HƯỚNG DẪN THỰC HIỆN THỬ NGHIỆM MÔI TRƯỜNG NUÔI NGHIỆM MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY VI SINH VẬT
Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (254 KB, 19 trang )
ISO/TS 11133-2
HƯỚNG DẪN THỰC HIỆN THỬ
NGHIỆM MÔI TRƯỜNG NUÔI
CẤY VI SINH VẬT
Lĩnh vực áp dụng
• Các nhà sản suất môi trường thương mại
• Đơn vị sản suất môi trường cung cấp cho
bên thứ 3
• Các PTN tự tổng hợp môi trường
Các chỉ tiêu cần kiểm soát
•
•
•
•
•
•
•
Thể tích, độ dày của môi trường
Màu sắc và sự đồng nhất
Độ bền của gel agar/gelatin
Độ ẩm
pH
Khả năng đệm
Độ vô trùng
Các chỉ số chất lượng về sự phát
triển của vi sinh vật
• Độ vô trùng
• Chỉ số phát triển của vi sinh vật
• Sự biểu hiện ổn định tính chất sinh lý/sinh
hóa của VSV
• Khả năng kháng khuẩn
Kiểm soát độ vô trùng
• Số lượng mẫu:
• ít nhất 1 ống/đĩa hay 1% ở đầu lô pha chế
• ít nhất 1 ống/đĩa hay 1% ở cuối lô pha chế
• Ủ
• ít nhất là 18h/37oC
• Hoặc ở điều kiện sử dụng của môi trường
Chỉ số phát triển của VSV
• Chỉ số phát VSV của môi trường
• Chỉ số tăng trưởng (productivity - Pr)
• Chỉ số chọn lọc (Selectivity)
• Phương pháp xác định thông qua kỹ thuật
• Định tính
• Định lượng
• Bán định lượng
Chỉ số tăng trưởng Pr
• Công thức tính
Ns
Pr =
No
– No: Tổng số khuẩn lạc đếm trên MT tham chiếu.
• No ≥ 100 CFU
– Ns: Tổng số khuẩn lạc đếm trên MT thử nghiệm.
– Pr MT không chọn lọc ≥0,7; Pr MT chọn lọc ≥0,1
• Tham khảo ISO/TS 11133-2, Annex B
Chỉ số chọn lọc SF
• Công thức tính
Sf = Do - Ds
– Do: Số khuẩn lạc phát triển trên môi trường tham
chiếu ở độ pha loãng cao nhất.
– Ds: Số khuẩn lạc phát triển trên môi trường thử
nghiệm ở độ pha loãng cao nhất.
Ds và Do được biểu diễn ở dang log10
• Tham khảo ISO/TS 11133-2, Annex B
Phương pháp đánh giá chỉ số phát
triển của môi trường VSV
• Khi nào cần đánh giá chỉ số phát triển?
