Ứng dụng công nghệ sinh học trong công nghệ lọc dầu

TRÖÔØNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI
NGÀNH : HÓA DẦU
-----

-----

ỨNG DỤNG CỦA CÔNG NGHỆ
SINH HỌC TRONG VIỆC KHỬ
KIM LOẠI TRONG DẦU MỎ

NGƯỜI HƯỚNG DẪN
: TS ĐỖ BIÊN CƯƠNG
SINH VIÊN THỰC HIỆN : HUỲNH ĐỨC KỲ

Loại bỏ kim loại trong dầu mỏ - SVTH: Huỳnh Đức Kỳ - Lớp Hóa dầu

Page 1


Ứng dụng công nghệ sinh học trong công nghệ lọc dầu

MỤC LỤC
ỨNG DỤNG CỦA CÔNG NGHỆ SINH HỌC
TRONG VIỆC KHỬ KIM LOẠI TRONG DẦU MỎ
I. Kim loại có trong dầu mỏ ...................................................................................... 2
1. Kim loại trong dầu mỏ..................................................................................... 2
2. Ảnh hưởng của kim loại trong các quá trình lọc dầu ....................................... 2
II. Ứng dụng công nghệ sinh học trong khử kim loại trong dầu mỏ ........................... 3
1. Porphirin......................................................................................................... 3

2.Biodemetallization............................................................................................ 3
III. Phương pháp loại bỏ kim loại ra khỏi nhiên liệu hóa thạch ................................. 5
1. Tóm tắt phương pháp ...................................................................................... 5
2. Mô tả chi tiết phương pháp.............................................................................. 6
IV. Thảo luận ........................................................................................................... 14

Loại bỏ kim loại trong dầu mỏ - SVTH: Huỳnh Đức Kỳ - Lớp Hóa dầu

Page 2


Ứng dụng công nghệ sinh học trong công nghệ lọc dầu

ỨNG DỤNG CỦA CÔNG NGHỆ SINH HỌC TRONG
VIỆC KHỬ KIM LOẠI TRONG DẦU MỎ
I. Kim loại có trong dầu mỏ.
1. Kim loại trong dầu mỏ.
Kim loại trong dầu mỏ không nhiều, thường từ vài phần triệu đến vài phần vạn.
Chúng có trong dầu mỏ dưới dạng phức với các hợp chất hữu cơ (cơ-kim), thông
thường là dạng phức porphirin.
Những kim loại nằm trong phức porphirin thường là Vanadium(V) và Nickel
(Ni), trong những loại dầu nhiều S chứa nhiều porphirin dưới dạng phức với V, ngược
lại trong các loại dầu ít S và đặc biệt là nhiều N thì chứa nhiều porphirin dưới dạng
phức với Ni.
Các phức nói trên ngoài của V và Ni còn có thể là phức của các kim loại khác
như Fe, Cu, Zn, Ti, Ca, Mn.
2. Ảnh hưởng của kim loại trong các quá trình lọc dầu.
Tuy kim loại tồn tại trong dầu mỏ với hàm lượng rất nhỏ (cỡ ppm) nhưng nó
phản ánh mức độ ảnh hưởng của chúng khi sử dụng các phân đoạn làm nguyên liệu
hay nhiên liệu cho các quá trình chế biến xúc tác.

Ví dụ : Nếu trong nhiên liệu đốt lò (FO) chứa nhiều V, Ni các kim loại này sẽ gây
thủng lò do tạo thành các hợp kim với sắt có nhiệt độ nóng chảy thấp; còn trong phản
ứng reforming xúc tác, Pb, As sẽ làm xúc tác mất hoạt tính nhanh chóng; Nhiên liệu
chứa nhiều kim loại nặng khi cháy sẽ tạo cặn gây ô nhiễm môi trường và làm mài mòn
đông cơ.
Các loại dầu chứa nhiều kim loại nặng đòi hỏi một công nghệ chế biến phức
tạp và chi phí sản xuất cao, hơn nữa năng suất lại không cao. Do đó nếu có thể loại bỏ
hoặc giảm tới mức có thể (thông thường không được quá 5-10 ppm) lượng kim loại
này trước khi đưa vào chế biến thì có thể giảm chi phí sản xuất mà hiệu xuất cũng
tăng lên vì giảm khả năng ngộ độc xúc tác do kim loại gây ra.
Loại bỏ kim loại trong dầu mỏ - SVTH: Huỳnh Đức Kỳ - Lớp Hóa dầu

