Xây dựng phương pháp định tính, định
lượng gentiopicrin trong Kem VIEMDA
AD bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao
Tạ Văn Bình\ Lê Thị Hải Yến\ Ma Thị Hổng Nga\ Nguyễn Thị Quỳnh^ Nguyễn Thị Kiểu Anh^

^Trường Cao đẳng YHà Nội, ^Trường Đại học Dược Hà Nội

SUMMARY
The aim of this work is to develop ơn analysis of gentiopicrin in VIEMDA AD cream by high performance lipid chromatography.
The analysis process was conducted on on Inertsil Cl 8 column (250 mm X 4.6 mm, 5 ụm). The mobile phase of methanol: water (35:65,
v/v) was pumped at the flow rate of 1ml/min. Gentiopicrin was identified by UV-DAD detector at wavelength of270 nm. The obtained
results showed that linear range, overage recovery and precision were 0.10- 0.30 mg/ml, 100.70% and 2.07% (n = 12), respectively.
Consequently, this HPLC method was good linear, repeotobility and precision. This validated method is appropriate to quantity
gentiopicrin in VIEMDA AD creom.
Từkhoá: Kern VIEMDA AD, long đởm, gentiopicrin, HPLC

Đặt vấn đề

Viêm da cơ địa (còn gọi là chàm thể tạng - Atopic
dermatitis - AD) là một dạng viêm da mạn tính, bệnh
thường xuất hiện ở trẻ em nhưng có thể kéo dài đến
tuổi trưởng thành, ngoài ra bệnh còn gặp ở người
lớn [6], Theo nghiên cứu của Christina M Gelbard và
Adelaide A Hebert [4] bệnh viêm da cơ địa là bệnh
mãn tính ảnh hưởng đến 10 - 20% trẻ em và 1 - 3%
người lớn ở Mỹ. Các triệu chứng của bệnh thường
dẫn đến mất ngủ, tâm lý căng thẳng, lo lắng... gây
ảnh hưởng xấu tới công việc và học tập. Tại Việt Nam,
theo báo cáo của Viện Da liễu Trung ương, mỗi ngày
khoa khám bệnh tiếp nhận từ 400 - 600 người mắc
bệnh về da, trong đó bệnh do viêm da cơ địa (sẩn

ngứa, mày đay, chàm, tổ đ ỉa...) chiếm tới 30% số bệnh
nhân. Đặc biệt, bệnh viêm da cơ địa có chiều hướng
gia tăng cùng với sự phát triển xã hội, ô nhiễm môi
trường trong những năm gẩn đây [2]. Hiện nay, điểu
trị chàm thể tạng chưa có thuốc đặc hiệu, chủ yếu sử
dụng corticosteroid với tác dụng chống viêm và giảm
các phản ứng dị ứng do vậy có thể gây các phản ứng
phụ rất nguy hiểm.
Kem VIEMDA AD trong thành phần có chứa dược
liệu Long đởm với dược chất chính là gentiopicrin,
đang được nghiên cứu bào chế để dùng trong điều
trị chàm thể tạng. Để có thể đưa thuốc vào sản xuất
và điều trị thì chất lượng thuốc cẩn được tiêu chuẩn

hóa và được kiểm tra, kiểm soát chặt chẽ. Nghiên cứu
này được thực hiện nhằm mục tiêu xây dựng phương
pháp định tính, định lượng gentiopicrin trong Kem
VIEMDA AD bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao, từ đó góp
phẩn xây dựng tiêu chuẩn kiểm nghiệm sản phẩm.
Hóa chất, thiết bị và phương pháp nghiên cứu

Mău thử
Kem VIEMDA AD đóng tuyp 20 g, sản xuất ngày
25/04/2013 là sản phẩm nghiên cứu của Trường Cao
Đẳng Y Hà Nội (thuộc đé tài cấp thành phố Hà Nội).
Hóa chất, chất chuẩn
Chất đối chiếu: gentiopicrin hàm lượng 99,0%
tính theo nguyên trạng, đóng lọ 20 mg do Chengdu
Biopurify Phytochemicals Ltd. (Trung Quốc) cung cấp.
Các dung môi, hóa chất thuộc loại dùng cho

HPLC hoặc PA (Merck - Đức).
Thiết bị
Hệ thổng HPLC - detector u v - DAD Agilent
Technologies 1260 Infinitive, Mỹ với phẩn mềm
Aligent Chemstation version B.
Cân phân tích Mettler Toledo, Thụy Sĩ (d = 0,01
mg); Máy siêu âm Ronorex RK 106, Đức; Máy lắc
xoáy Labinco L46, Hà Lan; Máy ly tâm lạnh Sartorius
sigma 2- 16K,Đức;Tủ lạnh Sanyo, Nhật; Nồi cách thủy
WiseCircu',Tây Ban Nha.
Các dụng cụ thủy tinh chính xác.


