Céng hoµ x∙ héi chñ nghÜa viÖt nam
Bé n«ng nghiÖp vµ ph¸t triÓn n«ng th«n

10 tcn

tiªu chuÈn ngµnh

Quy tr×nh chÈn ®o¸n bÖnh cóm gia cÇm

Hµ néi - 2005


Quy trình chẩn đoán bệnh cúm gia cầm
I. Phạm vi áp dụng
Quy trình này đợc áp dụng để chẩn đoán bệnh Cúm gia cầm tại các phòng xét
nghiệm chẩn đoán bệnh động vật
II. Khái niệm
Bệnh cúm gia cầm do virus cúm type A, thuộc họ Orthomyxoviridae gây ra cho các
loài gia cầm và chim hoang dã. Bệnh có nhiều dạng khác nhau: có dạng tỷ lệ chết rất cao,
có dạng không có triệu chứng.
Virus Cúm type A có thể gây nhiễm cho gia cầm, lợn, ngựa và các loài khác kể cả
con ngời. Virus cúm type A có 16 subtype kháng nguyên H (Haemaglutinin) và 9 subtype
kháng nguyên N (Neuraminidase). Sự kết hợp của 2 loại kháng nguyên bề mặt này tạo nên
nhiều chủng virus cúm khác nhau.
III. Lấy mẫu và bảo quản
Bệnh phẩm phát hiện virus là dịch ngoáy ổ nhớp, họng, khí quản (swab), các phủ
tạng (Não, phổi, khí quản, lách,ruột..).
Bệnh phẩm phát hiện kháng thể là huyết thanh gia cầm nghi nhiễm cúm hoặc huyết
thanh gia cầm sau khi tiêm vắc xin.
Chi tiết về cách lấy mẫu và bảo quản bệnh phẩm xem phần phụ lục
IV. Máy móc Dụng cụ Hoá chất Nguyên liệu

1. Máy móc
* Máy móc chung
- Tủ lạnh âm -15 đến -20oC
- Tủ lạnh thờng +2 đến +8oC
- Tủ ấm 37oC
- Nồi đun cách thuỷ (water bath)
- Buồng cấy vô trùng (BSC-Bio-safety cabinet)
- Máy hút chân không
- Máy ly tâm lạnh (ống 15 ml)
- Máy trộn ống nghiệm (vortex mixer)
- Máy ly tâm ống nhỏ (microcentrifuge)
* Máy móc thực hiện phản ứng huyết thanh học
- Máy lắc đĩa (orbital shaker)
- Máy đọc ELISA
* Máy móc thực hiện PCR
- Máy nhân gien (Thermal cycler)
- Máy ly tâm spinner
- Hệ thống điện di
- Hệ thống chụp ảnh điện di
- Buồng thao tác PCR (PCR work station hoặc PCR chamber)
2. Dụng cụ:
- Bình tam giác
- ống đong thuỷ tinh

1


- Cốc có mỏ
- ống nghiệm
- Lọ chắt huyết thanh

- ống eppendorf 1,5 ml (Rnase/Dnase free)
- Máng trộn chất phản ứng (reagent trough)
- Pipet thuỷ tinh: 1, 5 và 10 ml
- Micropipet đơn: 0,5-10, 5-40, 40-200, 200-1000 àl
- Micropipet nhiều đầu (8-12): 5-50, 50-300 àl
- Đầu típ các cỡ 10, 20, 100, 200 và 1000àl sử dụng cho micropipet (có lọc và không
lọc)
- Cối chày sứ
- Cát sạch để nghiền bệnh phẩm
- Dao, kéo, panh kẹp
- Găng tay cao su không bột hoặc găng nitrile
- Đĩa 96 giếng đáy chữ V
- Đèn soi trứng
- Kim 22 G, 11/2 inch
- Syringe 1 ml
- Dùi đục trứng
- Keo dán
3. Hoá chất
* Hoá chất thông thờng
- Nớc cất hoặc nớc khử ion
- Na2HPO4
- Na2HPO4.H2O
- Na Cl
- HCl
- NaOH
* Hoá chất cho PCR
- Cồn Ethanol 70%, cồn Ethanol tuyệt đối
- Trizolđ LS reagent hoặc Trizolđ reagent
- Chloroform
- Isopropanol

4. Nguyên liệu
4.1. Nguyên liệu cho phân lập và phản ứng HA, HI
- Trứng gà có phôi 9- 10 ngày tuổi, khoẻ mạnh
- Kháng huyết thanh chuẩn H1-H16 (ví dụ kháng huyết thanh H5N1
A/Chicken/scot/59)
- Kháng nguyên chuẩn H1-H16 (ví dụ kháng nguyên H5N1 Weybridge UK)
- Men xử lý huyết thanh RDE (Receptor Destroying Enzyme)
- Hồng cầu gà 0,5%
- Kháng sinh

2


4.2. Nguyên liệu cho RT-PCR
- Kít chiết tách RNA của virus (Qiagenđ Rneasy Extraction cat # 74104 50 prep
hoặc #74106 250 prep)
- Kít RT-PCR OneStep Qiagen (hoặc kit Invitrogen Superscript One-step RT-PCR)
- Thạch điện di
- Marker (100 bp DNA ladder)
- RNA đối chứng dơng tính
- PBS 0,01M pH 7,2
- Nớc cất đã xử lý DEPC
V. Các phơng pháp chẩn đoán
Sơ đồ chẩn đoán bệnh cúm gia cầm

Kiểm tra lâm
sàng

Đặc điểm dịch
tễ học


Lấy mẫu bệnh phẩm
(huyết thanh, swab, phủ tạng..)

Phát hiện
kháng thể (HI)

Phát hiện virus

Phân lập virus

RT-PCR (RRT-PCR)

(-)

(+)

(-)

Phân lập
lần 2

Giám định

Phân lập
virus

(HI)

Kết luận bệnh


(+)

3


1. Kiểm tra một số đặc điểm dịch tễ học, triệu chứng bệnh tích
1.1. Một số đặc điểm dịch tễ hoc
Bệnh Cúm gia cầm có tính lây truyền rất nhanh và mạnh.
Chim hoang dã đợc coi là nguồn truyền lây mầm bệnh. Chim mắc bệnh truyền
virus qua nớc dãi, dịch nớc mũi và phân.
Chim và gia cầm mẫn cảm có thể bị nhiễm bệnh khi tiếp xúc trực tiếp với chim mắc
bệnh hoặc gián tiếp qua các bề mặt nhiễm bẩn.
Ngoài ra một số loài khác cũng có thể bị mắc bệnh: ngời, lợn, ngựa..
1.2 Triệu chứng
- Gia cầm bị xù lông, ủ rũ, bỏ ăn, giảm đẻ.
- Đầu, mặt sng, phù quanh mắt. Mào, tích sng, xuất huyết
- Mắt bị viêm kết mạc và có thể xuất huyết
- Chân giữa vùng bàn và khuỷu bị xuất huyết
- Có triệu chứng hô hấp
- Con vật mắc bệnh thờng chết trong vòng 24-48 giờ sau khi xuất hiện các triệu
chứng đầu tiên
1.3. Bệnh tích
- Xuất huyết tràn lan ở các cơ quan nội tạng
- Gia cầm phù thũng dới da vùng đầu, cổ và ngực
- Miệng chứa nhiều dịch
- Khí quản xuất huyết chứa nhiều dịch nhày
- Đờng tiêu hoá xuất huyết
- Gà đẻ buồng trứng xuất huyết
2. Chẩn đoán phòng thí nghiệm

2.1. Phát hiện kháng nguyên
2.1.1. Phơng pháp phân lập virus cúm trên trứng gà có phôi
a. Chuẩn bị bệnh phẩm trớc khi phân lập:
- Dịch ngoáy ổ nhớp, họng, khí quản:
+ Lắc mạnh ống chứa tăm bông dịch ngoáy bằng máy lắc vortex mixer
+ Bỏ tăm bông của ống dịch ngoáy
+ Bổ sung 1/10 lợng kháng sinh đậm đặc 10X (xem phụ lục), lắc đều
+ Để mẫu lắng cặn khoảng 30 phút ở nhiệt độ phòng
Mẫu đã sẵn sàng để tiêm truyền.
- Tổ chức phủ tạng:
+ Nghiền bệnh phẩm bằng cối chày sứ vô trùng thành huyễn dịch 10% với dung dịch
vận chuyển hoặc bằng PBS 0,01M pH7,2
+ Bổ sung 1/10 lợng kháng sinh đậm đặc, chuyển sang ống ly tâm. Ly tâm với tốc
độ 400g (2.000 vòng/phút) trong 10 phút.
+ Thu dịch nổi.
b. Tiến hành phân lập:
- Chọn trứng có phôi 9-10 ngày tuổi khoẻ mạnh, 3 trứng/bệnh phẩm
- Lau trứng bằng cồn 70% và đục lỗ nhỏ phía trên buồng hơi
- Dùng syringe 1 ml lắp kim và hút dịch bệnh phẩm (đã xử lý ở trên) tiêm vào xoang
niệu mô với lợng 0,2 ml/trứng

