A-PHẢN ỨNG CHUỖI POLYMERASE(PCR):
I. ĐẠI CƯƠNG:

❖ Việc triển khai các ứng dụng của sinh học phân tử thường vấp phải trở ngại về

sổ
lượng vật chất di truyền .Các phương pháp tạo dòng in vivo tuy giải quyết được
vấn đề về
số lượng nhưng đòi hỏi thao tác phức tạp và thời gian dài .Sự ra đời của nhiều
phương
pháp khuếch đại in vitro có chọn lọc,trong đó nôi tiếng nhất phải ke đến phương
pháp
PCR,đã đảo lộn nguyên tắc của việc tạo dòng co điển ,mở ra những triển vọng ứng
dụng
to lớn .
❖ Bằng cách sử dụng enzyme DNA polymerase và Oligonucleotid tổng hợp
nhân
tạo
các mồi primer, một đoạn DNA bất kỳ có thể được nhân lên nhanh chóng hàng tỷ
lần
mà
không cần đưa vào tế bào vi khuẩn. Đó là kết quả tuyệt vời của PCR.
5'_________3'
5'_________3'5'_________3‘
❖ PCR (Polymerase
Chain
Reaction): phản ứng dây5'_________3‘
chuyền tồng họp nhờ
3'-------------5'
3'--------------5'3'--------------5'
3*-----------5*

5'_________3'
5'_________3'5'_________3'
3Ị
polymerase 3'-------------5' 3--------------- 3'--------------5’
°
do Karry Mullis và các cộng sự phát minh vào năm 1985. Từ một vi khuân có tính
chịu
nhiệtPCR
Thermus
Aquaticus
tạimã
YelloustonePark),
sốngdựa
ớ vùng
nước
là kỹ thuật
xử lý (được
in vitrotìm
cácthấy
chuỗi
hoá di truyền DNA,
trên cơ
sở
nóng,
phản
người
đã hợp
phânDNA
lập được
polymerase

ứng
sinh ta
tổng
theo Taq
3 trình
tự sau: cho phép ta khuếch đại một đoạn DNA
ớ1. Biến thành dây đơn (denature)
một
vùng
bất
kì
trong
hệ
gen
khi
trình
tự
hai
đầu
đoạn
DNA
đã
biết
có
tính
lập
đi
lập
lại
2. Phản ứng của primer gắn vào đầu dây chuỗi mã đối xứng với chuỗi mã trên

và dây
sổ
lượng
tăng lên(gọi
theolàhàm
mũ. anncaling) để có phân tử DNA mới. Kéo dài dây
template
tiếnsốtrình
❖ Dựa
vào
trình
tự
Nu
ở
hai đầu đoạn, các cặp oligonucleotic được tổng hợp
mới
nhờ
nhânprimer (extension)
tạo,
mỗi
oligo
tạo
liên
kết
bổ
sung
với
từng
sọi
đơn.Chúng

được
sử
dụng
làm
mồi
đế
Những phản ứng này được thực hiện nhờ polymerase như Taq polymerase và sự thay đổi
tổng
họp
chu kỳ nhiệt một cách hợp lý, đặc biệt là nhiệt độ cho denature và nhiệt độ cho
in vitro nhờ enzyme DNA polymerase.
annealing
❖ Như vậy, PCR là kỹ thuật xử lý in vitro các chuỗi mã hoá di truyền DNA bằng
cáchĨ.DNA polyiĩierase:
phát
cách đồng
loạt enzyme
trên các có
dâychức
đơn năng
DNA.tổng
Toàn
bộcác
tiếndây
trình
hoàn
❖ triển
DNAmột
polymerase
là một

hợp
đơnđược
DNA.
thiện
trong
do sựkiện
biếncho
chất
củanào
DNA
sự tác
của
đầusao
cácchép
dâyinđơn
điều
phép
đó, cần
tiến thiết,
trình tông
hợpđộng
DNA
nàyprimer
có thêtại
được
DNA
này.
vitro
❖ Polymerase được phân lập tùThermus aquaticus có khả năng là vật thể ổn
định về

TẮC CỦA
PCR
nhiệt độ,II.NGUYÊN
đó là Taq polymerase
vớiPHƯƠNG
hai thuận PHÁP
lợi chính:
• Hồi phục sau khi phục hồi nhiệt không cần kco dài.
• Enzyme này hoạt động ở nhiệt độ cao, lúc đó việc tác động của các
primer ở


■S PCR chuấn: DNA mục tiêu mớ dây đôi,sau đó 2 primer tác động ớ hai
đầu
dây đơn,rồi DNA mới tông hợp nhò' Taq với 4 deoxiribonucleotide
s PCR neo:chỉ cần một primer,một đuôi dG nhân tạo được gắn vào đầu 3’
của
DNA mục tiêu,DNA được khuếch đại nhiều lần nhờ một primer có chuỗi mã
đã
biết trước,và một primer thứ hai có oligo dc
s PCR đảo, người ta dùng nó để khuếch đại đoạn phân tử kế cận chuồi mã
DNA
đã biết trước,phân tử DNA này được phân cắt và nối lại bởi enzyme đế tạo
thành
một vòng tròn có tính chất monomer, sau đó DNA được khuếch đại nhờ một
primer tương đồng với đầu của chuồi mã đựơc biết trước
2. Thiểt kế chu kỳ vói nhỉêt đô tương thích

Nhiệt độ sử dụng trong phản ứng PCR phải được xác định
chính xác.