Page 3


Ứng dụng công nghệ sinh học trong công nghệ lọc dầu

II. Ứng dụng công nghệ sinh học trong khử kim loại trong dầu mỏ.
1. Porphirin.
Porphirin là các phân tử hữu cơ có cấu trúc rất giống với cấu trúc của diệp lục
trong thực vật và hemoglobin trong máu động vật. Tiền thân của porphyrin là
porphine, các porphine biến đổi được gọi là porphyrin. Chúng được phân loại như các
hợp chất tetrapyrrole và thường chứa các kim loại như Ni và V. Porphirin có thể dễ
dàng bị phá hủy trong môi trường oxi hóa hoặc môi trường nhiệt. Porphirin là một
trong những luận điểm chứng minh nguồn gốc sinh học của dầu mỏ.
Một số cấu trúc porphyrin thương gặp

Hình 1
Cấu trúc của heme (một trong các loại porphyrin phổ biến nhất) bao gồm 4 tiểu
đơn vị pyrrole kết nối với nhau ở nguyên tử carbon α của chúng thong qua các cầu

methane (=CH-).
2.Biodemetallization.
Biodemetallization trong nghành công nghiệp lọc dầu về cơ bản là việc loại bỏ
Nickel (Ni) và Vanadium (V) ra khỏi các loại dầu. Hiên nay, rất ít báo cáo công bố về
vấn đề này, nguyên nhân chủ yếu là hầu hết các vi sinh vật hoặc enzyme đã được tim
thấy và nguyên cứu không phải lúc nào cũng cần kim loại cho sự sinh trưởng và phát
triển của mình, trong nhiều trường hợp chúng có thể dễ dàng sử dụng các nguồn sinh
học khác để thay thế.

Loại bỏ kim loại trong dầu mỏ - SVTH: Huỳnh Đức Kỳ - Lớp Hóa dầu

Page 4


Ứng dụng công nghệ sinh học trong công nghệ lọc dầu

Mặt dù vậy, một số enzyme chủ yếu từ lớp haloperoxidase như enzyme
chloroperoxidase đã được chứng minh là có khả năng phản ứng oxi hóa dẫn đến sự
oxi hóa từng phần của phần tử porphyrin giữ kim loại do đó có thể giải phóng được
kim loại ra khỏi phức hợp này, phương pháp này có thể loại bỏ được 93% Ni và 53%
V.

Hình 2 : Cấu trúc của chloroperoxidase
Tuy nhiên, bất lợi của loại enzyme này là có độ ổn định không cao, hơn nữa
các phản ứng chỉ được chứng minh trong hỗn hợp dung môi hữu cơ chứ không phải là
trên các loại dâu mỏ,thêm vào đó phương pháp này đòi hỏi một lượng clorua và sản
phẩm được khử trùng bằng clo lớn nên gây ra những tác động không mong muốn tới
môi trường từ việc đốt cháy nhiên liệu do quá trình demetallization tạo ra.
Do vậy, việc nghiên cứu giải quyết các vấn đề liên quan đến khả năng hoạt
động của hệ thống enzyme để thực hiện phản ứng demetallization trong dầu thô hoặc

một thành phần có nguồn gốc dầu thô là cân thiết.
Một số báo cáo cho thấy rằng peroxidase không đòi hỏi phải có ion halogen,
chẳng hạn như việc sử dụng cytochrome C. Cytochrome C là một heme protein , là
một protein hòa tan cao, không giống như các cytochrome khác với độ tan vào
khoảng 100g/L và là một thành phần quan trọng chuỗi vận chuyển điện tử. Nó có khả
Loại bỏ kim loại trong dầu mỏ - SVTH: Huỳnh Đức Kỳ - Lớp Hóa dầu

Page 5


Ứng dụng công nghệ sinh học trong công nghệ lọc dầu

năng tham gia phản ứng oxi hóa và phản ứng khử, nhưng không liên kết với oxi, nó
chuyển đổi các electron giữa phức III và phức IV.