4


- Gắn vết tiêm bằng keo dán
- ấp trứng tiếp 2-3 ngày ở nhiệt độ 370C
- Theo dõi sau khi tiêm, soi trứng ngày 2 lần. Những trứng chết đợc cất vào tủ lạnh
40C để kiểm tra.
c. Thu hoạch nớc trứng sau khi phân lập:
- Trứng chết hoặc sống đợc cất vào tủ lạnh 40C qua đêm hoặc ít nhất 4 giờ trớc khi

thu hoạch.
- Lau trứng bằng cồn 70%
- Dùng panh và kéo vô trùng cắt vỏ trứng, bộc lộ buồng hơi, gạt màng xoang niệu
mô sang bên.
- Thu dịch niệu mô vào ống nghiệm. Thu hoạch riêng trứng sống và chết.
2.1.2. Giám định virus phân lập
a. Kiểm tra nớc trứng bằng phản ứng HA
- Nhỏ 25 àl PBS 0,01M vào đĩa 96 giếng chữ V từ giếng thứ 1 đến giếng 12 của mỗi
hàng
- Cho 25 àl dịch niệu mô vào giếng thứ 1
- Pha loãng kháng nguyên bằng cách chuyển 25 àl dịch niệu mô từ giếng thứ 1 sang
giếng thứ 2 và tuần tự đến giếng 11 thì bỏ đi 50 àl.
- Nhỏ thêm 25 àl PBS vào các giếng
- Nhỏ 25 àl hồng cầu gà 1% (v/v) vào tất cả các giếng trên.
- Lắc đĩa bằng máy hoặc bằng tay
- ủ đĩa phản ứng ở nhiệt độ phòng, thời gian khoảng 40 phút.
* Đọc kết quả:
Hiệu giá HA của virus đợc tính ở độ pha loãng kháng nguyên cao nhất còn hiện
tợng ngng kết hồng cầu.
Ví dụ: Nếu ở độ pha loãng 1/128 còn có ngng kết thì hiệu giá HA là 1/128.
- Nếu HA(+) dơng tính, chứng tỏ có virus. Tiếp tục giám định bằng phản ứng HI
với kháng huyết thanh chuẩn của một số subtype H virus Cúm A và kháng huyết thanh
chuẩn Newcastle để xác định loại virus phân lập.
- Nếu HA(-) âm tính mà phôi chết, có bệnh tích phôi, lấy nớc trứng tiêm truyền lần
2.
- Nếu HA(-) âm tính, phôi phát triển bình thờng, có thể tiêm lại hoặc không.
Bảo quản virus phân lập đợc ở 700C.
b. Giám định virus phân lập bằng phản ứng ngăn trở ngng kết hồng cầu - HI
- Pha kháng nguyên 4HA/25 àl: Lấy độ pha loãng cuối cùng có phản ứng ngng
kết hồng cầu chia cho 4.

Ví dụ: Hiệu giá HA của dịch niệu mô là 1/128
Đơn vị 8 HA = 128: 4 = 32.
Nh vậy sẽ trộn 1 phần dịch nớc trứng với 31 phần PBS để đạt đợc dung dịch
kháng nguyên 8HA.
- Chuẩn độ kháng nguyên 8 HA:
Sau khi pha, kháng nguyên 4HA phải đợc chuẩn độ lại.
Tiến hành: Nh phản ứng HA.

5


Đọc kết quả:
+ Pha chuẩn: Kết quả ngng kết xảy ra ở 2 giếng đầu.
+ Pha không chuẩn:
Kháng nguyên đặc: Nếu ngng kết đến giếng thứ 3 tức là thừa kháng nguyên. Nh
vậy, kháng nguyên 8HA phải đợc pha loãng (có thể gấp đôi) để có ngng kết đến giếng
thứ 2.
Kháng nguyên loãng: Nếu ngng kết đến giếng thứ 1 tức là thiếu kháng nguyên, có
thể thêm một lợng kháng nguyên (bằng với lợng kháng nguyên pha ban đầu) để có ngng
kết đến giếng thứ 2.
- Tiến hành phản ứng HI: Trên 1 đĩa có thể tiến hành phản ứng HI với nhiều kháng
huyết thanh của các subtype khác nhau
+ Nhỏ 25 àl PBS vào các giếng của đĩa 96 giếng
+ Nhỏ tiếp 25 àl kháng huyết thanh vào giếng đầu tiên
+ Pha loãng kháng huyết thanh theo cơ số 2, bằng cách chuyển 25 àl kháng huyết
thanh từ giếng 1 sang giếng 2 và tuần tự đến giếng 11 và bỏ đi 25 àl cuối cùng.
+ Nhỏ 25 àl kháng nguyên 4HA đã chuẩn bị vào các giếng từ giếng 1 - 11. Thêm 25
àl PBS vào hàng đối chứng hồng cầu (giếng 12)
+ Lắc đĩa và ủ ở nhiệt độ phòng 30 phút
+ Nhỏ 25 àl dung dịch hồng cầu vào tất cả các giếng của đĩa, lắcđều.

+ Để đĩa ở nhiệt độ phòng 40 phút. Đọc kết quả
* Đọc kết quả:
- Phản ứng (+) dơng tính: Hồng cầu lắng xuống đáy. Nh vậy, virus phân lập và
kháng huyết thanh chuẩn tơng ứng với nhau.
- Xác định subtype: Một virus phân lập đợc xác định subtype khi nó phản ứng với
một kháng huyết thanh chuẩn hiệu giá cao hơn 4 lần so với các kháng huyết thanh chuẩn
khác. Hiệu giá càng cao chứng tỏ sự tơng đồng của virus phân lập với kháng huyết thanh
chuẩn càng lớn.
2.1.3. Phơng pháp RT-PCR
a. Chiết tách RNA.
Có thể chiết tách RNA bằng bộ kít hoặc phơng pháp chiết tách Trizol.
Các mẫu swab nên chiết tách bằng kít, khi sử dụng nên theo hớng dẫn của nhà sản
xuất (có thể sử dụng bộ kít Qiagenđ Rneasy Extraction cat # 74104 50 prep hoặc #74106
250 prep).
Chiết tách bằng Trizol:
Cho 0,75 ml Trizolđ LS reagent (hoặc 1 ml Trizolđ reagent) + 0,25 ml dịch
bệnh phẩm(0,1 ml dịch bệnh phẩm nếu dùng Trizolđ reagent) vào ống 1,5 ml.
Lắc đều và để ở nhiệt độ phòng 5 phút.
Thêm 0.2 ml chloroform vào mỗi ống. Lắc mạnh trong 15 giây và để ở nhiệt độ
phòng 5 phút.
Ly tâm ống ở tốc độ 12.000 g trong 15 phút ở 4C.
Chuyển phần nớc (khoảng 500 àl) sang ống microtube mới.
Thêm 0.5 ml Isopropanol và lắc đều. Để 5-10 phút ở nhiệt độ phòng.

6


Ly tâm ống ở tốc độ 10.000 g trong 5 phút ở 4C. Bỏ dung dịch trong ống đi.
Rửa RNA đóng ở đáy ống bằng cồn 80%, lắc mạnh và ly tâm với tốc độ 10.000
g trong 5 phút ở 4C.