4

Phương pháp nghỉên cứu
-Điều kiện sắc ký:
+ Cột: Inertsil c^g(5 |am, 250 mm x4,6 mm)
+ Pha động: Methanol - nước (35:65)
+ Detector: u v 270 nm.
+Thể tích tiêm mẫu: 10 |jl
+ Tốc độ dòng: 1 ,0 ml/ phút
+ Nồng độ gentiopicrin trong dung dịch mẫu
tiêm: khoảng 0,2 mg/ml
- Chuẩn bị các dung dịch:
+ Dung dịch chuẩn gốc: cân chính xác một lượng
chất chuẩn tương đương khoảng 10 mg gentiopicrin
cho vào bình định mức 10 ml, hòa tan trong vừa đủ
thể tích bằng methanol. Bảo quản trong lọ thủy tỉnh
kín ở 2 - 8° c dùng trong vòng 1 tháng.

+ Dung dịch chuẩn: lấy chính xác 2 ml dung dịch
chuẩn gốc cho vào bình định mức 10 ml, pha loãng
vừa đủ thể tích bằng methanol. Lọc qua màng lọc 0,45
Mim.
+ Dung dịch thử: Lấy thuốc của 5 đơn vị chế phẩm
được chọn ngẫu nhiên. Trộn đổng nhất. Cân chính
xác khoảng 0,50 g chế phẩm vào ống nghiệm 10 ml,
thêm 7 ml methanot siêu âm trong 20 phút đun cách
thủy ở 60°c trong 15 phút để nguội. Chuyển toàn
bộ vào bình định mức 10 ml, rửa ống nghiệm 3 lẩn
mỗi lần với khoảng 1 ml methanol.Tập trung dịch rửa
vào bình định mức trên. Thêm methanol đến vừa đủ
thể tích. Lắc đểu. Ly tâm trong 5 phút với tốc độ 1000
vòng/ phút. Lọc lớp dịch trong qua màng lọc 0,45 lim.
Định tính:ĩrên sác ký đổ của dung dịch thử phải
có pic có thời gian lưu trùng với thời gian lưu của pic
gentiopicrin trên sắc ký đổ của dung dịch chuẩn.
Định lượng: Phương pháp so sánh với chuẩn
làm song song trong cùng điểu kiện. Hàm lượng
gentiopicrin p (%) trong chế phẩm được tính theo
công thức:

.

Kết quả nghỉên cứu

Khảo sát lựa chọn điều kiện phân tích
Khảo sát và lựơ chọn điểu kiện sắc ký
Dựa vào đặc tính của hoạt chất và các kết quả
nghiên cứu định lượng gentiopicrin bằng HPLC đã

công bố [3 ,5 , 8], tiến hành khảo sát và lựa chọn điểu
kiện phân tích phù hợp và khả thi.
- Sử dụng cột sắc ký Inertsil ODS-3 (250 X 4,6 mm,
5 pm) trong nghiên cứu.
-Thực hiện sắc ký gentiopicrin (dung dịch chuẩn)
với các hệ pha động methanol - nước với tỷ lệ thay
đổi, của methanol 25 - 40%, nước 75 - 60% (AC = 5%),
tốc độ dòng 1,4 ml/ phút. Kết quả cho thấy khi nồng
độ methanol tăng thời gian lưu của pỉc gentiopicrin
giảm nhưng áp suất cột táng nhanh (hình 1 và 2 ). ở
tỷ lệ methanol 35%, nước 65% thời gian lưu khoảng 6
phút và áp suất khoảng 220 bar. Để áp suất làm việc
của hệ thống không quá cao (< 200 bar), tiến hành
giảm tốc độ dòng pha động từ 1,4 ml/ phút tới 1,0
ml/phút (AV = 0,1 ml) thì thấy rằng tại tốc độ dòng
pha động là 1 ml/phútvớitỷlệphađộng như trên thì
áp suất cột khoảng 170 bar và thời gian lưu của pic
gentiopicrin khoảng 8 phút. Đổng thời, thể tích tiêm
mẫu nhỏ (10 |jl) được thực hiện nhằm hạn chế doãng
pic và giảm thiểu mức độ gây bẩn cột khi sắc ký đối
với mẫu thử là dạng cream và có nguồn gốc dược liệu.
250

