BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC



PHÚC TRÌNH THỰC TẬP
VI SINH VẬT MÔI TRƯỜNG
Mã học phần: CS107
Người hướng dẫn:
Th.s Nguyễn Thị Liên

Thành viên nhóm:
Nguyễn Trọng Nghĩa
B1303590
Nguyễn Thị Ngọc Giàu B1303564
Nguyễn Hữu Toàn
B1303538

Cần Thơ, 11/2015


MỤC LỤC
Phần 1: QUAN SÁT CÁC VI SINH VẬT TRONG CÁC MẪU NƯỚC Ở NGUỒN
TỰ NHIÊN .......................................................................................................................... 1
I. Giới thiệu vi sinh vật trong nước ............................................................................... 1
II. Vật liệu và phương pháp thu mẫu và quan sát mẫu dưới kính hiển vi ................ 1
1. Dụng cụ và thiết bị .................................................................................................. 1
2. Phương pháp lấy mẫu từ các nguồn nước ............................................................... 1
3. Phương pháp lấy mẫu để quan sát dưới kính hiển vi .............................................. 2
III. Kết quả quan sát dưới kính hiển vi......................................................................... 2

1. Mẫu nước sông lớn ................................................................................................. 2
2. Mẫu nước ở cửa sông .............................................................................................. 3
3. Mẫu nước cống Căn tin ký túc xá khu A ................................................................ 4
4. Mẫu nước rạch hẻm 51 ........................................................................................... 5
5. Mẫu nước ở ao sen .................................................................................................. 7
6. Mẫu nước ở ao cá tra............................................................................................... 8
7. Mẫu nước ao tù ....................................................................................................... 9
8. Mẫu nước rỉ rác ..................................................................................................... 11
Phần 2: PHÂN LẬP VI KHUẨN CÓ KHẢ NĂNG PHÂN GIẢI CELLULOSE TỪ
ĐẤT .................................................................................................................................... 12
I. GIỚI THIỆU ............................................................................................................. 12
1. Giới thiệu chung .................................................................................................... 12
2. Cellulose................................................................................................................ 13
3. Các vi khuẩn có khả năng phân giải Cellulose. .................................................... 14
II. Vật liệu và phương pháp ......................................................................................... 15
1. Vật liệu .................................................................................................................. 15
2. Phương pháp ......................................................................................................... 15
III. Kết quả và thảo luận .............................................................................................. 19
1. Kết quả phân lập ................................................................................................... 20
2. Đặc điểm tế bào vi khuẩn phân lập được dưới kính hiển vi ................................. 22


3. Kết quả các kiểm tra sinh hóa. .............................................................................. 24
4. Thảo luận............................................................................................................... 28


Phần 1: QUAN SÁT CÁC VI SINH VẬT TRONG CÁC MẪU NƯỚC Ở NGUỒN
TỰ NHIÊN
I. Giới thiệu vi sinh vật trong nước
Vi sinh vật có mặt ở khắp nơi trong các nguồn nước. Có nhiều yếu tố tác động đến

sựu phân bố của vi sinh vật trong nước như hàm lượng muối, chất hữu cơ, pH, nhiệt độ và
ánh sáng. Ngoài ra, tuỳ theo loại thủy vực mà nó có vai trò khác nhau, khiến cho sự phân
bố vi khuẩn và nấm trong các sông, hồ, biển có một số khác biệt đặc trưng.
Trong nước vi sinh vật được phân bố nhiều ở vùng duyên hải (littoral zone), vùng
nước nông (limnetic zone) và ngay cả ở vùng nước sâu (profundal zone), vùng đáy ao hồ
(benthic zone)...
Số lượng và số loại vi sinh vật trong nước phụ thuộc vào nhiều yếu tố, nhất là
hàm lượng chất hữu cơ có trong nước, các hóa chất độc hại, tia tử ngoại, pH môi
trường, những yếu tố có tính chất quyết định đến sự tăng khối lượng vi sinh vật như
các chất dinh dưỡng.
Trong nước có nhiều loại vi sinh vật: vi khuẩn, tảo và nguyên sinh động vật nhưng
chủ yếu vẫn là vi khuẩn.
Nói chung, trong nước số vi khuẩn không bào tử chiếm ưu thế, còn trong bùn thì
số vi khuẩn có bào tử lại chiếm ưu thế.
II. Vật liệu và phương pháp thu mẫu và quan sát mẫu dưới kính hiển vi
1. Dụng cụ và thiết bị: kính hiển vi, lam kính, lam men, ống hút pipet, chai lọ, bình
tam giác.
2. Phương pháp lấy mẫu từ các nguồn nước
Những dụng cụ lấy mẫu nhằm để phân tích vi sinh vật trong nước là các chai lọ đã
được súc rửa cẩn thận và rửa lại bằng nước cất và phải được khử trùng trước khi lấy mẫu.
Mẫu lấy vào các dụng cụ lấy mẫu không được lấy đầy chai mà phải chừa một
khoảng không khí trong chai chứa mẫu để đảm bảo mẫu được trộn đều trước khi phân
tích. Sau khi lấy mẫu xong phải đóng chặt nút chai lại.
Lấy mẫu nước ở các nguồn sông suối bằng cách cầm chai lấy mẫu trong tay, gần vị
trí đáy chai, đưa cổ chai xuống nước và đưa sâu xuống dưới mặt nước. Trong trường hợp
lấy mẫu xa bờ khi đi trên thuyền thì cần lấy mẫu nước ở trước mũi thuyền.
Lấy mẫu nước thải sinh hoạt: Mẫu nước phải lấy trực tiếp từ các đường ống chính.
Lấy mẫu nước từ ao, hồ: Mẫu lấy không được quá gần bờ hoặc quá xa bờ, không
quá sâu cũng không quá cạn
1