Mồi chu kỳ của PCR có ba nhièt độ cần được xác định như
sau:
• Thời kỳ biến tính DNA, tách dây đôi thành dây
đơn,
nhiệt độ được thiết kế là 94°c, với nhiệt độ này DNA sẽ tạo
ra
sợi đơn DNA, hoạt động như dây nền (template) cho quá
trình
tổng hợp DNA mới.
•
Thời kỳ lai giữa primer và
DNA (annealing), nhiệt độ
thay đổi 50-60°C. Nhiệt độ này tuỳ thuộc vào loại marker mà chúng ta đang sử
dụng,
với
chiều dài cụ thế của oligonucleotide. Chúng ta phải thử từng bước đế biết chắc
nhiệt
độ
cần được thiết kế là bao nhiêu.
• Thời kỳ kéo dài dây DNA mới được tổng họp nhò' Taq polymerase
(extension),nhiệt độ được thiết kế là 72°c.
Giai đoạn annealing là quan trọng nhất, bởi vì trong giai đoạn này, sự kiện sự
lai
DNA-DNA xảy ra. Neu nhiệt độ quá cao, không lai được DNA; nếu nhiệt độ quá
thấp,
việc
lai DNA sẽ bị nhiều lồi. Chính vì thế để thiết lập nhiệt độ cho chu kỳ PCR, người ta
xác
định nhiệt độ nóng chảy Tm với từng nhóm primer riêng biệt.
3. Chu kỳ khuếch đai


a Số chu kv
Thường dùng là 30 chu kỳ cho quá trình khuếch đại PCR. Neu thêm nhiều chu


mong muốn. Người ta cần có ethanol trong lần cuối của qui trình chuấn bị DNA.
Với
10% ethanol, nó vẫn chưa có thê gây ảnh hưởng đến hoạt động của Taq polimerase.
❖ Điều ghi nhận quan trọng là: phải có một mM EDTA trong chất đệm TE, trong
khi
sử dụng để hoà tan DNA.EDTA sẽ gắn với Mgí+, đe thể tích của DNA mục tiêu
không
vượt quá 1/15 của thể tích PCR
5.Primer và DNA
Trong PCR tiêu chuẩn, người ta cần có một căp mồi. Sự khuếch đại chuyên biệt nào đối
với một đoạn DNA cần nghiên cứu, đều phải tuỳ thuộc vào các cặp mồi tương xứng.c
ả
hai
yếu tố: chiều dài primer và thành phần C-G đều có ảnh hưởng quan trọng đổi với
nhiệt
độ
trong quá trình tác động ở đầu dây đơn. Nhiệt độ này là:
2x (A+T)+4x (G+C) +5°c.
Neu có 50%G+C, thì chiều dài của primer phải có kích thước tương ứng là 18-20
Nu.

Một qui trình PCR cần thiết đê khuếch đại một số lượng lớn chuồi DNA chuyên biệt gồm
3
giai đoạn, mỗi giai đoạn có 3 bước nhảy liên tiếp.
l.Biến tính (denaturation):

Bước đầu tiên trong hệ thống khuếch đại PCR là sự biến tính do nhiệt của
DNA
khuôn mẫu do sự tăng nhiệt độ trong ống nghiệm đến 95°c. Thêm vào đó, trong ống


nhiệt (e.g. Taq DNA polymerase chịu nhiệt được tách biệt từ vi khuẩn Thermus
aqaticus),
và bốn loại deoxyribonucleotide. Nhiệt độ là nhu cầu tối thiêu trong giai đoạn này.
2. HỒỈ tính (annealing):
Đối với bước thứ hai này, nhiệt độ của hỗn hợp giảm từ từ xuống 55°c. Trong
suốt
giai đoạn này, nhưng base mồi sẽ bắt cặp với mạch gốc theo nguyên tắc bổ sung.
3. Kéo dài (extension)
Nhiệt độ tăng đến 75°c, ở nhiệt độ này thuận lợi cho chức năng xúc tác của

• Đối vói một qui trình chuẩn thì chu kỳ 25-35 phải thực hiên trong điều kiện:


“Denature”
94-96°C
15 giây (hoặc lâu hơn)
“annealing”
55°C(50-56°C) 30giây
“extention”
72°c
1,5 phút
Chu kỳ đuợc kết thúc bằng một “extension”ở 72°c trong 1,5 phút. Sau đó
người
ta
cho dừng hẳn bàng cách tồn trữ sản phẩm PCR ở 4°c.

^ Phức tạp nhất là nhiệt độ trong giai đoạn “annealing”. Chúng ta phải điều chỉnh
để
có khuếch đại tốt nhất và ghi nhận được đa hình tốt nhất khi điện di trên gel.
^ Tóm lại trong qui trình chuẩn này, chúng ta cần tuân thủ các qui định sau:
■ Phuơng tiện và hóa chất:
Máy Thermal cycler (PE 9600 Perkin-Elmer)
Mẩu DNA ly trích lOOng/pl
Dung dịch stock của dNTP(mồi dNTP là 5 mM)
Taq polymerase (5Ư/pl Perkin-Elmer)
Dung dịch stock của lOxPCR buffer (buffer cuả Perkin-Elmercó 15mM
MgCl2,
500mM kCl. lOOmM Tris-HCl, pH 8,4, 0,1% gelatin,l% Triston X-100
DNA
1 pl
lOxdung dịch buffer
2,5 p
Mỗi primer lpl
Dung dịch stock dNTP
1 \x\
Taq polymerase
0,1
ịi\
Chu
kỳ nhiệt
trong
thí dụ
Thêm
nước
cất hai
lần, thermal

sao cho cycler
đủ
25 tìm
jnl đa hình của Sacl, clon BS3, 4kb
trong
nguời)
94°c trong 5 phút, theo sau là 30 chu kỳ
94 °c trong 30 giây
60 °Ctrong 30 giây
72 °c trong 1 phút
Giữ mẫu trong 4°c
■
■
■
■
■

Hạn chế:
1. Kích thưổc của trình tư cần khuếch đai là giới hạn đầu tiên: PCR cho kết
quả
tốt
với
những đoạn DNA có độ dài nhỏ hơn 1,5 Kb. Trong vài trường hợp PCR
không
hoạt
động
với nhừng đoạn lớn hơn 3Kb. Với những độ dài lớn hơn điều kiện tối ưu cho
phản
ứng
phải

được xác định qua thực nghiệm.
2. Mức đỏ ngoai nhiễm cao: nguồn ngoại nhiễm lớn nhất là các sản phẩm
khuếch
đại
của
những lần thao tác trước: việc mở nắp các ống nghiệm sau mồi lần khuếch đại
trong
khoảng không gian kín như phòng thí nghiệm khiến các phân tử đã được
khuếch
đại
thoát
ra khỏi ống nghiệm bay lơ lửng trong không khí sẽ bám vào tường, dụng cụ,
thiết
bị.
..dễ