225
Xì

200

150
20


25

30

35

40

45

Nồng độ M eO H (%)

H'inh 1. Ảnh hưởng củũ tỷ lệ thành phân phũ động tới áp suất cộĩsổc kỷ

xm^ X 5

16

Trong đó:
và A^: Diện tích pic của gentiopicrin trong sắc ký
đổ của dung dịch thử và dung dịch chuẩn.
và m : Khối lượng (mg) mẫu thử và mẫu chuẩn,
c và H: Hàm lượng (%) gentỉopicrin và độ ẩm (%)
của chất đối chiếu.
- Thơm định phương pháp: theo hướng dẫn của ICH
[7] đối với định tính, định lượng hoạt chất trong chế
phẩm, gồm các chỉ tiêu: tính chọn lọQ khoảng nồng
độ tuyến tính, độ chính xác, độ đúng.


.a
.2

12

It
Dí) C '

•I

I

20

25

30

35

40

45

Nồng độ M eO H (%)

Hình 2. Ảnh hưởng củũ tỷ lệ thònỉì phân phũ động tới thời giQíì lưu CỦQgentiopiơin


Bước sóng phát hiện được lựa chọn là bước

sóng cực đại hấp thụ khi quét phổ hấp thụ của pic
gentiopicrin trong sắc ký đổ dung dịch chuẩn.
Từ kết quả khảo sát bằng thực nghiệm, chúng tôi
lựa chọn điều kiện sắc ký để định lượng gentiopicrin
như trình bày ở phán phương pháp nghiên cứu.
Xử lý mâu
Gentiopicrin có khả năng hòa tan tốt trong
methanol mặt khác methanol là dung môi trong
thành phần pha động do đó methanol được lựa chọn
là dung môi dùng trong xử lý mẫu. Tiến hành khảo
sát bằng thực nghiệm với thể tích dung môi 10 -2 0
ml (AV = 2 ml), thời gian siêu âm và thời gian thủy
phân 10 -3 0 phút (At = 5 phút), nhiệt độ thủy phân
cố định là 60°c nhỏ hơn nhiệt độ sôi của methanol để
lựa chọn quy trình xử lý mẫu cho hiệu suất chiết cao
nhất loại được tạp với thời gian xử lý ngắn.Từ kết quả
thu được quy trình xử lý mẫu lựa chọn được trình bày
ở phần phương pháp nghiên cứu (Dung dịch thử).
Thẩm định phương pháp
Tiến hành thẩm định các tiêu chí theo hướng dẫn
của ICH [7].

Tính chọn lọc
Tiến hành sắc ký các dung dịch mẫu placebo, dung
dịch chuẩn gentiopicrin, dung dịch thử (Kem VIEMDA
AD). Kết quả được trình bày trong hình 3.
Kết quả ở hình 3 cho thấy thời gian lưu của pic
trên sắc đồ dung dịch mẫu thử trùng với thời gian lưu
pic gentiopicrin của dung dịch chuẩn (8,16 phút) và
trên sắc ký đồ mẫu placebo không xuất hiện pic trong

khoảng 7 - 1 0 phút. Như vậy phương pháp có tính
chọn lọc cao.
Tính thích hợp của hệ thống
Được xác định dựa vào độ lệch chuẩn tương đối
(RSD) của diện tích pic và thời gian lưu của gentiopicrin
khi sắc ký 6 lẩn liên tiếp dung dịch chuẩn gentiopicrin
nồng độ 0,2 mg/ml. Kết quả cho thấy RSD của diện
tích pic và thời gian lưu của pic gentiopỉcrin lẩn lượt
là 0,18% và 0,23% (n = 6) đểu thấp hơn 2,0% do đó
hệ thống sắc ký phù hợp để định lượng gentiopicrin.
Khoảng nổng độ tuyến tính
Của phương pháp được xác định dựa trên mối
tương quan hồi quy giữa nồng độ và diện tích pic của
gentỉopicrin trong khoảng nồng độ khảo sát 0,10 0,30 mg/ml. Kết quả được trình bày ở bảng 1 .