Bỏ dung dịch trong ống và làm khô RNA 10 phút ở nhiệt độ phòng và hoà tan
lại với 30 àl nớc cất không có Rnase hoặc nớc cất đã xử lý DEPC.
b. Tiến hành phản ứng RT-PCR
- Công thức pha: Công thức này có thể thay đổi cho phù hợp với từng loại primer và
từng loại kít RT-PCR khác nhau. Dới đây quy trình giới thiệu 2 bộ kit.
+ Công thức áp dụng cho kít RT-PCR 1 bớc của hãng Qiagen.
H2O
5X Buffer
dNTP
Enzyme mix
Primer forward
Primer reverse
Mẫu RNA
Tổng cộng

12 àl
5 àl
1àl
1àl
0,5 àl
0,5 àl
5 àl
25 àl

+ Công thức áp dụng cho kít RT-PCR của hãng Invitrogen
H2O
2X Reaction mix
RT/plat Taq mix
Primer forward
Primer reverse

Mẫu RNA
Tổng cộng

6 àl
12,5 àl
0,5 àl
0,5 àl
0,5 àl
5 àl
25 àl

- Chu trình nhân gien:
1) 600C 1 phút
2) 420C 10 phút
3) 500C 30 phút
4) 950C 15 phút
5) 940C 30 giây (tách sợi)
6) 500C 30 giây (gắn Primer)
7) 720C 1 phút (kéo dài)
8) Chu trình 35-40 vòng
9) 720C 10 phút
10) Giữ ở 40C
Quy trình nhân gien này áp dụng cho primer H5 (F 936 và R 1299) và N1 (F6 và
R595), đối với các cặp primer khác quy trình có thể thay đổi cho phù hợp
c. Chạy điện di:
- Chuẩn bị thạch agarose 1,5% pha trong dung dịch TAE hoặc TBE có Ethidium
Bromide (10 àg/àl)
- Đổ thạch vào khuôn điện di (có lợc)

7



- Thạch khô, rút lợc ra và cho mẫu vào các giếng (5 àl sản phẩm PCR + 2àl dung
dịch loading buffer).
- Sử dụng Marker trọng lợng phân tử (thang 100 bp)
- Chú ý khi chạy PCR phải có mẫu đối chứng dơng và đối chứng âm đi kèm (mẫu
đối chứng âm tính có thể là nớc cất sạch)
d. Đọc kết quả:
- Mẫu dơng tính: Xuất hiện vạch giống với mẫu đối chứng dơng tính.
- Mẫu âm tính: Không có vạch
Đánh giá kết quả: Có virus Cúm hoặc virus Cúm thuộc subtype nào dựa vào primer chạy
mẫu.
2.1.4. Phơng pháp Realtime RT-PCR
Phơng pháp này có giá trị chẩn đoán nh phơng pháp RT-PCR. Quy trình
Realtime RT-PCR (RRT-PCR) trình bày trong phần phụ lục.
2.2. Phát hiện kháng thể
2.2.1. Phản ứng HI phát hiện kháng thể subtype H5 (hoặc các subtype khác )
Huyết thanh kiểm tra: Huyết thanh gà không cần xử lý bằng RDE, huyết thanh vịt,
ngan có thể xử lý bằng RDE để chống hiện tợng ức chế ngng kết không đặc hiệu và xử lý
hồng cầu để chống hiện tợng ngng kết hồng cầu giả. (các phơng pháp xử lý huyết thanh
xem phần phụ lục)
a. Chuẩn bị kháng nguyên:
- Chuẩn độ kháng nguyên Xác định hiệu giá HA (phản ứng ngng kết hồng cầu
HA) xem phần 2.1.2.a.
- Pha kháng nguyên chuẩn 8HA/50 àl: Xem phần 2.1.2.b.
Chú ý: Trớc khi pha cần tính lợng kháng nguyên dùng cho phản ứng:
1 mẫu huyết thanh kiểm tra cần 175 àl kháng nguyên. Tính lợng kháng nguyên cần
dùng cho số mẫu huyết thanh cộng thêm 1ml để đảm bảo lợng kháng nguyên dùng cho
phản ứng.
Ví dụ: 30 mẫu huyết thanh kiểm tra: 5,25ml (5.250 àl)+ 1ml(thêm) = 6,25ml.

- Chuẩn độ kháng nguyên 8HA trớc khi tiến hành phản ứng HI (phụ lục II.3.3)
b. Phản ứng HI:
- Nhỏ 25 àl PBS vào các giếng của đĩa 96 giếng
- Nhỏ tiếp 25 àl kháng huyết thanh vào giếng đầu tiên
- Pha loãng kháng huyết thanh theo cơ số 2, bằng cách chuyển 25 àl kháng huyết
thanh từ giếng 1 sang giếng 2 và tuần tự đến giếng 11 và bỏ đi 25 àl cuối cùng.
- Nhỏ 25 àl kháng nguyên 4HA đã chuẩn bị vào các giếng từ giếng 1 - 11. Thêm 25
àl PBS vào hàng đối chứng hồng cầu (giếng 12)
- Lắc đĩa và ủ ở nhiệt độ phòng 30 phút
- Nhỏ 25 àl dung dịch hồng cầu vào tất cả các giếng của đĩa, lắcđều.
- Để đĩa ở nhiệt độ phòng 40 phút. Đọc kết quả
Đọc kết quả:

8


Phản ứng (+) dơng tính: Hồng cầu lắng xuống đáy.
Hiệu giá HI của mẫu đợc tính ở độ pha loãng huyết thanh cao nhất còn có hiện
tợng ức chế ngng kết hồng cầu. Huyết thanh đợc coi là dơng tính khi có hiệu giá huyết
thanh 1/16. Huyết thanh đối chứng âm tính phải có hiệu giá 1/4
Chú ý: Khi kiểm tra huyết thanh các loài khác không phải là gà nên có 1 giếng chỉ
có huyết thanh và hồng cầu để kiểm tra hiện tợng ngng kết hồng cầu không đặc hiệu.
Nếu phát hiện thấy có ngng kết hồng cầu không đặc hiệu xảy ra với mẫu huyết thanh nào
cần xử lý lại mẫu huyết thanh đó và kiểm tra lại bằng phản ứng HI.
2.2.2. Phản ứng ELISA
Hiện nay trên thị trờng có nhiều bộ kít ELISA thơng mại. Các bộ kit này chỉ phát
hiện đợc kháng thể gia cầm với kháng nguyên Nucleocapsid, tức là chỉ phát hiện đợc
kháng thể cúm A mà không phân biệt đợc subtype của kháng thể có trong huyết thanh.
Khi sử dụng kít ELISA nên áp dụng theo quy trình kèm theo.
2.3. Chẩn đoán phân biệt

Chẩn đoán phân biệt với các bệnh sau đây:
- Bệnh Niu cát xơn
- Bệnh Gumboro
- Bệnh Dịch tả vịt
- Bệnh Tụ huyết trùng
VI. Kết luận
- Nếu kết quả phân lập dơng tính virus, giám định HI dơng tính với kháng huyết
thanh chuẩn, kết luận dơng tính virus cúm
- Nếu kết quả RT-PCR (RRT-PCR) dơng tính, kết luận dơng tính virus cúm
- Nếu gia cầm cha tiêm phòng, phát hiện có kháng thể cúm, kết luận gia cầm đã
nhiễm virus cúm.
- Nếu kết quả phân lập âm tính, RT-PCR (RRT-PCR) âm tính, kết luận âm tính virus
cúm

9


Phụ lục
I. Lấy và Bảo quản bệnh phẩm
1. Lấy mẫu:
- Dịch ngoáy họng, khí quản: Đa tăm bông vào sâu trong họng rồi ngoáy thu lấy
dịch nhày, sau đó từ từ rút ra rồi đa vào ống chứa dung dịch bảo quản, bẻ que vừa với
chiều dài của ống, đóng kín nắp.
- Dịch ngoáy ổ nhớp: Cho que ngoáy sâu vào hậu môn gia cầm, ngoáy quanh thành
hậu môn, đa vào ống chứa dung dịch bảo quản nh trên.
- Mẫu phân: Dùng tăm bông ngoáy trực tiếp vào phân tơi ở chuồng gà, rồi cho vào
ống chứa dịch bảo quản.
- Mẫu tổ chức: Lấy kéo cắt phần tổ chức cần lấy cho vào túi nilon hay hộp nhựa
sạch, bảo quản lạnh. Mẫu tổ chức nhỏ có thể cho vào dung dịch bảo quản.
- Mẫu huyết thanh: Lấy 3-5 ml máu gia cầm vào ống nghiệm, để nghiêng, chờ máu

đông chắt lấy huyết thanh.
Bệnh phẩm sau khi cho vào dung dịch vận chuyển có thể bảo quản ở 40C từ 1-2
ngày, nếu bảo quản lâu hơn nên giữ ở nhiệt độ -200C.
Mẫu huyết thanh có thể để ở nhiệt độ 40C trong vòng 1 tuần, nếu bảo quản lâu hơn
nên giữ ở nhiệt độ -200C.
Mẫu đợc chuyển tới phòng xét nghiệm trong điều kiện lạnh (phích đá), càng sớm
càng tốt, có phiếu gửi bệnh phẩm kèm theo.
2. Môi trờng bảo quản bệnh phẩm
Bệnh phẩm là dịch ngoáy ổ nhớp, họng, khí quản đợc bảo quản trong dung dịch vận
chuyển. Có thể sử dụng môi trờng 199 hoặc môi trờng glycerol có bổ sung kháng sinh,
bảo quản ở 40C từ 1-2 ngày, nếu lâu nên giữ ở nhiệt độ -200C.
- Môi trờng 199 chứa 0,5% BSA (Albumin huyết thanh bò)
Bổ sung kháng sinh
Penicillin G
2.000.000U/lít
Streptomycin
200 mg/lít
Polymyxin B
2.000.000 U/lít
Gentamicin
250 mg/lít
Nystatin
500.000 U/lít
Ofloxacin HCl
60 mg/lít
Sulfmethoxasole
200 mg/lít
- Môi trờng Glycerol
+ Pha chế PBS
NaCl

