượng vitamin A trong dịch
chiết (Co) thông qua đường chuẩn xây dựng ở bước trên.
e. Tính kết quả
Hàm lượng vitamin A có trong mẫu được tính theo công thức sau:
C = Co/m
Trong đó:
- C là hàm lượng Vitamin A có trong mẫu Tính theo mg/Kg
9


- Co là hàm lượng Vatamin A trong dịch chiết.(Co) thông qua đường
chuẩn, mg/L
- m: Khối lượng (g)
2.1.2. Vitamin D
2.1.2.1. Vai trò của vitamin D
- Hình thành hệ xương: vitamin này tham gia vào quá trình hấp thụ canxi
và photpho ở ruột non, nó còn tham gia vào củng cố, tu sửa xương.
- Vitamin D còn tham gia vào điều hoà chức năng một số gen. Ngoài ra,
còn tham gia một số chức năng bài tiết cảu insulin, hormon cận giáp, hệ miễn
dịch, phát triển hệ sinh sản và da ở nữ giới.
Chức năng chủ yếu của vitamin D tập trung vào quy trình kiến tạo xương,
thông qua cơ chế phân phối chất vôi và phosphor.
2.1.2.2. Phương pháp phân tích vitamin D
Xác định vitamin D (D2 và D3) trong
thực phẩm bằng phương pháp sắc ký lỏng
hiệu năng cao được sử dụng rộng rãi trên thế

giới. Để chuẩn hoá phương pháp này phù
hợp với phòng thí nghiệm chúng tôi đã tiến
hành khảo sát và phân tích bằng HPLC của
hãng Finnigan.

Hình 2.2. Vitamin D
Mẫu được xà phòng hoá bởi dung dịch kali hydroxit trong môi trường
ethanol ở nhiệt độ phòng qua đêm hoặc ở nhiệt độ 75 0C trong 1 giờ. Sau đó các
chất không xà phòng hoá (trong đó có vitamin D) được chiết bằng ete dầu hoả
và làm sạch qua cột SPE. Bơm dung dịch rửa giải thu được vào hệ thống sắc ký
và xác định vitamin D định bằng detector DAD ở bước sóng 265nm. Kết quả thu
được cho giới hạn phát hiện của vitamin D2 và D3 là 2,2 và 3,4 ppb; giới hạn
định lượng tương ứng là 7 và 11ppb; độ thu hồi của vitamin D đạt 75-90%.

10


Hình 2.3. Sơ đồ hệ thống HPLC
Trong đó:
1: Bình chứa pha động.
2: Bộ phận khử khí
3: Bơm cao áp
4: Bộ phận tiêm mẫu
5: Cộ sắc ký (pha tĩnh)
6: Đầu dò
7: Hệ thống máy tính có phần mềm ghi nhận tín hiệu, xử lý dữ
liệu và điều khiển hệ thống.
8: In dữ liệu.
 Ưu điểm:
- Quy trình xử lý mẫu tương đối đơn giản

- Ít tốn dung môi và thời gian phân tích
- Xác định được trong nhiều loại nền mẫu khác nhau
 Nhược điểm:
- Chỉ thực hiện với một lượng nhỏ mẫu vật
- Chỉ có hiệu suất cao khi thực hiện từ 0,5-1,25g vật mẫu. Trên khối
lượng này cột bị quá tải nên hiệu suất thấp.
- Trong quá trình xử lý mẫu tốn nhiều kinh phí.
11


Một số hình ảnh thiết bị:
 Hệ thống HPLC 10A :

 Hệ thống HPLC 20A:

12


2.1.3. Vitamin C.
2.1.3.1. Vai trò:
13


- Vitamin C dễ dàng tham gia vào các phản ứng oxy hóa khử của quá trình
trao đổi chất nhờ khả năng cho và nhận H của nó. Vitamin C còn tham gia vao
quá trình trao đổi axit nucleic, quá trình xoy hóa các axit amin có nhân thơm.
- Vitamin C đảm bảo cho việc tổng hợp cá hormon của tuyến trên thận,
tuyến giáp trạng, đảm bảo việc chuyển hóa procollagen thành collagen. Vitamin
C cũng cần thiết cho quá trình hydroxy hóa các gốc prolin có trong collagen.
- Vitamin C là coenzym của enzym xúc tác cho phản ứng thủy phân một

số thioglycosit. Vitamin C còn hoạt hóa hàng loạt enzym :amylaza, arginaza,
proteinaza…
Vì thế, nếu thiếu vitamin C sẽ mắc bệnh hoại huyết, chảy máu ở lợi, răng,
lỗ chân lông hoặc ở nội quan.

Hình 2.4. Vitamin C
2.1.3.2. Xác định Vitamin C
a. Nguyên tắc:
Vitamin C (axit ascorbic) có phổ biến trong cơ thể động và thực vật. Trong
phân tử ascorbic chứa nhóm dienol (-COH=COH-) có tính khử mạnh vitamin C
dễ bị oxy hóa thành axit dehydroascorbic, phản ứng có tính thuận nghịch.
• Dựa trên tính khử mạnh của acid ascorbic người ta đã đề ra hàng loạt
phương pháp hóa học để định lượng nó. Tuy nhiên, cho kết quả chính xác nhất
và hay dùng nhất là phương pháp cho acid ascorbic khử muối natri của 2,6
diclophenolindophenol.

14


• Xác định vitamin C dựa trên nguyên tắc: vitamin C được chiết ra khỏi
lương thực, thực phẩm bằng acid acetic hoặc acid clohydric. Sau đó chuẩn độ
nước chiết trong môi trường axit (pH=3-4) bằng 2,6 diclophenolindophenol, rồi
tính ra lượng vitamin C.
b. Dụng cụ chất hóa học:
• Cân phân tích
• Bình định mức dung tích 100ml, 1000ml
• Cốc dung tích 100ml
• Bình nón dung tích 200ml
• Pipet các loại
• Microburet

• Giấy lọc
• Phễu thủy tinh, cối chày thủy tinh hoặc sứ, bột thủy tinh hoặc cát
sạcHCL 1% hay CH3COOH 5%, axit metaphotphoric 2% hay axit oxalic 1%
• Dung dịch oxalat amoni bão hòa, dung dịch hồ tinh bột 1%
• KI tinh thể, H2SO4 2%, axit ascorbic tinh thể( tinh khiết)
• Dung dịch muối Natri 2,6 diclophenolindophenol 0,001N
Cho 0,15g 2,6 diclophenonolindopgenol vào bình định mức dung tích
500ml thêm 350ml nước cất và tiếp đó dung dịch đẹm photphat có pH=6,9-7,0
cho tới vạch mức. vì trong dung dịch nước thuốc thử này bị phá hủy rất nhanh
nên phải pha trong dung dịch đệm. dung dịch đẹm có pH=6,9-7,0.
Thuốc thử 2,6 diclophenonolindophenol được bảo quản trong bình có
màu ở nơi tối.
c. Cách tiến hành
Chuẩn bị mẫu thử: tất cả các sản phẩm dạng lọc hoặc dạng bột đều phải
trộn đều nhưng không lắc để tránh lên bọt khí.
• Lượng cân sản phẩm lấy tùy thuộc vào hàm lượng vitamin Atamin C
của nó.
• Có thể dùng acid oxalic 1% để tráng cối và thêm đến vạch mức, hoặc
dùng acetat chì 5%(5ml) để kết tủa protein, loại trừ chất khử và sắc tố.
• Dùng pipet hút vào bình nón hoặc cốc nhỏ 5ml dịch lọc có chứa vitamin
Atamin C, thêm 5ml dung dịch oxalat amoni bão hòa, 10ml nước cất và định
phân bằng dung dịch 2,6 diclophenolindophenol 0,001N từ microburet cho tới