3. Phương pháp lấy mẫu để quan sát dưới kính hiển vi
- Hút một giọt nước từ từng mẫu cho lên lam kính và dùng lamen đậy lại (tránh tạo
bọt khí)
-

Đặt lên kính hiển vi và quan sát mẫu ở vật kính 10X, sau đó chuyển qua vật kính
40X (có thể điều chỉnh độ sáng phù hợp để quan sát mẫu rõ hơn), sau đó di chuyển
sang các thị trường khác nhau để tìm kiếm các nhóm vi sinh vật khác có trong
mẫu.

-

Quan sát và ghi nhận từng nhóm hoặc từng loài quan sát được ở từng mẫu.

III. Kết quả quan sát dưới kính hiển vi
1. Mẫu nước sông lớn

Hình 1. Mẫu nước sông lớn
+ Đặc điểm: nước có màu trắng hơi đục, không có mùi
+ Các vi sinh vật quan sát được: Tập đoàn Volvox

.
2


Hình 2. Tập đoàn Volvox ở vật kính 40X
2. Mẫu nước ở cửa sông


Hình 3. Mẫu nước cửa sông
+ Đặc điểm: nước có màu trắng trong và không mùi
+ Các vi sinh vật quan sát được: vi khuẩn hình cầu kết cặp.

Hình 4. Vi khuẩn hình cầu kết đôi ở vật kính 40X

3


3. Mẫu nước cống Căn tin ký túc xá khu A

Hình 5. Mẫu nước cống Căn tin KTX khu A
+ Đặc điểm: nước có màu trắng đục và có mùi hôi.
+ Các vi sinh vật quan sát được: Vi khuẩn hình que, tảo mắt, nguyên sinh động vật.

Hình 6. Tảo mắt ở vật kính 40X

4


Hình 7. Vi khuẩn hình que ở vật kính 40X
4. Mẫu nước rạch hẻm 51

Hình 8. Mẫu nước rạch hẻm 52
+ Đặc điểm: nước có màu trắng trong hơi xanh, không mùi
+ Các vi sinh vật quan sát được: tập đoàn Volvox, vi khuẩn.

5



Hình 9. Tập đoàn Volvox ở vật kính 40X

Hình 10. Vi khuẩn ở vật kính 40X

6


5. Mẫu nước ở ao sen

Hình 11. Mẫu nước ao sen
+ Đặc điểm: nước có màu trắng trong và không mùi
+ Các vi sinh vật quan sát được: trùng roi, Phacus.

Hình 12. Phacus dưới kính hiển vi ở vật kính 40X

7


Hình 13. Trùng roi xanh ở vật kính 40X
6. Mẫu nước ở ao cá tra

Hình 14. Mẫu nước ao cá tra
+ Đặc điểm: màu trắng trong hơi xanh và không mùi.
+ Các vi sinh vật quan sát được: Euglena.

8


Hình 15. Euglena ở vật kính 40X
7. Mẫu nước ao tù


Hình 16. Mẫu nước ao tù
+ Đặc điểm: nước có màu vàng xanh và không mùi
+ Các vi sinh vật quan sát được: tập đoàn Volvox, tảo silic
9


Hình 17. Tảo silic ở vật kính 40X

Hình 18. Tập đoàn Volvox ở vật kính 40X

10


8. Mẫu nước rỉ rác

Hình 19. Mẫu nước rỉ rác
+ Đặc điểm: nước có màu nâu và có mùi hôi
+ Các vi sinh vật quan sát được: vi khuẩn.