Hình 2 : Cấu trúc ba chiều của cytochrome c với mọt phân tử heme
phối hợp với một trung tâm nguyên tử sắt

III. Phương pháp loại bỏ kim loại ra khỏi nhiên liệu hóa thạch.
Mặt dù vi sinh vật đã được chứng minh là có thể làm phân hủy các
metaltoporphyrin, nhưng có rất ít bằng chứng chứng minh rằng công nghệ sinh học có
thể tiếp cận được vấn đề tách kim loại ra khỏi dầu thô. Gần đây, Fedorak et al.
(Fedorak, PM et al, Enzyme microb Technol. 15:429-437 (1993)) đã chứng minh rằng
một enzyme ngoại bào, chloroperoxidase có thể biến đổi các petroporphyrin và
asphaltenes.Phương pháp đã loại bỏ được 93% Nickel octaethylporphyrin và 53%
vanadyl octaethyporphyrin từ phần asphalten. Tuy nhiên hệ thống yêu cầu clorua và
các sản phẩm khử trùng bằng clorua. Sản phẩm khử trùng bằng clo tạo ra những vấn
đề không mong muốn về môi trường
1. Tóm tắt phương pháp.
Là một phương pháp loại bỏ kim loại trong nhiên liệu hóa thạch với một xúc

tác sinh học chứa oxygenase, chính nó sẽ làm giảm các phân tử porphyrin khi có
những điều kiện thích hợp cho việc loại bỏ kim loại và sẽ tách kim loại từ nhiên liệu
hóa thạch. Các phản ứng được thực hiện tốt nhất khi không có mặt clo hoặc clorua.
Ngược lại với peoxidase, chẳng hạn như chloroperoxidase, oxygenase có thể làm giảm
Loại bỏ kim loại trong dầu mỏ - SVTH: Huỳnh Đức Kỳ - Lớp Hóa dầu

Page 6


Ứng dụng công nghệ sinh học trong công nghệ lọc dầu

các phân tử porphyrin mà không phụ thuộc vào mạch hydrocarbon bằng clo và
peroxidase. Những điển hình của các xúc tác sinh học này gồm có các heme
oxygenase và cytochrome c reductase, chẳng hạn như cytochrome C reductase từ
Bacillus megaterium, Catharanthus roseuse, Escherichia coli, các tế bào động vật, tế
bào thực vật nấm men.
2. Mô tả chi tiết phương pháp.
Phương pháp dựa trên việc khám phá ra rằng các enzyme có thể phân hủy các
phân tử porphyrin, đặc biệt là metalloporphyrin và có thể loại bỏ các kim loại ra khỏi
nhiên liệu hóa thạch. Các kim loại có thể được loại trừ bằng sáng chế thường nằm
trong các hợp chất organometallic như etioporphyrin. Các kim loại có thể được loại bỏ
là nikel (Ni), Vanadium (Va), Coban (Co), Đồng (Cu), Sắt (Fe), Magie (Mg), và kẽm
(Zn)
Nhiên liệu hóa thạch có chứa kim loại bao gồm dầu mỏ và một số sản phẩm từ
các phân đoạn chưng cất dầu khí, chất lỏng từ đá phiến có nguồn gốc từ than, dầu,
bitum, gilsonite, hắc ín và các sản phẩm tổng hợp từ chúng. Ở đây đặc biệt chú trọng
đến dầu thô và một số sản phẩm từ các phân đoạn chưng cất dầu khí.
Các chất xúc tác được sử dụng bao gồm một số loại enzyme có khả năng phản
ứng demetallization hoặc các mảnh vỡ bất kỳ có khả năng đó của enzyme. Các xúc tác
sinh học được sử dụng trong phương pháp có thể giải phóng một cách tốt nhất kim

loại ra khỏi các phân tử porphyrin.
Ví dụ : Xúc tác sinh học heme oxygenase (EC 1.14.99.3) và cytochrome C reductase
chẳng hạn như cytochrome C reductase (EC 1.6.99.3) từ Bacillus megaterium,
Catharanthus roseuse, Escherichia coli, tế bào động vật (chẳng hạn các tế bào trong
gan, thận), tế bào thực vật (chẳng hạn như tế bào trong đậu xanh hoặc cây
Araibidopsis thaliana), hoặc tế bào nấm men (chẳng hạn như Candida tropoculis)
Nói chung enzyme là chất xúc tác protein của tế bào sống. Enzyme thúc đẩy,
định hướng tạo điều kiện thuận lợi cho sự xuất hiện một phản ứng cụ thể nào đó hoặc
một loạt các phản ứng (chuỗi phản ứng) mà không tham gia vào thành phần sản phẩm.
Các xúc tác sinh học hữu ích trong phát minh bao gồm các loại vi sinh vật phân giãn,
trích xuất, phân hủy.
Loại bỏ kim loại trong dầu mỏ - SVTH: Huỳnh Đức Kỳ - Lớp Hóa dầu