15


xuất hiện màu hồng bền (không mất màu trong 1 phút ). Trường hợp dung axit
oxalic thì không dùng thêm oxalate amoni nữa.
d. Tính kết quả:
Hàm lượng vitamin C (mg %) tính theo công thức:


X=

( a − b ) . f .V .100
5m

Trong đó:
a: Số ml 2, 6 diclophenolindophenol dùng định phân dịch chiết vitamin C
b: Số ml 2, 6 diclophenolindophenol dùng định phân mẫu kiểm chứng
(hỗn hợp các thuốc thử đem dùng )
f : Số mg axit ascorbic ứng với 1ml dung dịch 2, 6 diclophenolindophenol
v: tổng thể tích pha lỏng
m : lượng mẫu cân, g
5 : 5ml dịch lọc hút đem chuẩn độ
2.1.4. Vitamin b
* Xác định vitamin B1 bằng phương pháp so màu huỳnh quang.
 Vai trò, chức năng sinh học:
- Là tiamin (có nhóm amin và lưu huỳnh). Thường ở dạng
Tiaminpyrophosphat (TTP) làm coenzym. Có rất nhiều trong cám, men bia, gan,
thịt lợn.
- TTP là nhóm ngoại của enzym pyruvat decacboxylaza làm nhiệm vụ xúc
tác cho quá trình chuyển hóa axit pyruvic trong trao đổi gluxit, vì thế, thiếu
vitamin B1, axit pyruvic bị tích tụ, gây độc cho tế bào thần kinh, gây bệnh viêm
thần kinh, nặng hơn là tê phù, phù thủng B1 cũng rất cần cho cơ bắp.
 Phương pháp tiến hành
a. Nguyên tắc:
- Vitamin B1 (thiamin) có công thức cấu tạo như sau:

H


16


- Vitanmin B1 dạng estepirophotphoric là một tiền men cagacboxylaza
tham gia vào sự trao đổi gluxit.
- Thiamin là chất kết tinh không màu. Trong môi trường trung hòa và
kiềm, rất nhạy với nhiệt độ cao (dễ bị phân hủy hoặc tự phân hủy).
- Vitamin B1 bền trong môi trường axit, ở Ph = 3 nó không bị phân hủy
khi đun nóng tới 120 0C. Thiamin dễ tan trong trong nước, trong rượu etylic
loãng, trong rượu metylic, trong axit axetic và không tan trong cloroform, rượu
butylic, isobutylic, isoamylic ete petro, ete sunfuric. Thiamin rất nhạy với chất
oxy hóa với chất khử. Một điểm đặc biệt là khi bị oxy hóa nó biến thành
thiocrom. Chất này dưới tác dụng tử ngoại có màu huỳnh quang xanh. Đây là cơ
sở của phương pháp xác định vitamin B1 vì phản ứng oxy hóa vitamin thành
thiocrom xảy ra theo đúng tỷ lệ đương lượng: một phân tử thiamin tạo thành một
phân tử thiocrom.
- Để phản ứng trên có thể xảy ra, trước hết phải giải phóng thiamin ra
khỏi mẩu bằng chế phẩm men.
b. Dụng cụ, hóa chất:
- Cân phân tích
- Ống nghiệm
- Cối thủy tinh
- Nồi cách thủy
- Phểu thủy tinh
- Phểu chiết, bình định mức, máy huỳnh quang.
- Rượu butylic, isobutylic hoặc isoamylic. Các rượu này phải không phát
huỳnh quang. Có thể khử chất phát huỳnh quang bằng than hoạt tính (15gam
than cho một 1ml rượu) rượu trộn với than lắc 30 phút trên máy lắc,làm khan
bằng CaCl2 và cất ở nhiệt độ thích hợp.
- Chế phẩm men của vi khuẩn ti penicillum, khuẩn ti pencillium được sấy