Hình 20. Vi khuẩn trong nước rỉ rác ở vật kính 40X

11


Phần 2: PHÂN LẬP VI KHUẨN CÓ KHẢ NĂNG PHÂN GIẢI CELLULOSE TỪ
ĐẤT
I. GIỚI THIỆU:
1. Giới thiệu chung
Khoảng một nửa hợp chất carbon trong sinh khối (biomass) trên mặt đất là

cellulose, chiếm tới 35 – 50% khối lượng khô sinh khối thực vật. Tất cả sản phẩm sinh
khối sẽ được khoáng hóa nhờ hệ thống enzyme được cung cấp bởi vi sinh vật. Hệ thống
enzyme phân giải cellulose thường chậm và không hoàn toàn. Tuy nhiên, trong khoảng
thời gian ngắn (48 giờ) hệ vi sinh vật trong dạ cỏ bò có thể phân giải 60– 65% cellulose.
Hơn thế nữa, nhờ hệ thống vi sinh vật trong đường ruột mà loài mối có thể tiêu hóa đến
90% cellulose của gỗ. Còn trong hệ thống sinh học phức tạp như rễ cây hoặc những mảnh
vỡ thực vật trong đất, cellulose có thể được phân hủy trong khoảng thời gian lâu hơn 1T
(Schwarz, 2001)1T. Hệ vi sinh vật phân giải cellulose có thể lên men hiếu khí hoặc kỵ
khí, bình nhiệt hoặc ái nhiệt, bao gồm nấm, vi khuẩn và xạ khuẩn được tìm thấy nhiều
trong đất, nước, đường tiêu hóa một số động vật… nơi cung cấp lượng cellulose dồi dào
để vi sinh vật phân giải và phát triển.
Đồng bằng sông Cửu Long là vùng chuyên canh cây lúa, hàng năm sinh ra một lượng
rơm rạ khổng lồ. Với phế phẩm giàu cellulose này, một lượng rất ít được sử dụng để trồng
nấm hay làm thức ăn gia súc, phần lớn được xử lý theo phương pháp truyền thống là đốt
trực tiếp trên đồng ruộng, điều này gây ra nhiều hậu quả như góp phần ô nhiễm không
khí, phá hủy hệ sinh thái đất và đất ngày càng bạc màu. Một biện pháp nhằm tận dụng
rơm rạ có hiệu quả hơn đó là sử dụng vi khuẩn có khả năng phân giải cellulose giúp phân
giải rơm rạ thành phân hữu cơ bón cho đất, góp phần cải thiện độ phì nhiêu đất.

12


Hình 1. Một số hình ảnh lãng phí chất hữu cơ

2. Cellulose
Cellulose là hợp chất cao phân tử được trùng hợp (polyme hóa) từ các gốc β-Dglucose bằng cầu nối β-1,4-glycosid nhờ vào khả năng tự dưỡng dưới ánh sáng của
thực vật. Vì vậy, cellulose là hợp chất phổ biến nhất trong tự nhiên. Cellulose có cấu
trúc mạch thẳng dạng sợi rất bền, khó bị phân hủy. Hằng ngày một lượng lớn cellulose
từ xác bả thực vật, cây cối chết, cành lá rơi rụng rác sinh hoạt….tích lũy trong đất. Nếu
không có nhóm vi sinh vật phân giải cellulose thì lượng hữu cơ này tràng ngập trái đất

trong thời gian ngắn

Hình 2. Cấu trúc của cellulose
13


Muốn phân hủy cellulose sinh vật cần phải có enzyme cellulase. Con người và phần
lớn động vật không có enzyme này nên không phân hủy được cellulose. Riêng động vật
nhai lại có thể phân hủy được cellulose nhờ hệ vi sinh vật trong dạ cỏ.
 Cơ chế quá trình phân hủy cellulose
Cellulose là hợp chất không hoà tan, khó bị phân hủy. Enzyme phân hủy cellulose
nhờ hệ enzyme cellulase gồm 4 enzyme.
 Enzyme1: cellobiohyrolase cắt đứt liên kết hydro.
 Enzyme 2: endoglucanase cắt đứt các liên kết β-1,4 bên trong phân tử tạo
thành những chuỗi carbon dài.
 Enzyme 3: exoglucanase phân cắt các chuỗi carbon dài thành các
disaccharide là cellobiose.
 Enzyme 4: β-glucosidase thuỷ phân cellobiose thành glucose.
3. Các vi khuẩn có khả năng phân giải Cellulose.
Các dòng vi khuẩn hiếu khí thường gặp là Pseudomonas, Cellulomonas,
Achromobacte, Bacillus,…
Các dòng vi khuẩn kỵ khí như Clostridium và các nhóm vi khuẩn trong dạ cỏ của động
vật nhai lại như Ruminococcus.
Ngoài ra các xạ khuẩn như Streptomyces thuộc nhóm vi khuẩn ưa nóng phát triển ở
nhiệt độ 45-500C rất thích hợp để phân hủy các loại rác thải sinh hoạt

Cellulomonas flavigena

Ruminococcus.