8g
KCl
0,2 g
Na2HPO4
1,15 g
KH2PO4
0,2 g
Nớc cất vđ
1000 ml

10


+ Hấp vô trùng (1210C/15) phút, bổ sung kháng sinh (nh trên) và trộn với glycerol
theo tỷ lệ 1:1
Ngoài ra có thể sử dụng các môi trờng bảo quản khác nh: Muối đệm Hank, môi
trờng M.E.M, PBS, Tryptose Phosphate broth, Veal Infusion Broth, Sucrose-phosphate
buffer. Các dung dịch này có thể đợc bổ sung bovine serum albumin (BSA), gelatin 0,51%, các chất kháng sinh, kháng nấm.
II. Chuẩn bị các dung dịch và xử lý huyết thanh
1. Dung dịch PBS 0,01M pH7.2
1,096 g
Na2HPO4
0,316 g
NaH2PO4.H2O
Na Cl
8,5 g
Nớc cất
1 lít
Chỉnh pH = 7.2 bằng NaOH 1N hoặc HCl 1N, hấp vô trùng, bảo quản 40C không
quá 3 tuần.

2. Dung dịch nớc muối sinh lý 0,85%:
8,5 g NaCl trong 1 lít nớc cất.
Hấp vô trùng, bảo quản 40C không quá 3 tuần.
3. Dung dịch hồng cầu gà 0,5%:
- Máu gà trống khoẻ mạnh đã trởng thành, không có kháng thể cúm và newcastle.
- Dùng bơm tiêm 5 10 ml hút sẵn 1ml (10 % thể tích) dung dịch chống đông (Natri
Citrat 4%, Alserver) rồi lấy máu gà cho máu vào ống nghiệm.
- Ly tâm 1000 1500 vòng/phút, trong 15 phút, đổ bỏ huyết tơng, cho thêm nớc
sinh lý (NaCl 0,85%) vào hồng cầu, lắc đều. Ly tâm nh trên 3 4 lần để rửa hồng cầu. Sau
lần ly tâm cuối hút bỏ nớc ở trên.
- Pha hồng cầu thành huyễn dịch 0,5% bằng cách pha 0,5 ml hồng cầu với 99,5 ml
nớc muối sinh lý.
- Bảo quản huyễn dịch hồng cầu ở nhiệt độ 4 80 C. Hồng cầu sau khi pha có thể
dùng trong 4-5 ngày (nếu dung dịch hồng cầu bị dung huyết loại bỏ không dùng).
4. Chuẩn độ ngợc kiểm tra kháng nguyên 4 HA
1

2

3

4

5

6

7

8


9

10

11

12

HA

A

1

B

2

C

4

D

8

E

16


F

32

G

64

H

11


1. Nếu là 1, thêm 7 lợng kháng nguyên (KN) cha pha loãng nữa (ví dụ nếu đã sử
dụng 0,1ml KN trớc đó, thì thêm 0,7ml KN nữa
2. Nếu là 1 1/2, thêm 5 lợng KN cha pha loãng nữa
3. Nếu là 2, thêm 3 lợng KN cha pha loãng nữa
4. Nếu là 2 1/2, thêm 2 lợng KN cha pha loãng nữa
5. Nếu là 3, thêm 1 lợng tơng đơng KN cha pha loãng nữa
6. Nếu là 3 1/2, thêm 1/2 lợng KN cha pha loãng nữa
7. Nếu là 4, đạt tiêu chuẩn
8. Nếu là 4 1/2, thêm 1/2 lợng PBS nữa
9. Nếu là 5, thêm 1 lợng tơng đơng PBS nữa
10. Nếu là 5 1/2, thêm 2 lợng PBS nữa
11. Nếu là 6, thêm 3 lợng PBS nữa
12. Nếu là 6 1/2, thêm 5 lợng PBS nữa
5. Kháng huyết thanh chuẩn:
- Kháng huyết thanh chuẩn chế trên các loài nh thỏ, dê, cừu... cần đợc xử lý bằng
RDE (Receptor Destroying Enzyme) trớc khi xét nghiệm.

- Kháng huyết thanh chế trên gà không cần xử lý bằng RDE. Tuy nhiên, nếu phản
ứng cho kết quả không rõ ràng, kháng huyết thanh có thể xử lý RDE để khẳng định kết quả
dơng tính.
- Hoàn nguyên kháng huyết thanh và bảo quản ở nhiệt độ -200C
a. Xử lý kháng huyết thanh vô hoạt yếu tố ức chế không đặc hiệu:
Trộn 3 phần RDE với 1 phần kháng huyết thanh (vd: 0,9 ml RDE+0,3 ml huyết
thanh)
ủ ở nhiệt độ 370C trong nồi đun cách thuỷ (water bath) qua đêm.
Sau ủ tiếp ở nồi đun cách thuỷ nhiệt độ 560C/30 phút để vô hoạt RDE còn d.
Kháng huyết thanh đã xử lý để nguội cho thêm 6 phần nớc muối sinh lý (0,3 ml
HT + 1,8mlSL), độ pha loãng cuối cùng của kháng huyết thanh sẽ là 1/10.
b. Xử lý huyết thanh chống hiện tợng gây ngng kết hồng cầu giả.
Hiện tợng gây ngng kết hồng cầu giả có thể xử lý bằng cách hấp phụ huyết thanh
kiểm tra với hồng cầu gà. Thêm 25 àl hồng cầu đặc vào 500 àl huyết thanh, lắc nhẹ và để ở
nhiệt độ phòng trong 30 phút, sau đó ly tâm ở tốc độ 800 g trong vòng 2-5 phút. Thu lây
huyết thanh đã hấp phụ.
III. Công thức một số cặp mồi (primer)
Stt
Cặp mồi
Trình tự chuỗi
Kích thớc
1
2
3
4
5
6

12


H5-219f
H5-515r
IVA-D150-H5f
IVA-D151-H5r
AI N1-f6
AI N1-595
NP1200f
NP 1529r
M52C
M253R
H5F 936
H5R 1299

GAG TGA AGC GTC TCA TTT TG
GAT CTT CTT GGT TGG TAT TAT GTA GCT CC
GGA ATG CCC CAA ATA TGT GAA ATC
TCT ACC ATT CCC TGC CAT CC
AGC AGG AGA TTA AAA TGA ATC CAA
CTG GAC CAG AAA TTC CGA TTG
CAG RTA CTG GGC HAT AAG RAC
GCA TTG TCT CCG AAG AAA TAA G
CTT CTA ACC GAG GTC GAA ACG
AGG GCA TTT TGG ACA AAK CGT CTA
GCC ATT CCA CAA CAT ACA CCC
TAA ATT CTC TAT CCT CCT TTC CAA

296
150
586
329

201
363


V. Kỹ thuật Real-time RT-PCR
Phát hiện virus cúm gia cầm và giám định Các subtype H5 và H7 từ mẫu bệnh phẩm
1. Dụng cụ
- ống 25 àl Smart Cyclerđ (catalog #900-0022 hoặc 900-0003, Cepheidđ Smart
Cycler, Sunnyvale, CA)
- Giá ống phản ứng PCR làm lạnh đợc và máy li tâm ống nhỏ. Cả 2 thiết bị này
đợc cung cấp kèm theo hệ thống máy Smart Cyclerđ
- Hệ thống bơm hút chân không 24 van QiaVacđ có khả năng hút 18-20 lít/phút.
2. Nguyên liệu
- Nớc cất vô trùng (Rnase-free)
- RNA đối chứng dơng tính M, H5 và H7 (đợc NVSL cung cấp)
- Cồn tuyệt đối
- Isopropanol, 99+% tinh khiết
- Chloroform, 99+% tinh khiết
- Trizolđ LS reagent (Invitrogen, cat #10296-010 hoặc 10296-028)
- Kít chiết tách Qiagenđ Rneasy Extraction (cat # 74104 50 prep hoặc #74106 250
prep)
- Kit RT-PCR 1 bớc Qiagenđ (cat # 210210 hoặc 210212) hoặcSuperscriptđ RTPCR One-Step RT-PCR với Platinium Taq DNA Polymerase (cat @10928-034 hoặc 10928042, Invitrogenđ).
- Mẫu dò và primer
Có thể đặt primer và mẫu dò: Integrated DNA Technologies, ( />hoặc Operon ( />Bảng trình tự chuỗi của mẫu dò và Primer cho RRT-PCRphát hiện cúm gia cầm
Đặc hiệu
Trình tự chuỗi
M+25*
M
(cho bất kỳ 5 Primer
M+64*

cúm A)
Mẫu dò
M-124*
3Primer
H7+ 1244*
H7
5 Primer
(Bắc Mỹ)
H7+1281*
Mẫu dò a
H7-1342*
3Primer
H5+1456*
H5
5 Primer
H5+1637*
Mẫu dò
H5-1685*
3Primer