khô ở nhiệt độ dưới 40o rồi chiết lấy men bằng cách nghiền khuẩn ti với một ít
dung dịch natri axetat
- Dung dịch vitamin B1 tiêu chuẩn.
- Dung dịch cơ sở (a) được pha như sau : hòa tan 10 gam tinh thể thiamin
vào 10ml axit clohydric dung dịch nồng độ 0.001N, chuyển toàn bộ dung dịch
vào bình định mức dung tích 100ml. Thêm nước cất đến vạch mức,lắc kĩ. Dung
dịch này được đặt trong chai màu, để chor mát tng 1 tháng không bị hư hỏng.
- Lấy 1ml dung dịch này cho vào bình định mức dung tích 100ml, them
nước cất đến vạch mức,lắc kĩ, 1ml dung dịch này chứa 1 µg thiamin.
17


- Dãy tiêu chuẩn (b) được chuẩn bị như sau : từ dung dịch trên lấy vào
một dãy ống nghiệm làn lượt 0,5;1;1,5 ; 2ml…(chứa 0,5;1;1,5;2 ¥ thiamin ) rồi
them vào 3,5;5;2,5;2,0 ml..nước cất và 1ml K3Fe(CN)6 dung dịch 1% (vừa điều
chế ). Cuối cùng cho vào mỗi ống 3ml natri hydroxit dung dịch 15%,lắc nhanh.
Mỗi ống lại được cho vào 10ml rượu butylic,lắc kỹ. để yên 2 phút, dung dịch sẽ
tách thành 2 lớp,tách bỏ lớp dưới. cho vào đó 1 gam natri sunfat khan. Dung
dịch rượu khan chứa thiocrom.
c. Cách tiến hành:
- Cân 5-10g mẫu, nghiền kỹ trong cối sứ với 10-15ml H2SO4 0,1N.
Chuyển cả vào bình định mức, thêm H2SO4 đến 75ml.Đặt bình vào cách thủy
sôi trong 45 phút, lắc đều. Để nguội bình và cho chế phẩm men vào. Đặt bình
vào máy điều nhiệt ở 400C trong 12 giờ. Sau đó lấy bình ra, thêm nước cất đến
vạch mức, lắc kỹ, lọc.
- Hút lấy 10ml nước lọc cho vào phễu chiết, thêm vào 20ml rượu butylic, lắc
mạnh 1-2 phút. Chiết tách lớp rượu ra. Thêm vào 1ml K3Fe(CN)6 dung dịch 1%
và 3ml NaOH dung dịch 15%, lắc nhanh hỗn hợpvà thêm vào 10ml rượu butylic,
lại lắc. Tách bỏ lớp nước, còn lớp rượu cho qua giấy lọc chứa Na2SO4 khan.
- Sau đó chuyển dung dịch vào ống nghiệm có cùng kích thước, cùng

dung tích và màu thủy tinh giống như dãy ống tiêu chuẩn.
- Đo cường độ huỳnh quang của mẫu thử so với dãy tiêu chuẩn trên máy
huỳnh quang.
- Đo cường độ huỳnh quang dưới ánh sáng tử ngoại của đèn thạch anh
thủy ngân, dùng kính lọc màu đen.
d. Tính kết quả:
Hàm lượng vitamin B1 (mg%) được tính bằng công thức:

X=

a.V .100
V1.G.100

Trong đó:
a: Lượng thiamin có trong ống tiêu chuẩn có màu huỳnh quang trùng với
ống c hứa mẫu thử, μg.
V: Dung tích bình đựng mức.
V1: Thể tích dung dịch thử lấy để oxi hóa, ml.
G: Lượng mẫu cân, g.
1000: Giá trị chuyển đổi từ μg sang mg

18


2.1.5 Vitamin B2
* Xác định vitamin B2 bằng phương pháp huỳnh quang
 Vai trò, chức năng sinh học
- Tên hóa học là riboflavin. Thường tham gia tạo coenzym FAD của
enzym oxy hóa khử, vận chuyển hydro, tham gia quá trình hô hấp của tế bào.
Thức ăn thường chứa đủ B2.