•bÁÒVo-S;;;ã>Ò4Ri«^(AHffeSÚWAtk'.YÂÌN
mAU

120
100

10

mAU

ĩ
1

80


lỊ

60
40
20

1

^

0

()

1

.^

0 --- -2

4

6

Kinh 3. Sâc ký đổ các mẫu: a. Plũcebo; b. genĩiopicrin chuổn; c Kem VIEMDA AD

. _ .... ........... ..... ỉ
8

10


12

14 min

12

14

min


Bỏng I Kết quỏ khỏo sát khoỏng nống độ tuyến tính
Nồng độ gentiopicrin (mg/ml)

0,10

0,15

0,20

0,25

0,30

Diện tích pic (mAU. giây)

1123,6

1912,5


2332,4

2853,8

3294,8

Phương trình hổi quy: y = 10567 X - 189,9
Hệ sỗtương quan: r = 0,9930
Độ chính xác
Của phương pháp được xác định dựa vào sự phân tán số liệu (RSD) khi tiến hành phân tích 6 lần riêng biệt
trong 1 ngày (độ lặp lại) và thực hiện tương tự như vậy ở ngày phân tích khác (độ chính xác khác ngày) trên một
mẫu chế phẩm Kem VIEMDA AD theo quỵ trình trên. Kết quả được trình bày ở bảng 2.
Báng 2. Kết quở độ chính xác CỦQ phương pháp
Ngày phân tích 2

Ngày phân tích 1
Diện tích pic
(mAU.s)

Hàm lượng
gentiopicrin (%)

TT

Khối lượng (g)

(g)

Diện tích pic

(mAU.s)

Hàmlượng
gentiopicrin (%)

1

0,5100

2507,0

0,386

1

0,5030

2437,6

0,380

2

0,5096

2534,3

0,390

2


0,5012

2427,8

0,380

3

0,5042

2454,1

0,382

3

0,5090

2538,2

0,391

4

0,5009

2385,7

0,374


4

0,5011

2439,3

0,382

5

0,5038

2417,3

0,376

5

0,5053

2548,3

0,396

6

0,5083

2400,9


0,371

6

0,5040

2530,2

0,394

TT

Khối lương

Trung bình

0,3787

Trung bình

0,3872

RSD(%)

1,94

RSD(%)

1,87


Hàmlượng trung bình gentiopicrin với n = 12 là: 0,383%
RSDvớin = 12là:2,07%

Độ đúng
Được xác định theo phương pháp thêm chuẩn bằng cách thêm một lượng chính xác chuẩn gentiopicrin
vào mẫu thử (khối lượng 0,50 g) ở 3 mức lần lượt là 0,2 mg; 0,4 mg và 0,6 mg (thêm 1,00 ml; 2,00 ml và 3,00 ml
dung dịch gentiopicrin chuẩn có nồng độ 0,2 mg/nnl) tương ứng lượng gentiopicrin thêm vào là khoảng 10 %;
20% và 30% lượng hoạt chất có trong mẫu thử. Xử lý mẫu và tiến hành sắc ký. Kết quả được trình bày ở bảng 3.
Bỏng 3. Két quở khâo sớt độ đúng (n=3)
Mức thêm

Lượng gentiopiain thêm vào
(mg)

Lượng gentiopicrin tìm lại được
(mg)

Tỷ lệ thu hổi (%)

RSD%

10%

0,20

0,1975

98,8


0,84

20%

0,40

0,3940

98,5

0,63

30%

0,60

0,5976

99,6

1,91

Bàn luận

Kem VIEMDA AD là một chế phẩm thuốc mới được bào chế từ dược liệu, đã chứng minh có tác dụng tốt
trong điểu trị viêm da cơ địa. Thành phần chính của chế phẩm này là dược liệu Long đởm với dược chất chính


là gentiopicrin [3]. Để có thể đưa thuốc vào sản xuất
và đăng ký lưu hành thì cẩn tiêu chuẩn hóa chất lượng

sản phẩm. Dược điển Việt Nam IV [1], trong chuyên
luận "Long đởm" mới chỉ để cập tới phương pháp
định tính Long đởm dựa vào chuẩn là dược liệu chuẩn
bằng sắc ký lớp mỏng và hóa học Các nghiên cứu xác
định (định tính, định lượng) gentiopicrin trong dược
liệu thường được thực hiện bằng phương pháp sắc
ký lỏng hiệu năng cao [3,5 , 8].
Định tính, định lượng gentiopicrỉn trong Kem
VIEMDA AD - chế phẩm bào chế từ dược liệu Long
đởm - được thực hiện bằng phương pháp HPLC cho
phép tách hoạt chất ra khỏi nển mẫu phức tạp (tá
dược thuốc cream, thành phần khác trong dược liệu
Long đởm), định tính dựa vào thời gian lưu của pic
gentiopicrin trong sắc ký đổ của dung dịch chuẩn bị
từ mẫu chế phẩm và dung dịch chuẩn gentiopicrin;
định lượng theo phương pháp chuẩn ngoại chuẩn
hóa một điểm dựa trên so sánh diện tích pic của
gentỉopicrỉn trong dung dịch mẫu thử và mẫu chuẩn,
nổng độ gentiopicrin trong dung dịch mẫu chuẩn và
lượng mẫu thử đem định lượng. Quá trình tách, định
tính, định lượng hoạt chất được thực hiện đổng thời
trong cùng một phép phân tích nên phương pháp
được thực hiện nhanh, có tính kinh tế với độ chính
xác cao.
Phương pháp định tính, định lượng gentỉopicrin
trong chế phẩm xây dựng được đơn giản chỉ cán sử
dụng thiết bị HPLC detector uv là loại detector phổ
biến trong các phòng phân tích. Phương pháp có tính
chọn lọc cao (pic gentiopicrin tách khỏi các pic cản
trở, cân đối với thời gian lưu khoảng 8,10 phút), chính