5-AgA TgA gTC TTC TAA CCg Agg TCg-3
5-FAM-TCA ggC CCC CTC AAA gCC gA-TAMRA-3
5-TgC AAA AAC ATC TTC AAg TCT CTg-3
5-ATT ggA CAC gAg ACg CAA Tg-3
5-FAM-TAA TgC TgA gCT gTT ggT ggC-TAMRA-3
5-TTC TgA gTC CgC AAg ATC TAT Tg-3
5-ACg TAT gAC TAT CCA CAA TAC TCA-3
5-FAM-TCA ACA gTg gCg AgT TCC CTA gCATAMRA-3
5-AgA CCA gCT ACC ATg ATT gC-3


- Rnase Inhibitor, 40 unit/àl (Promega, cat # N2511 hoặc N2515)

13


- MgCl2, 25 mM (Promega, cat # A3511 hoặc A3513)
- Đệm TE pH 8.0, 1X, (Promega #V6231 hoặc V6232)
- 14.3 M *-mercaptoethanol (-ME) (Sigma M6250) chú ý: độc, phải sử dụng
buồng hốt, đeo găng.
- Hạt chất phản ứng M và H5 cho AIV RRT-PCRđã đợc chuẩn bị bởi Cepheidđ để
sử dụng cho các xét nghiệm M và H5. Mỗi Hạt chất phản ứngđủ cho 4 phản ứng loại 25àl .
Mỗi giọt chứa primer và mẫu dò đặc hiệu, KCl, MgCl2, và đệm HEPES. Thêm vào đó giọt
M gồm cả chất điều khiển trong (IC). Mục đích của IC là phát hiện 1 âm tính giả tạo ra từ
các chất ức chế không đặc hiệu của quá trình nhân gen.
Chất điều khiển trong M là một RNA chuỗi đơn đã phiên mã dài 228 bazơ. Nó chứa
chuỗi bổ sung với primer tiến M ở đầu 5 và primer lùi ở đầu 3, và 1 chuỗi bên trong
(internal) để gắn vơi mẫu dò IC. Hạt M gồm có 1 mẫu dò đánh dấu FAM để phát hiện gen
M, và mẫu dò đánh dấu Cal-Flour Red 610 cho IC.
Hạt chất phản ứng H5 gồm có 2 primer tiến, 1 để phát hiện AIV H5 dòng Bắc
Mỹ và 1 để phát hiện AIV H5 dòng Âu-á. Chất phản ứng H5 1 mẫu dò H5 đánh dấu FAM
phát hiện đợc cả 2 dòng. Chất phản ứng đợc chia vào các ống 0,5 ml có thể sử dụng để
hoàn nguyên. Chất phản ứng đợc sử dụng với dNTP và enzyme của kít Qiagenđ RT-PCR
onestep. Chất phản ứng có thể bảo quản trong túi thiếc ở 40C trong 6 tháng. Không cởi bỏ
túi nếu cha sử dụng.
* Chú ý khi sử dụng hóa chất này.
3. Chuẩn bị thực hiện kỹ thuật Real-time RT-PCR
Chú ý: Cần phải có các khu vực tách biệt và thiết bị riêng cho việc chiết tách axit nucleic,
quy trình sạch, thao tác với axit nucleic đã đợc nhân lên.
- Khu vực sạch để chuẩn bị nguyên liêu phản ứng cho PCR. Các cDNA đã đợc nhân lên
hoặc mẫu RNA không đợc đa vào khu vực này.

- Có một buống cấy dành riêng cho các thao tác sạch.
- Cần có 1 bộ pipet và đầu tip sạch, nớc Rnase-free, ống pha chất phản ứng, giá ống
nghiệm và hộp đá riêng cho khu vực sạch.
- Một tủ âm 200-C dành riêng cho việc cất giữ nguyên liêu phản ứng sạch.
- Một buồng cấy thứ 2, các pipet và dụng cụ, máy móc khác dành riêng cho việc chiết tách.
Tốt nhất nếu có 1 buồng cấy thứ 3 dành cho việc chuyển các mẫu RNA vào ống phản ứng.
- Đặc biệt luôn đeo găng cao su hoặc nitril và thay đổi găng trong suốt quá trình thao tác.
RNA rất yếu và dễ bị suy biến bởi Rnase tồn tại ở nhiều nơi, đặc biệt trên da. Găng cũng
giúp cho việc bảo vệ nguyên liệu và mẫu khỏi bị tạp nhiễm. Hiện tợng tạp nhiễm chéo có
thể làm đảo lộn kết quả. Luôn thay găng sau khi làm việc với mẫu RNA hoặc DNA. Luôn
đeo găng mới khi làm việc với nguyên liệu sạch. Cần đeo kính, găng và áo bảo hộ khi làm
việc với 1 số hoá chất độc.
- Quy trình chiết tách Qiagenđ và Trizolđ nên thực hiện trong buồng cấy cấp II có quạt
3.1. Trình độ kỹ thuật viên: Các kỹ thuật viên PCR cần thành thạo:
- Chuẩn bị và thao tác đúng cách với các mẫu và chất phản ứng
- Biết kiểm tra, bảo dỡng và sử dụng các thiết bị trong tài liệu này
3.2. Chuẩn bị máy móc-dụng cụ
Thiết bị lạnh, tủ ấm, máy ly tâm, pipet và máy nhân gen đợc kiểm tra và chứng
nhận theo tiêu chuẩn.

14


3.3. Chất sát trùng
Có nhiều loại chất sát trùng, ví dụ I ốt, phenolic, nhóm hợp chất amoniac bậc 4, cồn
70%, xút 10%, hợp chất peroxigen có thể vô hoạt AIV bằng cách phá hủy vỏ bọc lipid của
virus. Tuy nhiên trong các hóa chất trên, chỉ có xút (thuốc tẩy trắng) và hợp chất peroxigen
(Vircon-S) làm suy biến axit nucleic cũng nh phá hủy sự lây nhiễm của AIV. Điều này rất
quan trọng khi lựa chọn 1 chất sát trùng để làm sạch các bề mặt đã tạp nhiễm axit nucleic.
3.4 Chuẩn bị các nguyên liệu phản ứng/đối chứng

3.4.1. Primer
Chuẩn bị primer trong buồng cấy sạch (xem phând 3.0.) Luôn đeo găng khi sử dụng
primer
Pha loãng primer đến nồng độ 200 pmol/àl (200 mM) trong đệm TE 1X để làm độ
pha loãng gốc và nồng độ 20 pmol/àl bằng nớc Rnase free để sử dụng. Chia nhỏ lợng
primer vào các ống để tránh việc làm tan đông nhiều lần. Nếu chỉ lu giữ primer trong thời
gian ngắn (dới 2 tuần) có thể để ở 40C. Để bảo quản lâu dài, nên để ở nhiệt độ 200C hoặc
lạnh hơn. Primer gốc có thể để ở 200C hoặc 700C. Các loại Primer M, H5 và H7 đều đợc
dùng với lợng 10 pmol trong 25 àl phản ứng. Xem phần 2.2.9.
3.4.2. Mẫu dò thủy phân.
Chuẩn bị mẫu dò trong buồng cấy sạch (xem phần 3.0). Luôn đeo găng khi sử dụng
mẫu dò. Mẫu dò thủiy phân nhạy cảm với ánh sáng nên phải tránh tiếp xúc với ánh sáng
trực tiếp. Mẫu dò đã pha loãng có thể giữ ở ống ly tâm nhỏ vô trùng màu hổ phách hoặc
ống đợc bọc giấy thiếc.
Pha loãng mẫu dò đến nồng độ 120 pmol/àl (120 uM) trong đệm TE 1X làm độ pha
loãng gốc và 6 pmol/àl bằng nớc Rnase free để sử dụng Chia nhỏ lợng mẫu dò vào các
ống để tránh việc làm tan đông nhiều lần. Primer đã pha loãng có thể để ở 200C hoặc
700C. Tránh đông và tan nhiều lần. Mẫu dò đã pha loãng không nên đông/tan quá 4 lần.
Các loại mẫu dò M, H5 và H7 đều đợc dùng với lợng 3 pmol trong 25 àl phản ứng.
3.4.3. Thao tác và pha loãng primer và mẫu dò .
Primer và mẫu dò đông khô phải đợc ly tâm ngắn đẻ chắc chắn rằng hạt DNA đợc
lắng xuống đáy ống trớc khi mở và hoàn nguyên. Lần đâù tiên nên dùng đêm TE để hoàn
nguyên primer và mẫu dò. Các thông tin định lợng đợc nhà sản xuất cung cấp cùng với
primer.
Ví dụ tính cách hoàn nguyên primer:
- Có 17786 pmol primer (thông tin trong giấy đi kèm)
- Cần nồng độ 200 pmol/àl làm gốc.
17786 pmol
= 88 .9 ulTE 1X
200 pmol / ul