- Vòng isoalloxasin của vitamin B2 có khả năng nhận 2H ở vị trí nitơ số 1
và 10, ngược lại có thể loại bỏ 2H ở hai vị trí trên, vì thế vitamin B 2 dễ dàng bị
oxy hóa và bị khử. Đây chính là lý do nó có trong thành phần của FMN và FAD
vốn là nhóm ngoại của enzym dehydrogenaza yếm khí, xúc tác cho các phản
ứng oxy hóa khử của quá trình hô hấp.
- Nếu thiếu vitamin B2, thì toàn bộ quá trình trao đổi chất bị rối loạn , cơ
thể ngừng sinh trưởng, biểu hiện bệnh lí: thiếu máu, viêm màng nhày, rụng tóc,
nhiệt độ cơ thể hạ thấp, rối loạn hô hấp.
 Cách tiến hành
a. Nguyên tắc
Vitamin B2 (Riboflavin) chứa nhiều trong bia, gạo, bột mì, khoai tây và
trong các sản phẩm lương thực, thực phẩm khác.
Công thức hóa học của riboflavin như sau:

Riboflavin là một chất kết tinh màu vàng, vị đắng. Riboflavin liên kết với
axit photphoric trong thành phần của men flavin thuộc vào nhóm dehydraza hiếu
khí. Do vậy Vitamin B2 tham gia vào quá trình oxi hóa khử. Khi bị khử dạng
màu vàng vủa Vitamin B2 chuyển thành dạng không màu. Riboflavin có màu
huỳnh quang vàng xanh trong dung dịch nước trung tính. Khi bị axit hóa hoặc
19


kiềm hóa, màu huỳnh quang của riboflavin giảm dần rồi mất hẳn. Riboflavin bị
phân hủy trong môi trường kiềm, bền trong axit.
Đặt tính phát huỳnh quang của riboflavin là cơ sở của phương pháp định
lượng vitamin B2. Dựa vào việc đo cường độ huỳnh quang của dung dịch
vitamin B2 ta có thể xác định hàm lượng của chúng chứa trong thực phẩm.
Nhược điểm của phương pháp này là trong nước chiết các sản phẩm thực
phẩm ngoài vitamin B2 còn chứa một số chất khác cũng phát huỳnh quang.
Nhưng nhược điểm này có thể khắc phục được bằng cách đo huỳnh quang các

chất trong mẫu khử sau khi đã khử riboflavin bằng natri dithiosunfat.
b. Dụng cụ hóa chất
- Pipet, buret;
- Phễu thủy tinh;
- Cốc thủy tinh ;
- Bình nón;
- Cân phân tích;
- Nồi cách thủy;
- Cối thủy tinh;
- Máy huỳnh quang H Φ M;
- Bình định mức 100ml
- KMnO4 dung dịch 4%.
hoặc 250ml;
- Natri axetat dung dịch 2,5 M: hòa tan 340g natri axetat trong 1000ml
nước cất.
- Dung dịch thiếc clorua: hòa tan 10g SnCl4 trong 25ml HCl đậm đặc
(d =1,19). Dung dịch này được đụng trong ừ dung dịch này điều chế dung
dịch mới bằng cách pha 0,2ml với nước cất thành 100ml.
- Dung dịch natridithiosunfat: 0,25g Na2S2O4.2H2O hòa tan trong 10ml
Na2CO3 dung dịch 2%.
- Dung dịch K2HPO4 4M: 69,6g K2HPO4 hòa tan trong 100ml nước cất.
- Dung dịch đệm photphat (pH = 7-8);
- Chế phẩm men tripsin hoặc pancretin tinh khiết.
- Dung dịch riboflavin tiêu chuẩn: Cân 10g riboflavin tinh thể cho vào
bình định mức 250ml thêm acid HCl dung dịch 0,01M.
c. Cách tiến hành
Cân 5 – 10g sản phẩm lương thực, thực phẩm (gạo, quả,…) nghiền kỹ
trong cối thủy tinh với 20ml dung dịch đệm photphat ( pH = 7 – 8 ). Chuyển
toàn bộ vào bình định mức dung dịch 250ml, rồi thêm 100ml dung dịch đệm
nữa. Hỗn hợp được để đúng 40 phút trong nồi cách thủy đang sôi. Sau đó lấy ra