Trước lần phản ứng kế tiếp, thêm vào dung dịch phản ứng enzyme
uracylglycosylase,
có tác dụng phân huỷ tất cả các DNA mang dUTP nhiễm từ lần trước đồng thời
enzyme
sẽ
bị phân huỷ bởi nhiệt ngay từ lần biến tính đầu tiên.
3. Sư kém trung thưc của quá trình tồng hợp bởi Taa polvmerase : việc tổng
họp
DNA
in vitro nhờ Taq polymerase có độ chính xác không cao: 2.1CT4.Trong một
phản
ứng
với

30
chu kì, tần suất sai sổ tổng thể 0,25%. Do đó bất kì một trình tự nào có được
từ
phương
pháp PCR đều cần được xác nhận lại bàng cách xác định trình tụ- của nó. Taq
polymerase
biểu hiện tính chính xác khá thấp in vitro, làm xuất hiện các đột biến ngẫu
nhiên
bên
trong
vùng khuếch đại, vì thế đoạn được khuếch đại phải được xác định trình tụ
càng
khó
nếu
kích thước lớn.
Ngày nay nhờ sự phát triển của khoa học công nghệ có thể làm đơn giản hoá
phản
ứng PCR cho phép nó được sử dụng rộng rãi trong hầu hết các phòng thí nghiệm sinh
học
phân tử như là một routine proccdure.
IV. THIẾT KẾ CÁC PRIMER
Việc chọn lọc primer nào đó là một thử thách cực kỳ quan trọng khi chúng ta
muốn
sử dụng PCR có hiệu quả và độ trung thực cao.
Nhàm đạt được thành công trong việc khuếch đại của PCR, chúng ta phải có
một
thiết kế chính xác về oligonucleotide primer.
Sequence của primer đuơc chọn chính xác kích thước, vị trí của sản phẩm PCR,
cũng
như nhiệt độ Tm vùng được khuếch đại. Primer được thiết kế đúng có thể giúp chúng

ta
tránh tạo ra những sản phẩm PCR không chuyên biệt, giống như hiện tượng phân biệt
giữa
cDNA và DNA của genome trong RNA-PCR.
4.1.Thông số CO’ băn đế thiết kể prỉmer
Mục đích của thiết kế primer là có được một cân bằng giữa hai kết quả: sự
chuyên
tính
và sự hiệu quả của PCR:
❖ Sự chuyên tính được xem xét trên cơ sở xuất hiện bao nhiêu lần hiện tượng
priming
nhầm trên tông số lần priming (sự lai giữa primer và dây template tại vị trí mục
tiêu
của
nó).
❖ Tính hiệu quả của một primer là làm thế nào tiếp cận với lý thuyết về kết quả
sản
phẩm, trong mồi chu kỳ PCR, một cặp primer có thể khuếch đại ra một sản phẩm.


tính giữa primer và dây template sẽ giảm. Người ta thường thiết kế primer có độ
dài
1824 mer.
❖ Mặt khác, primer càng ngắn, quá trình quấn đôi giữa primer và dây DNA càng
nhanh, tạo thành dây đôi ổn định trong tổng họp DNA.
❖ Thông thường, primer có 28-35 mer cần cho việc khuếch đại các sequence có
mức
độ di hop cao
• Có hai khả năng áp dụng trong thiết kế chiều dài của primer:
Khuếch đại nhhừng phần tử có tính đồng dạng (isoform)của protein hoặc một họ

protein trong cùng một loài sinh vật, cũng như cloning một gen của loài khác mà
sequence
của nó rất cần thiết cho nhà nghiên cứu (dveksler và ctv.1993)
Khuếch đại những sequence của virut như HĨV-1, mà sự biến thiên của
sequence,
sự
có mặt của sequence, sẽ xác nhận sự có mặt của bệnh do virut gây ra.
Trong cả hai trường họp, người ta đều nhờ phần mềm của máy tính đề thiết kế
primer,
nhằm so sánh tất cả các sequence có liên quan và mô tả vùng của DNA mục tiêu với
số
lượng thấp nhất sự biến thiên của chuồi mã.
Khi chọn lựa primer để khuếch đại DNA từ những loài sinh vật khác nhau, chúng
ta
nên
tránh chuồi mã ở vùng không giải mã được 5’-3’ của mRNA. Bởi vì nó có thể không
có
bất
cứ một mức độ tương đồng nào (homology)
• Vị trí đầu 3’ của primer nên được xác định cẩn thận, vì nó có tính chất quyết định
cho
sự
thành công của PCR. Khi chúng ta xác định được một amino acid, hai base đầu tiên
trong
codon của nó, hoặc base trong trường họp nó được mã hoá bằng codon đơn
(methionine
và
tryptophan), thì 2 hoặc 3 base đầu tiên này được dùng như đầu 3’.
Những cặp base hoàn chỉnh giữa những đầu 3’ của primer và template cho phép
chúng

ta
có được kết quả mong muốn và giảm thiểu tối đa hiện tượng không tương xứng
(mismatches) trong khoảng 5-6 nucleotide tại đầu 3’ của primer
Thông thường, sự thêm vào sequence không có liên quan tại đầu 5’ của primer vẫn
không
làm thay đôi quá trình annealing. Trong một vài trường hợp, khi số lượng base nhiều
lên
có
ý nghĩa, những base này không tương xứng với sequence của dây template, được
thêm
vào
primer. Sự khuếch đại 4-5 chu kỳ sẽ có thể hoàn tất, trong điều kiện nhiệt độ
annealing
thấp.
Đối với nhũng primer ngắn hon 20 mer, Sugg và ctv (1981) đã đề xuất một công
thức
tính Tm liên hệ với các base: Td=4(G+C)+2(A+T)


4.1.3. Hàm lươnọ GC và Tm
Primer của PCR phải duy trì được hàm lượng GC đến mức có thế được. Những
oligonucleotide có 20 base, với 50% G+C,thường có giá trị Tm trong khoảng 56620C,tạo
ra điều kiện để quá trình annealing đạt kết quả tốt. Hàm lượng GC và Tm phải khớp
với
một cặp primer sẽ được thiết kế. nếu giá trị Tm càng lớn, cơ hội cho priming nhầm
càng
cao.
Do đó khi thiết kế primer, chúng ta phải chú ý đến hàm lượng GC, đôi khi do làm nhiều
mẫu, chúng ta sẽ có những kinh nghiệm riêng trong thiết kế primer, nhất là việc
chuyển