Cách tính hoàn nguyên mẫu dò cũng tơng tự. Lắc nhẹ và để tan hoàn toàn trong
nớc 10 phút trớc khi sử dụng.
Primer sử dụng nên ở nồng độ 20 pmol/àl và mẫu dò sử dụng nên ở nông độ 6
pmol/àl
Pha loãng primer 1/10 và mẫu dò 1/20 bằng nớc không có nulease (không dùng
đệm TE)

15


Huỳnh quang nền của mỗi lô mẫu dò nên đợc xác đinh theo công thức. Nếu huỳnh
quang nền vợt quá 500 đơn vị huỳnh quang, mẫu dò cần phải bỏ đi và sử dụng lô mới.
Mẫu dò có huỳnh quang nền cao (thuốc nhuộm nổi tự do thừa) sẽ làm giảm lợng đơn vị
huỳnh quang để phát hiện chẩn đoán. Huỳnh quang nền của mỗi lần xét nghiệm cần đợc
kiểm soát để xác định nếu có dấu hiệu về sự suy biến của mẫu dò.
Các thông tin về thao tác và bảo quản mẫu dò huỳnh quang có thể tìm thấy tại:
www.operon.com, www.idtdna.com và www.idahotech.com
3.4.4. Chuẩn bị cồn 70% từ cồn 100% (tuyệt đối) và nớc Rnase free.
3.4.5. Chuẩn bị cồn 80% từ cồn 100% (tuyệt đối) và nớc Rnase free
3.4.6. Cần -Mercaptoethanol (-ME) bổ sung vào đệm Rneasy RLT trớc khi dùng. Thêm
10 àl -ME /ml dung dịch RLT. Dung dịch RLT vẫn ổn định trong vòng 1 tháng sau khi bổ
sung -ME.
3.4.7. Bổ sung cồn 100% vào dung dịch đệm Rneasy RPE theo hớng dẫn của bộ kít
3.4.8. Mẫu đối chứng dơng tính cho gen M, H5 và H7 có thể yêu cầu từ NVSL. Cần pha
loãng RNA dơng tính về nồng độ sử dụng để tạo ra Ct đích xấp xỉ 25,0. Pha loãng RNA
bằng nớc Rnase free theo chi dẫn kem theo. Chạy RNA đã pha loãng trong xét nghiệm
RRT-PCRđể xác định nếu đối chứng dơng có Ct nằm trong dải cho phép. (phần 6.2).
RNA đối chứng dơng có thể đặt hàng khi sử dụng mã nguyên liệu phản ứng dới đây.
Form đặt hàng 4-9 có thể lấy từ website
/>Mã nguyên liệu phản ứng

Tên sản phẩm
200 ADV
APMV-1 RNA
201 ADV
AIV H7 RNA
202 ADV
AIV H5 RNA
203 ADV
AIV M RNA
3.4.9. Pha loãng Rnase inhibitor đến 13,3 unit/àl với nớc Rnase free
3.5. Chuẩn bị mẫu
Thực hiện tất cả quy trình trong buồng cấy an toàn sinh học cấp II có lọc HEPA. Luôn mặc áo
bảo hộ, đeo kính bảo hộ và găng khi xử lý tổ chức nhiễm hoặc virus sống
Sử dụng mẫu dịch ngoáy khí quản gộp (5 swab/ống) và chiết tách RNA bằng kít
Qiagenđ. Các tổ chức thích hợp(lách, phổi, ruột) đợc xử lý thành huyễn dịch 10-20% và
chiết tách bằng quy trình Trizol. Cách khác là lấy mảnh tổ chức khoảng 5 mm3 cho vào 2 ml
môi trờng BHI, làm dông cứng, tan và ly tâm. Lấy dịch nổi từ ống dung môi (250 àl) và
chiết tách bằng Trizol.
Các dữ liệu chuẩn cho biết các mẫu dịch ngoáy ổ nhớp sẽ kém nhạy hơn dịch ngoáy
họng-khí quản đối với RRT-PCR. Quy trình Trizol chiết tách mẫu dịch ngoáy ổ nhớp tốt
hơn quy trình Qiagenđ. Các mẫu dịch ngoáy ổ nhớp có kết quả RRT-PCRâm tính cần đợc
kiểm tra bằng phân lập virus để xác định thực sự âm tính AI. Tuy nhiên nếu lợng virus
trong mẫu đủ sẽ phát hiện đợc bằng RRT-PCR. Các mẫu môi trờng không thích hợp với
xét nghiệm với RRT-PCRbằng phân lập virus. Tổ chức của các gia cầm khác nhau không
nên gộp chung lại.
Tất cả các mẫu phải đợc xử lý trong buồng cấy vô trùng Class II.

16



3.6. Chuẩn bị hạt nguyên liệu cho phản ứng phát hiện matrix và H5
Mỗi hạt phải đủ dùng cho 4 phản ứng lợng 25àl.
Hoàn nguyên hạt (phát hiện matrix hoặc H5 cúm gia cầm) theo chỉ dẫn trong mục 4.5. Các
hạt nguyên liệu này không chứa dNTP's, RNase inhibitor hoặc RT/PCR enzyme. Hỗn dịch
Qiagenđ enzyme, dNTP's và RNase inhibitor sẽ đợc bổ sung sau bởi cán bộ xét nghiệm.
4. Thực hiện phản ứng
Trớc khi làm RT-PCR, đặt các pipet, khay, đầu pipet,... vào buồng vô trùng sạch. Tơng
tự, đặt các dụng cụ làm mẫu vào buồng vô trùng khác. Bật đèn tử ngoại trong nhiều giờ
hoặc qua đêm để giảm tạp nhiễm ARN từ pipet và các dụng cụ khác.
4.1. Chiết tách ARN từ mẫu dịch ngoáy (Phơng pháp Qiagenđ RNeasy)
4.1.1. Lắc mạnh (bằng máy Votex) ống chứa dịch ngoáy và chuyển lợng 500àl sang ống
ly tâm nhỏ và ghi ký hiệu mẫu.
4.1.2. Cho 500àl Qiagenđ buffer RLT có -ME vào ống ly tâm trên. Lắc đều trên máy
Votex.
4.1.3. Ly tâm (bằng máy Spindown) để dịch bệnh phẩm đọng trên nắp trôi xuống đáy ống.
Cho 500àl cồn ETOH 70% (ethanol), lắc mạnh bằng Votex. Ly tâm mẫu đã bị dung giải
trong 5 phút ở tốc độ 5000xg ở nhiệt độ phòng.
4.1.4. Chuyển tất cả dịch nổi chứa mẫu bị dung giải sang cột RNeasyđ Qiagen đã ghi sẵn
ký hiệu mẫu. Ly tâm trong 15 giây tốc độ 8000xg ở nhiệt độ phòng. Kiểm tra dịch mẫu đã
thấm qua cột lọc cha. Lặp lại bớc này cho đến khi toàn bộ mẫu đã qua cột lọc.
* Ngoài ra có thể dùng ống hút QuiVacđ để hút dịch mẫu và rửa thông qua cột thu mẫu.
Phơng pháp này làm tăng hiệu quả và không phải ly tâm cột lọc nh các bớc 4.1.3, 4,1,4,
4.1.5, 4.1.6 và 4.1.7.
4.1.5. Bổ sung 700àl dung dịch rửa1 (RW1 buffer) vào cột RNeasyđ Qiagen, ly tâm trong
15 giây ở tốc độ 8000xg, thay ống thu mẫu mới (collection tube) vào cột lọc.
4.1.6. Cho 500àl RPE buffer vào cột RNeasyđ và ly tâm trong 15 giây ở tốc độ 8000xg,
thay ống thu mẫu mới vào cột lọc.
4.1.7. Lặp lại bớc trên 2 lần với dung dịch rửa RPE buffer. Sau lần rửa cuối cùng thay ống
thu mẫu mới loại 2 ml vào cột lọc.
4.1.8. Ly tâm cột lọc trống không trong 2 phút ở tốc độ tối đa (khoảng 12.000 vòng/phút),

bỏ ống thu mẫu.
4.1.9. Đặt cột lọc vào ống thu hoạch hoặc ống 1,5 ml đã đợc ghi sẵn ký hiệu mẫu. Cho 50
àl RNase free H2O vào cột lọc. Chú ý không đợc chạm đầu pipet vào mặt thạch Silica
trong cột lọc. ủ ở nhiệt độ phòng trong ít nhất 1 phút. Tách ARN bằng cách ly tâm cột trong
1 phút ở 10.000vòng/phút. Bỏ cột lọc RNeasyđ.
4.1.10. Bảo quản mẫu ARN thu đợc ở 40C trong thời gian ngắn trớc khi làm RRT-PCR,
nếu sau 24 giờ, mẫu nên bảo quản ở -200C hoặc nhiệt độ thấp hơn.
4.2. Chiết tách mẫu tổ chức bằng TrizolđLS.: Xem phần phơng pháp RT-PCR
4.3. Sao mã ngợc và PCR
Có 2 khu vực tiến hành xét nghiệm trong quy trình này:

17


Một là khu vực sạch gồm có buồng cấy vô trùng (BSC), tủ âm cùng các dụng cụ và
khu vực nhân gen (thermal cycling area). Không đợc để các chất có ARN/ADN vào khu
vực sạch và phải luôn thay găng tay trớc khi vào khu vực sạch.
4.3.1. Trong buồng vô trùng sạch, chuẩn bị hỗn hợp nhân gen (master mix) với các thành
phần sau đủ dùng cho số lợng mẫu cần xét nghiệm. Liều lợng cho từng mẫu xem chi
tiết tại bảng sau.
Quy trình này đợc áp dụng cho máy nhân gen Cepheidđ Smart Cycler (Cephiedđ,
Sunnyvale, CA).
Thông tin về khởi động và cài đặt chơng trình cho máy Smart Cycler có trong quyển
hớng dẫn của hãng. Chế độ chạy RT-PCR cho máy Smart Cycler đợc hớng dẫn trong
bảng 2 và 3.

Bảng 2. Chu kỳ nhiệt của bớc phiên mã ngợc (RT) dùng cho
Quiagenđ one step RT-PCR kit.
Bớc phiên mã ngợc
1 chu kỳ

30 phút
500C
15 phút
950C
Bảng 3. Chu kỳ nhiệt cho tổng hợp gen và các cặp mồi.
Cặp mồi
AIV matrix

Bớc
Biến tính
Bám của cặp mồi

Thời gian
1 giây
20 giây

Nhiệt độ
940C
600C

45 chu kỳ

H7

40 chu kỳ

Biến tính
Bám của cặp mồi

1 giây

20 giây

940C
580C

H5

40 chu kỳ

Biến tính
1 giây
Bám của cặp mồi 20 giây
Kéo dài chuỗi 5 giây
tổng hợp

940C
570C
720C

Chú ý: Màu huỳnh quang đợc xác định ở bớc bám gắn của cặp mồi.
4.3.2. Phản ứng real time RT-PCR đợc tiến hành với những thành phần sau cùng với cặp
mồi và chu kỳ thích hợp. Khởi động phản ứng với các ống phản ứng đợc đặt trong giá
đựng ống lạnh và dùng các đầu pipet có lọc.
Chuẩn bị hỗn dịch phản ứng (mọi thứ ngoại trừ mẫu ARN) bằng pipet: nớc, 5x
reaction buffer (có trong bộ kit), dNTPs (có trong bộ kit), MgCl2, các cặp mồi tổng hợp
xuôi và tổng hợp ngợc) trong ống ly tâm nhỏ với lợng cho từng phản ứng đợc tính theo
bảng 4. Các nguyên liệu để trong ngăn đá, kể cả MgCl2 phải đợc lắc bằng Votex và ly tâm
trớc khi lấy ra bằng pipet. Tiếp đến cho RNase inhibitor và enzym. Cho mẫu dò vào sau
cùng, trộn đều và ly tâm nhanh. Khi cho mẫu dò vào hỗn dịch tránh để tiếp xúc với ánh
sáng.


18


4.3.3. Chuyển Master mix sang buồng cho mẫu ARN và cho hỗn dịch phản ứng (17 àl) vào
ống Smart Cycler.
4.3.4. Cho 8 àl mẫu ARN vào ống Smart Cycler bằng pipet chuyên dùng cho lấy mẫu
ARN. Đóng nắp ống, số ống phản ứng tơng ứng với phiếu xét nghiệm. Cho 8 àl ARN đối
chứng dơng vào ống đối chứng dơng tính và 8 àl nớc sạch RNase vào ống đối chứng âm
tính. ARN đối chứng dơng tính đợc pha loãng bởi cán bộ xét nghiệm ở độ pha loãng
thích hợp có ngỡng chu kỳ khoảng 25.
4.3.5. ống phản ứng đợc đẩy bọt khí ra ngoài từ cửa sổ đọc của ống PCR. Bọt khí trong
ống cho biết lợng hỗn dịch RT-PCR master mix không đủ hoặc thiếu mẫu ARN.
4.3.6. Đặt ống phản ứng vào máy chu kỳ nhiệt và chọn chơng trình chạy PCR, bắt đầu
chạy, nhập ký hiệu mẫu kiểm tra cùng với mẫu đối chứng dơng tính, âm tính vào phần Ký
hiệu mẫu (sample identification) trong bảng kết quả. Lu chơng trình chạy máy.
Bảng 4a. Lợng chất phản ứng Real time RT-PCR dùng cho các cặp mồi phát hiện gen MA
(Cúm A), H5 và H7.
Liều lợng cho 1 Hàm lợng cuối cùng
phản ứng
H2 O
6,95 àl
5X buffer
5
1X
1,25
3,75 mM*
25mM MgCl2
dNTP's (10mM mỗi loại)
0,8

320 àM mỗi loại dNTP
0,5
10 pmol/25 àl
Mồi chạy xuôi (20 pmol/àl)
0,5
10 pmol/25 àl
Mồi chạy ngợc (20 pmol/àl)
0,5
RNase Inhibitor (13,3 units/àl)
0,266 units/àl
Enzyme Mix
1,0
0,5
0,12 àM
Mẫu dò (6 pmol/àl)
Tổng lợng cho 1 phản ứng
17 àl
Mẫu ARN
8 àl
Lợng toàn bộ trong ống mẫu
25 àl
* Quiagen buffer đã có sẵn MgCl2 2,5mM ở hàm lợng 1X
5. Cài đặt chơng trình phân tích dữ liệu cho máy chu kỳ nhiệt Cepheidđ Smart
Cycler.
Phần mềm Smart Cycler cung cấp nhiều phơng pháp xác định ngỡng chu kỳ (Ct).
Tất cả các cách phân tích dữ liệu đợc lấy từ Analysis Settings trong View Results. Những
thay đổi trong cài đặt mặc định tiêu chuẩn đã đợc thiết lập đối với các phân tích phát hiện
virus Cúm A với các cặp mồi Matrix, H5 và H7. Biên tập các phần phân tích mặc định của
Smart Cycler đợc mô tả dới đây, các dữ liệu thô sẽ đợc phân tích tuỳ theo mức độ phân
tích đợc mô tả.

Phân tích đờng cong (Curve analysis): Chấp nhận cài đặt đờng cong sơ cấp
"Primary curve" Ct đợc phát hiện và thông báo ở chu kỳ có đờng cong sơ cấp cắt
chéo ngỡng.

19


Cách sử dụng (Usage): Chấp nhận cài đặt mặc định "Assay" đối với kênh FAM.
Trừ giá trị nền (Background Subtraction): Chấp nhận giá trị mặc định "ON"
Giá trị tối thiểu nền (Background Minimum): Chấp nhận giá trị mặc định "5"
(phút). Chu kỳ đầu tiên đã tính giá trị nền khi phần trừ giá trị nề đợc Bật
Chu kỳ cực đại giá trị nền (Background Maximum cycle): Nhập số "28" là chu kỳ cực đại
để tính toán giá trị nền khi trừ giá trị nền đợc Bật. Mặc định là 40.
Đặt ngỡng (Threshold Settings): chấp nhận mặc định của "Manual"
Đơn vị huỳnh quang ngỡng xác định (Manual Threshold Fluorescence units): Nhập
số "25" là đơn vị huỳnh quang. Ct nằm phía trên huỳnh quang nền. Nếu cài đặt huỳnh quang
nền càng gần giấ trị cận ngỡng thì giới hạn phát hiện càng nhạy hơn. Tuy nhiên nếu giá
trị ngỡng quá gần với giá trị huỳnh quang nền thì độ ồn của nền có thể cắt chéo ngỡng và
cho kết quả không chính xác là mẫu đó dơng tính (phản ứng dơng tính giả). Nếu đơn vị
huỳnh quang ngỡng thấp từ 30 đến 25 (giá trị mặc định), độ nhạy phân tích sẽ tăng lên.
Khả năng cho kết quả âm tính giả giảm trong khi đó khả năng cho kết quả dơng tính giả
tăng.
Boxcar Average: chấp nhận mặc định "0"
* Kiểm tra các kết quả xét nghiệm
Chỉ những thay đổi trong phần mặc định của máy chu kỳ nhiệt Cepheidđ Smart
Cycler đợc cài đặt Giá trị nền cực đại và giá trị ngỡng. Với phần cài đặt phân tích, mẫu
đợc xem là dơng tính (cắt chéo Ct) khi các đơn vị huỳnh quang vựot quá 25 đơn vị.
Những cài đặt này đợc thiết kế nhằm tối u hóa khả năng phân biệt mẫu dơng tính và âm
tính trong quy trình hớng dẫn cụ thể này, tuy nhiên kết của của mỗi lần chạy phản ứng cần
phải đợc xác nhận bởi cán bộ xét nghiệm. Đờng cong phải nằm trong pha tuyến tính log