• Một lô môi trường mới
• Thay thế loại MT cũ bằng MT mới có chức năng tương
đương
• Thay đổi nhà cung cấp
• Chủng VSV dùng cho thử nghiệm
• Chủng phù hợp với môi trường (dùng cho xác định chỉ số Pr)
• Chủng không phù hợp với MT cần thử nghiệm (xác định Sf)
– Sử dung ít nhất 2 chủng
Mật đô vi sinh vật cho thử nghiệm
Productivity
• Thử nghiệm chỉ số tăng trưởng - Pr
– Thử nghiệm định lượng: 102cfu/đĩa
– Thử nghiệm định tính hay bán định lượng:
• 103 – 104 CFU/đơn vị cấy
– Thử nghiệm định tính cho MT lỏng:
• 10 – 100 CFU/đơn vị cấy
• Thử nghiệm chỉ số chọn lọc Sf
• 104 – 106 CFU/đơn vị cấy
Phương định lượng trên đĩa
• Thích hợp cho tất cả các loại môi trường agar
Chọn VSV
Chọn số lượng
Cấy vào môi trường đối chứng /
kiểm tra
Ủ ở trong cùng điều kiện
Đếm số khuẩn lạc xuất hiện trên
MT thử nghiêm / đối chứng
Tính các chỉ số
Phương pháp bán định lượng
• Chọn chủng VSV với mật độ 104-106
CFU/ml
• Que cấy vòng 1ul
• Góc giữa que cấy và mặt thạch: 20 – 30 O
Cách cấy bán định lượng
Sinh khối xuất hiện kín đường cây: 1
1
2
3
A
Xuất hiện khoảng nửa đường: 0,5
Xuất hiện < 1/2 đường: 0
4
16
B
15
14
8 7 6 5
D
13
Chỉ số phát triển
12
11
10
C 9
- Chủng VSV mục tiêu: Gl ≥ 6
- Không phải VSV mục tiêu: có
thể bị ức chế hoàn toàn
- Khuẩn lạc phải đặc trưng cho
chủng
Cách cấy định tính
• Sử dụng để kiểm tra môi trường rắn
Các chủng VSV thử nghiệm
khác nhau
-Điểm 0: VSV không mọc
- Điểm 1: VSV mọc yếu
- Điểm 2: VSV phát triển tốt
-Chỉ số chấp nhận:
-VSV đích: phải đạt 2 điểm
-VSV khác: 0 - 1 điểm
Phương pháp kiểm soát môi
trường nuôi cấy lỏng – định lượng
• Bước thực hiện
– Cấy
•
•
•
•
Trích 10ml MT thử nghiệm và đối chứng
Với VSV mục tiêu: cấy 10-100cfu
Với VSV không phải mục tiêu: cấy >1000cfu
Cấy hỗn hợp: cấy 10-100cfu VSV mục tiêu và >1000cfu VSV
không phải mục tiêu
(không sử dụng môi trường đối chứng)
– Ủ ở điều kiện sử dụng của MT
– Trích mẫu cấy trãi trên môi trường agar không chọn
lọc
– Đếm khuẩn lạc xuất hiện
•
Phương pháp kiểm soát môi
trường nuôi cấy lỏng – định lượng
• Diễn giải kết quả
– Môi cấy riêng lẻ và so với môi trường đối
chứng
• VSV mục tiêu: Pr ≥ 0,1
• VSV không mục tiêuSf ≥ 2
– Nuôi cấy hỗn hợp: đa số phải là VSV mục tiêu
– Yêu cầu trên mỗi MT
• VSV mục tiêu: mật độ đạt > 106 cfu/ml
• VSV không mục tiêu: không quá 104 cfu/ml
Phương pháp kiểm soát môi trường
nuôi cấy lỏng – bán định lượng
• Qui trình
– Cấy
• Trích 10ml MT thử nghiệm và đối chứng
• Với VSV mục tiêu: cấy 10-100cfu
• Với VSV không phải mục tiêu: cấy >1000cfu
– Ủ ở điều kiện thích hợp
• VSV mục tiêu: trãi 10 µl lên MT rắng chọn lọc đặc
trưng
• VSV không mục tiêu: trãi 10 µl lên MT TSA
Phương pháp kiểm soát môi trường
nuôi cấy lỏng – bán định lượng
• Diễn giải kết quả
– Với VSV mục tiêu: xuất hiện ít nhất 10 khuẩn
lạc đặc trưng trên MT rắn chọn lọc
– Với VSV không mục tiêu: không nhiều hơn 10
khuẩn lạc trên TSA
Phương pháp kiểm soát môi trường
nuôi cấy lỏng –định tính
• Cấy trực tiếp VSV vào môi trường thử
nghiệm
• Diễn giải kết quả
• Không đục: 0
• Đục nhẹ: 1
• Đục: 2
Môi trường đạt yêu cầu khi đạt độ đục là: 2