đổi
sequence của RFLP sang STS marker.
4.1.4. Chon loc không dưa trên Computer
Primer phải được chọn lọc từ những vùng được cô tả rất kỹ ở đầu 3’và đầu 5’của một
scquence rất chuyên tính nào đó. Phương pháp thiết kế primer đơn giản ở đây là:
chọn
những vùng có thiếu một nucleotide đon nào đó.Phương pháp chọn lọc primer như
vậy
là
cách làm giảm cơ hội xay ra hiện tượng tương đồng primer-primer.một lần nữa,
chúng
ta
phải thận trọng cân nhắc về chiều dài cặp primer, hàm lượng base,đê giá trị Tm của
primer
xê xích trong vòng 2-3°C
4.2. Sử dung phần mềm đế thiết kế primer
Công thức đầu tiên của Suggs và ctv( 1981 Mà:20Cx(A+T)+4°CxíG+C)đã trở nên
phổ biến
nhờ tính đơn giản và tính chính xác của nó.
Hai chương trình sử dụng hơi khác nhau một chút về cách tính toán, nhung cùng
cho ra
một primer được chọn, nếu chúng ta nhập vào những thông số cơ bản giốnh nhau.
Những sai biệt do phép tính khác nhau dẫn đến thứ tự ưu tiên trong tiêu chuấn chọn lọc
đã
và đang được áp dụng.
Người ta thực hiện các phưong án đổ dự đoán giá trị Tm trên cơ sở các thông số nhiệt
động
học. Trong chương trình khác, người ta mô hình hoá nhiệt độ annealing dựa trên công
thức
được phát triển từ các đoạn phân tử DNA có độ dài hơn 100 nucleotide

(MeConaughy
và
ctv. 1969).Công trình nghiên cúư của Rychlik và ctv(1990)cho phép chúng ta mô
hình
hoá
về nhiệt độ annealing tối hảo của một cặp primer. Sau đó, Wu và ctv (1991)đã dựa
trên
chiều dài primer, hàm lượng GC,để mô hình hoá nhiệt độ tối hảo này.
Hầu hết các chương trình đều nhằm tìm một nhiệt độ annealing thích họp cho PCR.

V.CÁC CHỈ TIÊU ẢNH HƯỞNG ĐẾN PCR


1) DNA mẫu

Phản ứng khuếch đại tối ưu xảy ra trên DNA thật tinh sạch nhưng nhiều kỳ
thuật
chẩn đoán bằng PCR vẫn đạt kết quả tốt với DNA thu nhận trực tiếp từ dịch chiết tế
bào.
Lượng DNA mẫu sử dụng cũng có khuynh hướng giảm (1 |ig xuống còn 100 ng)
với
việc
sử dụng các polymerase cho hiệu quả cao. Hơn nữa việc, giảm lượng mẫu ban đầu
còn
hạn chế được khuếch đại “kí sinh” tạo những sản phẩm phụ không mong muốn.
Một
ưu
diêm khác của phương pháp PCR là cho phép khuếch đại cả những mẫu DNA
không
được bảo quản tốt, đã bị phân huỷ từng phần như trong các vết máu lâu ngày, tinh

dịch
đã khô, hoá thạch, tóc, móng tay,của người đã chết ....
2) Enzyme

Enzyme được sử dụng đầu tiên là đoạn Klenow của DNA polymerase I. vì đây là
không chịu nhiệt nên thao tác phức tạp và hiệu quả thấp ( phải thêm enzyme mới vào
phần phản ứng sau mỗi lần biến tính vì enzyme cũ đã bị phân huỷ do nhiệt, nhiệt độ
lai
thấp khiến sự khuếch đại ký sinh rất cao, ...). Phương pháp PCR chuyên sang một
bước
ngoặt mới cùng với sự phát hiện một DNA polymerase chịu nhiệt được tách chiết từ
một
vi
khuẩn suối nước nóng, Thermus aquaticus. En zym này - Taq polymerase không bị
phá
huỷ ở nhiệt độ biến tính và xúc tác sự tông hợp từ đầu đến cuối quá trình phản ứng.
Ngày nay, nhiều polymerase chịu nhiệt khác đã được đưa ra thị trường với nhiều chức
năng
chuyên biệt hay hoàn thiện hơn. Tth polymerase, một enzyme chiết tách từ Thermus
thermophilus, có khả năng hoạt động như một enzyme phiên mã ngược khi có mặt
RNA
khuôn và ion Mn++; nhưng với sự hiện diện của DNA khuôn và ion Mg++’ Tth pol
lại
xúc
tác phản ứng khuếch đại bản mẫu là RNA khuôn thông qua sự hình thành cDNA
3) Mồi và nhiệt độ lai

Mồi là chỉ tiêu quan trọng nhất đổ đạt được một sự khuếch đại đặc trung và có
hiệu quả
cao. Việc chọn mồi là giai đoạn quyết định của phương pháp PCR, và phải tuân

thủ một
sổ nguyên tắc:


Trong thực tế, người ta không vượt quá 40 chu kỳ cho một phản ứng PCR. Sở dĩ như vậy
là vì phản ứng PCR diễn tiến qua 2 giai đạn, trong giai đoạn đầu số lượng bản sao
tăng
theo cấp số nhân với tỉ lệ với lượng mẫu ban đầu, sau đó hiệu quả khuếch đại giảm
dần
vì
những nguyên nhân sau:
• Sự phân huỷ cạn và kiệt các thành phần của phản ứng.
• sự xuất hiện các sản phẩm phụ ức chế phản ứng.
• Các bản sao vừa được tổng hợp không két hợp với mồi mà bắt cặp với
nhau....
• Số chu kỳ cho một phản ứng tuỳ thuộc vào số lượng bản mẫu ban đầu. Ví
dụ, nếu
số lượng bản mẫu là 10“ thì cần 25-30 chu kì, nếu số lượng bản mẫu là 102
103
thì số chu kì phải là 35-40,...
6) Thiết bị và dụng cụ cho phản ứng PCR:

Thực chất một thiết bị dùng để tiến hành phản ứng PCR chỉ cần đáp ứng được yêu càu
thay
đổi nhiệt độ thật nhanh và chính xác. Các thiết bị hiện nay đã được cải tiến để tránh
tối
đa
sự bốc hơi nước trong quá trình phản ứng, hay cho phép tiến hành PCR ngay trên mô
tế
bào, ...Tuy nhiên, mỗi kiểu thiết bị có đặc điểm khuếch đại riêng nen mọi thí nghiệm

của
một nghiên cún cần được tiến hành trên cùng một loại thiết bị.
Hơn nữa, ống nghiệm dùng cho phản ứng của cùng một nghiên cứu phải thuộc cùng một
kiểu vì đặc tính truyền nhiệt của các ống này cũng như độ tiếp xúc giữa ống và bộ
phận
tạo
nhiệt của thiết bị có ảnh hưởng lớn đến quá trình khuýech đại.
VI.TỐI ƯU HÓA CÁC ĐIỀU KIỆN CHO PHẢN ỨNG PCR
Ĩ.Sequence của primer
Thông thường người ta cần có primer chuỗi dài cỡ 18 nucleotide trở lên, áp dụng
cho
genome của những sinh vật thuộc eukaryote, và primer ngắn -khoảng 10
nucleotidecho
những DNA được clone hóa như cosmid. Tuy nhiên tùy theo loại primer tương hợp
với
mục
tiêu lựa chọn marker phân tủ’ trong xét nghiệm PCR, người ta thường có những
primer
của
những marker có tính ngẫu nhiên như RAPD rất ngắn (10-16 mer), hoặc STS marker
cần
primer có độ dài 20-24 mer.
Tuy nhiên, chúng ta nên nhó' rằng, DNA không phải là chuồi mã của những
nucleotide một cách ngẫu nhiên, mà nó còn có đặc tính của những họ (gene families),


những máy thermal cycler được thiết kế cho phép chung ta đưa vào nhiều nghiệm thức
Td
đê xác định nghiệm thức tôi hảo.
3. Phàn ứng dung dich đêm


Một trong những ảnh hưởng có tính chất quyết định là nồng độ Mg2+,kề cả về tác dụng
chuyên biệt và kết quả PCR.môi trường có tính chất ion như vậy làm cho dung dịch
đệm
trở
nên năng động hơn rất nhiều, do đó nồng độ Mg2+ cao hay thấp đều tạo ra ảnh
hưởng
rất
khác nhau trong phản ứng PCR. nồng độ cao của Mg2+ sè làm cho phân tử DNA dây
đôi
ôn định hơn, và ngăn ngừa sự biến chất hoàn toàn (sự mớ dây đế cho dây đơn)của sản
phấm
trong mỗi chu kỳ, làm cho kết quả PCR ít hơn. Lượng dư thừa Mg2+ còn làm cho
hiện
tượng annealing giả xẩy ra thêm ổn định hơn, tại những vị trí không đúng của dây
đơn,cho
ra nhửng sản phẩm không mong muốn với số lượng khá lớn, nhung mức độ chuyên
tính
rất
thấp (Oste 1989)
Ngược lại, nếu nồng độ Mg2+quá thấp (<0,5pM),nó sẽ làm xấu đi quá trình
extension
(kéo dài chuỗi mã đối lập với dây gốc),trong đó Mg2 đóng vai co factor của Taq
polymerase. Một vài ion Mg2+ sè được kẹp giữ bởi Dntp trong phản ứng. Do đó,
người
ta
cần phải xác định nồng độ tối ưu của Mg2+ nhàm đảm bảo kết quả sổ lượng sản
phẩm
và
sự

chuyên tính của sản phẩm PCR. trong một vài vùng có tính chất recalcitrant nghĩa là
có
rất
nhiều cặp GC,thì chỉ cần có một khoảng biến thiên rất hẹp về nồng độ Mg2+,đủ cho
ra
kết
quả PCR và sự chuêyn tính mong muốn.
Môi trường đệm KC1 đã và đang được áp dụng rộng rãi, cũng có thế là buffer
rất
hữu
dụng cho kỳ thuật PCR. Tuy nhiên trong một vài loci, người ta thấy môi trường đệm
này
rất
khó dùng cho khuếch đại sản phấm, chỉ trừ Mg2+ đã được lựa chọn.
PCR của những loci giàu GC cho thấy: mức độ chuyên tính gia tăng khi
khuếch
đại
trong dung dịch đệm NaCl,nhờ sự biến chất hoàn toàn (complete denature) (Holm và
ctv
1991)
Người ta còn tìm thấy dung dịch đệm ammonium sulpate -dung dịch được sử
dụng
rất sớm -làm giảm những sản phẩm được phát triển một cách không hoàn toàn trong
PCR
với Taq. phương pháp này dùng đế phát hiện những băng có trọng lựơng phân tử thấp


này đủ đê kiêm soát sự chuyên tính của phản ứng khuêch đại.
Chúng ta không nên sử dụng nồng độ cao hơn 2,5nM của enzym
Ỏ.Nồng đô các primer

Lượng thừa đầu tiên của các primer ứng với dây đơn template (107) là nồng độ
primer
cần thiết, nó phải là hàng số. 95% các phân tử đầu tiên của primer vẫn còn duy trì sau
30
chu kỳ. trong hầu hết các ứng dụng PCR, hai primer F và R đều phải có nồng độ bàng
nhau.
Nồng độ sau cùng của mồi primer là 0,1 pM, tương ứng với 2,5 pmol(16,25 ng của
20mer)trong 20 pl dung dịch cacktail.nồng độ này pahỉ được điều chỉnh 0,5pM, tùy
thuộc
vào
locus nào đó cần được khuếch đại
. Những protocol trước đây khuyến cáo primer ở nồng độ 3pM, nhưng với nồng
độ
cao
như vậy không những không cần thiết mà còn tạo ra bất lợi, vì quá thừa primer, dẫn
đến
sự
hình thành hiện tượng primer dimer, và hiện tượng priming.
7.