Hình 3. Các dòng vi khuẩn có khả năng phân hủy cellulose
Các dòng vi khuẩn có khả năng phân hủy cellulose kém hơn nấm vì thường chúng
tiết ra không đủ loại enzyme nên thông thường mỗi loài vi khuẩn tiết ra một hay 2 loại
enzyme và kết hợp với các dòng khác mới phân hủy hết được cellulose.

14


II. Vật liệu và phương pháp
1. Vật liệu
- Nguồn đất: mẫu đất vùng rễ của bắp.
-

Môi trường nuôi cấy: PDA và môi trường phân lập: CMC
Thành phần môi trường CMC
Khối lượng
1g
1g
0,5g
0,001g
10g
20g

-

Hóa chất
(NH4)2SO4
K2HPO4
MgSO4.7H2O
NaCl

CMC
Agar
Thêm nước cất cho đủ 1 lít và chỉnh pH=7.

-

Hóa chất để kiểm tra thủy phân CMC: Congo Red và dung dịch muối NaCl 1M.

-

Dụng cụ và thiết bị: cân, máy khuấy từ, bình tam giác, tủ ủ, tủ cấy vô trùng, que
trải, que cấy, đĩa petri, đèn cồn, micropipette, lam kính,….

2. Phương pháp
a) Phương pháp phân lập

15


Cân khoảng 10g đất

Cho vào bình tam giác có chứa 90
ml nước cất vô trùng

Lắc đều trong 30 phút

Để yên 15 phút để đất lắng xuống đáy
bình
Mẫu đất sau khi đã lắc 30 phút và để yên
Pha loãng mẫu với tỉ lệ 1: 1 (50µl mẫu :50µl nước)

và để yên để mẫu lắng.

Dùng micropipette lấy 50µl phần dịch trong trải lên
môi trường

Mẫu sau khi pha loãng

Ủ ở 30oC trong khoảng 2-3 ngày

Chọn khuẩn lạc đơn cấy chuyển lên môi trường
mới

Cấy chuyển cho đến khi ròng.

Khuẩn lạc sau khi cấy trải và khuẩn lạc
được chọn để cấy chuyển (khuẩn lạc
được khoanh tròn)

Quan sát mẫu dưới KHV và ghi nhận các đặc điểm của tế
bào và khả năng chuyển động của chúng.

Mô tả hình dạng khuẩn lạc (kích thước, hình dạng, màu sắc,
dạng bìa, độ nổi, bề mặt của khuẩn lạc).

16


b) Phương pháp kiểm tra khả năng thủy phân CMC của vi khuẩn phân lập
Lấy sinh khối khuẩn lạc đã phân
lập


Chia đĩa petri làm ba và chấm sinh khối thành 3
điểm trên môi trường CMC

Ủ trong 3 ngày ở 30oC

Nhuộm môi trường với dung dịch Congo Red
trong 15 phút

Rửa lại đĩa môi trường bằng dung dịch NaCl 1M

Quan sát sự hình thành vòng halo xung quanh
khuẩn lạc

c) Kiểm tra sinh hóa
 Thử nghiệm catalase
Lấy sinh khối khuẩn lạc trên môi trường thạch sau 24-48 h ủ. Rồi chuyển lên miếng, sau
đó nhỏ một giọt H2O2 3%. Quan sát sự hình thành bọt khí và ghi nhận kết quả
+ Dương tính: khi có hình thành bọt khí
+ Âm tính: Không có sự hình thành bọt khí

17


Hình 4. Phân biệt kết quả thử nghiệm catalase
 Thử nghiệm oxidase
Nhỏ 3-4 giọt nước cất vô trùng lên lam
để giấy lọc có tẩm thuốc thử oxydase
lấy sinh khối và dùng que cấy trải đều lên giấy lọc
quan sát màu sau 10s.