khi cắt chéo ngỡng. Khi giá trị nền cực đại thấp, ảnh hởng của các vệt hình chữ V cũng
giảm xuống. Các mẫu vẫn còn vệt chình chữ V, có thể đặt giá trị nền cực đại xuống 15 cho
đén khi các chu kỳ còn xuất hiện vệt nằm ngang và thẳng hàng với giá trị huỳnh quang là
"số không" (Sơ đồ 2a và 2b). Phải luôn nhớ rằng luôn đặt giá trị cực đại thấp hơn nếu muốn
chạy càng nhiều chu kỳ càng tốt khi tính toán giá trị nền. Đây là một sự điều chỉnh của
phần mềm cung cấp dữ liệu và giảm số lợng chu kỳ khi tính toán giá trị nền và căn chỉnh
đờng cong. Nếu có các câu hỏi về các vệt, hãy xem các vệt với giá trị trừ nền đợc tắt. Nó
sẽ cho thấy dữ liệu huỳnh quang thô và đôi khi cần có những phân tích hỗ trợ.
Huỳnh quang nền cũng phải đợc theo dõi thờng xuyên. Sự suy giảm của Mẫu dò
sẽ xảy ra khi tăng huỳnh quang nền.
Vệt huỳnh quanh trong mẫu cần đợc xem xét trớc khi chấp nhận kết quả dơng
tính/âm tính của máy chu kỳ nhiệt Smart Cycler. Các mẫu bệnh phẩm có vệt huỳnh quang
làm gia tăng các đơn vị huỳnh quang và giá trị tiếp cận, nhng không cắt ngang Ct, nên
đợc gửi đến NVSL để xét nghiệm thêm. Những mẫu này đợc xem là tăng chậm "late riser
LR" và thờng cho kết quả gần với ngỡng phát hiện. Hiện nay các mẫu LR này cha
đợc tìm hiểu rõ nên cần xét nghiệm thêm bằng phơng pháp phân lập virus.

20


Các chất phản ứng H5 sẽ phát hiện đợc cả 2 chủng virus thuộc phân nhóm
(subtype) Eurasian H5 và North American H5. Phản ứng này không phân biệt đợc phả hệ
của virus.
6. Phân tích kết quả xét nghiệm
6.1. Độ đặc hiệu của các phơng pháp xét nghiệm matrix, H5 và H7
Phơng pháp xét nghiệm matrix virus Cúm gia cầm (AIV) đợc dùng phát hiện tất
cả các phân nhóm của AIV. Ngợc lại phơng pháp đặc hiệu xác định phân nhóm H5, H7
dùng giám định AIV H5 và H7 chủng North American (Bắc Mỹ). Phơng pháp xét nghiệm
H5 đã cho thấykhả năng phát hiện AIV H5N1 chủng Asian (Châu á). Vì phơng pháp xét
nghiệm matrix nhạy hơn (khoảng 10 lần) H5 hay H7 nên thờng dùng test này để kiểm tra

tất cả các mẫu. Mẫu dơng tính với matrix và cả H5 hoặc H7 sẽ cho phép khẳng định mẫu
chứa ARN của AIV. Tuy nhiên mẫu dơng tính với matrix bằng kỹ thuật RRT-PCR mà âm
tính với H5 và H7 thì có thể vẫn chứa ARN của phân nhóm H5, H7 nhng do số lợng
ARN thấp hơn khả năng phát hiện của kỹ thuật xét nghiệm này hoặc có phân nhóm khác
ngoài H5 và H7 đang gây bệnh. Những mẫu bệnh phẩm này đợc xem là mẫu nghi ngờ.
Phơng pháp xét nghiệm matrix, H5, H7 cũng có thể phát hiện các mẫu bệnh phẩm
dơng tính giả. Những mẫu có Ct bằng 35 hoặc lớn hơn đợc xem là dơng tính nghi ngờ
và đợc xét nghiệm lại bằng RRT-PCR
Tất cả mẫu bệnh phẩm nghi ngờ và mẫu chỉ cho dơng tính matrix với kỹ thuật
RRT-PCR cần đợc xác chẩn bằng phơng pháp phân lập virus trớc khi thông báo kết quả
dơng tính. Tất cả các mẫu cha chắc chắn thì phải xét nghiệm lại.
6.2. Giá trị Ct của đối chứng dơng tính ARN đợc sao mã
Đối chứng dơng tính ARN đã sao mã đợc pha loãng ở hàm lợng sử dụng cho giá
trị Ct khoảng 25. Khi đối chứng có Ct cao hơn 29 thì phải làm lại để xét nghiệm đảm bảo.
Nếu Ct của đối chứng dơng tính thấp hơn 20, nên chuẩn độ lại độ pha loãng của đối chứng.
Bất kỳ thời điểm nào Ct của đối chứng dơng tính hoặc đờng cong tăng trởng khác thấp
hơn 14, giá trị trừ nền có thể bị sai lệch.
6.3. Hớng dẫn đánh giá đồ thị huỳnh quang
Đánh giá đồ thị huỳnh quang kèm theo các điều kiện dới đây sẽ rất hữu ích cho
việc xác định kết quả thờng quy. Điều quan trọng là mỗi mẫu bệnh phẩm phải đợc phân
tích độc lập.
6.3.1. Giám định các mẫu dơng tính yếu.
Loại bỏ tất cả phản ứng lớn hơn 100 đơn vị tăng huỳnh quang từ trong đồ thị (điều
này làm thay đổi thớc đo để dễ xác định các trờng hợp dơng tính yếu). (Sơ đồ 1a và 1b).
Quan sát riêng từng mẫu sẽ giúp xác định các phản ứng dơng tính yếu

21


Sơ đồ 1a. Ví dụ về đồ thị huỳnh quang của các mẫu chạy trên máy Smart Cycler.

Giá trị trừ nền đợc bật. Tất cả các tiêu chí phân tích đã đợc cài đặt giá trị mặc định thích
hợp. Chú ý thớc đo từ 0 đến 1000 đơn vị huỳnh quang (trục Y) khó xác định đợc các
mẫu dơng tính yếu.

Sơ đồ 1b. Đồ thị huỳnh quang tơng tự nh 1a, tuy nhiên các mẫu tăng trên 100 đơn vị
huỳnh quang đợc loại bỏ khỏi đồ thị. Chú ý thớc đo từ 0 đến 120 đơn vị huỳnh quang
(trục Y) sẽ cho phép phát hiện dơng tính yếu dễ hơn.

6.3.2. Nếu các mẫu có vệt huỳnh quang hình chữ V, hạ thấp các chu kỳ cực đại nền (theo
bảng cài đặt phân tích) cho đến khi chu kỳ tới có đờng biểu diễn nằm ngang và nằm gần

22


với mức huỳnh quang số 0 (Sơ đồ 2a và 2b). Giá trị chính xác cho các chu kỳ cực đại nền
là chu kỳ có đáy chữ V, khoảng18 nh ở sơ đồ 2a.
Sơ đồ 2a. Ví dụ về vệt huỳnh quang hình chữ V. Chu kỳ cực đại nền đợc cài đặt
mặc định là 40 (vòng). Tất cả tiêu chí phân tích khác đợc cài đặt các giá trị mặc định. Đối
chứng âm tính dùng để tham chiếu (đờng nằm ngang ở số 0).

Sơ đồ 2b. Đồ thị huỳnh quang tơng tự 2a, tuy nhiên các chu kỳ cực đại nền đợc giảm
xuống 20 (vòng) để gần sát với huỳnh quang nền ở đơn vị 0. Tất cả tiêu chí phân tích khác
đợc cài đặt các giá trị mặc định. Đối chứng âm tính dùng để tham chiếu (đờng nằm
ngang ở số 0).

23