Chất ổn đinh hoat đông của enzvme

Những hoạt chât ôn định hoạt động của enzyme (enzyme stabilizers) cũng
được
chú ý. Nhiều nhà sản xuất hóa chất đã xem xét gelatin hoặc Triston x-100 là 1 trong
những
buffer đễ tồn trữ enzyme . Có trường hợp người ta sử dụng cả hai làm dung dịch đệm.
Nhằm bảo quản và ôn định enzyme trong quá trình xử lý nhiệt của PCR, mỗi dung
dịch
đệm trong phản ứng đều chứa gelatin ở nồng độ 0,01% và Triston X-100 ở nồng độ

0,1%
(v/v).
8.SỐ lưong DNA
Phân tử DNA ở đây hiếu theo nghĩa “DNA template” (dây nền).
Thí dụ genome của người, DNA có 125 ng/25pl được sử dụng. Điều này tưng
ứng
với
0,063 attomoles của DNA (#10~9 mol)và ớ nồng độ 2,5fM. Khi khuếch đại vùng
mục
tiêu
từ
dây đơn DNA, số lượng của template được tính tóan trên cơ sở “moi”. Phép tính này
giúp
chúng ta xác định số lượng DNA cần phải có, số chu kỳ để tổng họp ra DNA với số
lượng
mong muốn.
Tính trung thực của việc khuếch đại nhiều ít tùy thuộc vào mức độ sai sót của
DNA
l.Phát hiện virus HIV:


Nguyên lý của kĩ thuật xét nghiệm băng PCR:tông hợp và nhân bản sao một đoạn DNA
đặc
hiệu HIV từ một tế bào nhiễm nhờ phát hiện đirợc bằng điện di gel thạch
agarose.,cho
kết
quả nhạy và đặc hiệu.
Có thể chẩn đoán sớm nhiễm HIV ở giai đoạn tiềm tàng, phát hiện HIV ở trẻ sơ sinh và
bà
mẹ bị nhiễm.

2. PCR sản xuất đột biến: dùng PCR đề xóa đi hoặc cấy ghép một đột biến
vào
phân
tử DNA mục tiêu; giúp nghiên cứu chức năng tương lai của các protein cuối cùng
3. Trong clonỉng tái tố họp: chỉ cần một vài tế bào đích ban đầu có thể dùng
đoạn
mồi
đặc hiệu đê tong hợp và khuếch đại đoạn gen muốn tìm thành hàng tỉ bản sao giống
hệt
nhau rồi đưa vào plasmid. lúc này plasmid mang đúng đoạn gen đích không thể lẫn
đoạn
gen khác. Vì vậy khi chuyển plasmid vào vi khuẩn không cần phải làm kỉ thuật chọn
dòng.
4. Nhân bản đoạn DNA mong muốn:từ một số lượng DNA với một cặp mồi
đặc
hiệu
có thể tổng hợp và khuếch đại đoạn DNA đích trong bộ gen phức tạp thành hàng ti73
bản
sao các đoạn DNA giống hệt nhau mà không cần phải li trích
5. Phát hiện vi sinh vật gây bệnh: bàng cách khuếch đại đoạn nucleotidc đặc
trung
của
vi sinh vật gây bệnh trong mẫu bệnh phấm thử nghiệm PCR có thê phát hiện vi sinh
vật
gây
bệnh với độ nhạy cực cao vàcòn phân loại kiều di truyền của vi sinh vật mà không
cần
nuôi
cấy.
Vì phản ứng PCR quá nhạy nên khi áp dụng chẩn đoán cần tránh hiện tượng

dương
tính
giả bàng cách thực hiện phản ứng PCR trong phòng thí nghiệm có tổ chức chặt chẽ,
các
giai
đoạn thí nghiệm thực hiện tại các khu vực riêng sử dụng nhiều vật liệu chỉ dùng một
lần
kết hợp nhiều phương pháp loại trừ ngoại nhiễm (phương pháp nội tại)
ó.Trong tiến hóa: nghiên cứu tiến hóa dựa trên cấu trúc phân tử của
protein:cytochrom,hemoglobin,ribonoclease
7. Phát hiện các khiếm khuyết về gen gây các bệnh di truyền hay ung thư, xác
định
dấu ấn di truyền, kĩ thuật PCR phát hiện dấu ấn di truyền đã có những đóng góp rất
lớn
trong khoa học hình sự
8. PCR vói việc định loại các mô: là một hứa hẹn đầy triển vọng do cho nhiều
thống
tin
hơn phương pháp miễn dịch học
B-REAL- TIME PCR


(virus) ớ mức độ một phân tử (copy) trên một mẫu trước khi xuất hiện các biếu hiện
sinh lý.
❖ Vào năm 1992 - 1993, Higuchi và các cộng sự đã tiên phong phân tích PCR kinetic
(PCR động) bằng cách thiết lập hệ thống phát hiện các sản phâm khuếch đại khi
các

sản


phẩm này được tích lũy. Hệ thống Real - time bao gồm máy luân nhiệt có hệ
thống
chiếu mẫu bàng tia uv và tín hiệu huỳnh quang được thu nhận qua CCD (charge
coupled device) camera. Ethidium bromide được thêm vào trong mồi hồn họp
phản

ứng

Real
- time
Khi khoa
có sựhọc
khuếch
số lượng
ADN
đôiReal
ngày
càng PCR,
tăng,
❖ Ngày
nay,PCR.
các nhà
khôngđại,
ngừng
cải tiến
kỹ sợi
thuật
- Time
đồng
thời phát minh ra các chất chỉ thị huỳnh quang có độ phát sáng cao: SYBR Green

I,
Real
time PCR
phương
pháp khuếch đại và đồng thời phát hiện đoạn ADN
FAM,- HEX,
TexaslàRed®,
Cy™5,...
chuyên biệt thông qua các chất chỉ thị huỳnh quang. Trong phản ứng Real - time
PCR,
quá trình nhân bản ADN đang diễn ra theo từng chu kỳ nhiệt được theo dõi trực
tiếp
(Newton c. R. and Graham A., 1997).
Real - time PCR gồm hai quá trình diễn ra đồng thời: nhân bản ADN bằng phản
ứng
PCR và đo độ phát huỳnh quang, độ phát quang này tỷ lệ thuận với số lượng đoạn
Dna
tạo thành. (Nguyễn Thái Thủy, 2003).
Máy luân nhiệt
im imktầliMMI -

Hình 2.8 Hệ thống Real - time PCR


,
,

V

-


'

'
J'.