xác (độ lặp lại trong ngày đều có RSD < 2,0% với n =

6 và độ chính xác khác ngày RSD < 3,0% với n = 12),
khoảng nồng độ tuyến tính phù hợp (khoảng nồng
độ 0,10 - 0,30 mg/ml với r > 0,99), độ đúng nằm trong
khoảng cho phép 98,0 -102% theo qui định vể thẩm
định phương pháp phân tích [7].
Xu hướng hiện nay là ứng dụng các phương pháp
phân tích hiện đại - đặc biệt là phương pháp HPLC để tiêu chuẩn hóa dược liệu và các chế phẩm từ dược
liệu với chất đánh dấu có hoạt tính sinh học nhằm
đánh giá đúng và góp phần kiểm soát chất lượng
dược liệu. Khi thực hiện nghiên cứu, trước tiên phải
xác định được chất đánh dấu có hoạt tính sinh học để
tiêu chuẩn hóa, mặt khác phải có chất chuẩn. Nhưng
khó khăn là chất chuẩn dược liệu rất hiếm và đắt tiền
(đắt hơn 3 - 10 lẩn so với chất chuẩn có nguổn gốc
tổng hợp). Do đó, để có thể nâng cao chất lượng kiểm
nghiệm dược liệu và các chế phẩm có nguổn gốc từ
dược liệu một trong những việc cắn chú trọng là thiết
lập chất chuẩn có nguồn gốc dược liệu tạo điểu kiện
cho các nhà sản xuất nhà phân tích có cơ hội sử dụng
chuẩn với giá thành hạ và dễ dàng.
Kết luận

Phương pháp HPLC định tính, định lượng
gentiopicrin trong Kem VIEMDA AD - chế phẩm bào
chế từ dược liệu Long đởm - đã xây dựng đơn giản, có
tính chọn lọc cao, độ chính xác, độ đúng đảm bảo phù
hợp với điểu kiện thiết bị của các phòng phân tích do
đó phương pháp có tính ứng dụng cao. Kết quả này

là cơ sở để hoàn thiện Tiêu chuẩn kiểm nghiệm chế
phẩm trong hổ sơ xin đăng ký sản phẩm nhằm sớm
đưa thuốc ra thị trường phục vụ cộng đổng.

TÀI LIỆU THAM KHẢO
1.

Bộ Y tế (2009), DƯỢC điển Việt Nam IV, tr. 812-813.

2.

Lê Hữu Doanh (2009), Tinh hình viêm da cơ địa tại viện Da liễu Quốc gia từ 1995 đến 2005, Tạp chíYhọc thực hành, (12).

3.

Chinese Pharmacopoeia Commission (2010), Pharmacopoeia of the People's Republic of China, pp. 204-205.

4.

Christina M Gelbard, Adelaide A Hebert (2008). Patient Preference and Adherence, Vol.2, p 387-392.

5.

Huang z, Lin s. (2005), Determination gentiopicrin in biyanqingdugmnuloe by SPE-HPLC, Zhong Yoo Col, 28(6), pp. 507-8.

6.

Donald Y.M. Leung, Mark Boguniewicz, Michael D. Howell, Ichiro Nomura, and Qutayba A. Hamid (2004), The Journal of Clinical
Investigation, Vol 113(5), pp. 651-657.


7.

ICH Q2(R2) Validation of analytical procedures (2005): Text and Methodolody. Analytical Method Validation.

8.

Yin H,ZhaoQ,Sun FM, AnT. (2009),Gentiopicrin-producingendophyticfungusisolatedfromGenf/ữnơmứcrop/7y//a,P/73^omed/c/ne.,l 6(8),
pp. 793 7

92 ! Nghiên cứuduợcThòng tin thuốc I Số 3/2014