làm nguội đến 300C rồi đo pH bằng giấy thử pH. Lấy bình định mức ra, thêm
nước cất đến vạch mức, lắc kỹ, lọc qua giấy lọc khô.

20


Dùng pipet hút lấy 10ml nước lọc vào bình nón, thêm vào 5ml acid
tricloaxetic dung dịch 20% và để hỗn hợp 10 phút trong nồi cách thủy đang sôi
để giải phóng hoàn toàn riboflavin ra khỏi hỗn hợp ở dạng tự do. Sau khi làm
nguội, thêm vào dung dịch một lượng H 2HPO4 4M để đưa pH về 6.
Tiếp đó nhỏ vào bình nón từng giọt KMnO4 dung dịch 4% đến có màu
hồng nhạt. Để yên 10 phút, nhỏ vào bình nón vài giọt H 2O2 dung dịch 3% đến
mất màu hồng hoàn toàn. Cuối cùng thêm vào 0,2ml dung dịch thiếc clorua và
0,1ml dung dịch natridithiosunfat, lắc mạnh 20 phút. Lọc lấy dung dịch qua giấy
lọc khô cho vào 1 cốc khô sạch.
Đem nước lọc đo cường độ huỳnh quang trên máy huỳnh quang HФM.
Dung dịch mẫu thử và dung dịch riboflavin tiêu chuẩn được cho vào cuvet 0,1g
Na2CO3 và 0,1g Na2S2O4.2H2O và lại đo cường độ huỳnh quang. Cường độ
huỳnh quang chính xác của riboflavin đo bằng hiệu số.
d. Tính kết quả
Hàm lượng vitamin B2 (mg%) tính bằng công thức:

X=

(a − b).0, 4.V .100
C.V1.G.100

Trong đó:
a: Trị số máy khi đo cường độ huỳnh quang của dung dịch thử;
b: Trị số máy khi đo cường độ huỳnh quang của dung dịch đã khử

riboflavin.
c: Trị số máy khi đo cường độ huỳnh quang của dung dịch chứa 0,4 μg
riboflavin trong 1ml.
0,4: Lượng riboflavin của 1ml dung dịch tiêu chuẩn, μg.
V: Dung dịch bình định mức, ml.
V1: thể tích dung dịch mẫu thử hút từ bình định mức để thí nghiệm, ml.
G: lượng cân mẫu, g.
21


1000: giá trị để chuyển từ μg sang mg.

22


PHẦN 3. KẾT LUẬN
Vitamin nó có vai trò rất quan trọng quyết định đến dinh dưỡng và sự
sống của con người nhưng bên cạnh đó để có thể biết được như thế nào là
Vitamin tốt và hàm lượng như thế nào là đủ để tránh khỏi trường hợp dư thừa
vitamin thì phương pháp phân tích vitamin có vai trò rất quan trọng. Nếu không
có các phương pháp này thì quá trình sản xuất các sản phẩm thực phẩm khó xác
đinh được các hàm lượng có trong sản phẩm và người tiêu dùng cũng lo ngại về
các vấn đề bệnh tật do thiếu hoặc thừa Vitamin.
Trong khuôn khổ cho phép và quá trình tìm và đọc tài liệu còn hạn chế nên
nhóm chúng tôi khó tránh khỏi sai sót, mong cô và các bạn góp ý. Xin cảm ơn.

23