| ‘ v

✓

>

-giữa' nông độ huỳnh quang đo đuợc và sô chu kỳ. Tại* vị trí
1 căt này, tín hiệu huỳnh
ÉO Hệ
thống này hoạt động theo nguyên tắc sau: nguồn sáng chiếu sáng qua kính lọc
quang
kích
vượt qua tín hiệu nền rõ rệt. Chu kỳ ngưỡng của mẫu và chuẩn được xác định tại vị
thích
và truyền đến mẫu đã được đặt trên máy luân nhiệt. Ánh sáng kích thích này
trí đó.
giúp❖ Đường chuẩn được hình thành dựa vào chu kỳ ngưỡng (đã được xác định
chất
ở
chỉtrên)
thị huỳnh quang tương ứng với số ADN đích trong ống phản ứng phát ra ánh
và
sáng.
Ánh

nồng độ bản sao của các chuấn đã biết. Chu kỳ ngưỡng của mẫu xét nghiệm được
sáng
đốihuỳnh quang này sẽ qua bộ kính lọc phát sáng. Kính lọc này sẽ chọn lọc các ánh
chiếu qua chu kỳ ngưỡng của các chuẩn nằm trên đường chuẩn biểu diễn mối quan
hệ
giữa log số bản sao ban đầu và chu kỳ ngưỡng. Kết quả đổi chiếu này sẽ cho giá trị
log

số

bản sao ban đầu của mẫu xét nghiệm qua phương trình Y = a.x + b (trục Y: chu kỳ
ngưỡng, trục X: log số bản sao ban đầu). Từ giá trị log số bản sao ban đầu này ta sẽ
quy
đổi ra sổ bản sao ban đầu của mẫu xét nghiệm.
❖ CHƯ KÌ NGƯỠNG Ct (Treshold Cycle):nơi mà tín hiệu huỳnh quang cao hơn

tín
hiệu nền một cách thấy rõ.Chu kì ngưỡng tương quan chặt chẽ với sổ lượng DNA
đích
ban đầu
rv/phưong pháp nhận tín hiệu Real -time khi phản ứng PCR đang diễn rai

III/Nguyên lý định lưọng của phương pháp Real-Time PCR:
❖ Đê định lượng số bản sao ban đầu của mẫu cần xét nghiệm, khi thực hiện định
lượng
qua Real - time PCR cần chạy kèm với các chuẩn đã biết chính xác số bản sao ban
đầu.
Khi phản ứng Real - time PCR kết thúc, giá trị chu kỳ ngưỡng của mẫu xét nghiệm



SYBR Green I gắn vào DNA mạch đôi và phát tín hiệu huỳnh quang ớ bước sóng
530
nm khi được kích thích bàng ánh sáng có bước sóng 490 nm. Mức độ huỳnh quang
tương
ứng với số DNA mạch đôi trong phản ứng. Đổi với SYBR Green I dừ liệu huỳnh
quang
được thu nhận trong giai đoạn kéo dài. SYBR Green I gắn vào DNA mạch đôi và
phát
huỳnh quang sáng gấp 50 đến 100 lần so với khi không gắn kết vào DNA.
Hạn chế của SYBR Green I trong phát hiện sản phẩm PCR khuếch đại là sự phát
hiện
DNA không đăc hiẽu. Do mọi phân tử DNA đôi hiện diện trong phản ứng đều được
định
lượng, bao gồm các sản phấm PCR không đặc hiệu và primer- dimer.
2/ Molecular Beacons prohe:
Molecular Beacons probe được đánh dấu íluorophore (F-chất chỉ thị huỳnh
quang)

ở

cuối đầu 5’và một phân tử quencher (Q-chất hấp thụ) ở cuối đầu 3’. Molecular
Beacons
probe gôm: trình tự probe bô sung với DNA đích (loop) và hai trình tự bên thân probe
(stem) với khoảng 5 nucleotide hay nhiều hơn. Trình tự hai bên thân probe (stem)
không

bổ

sung với ADN đích mà bổ sung lẫn nhau. Khi trình tự hai bên thân probe bắt cặp với
nhau,


SYBR Green I chèn vào DNA sợi đôi
Lần đầu tiên tiến hành Real-Time PCR, người ta dùng thuốc nhuộm Ethidium bromide,
sau
đó người ta dùng SYBR green, ...Khi mà DNA polymerase kéo dài phân tử thì các
phân

tử
Hình 2.11 Nguyên tắc của Molecular Beacons probe


PCR Product-Speciíìc Nucleotides
ị

1 1 1 1
Primer 1

PCR Product

Primer 2

TTTT^TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTn

Khi probe tự do tồn tại dưới cấu trúc này thì tín hiệu huỳnh quang từ F sẽ bị Q hấp
thu
KHÔNG PHÁT HUỲNH QUANG

=



Ghi nhận tín hiệu huỳnh quang ớ 55°c
PROBEimẫu dò probe là bất cứ cái gì mình đã biết trước về nó và dùng nó để dò
tìm
những cái có thể tương tác một cách có ý nghĩa với nó (probe). Ví dụ: một
oligo,một

đoạn

cDNA đã biết trình tự và được gắn huỳnh quang hay chất phóng xạ sẽ được dùng
làm
probe đổ đi dò tìm và phát hiện nhũng đoạn gen khác nếu có sự tương tác do có
trình

tự

bô sung với trình tự' của probe.
3/Fluorescence Resonance Energy Transfer ÍFRET nrobeRcó kiểu thiết kc

- Các phân tử cho và nhận phải ở gần nhau (cụ thể 10 - 100 A°).
- Phổ hấp thụ của vật nhận phải bao phủ phổ phát quang của vật cho.
- Hướng chuyển đổi giữa vật cho và vật nhận phải đổi diện nhau.