+ Dương tính: xuất hiện màu xanh đậm
+ Âm tính: không xuất hiện màu

Hình 5. Phân biệt kết quả thử nghiệm oxidase
d) Nhuộm gram
Trình tự nhuộm Gram được thực hiện như sau:
-

Lấy 10µl nước cất vô trùng nhỏ lên giữa kính mang vật.

-

Dùng que cấy đã khử trùng trên ngọn đèn cồn lấy một ít vi sinh vật rồi trải
mỏng vi sinh vật trên kính mang vật.

-

Hơ mẫu vật trên ngọn lửa đèn cồn nhằm mục đích cố định vi sinh vật trên kính
mang vật.

-

Nhỏ từ một đến hai giọt Crytal violet lên kính mang vật có chứa mẫu vi sinh vật
đã cố định, trải đều Crystal violet bằng que cấy và để 2 phút.

-

Rửa lại bằng nước cất vô trùng, chậm nhẹ cho khô nước.
18



-

Nhỏ từ 1-2 giọt dung dịch Iod rồi trải đều bằng que cấy và để trong một phút.

-

Rửa lại bằng nước cất vô trùng, chậm nhẹ cho khô.

-

Rửa lại bằng cồn 70°C thật nhanh để tầy màu từ đầu đến cuối kính mang vật sai
cho đến khi giọt cồn cuối cùng không còn màu tím nữa.

-

Rữa lại bằng nước cất vô trùng trong vài giây, chậm nhẹ cho khô.

-

Nhỏ từ 1-2 giọt Fucshin rồi trải đều bằng que cấy sau đó để khô 1 phút.

-

Rữa lại bằng nước cất vô trùng cho đến giọt nước cuối cùng không còn màu của
Fushin.

-

Dùng giấy thấm chậm nhẹ cho kính mang vật khô nước.


-

Quan sát mẫu trên kính hiển vi quang học có độ phóng đại 400 lần và ghi nhận
Gram của vi khuẩn. Nếu vi khuẩn có màu tím xanh của Crystal violet là mẫu
Gram dương, có màu hồng đỏ của Fushin là mẫu Gram âm.

Hình 6. Phân biệt kết quả nhuộm Gram
III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
Sau khoảng 1 tuần tiến hành cấy chuyển ta thu được kết quả như sau:
19


Trong phần này ta quy ước:
(1) Kết quả phân lập và kiểm tra sinh hóa của Nguyễn Hữu Toàn.
(2) Kết quả phân lập và kiểm tra sinh hóa của Nguyễn Thị Ngọc Giàu.
(3) Kết quả phân lập và kiểm tra sinh hóa của Nguyễn Trọng Nghĩa.
1. Kết quả phân lập

(1)

(2)

(3)
Hình 7. Kết quả phân lập
1. Hình dạng khuẩn lạc
 Nguyễn Hữu Toàn (1)

20



Hình 8. Hình dạng khuẩn lạc phân lập được của Nguyễn Hữu Toàn
Miêu tả hình dạng của khuẩn lạc:
 Hình dạng khuẩn lạc: hình tròn.
 Dạng bìa: bìa nguyên.
 Độ nổi: mô
 Màu sắc: trắng đục
 Kích thước khuẩn lạc: 0,2 cm
 Bề mặt khuẩn lạc: trơn, nhầy, ướt.
 Nguyễn Thị Ngọc Giàu (2)

Hình 9. Hình dạng khuẩn lạc phân lập được của Nguyễn Thị Ngọc Giàu
Miêu tả hình dạng của khuẩn lạc:
 Hình dạng khuẩn lạc: hình tròn
 Dạng bìa: nguyên
 Độ nổi: phẳng
21


 Màu sắc: trắng đục
 Kích thước khuẩn lạc: 0,4 cm
 Bề mặt khuẩn lạc: khô
 Nguyễn Trọng Nghĩa (3)

Hình 10. Hình dạng khuẩn lạc phân lập được của Nguyễn Trọng Nghĩa
Miêu tả hình dạng của khuẩn lạc:
 Hình dạng khuẩn lạc: hình tròn
 Dạng bìa: bìa nguyên
 Độ nổi: mô
 Màu sắc: đỏ tươi

 Kích thước khuẩn lạc: 0,15 cm
 Bề mặt khuẩn lạc: trơn, láng, bóng
Nhận xét: từ hình dạng và đặt điểm của các khuẩn lạc sau khi phân lập thì ta thấy rằng ba
chủng vi khuẩn phân lập được là ba chủng vi khuẩn khác nhau.
2. Đặc điểm tế bào vi khuẩn phân lập được dưới kính hiển vi
 Nguyễn Hữu Toàn (1)

22