Hệ thống FRET dựa vào hai chất chi thị huỳnh quang, hai chất này khi ở gần nhau
sẽ

tạo

ra tín hiệu huỳnh quang chuyên biệt. Một chất đánh dấu huỳnh quang được kích thích
bởi
nguồn sáng và chuyển năng lượng cho chất đánh dấu huỳnh quang thứ hai. Chất đánh

dấu
huỳnh quang thứ hai này sẽ phát ra ánh sáng ở bước sóng khác để phát hiện. Probe lai
được
thiết kế ớ dạng một cặp - một probe đánh dấu với màu cho (3’ - Fluorescine), probe
còn

lại

được đánh dấu với màu nhận (5’ - Red 640 hay 5’ - Red 705). Khi hai probe bắt cặp
với
đoạn DNA đích thường chúng được tách riêng ra và bắt cặp vào ở vị trí cách nhau 1 5


Probe oligonucleotide gắn vào đoạn bên trong DNA đích. Probe này được đánh
dấu

ớ

đầu 5’ bàng chất nhuộm chỉ thị huỳnh quang - tluorescent reporter dye (gọi là
reporter)

và

chất hấp thụ - quencher ở đầu 3’. Reporter và quencher có phổ kích thích và phát
quang
trùng nhau. Nhò' đó tín hiệu huỳnh quang được hấp thu. Khi DNA đích tích lũy,
probe

gắn


vào DNA đích nhung chưa phát quang. Khi mạch bồ sung với mạch khuôn mà probe
bắt
cặp được kéo dài, Taq DNA polymerase tiến tới đầu 5’ của probe. Hoạt tính 5’->3’
exonuclease của Taq 4N polymerase sẽ phân cắt đầu 5’ đã được đánh dấu huỳnh
quang

của

probe. Do đó chất chỉ thị huỳnh quang - reporter được phóng thích ra khỏi sự bắt cặp
của
chất hấp thụ - quencher và tín hiệu huỳnh quang tăng lên. Mức độ huỳnh quang
tương

ứng

với số DNA chuyên biệt mong đợi. Khác với SYBR Green I, primer dimer và các sản
phẩm
DNA khuếch đại không đặc hiệu sê không cho tín hiệu huỳnh quang
Như vậy, tín hiệu huỳnh quang được ghi nhận trong giai đoạn kéo dài. Độ mạnh
tín

hiệu

huỳnh quang tích lũy tăng dần.
Tuy nhiên TaqMan probe cần phải đảm bảo


J' TT1TTTTT1TTTTTTT1TTTTTTTTTTTT1TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT s
@
Taq

Phưong pháp miễn dịch Phưong pháp PCR
Dựa trên protein
❖

Nguyên liệu

Dựa trên DNA/cDNA
Phân tích
End-point, xác định dương
tính hay âm tính5
--------------------------------------------------Nguyên5‘liệu
và thành phâm

Test định tính

Test định lượng(Real Time
v/ứng dụng:
Master
Không đủ nhạy và đặc
PCR)cũng được ứng dụng vào trong các lĩnh vực tương tự như PCR truyền
Real - timemix
PCR
hiệu
và mầu
nhạy,đặc
hiệuthu
và nhận
chínhtín
xáchiệu huỳnh quang tương ứng với số DNA đích ớ
thống.Rất

Nhò'
khả năng
Không mắc tiền
Mắc tiền
pha
cấp
số, Real - time PCR được mở rộng thêm nhiều ứng dụng mới và hiệu quả hơn PCR
truyền
thống (Applied Biosystems, 2004):
Biến tính
❖ Định lượng hàm lượng virus, mức độ nhiễm virus,vi khuấnxhấn đoán viêm gan
siêu
vi B, phát hiện nhanh vi sinh vật gây bệnh trong thực phẩm: Virio parahaemolyticus
và

Bắt cặp
Vibrio vulniĩicus gây bùng nổ ngộ độc thực phẩm,đặc biệt là thủy sản.
❖ Nối
Nghiên
dài cứu biểu hiện gen:

+Cho kết quả không những gen nào đang hoạt động mà còn định lượng mức
Thay
độ
biểu
mạch
* IMĨĨT"ĨĨTT1TTT
TTTTT
m
ill

H
lí
\>
hiệncủa gen đó
limlli I y r
+Tiếp cận phổ biến nhất là phối họp với phân tích microarray khi các nhà
2. Phân
cắtnghiên
Taq
Q^
\N^
>
cứu muốn
địnhhợp
lượngichính xác
biểu Ihiện
tâm hoặc khảo sát mô
3. Hoàn
tất tống
r~i.......I
I I Hcủa
I I Icác
H Igen
.....Iquan
IIIH
IIIIIIIII r
hình
1.

biếu hiện của nhiều gan thay đôi như thế nào liên quan đến một điều kiện thí

4. Phát hiện

r

TiIn111111111111111IM1111 í111111111111II1111nI I 5

CÁC GIẢI PHÁP REAL -TIME PCR:
❖

Theo dõi phản ứng PCR đang xảy ra

❖

Định lượng nồng độ DNA mẫu trước phản ứng bằng cách so sánh chu kì Ct

mẫu

với

Ct của các chuẩn đã biết trước nồng độ.số lượng DNA đích ban đầu càng nhiều thì
thời
điểm (Ct) phát hiện tín hiệu sản phẩm khuếch đại càng sớm.
❖

Dùng Melt Curve để xác định đặc tính khuếch đại:xem trong sản phẩm


Đối với tác nhân gây bệnh là virus, Real - time PCR đóng vai trò rất quan trọng
trong
phát hiện và định lượng tác nhân gây bệnh này. Đặc biệt Real-Time PCR có vai trò

trong
chẩn đoán viêm gan siêu vi:
•
Phát hiện và định lượng HBV để chỉ định điều trị đặc hiệu và theo dõi
điều trị
Phát hiện và định lượng HCV đế chỉ định điều trị đặc hiệu và theo dõi
điều trị
Vì sao phải sử dung REAL TIME PCR ?
Đây là phương pháp PCR định lượng chính xác nhất
Độ nhạy cao nhất
Độ đặc hiệu
Có thể nhiều hơn một loại gen cùng một lúc
Có thể dùng melt curve để xác định đặc tính của sản phẩm khuếch đại
Toàn bộ qui trình nhân bản và phát hiện diễn ra trong tube kín:rút ngắn thời gian, hạn chế
nhiễm chéo
VT/ƯU nhuọc điếm: định lượng chính xác số DNA tham gia phản ứng, quan sát trực tiếp
•

tiến trình khuếch đại đang diễn ra theo từng chu kỳ khi phản ứng Real - time PCR
xảy

ra.

Ngoài ra, Real - time PCR còn thê hiện một sô ưu diêm nôi bật:
-

Không cần điện di sau khi thực hiện phản ứng Real - time PCR.

-


Quy trình đơn giản, tiến trình thực hiện nhanh, rút ngắn thời gian cho kết
quả.,có

thể

lượng nhiều hơn một loại gen cùng một lúc.
thành khá cao.

Chẩn đoán phân tử
Phân biệt Allelic/SNP
ứng dụng hiệu quả trong trị liệu
thuốc.
❖
❖
❖

định