Page 7


Ứng dụng công nghệ sinh học trong công nghệ lọc dầu

Các chất dinh dưỡng và các chất phụ gia có thể được bổ sung thêm vào bao
gồm coenzyme, cofactor, hoặc các coreactant của các tế bào hoặc các enzyme.
Ví dụ : NADPH là giúp ích thêm cho quá trình sử dụng cytochrome c reductase từ
Bacillus megaterium hoặc Catharanthus roseuse.
Một trong những khả năng của chất xúc tác sinh học cố định là tạo thuận lợi
cho việc phục hồi các xúc tác sinh học. Ví dụ, một vi sinh vật không hữu hiệu có thể
đóng vai trò như một người vận chuyển (carrier) cho các xúc tác sinh học. Một số loại
carrier có thể được sử dụng gồm loại màng, bộ lọc, nhựa cao phân tử vật liệu
diatomaceous, hạt thủy tinh, các hạt gốm hoặc các chất hỗ trợ khác.
Các xúc tác sinh tốt nhất là tồn tại ở pha lỏng trước khi được cho tiếp xúc với
hỗn hợp nhiên liệu hóa thạch. Pha lỏng có thể chỉ là nước hoặc có thể kết hợp với một
số dung môi phụ hợp khác bao gồm cả hỗn hợp của nước với một hợp chất hữu cơ nào

khác. Nói chung việc lựa chọn dung môi thích hợp là việc đòi hỏi phải có kĩ năng cao
trong công việc.
Hỗn hợp nhiên liệu hóa thạch và xúc tác sinh học này có thể được pha trộn để
tạo thành một nhũ tương (ổn định hoặc không ổn định) hay microemulsion microemulsion đơn giản là sự pha trộn các thành phần mà không đòi hỏi những điều
kiện cao thường được dung để hình thành các nhũ tương bình thường, chúng có độ ổn
định về nhiệt động lực học, là một hỗn hợp đẳng hướng của nước, dầu và chất hoạt
động bề mặt,ba loại cơ bản của microemulsion là loại trực tiếp (dầu phân tán trong
nước o/w), đảo ngược (nước phân tán trong dầu w/o), và bicontinuous - có hoặc
không có phụ gia (chẳng hạn như chất hoạt động bề mặt hoặc chất phân tán)
Nhũ tương hoặc microemulsion được tạo ra theo các phương pháp kĩ thuật đã được
biết tới, trong đó pha liên tục có thể là nước hoặc hợp chất hữu cơ, nhưng tốt nhất là
hợp chất hữu cơ vì có thể giảm thiểu lượng nước đưa vào phản ứng
Môi trường phản ứng, có thể nhũ tương hoặc microemulsion, được duy trì theo
những điều kiện đủ để quá trình loại bỏ các kim loại ra khỏi các hợp chất
organometallic xảy ra.

Loại bỏ kim loại trong dầu mỏ - SVTH: Huỳnh Đức Kỳ - Lớp Hóa dầu

Page 8


Ứng dụng công nghệ sinh học trong công nghệ lọc dầu

Ví dụ : Môi trường phản ứng có thể được ủ trong những điều kiện thuận lợi trong một
thời gian đủ để tạo ra một sản phẩm hữu cơ, kim loại tự do và trả lại nguyên ven xúc
tác sinh học đã dùng, tốt nhất ở nhiệt độ từ 5 - 40oC, pH tốt nhất từ 5 – 9.
Phản ứng này được thực hiện cho đến khi một phần lớn organometallic được
chuyển đổi. Các kim loại có thể được thu hồi từ dung dịch nước đi ra bằng các
phương pháp như trích ly, chưng cất, hoặc sắc kí trao đổi ion.
Quá trình này có thể được tiến hành trong một mẻ theo chế độ liên tục, bán liên

tục hoặc gián đoạn kết hợp với một hoặc nhiều quá trình biorefining bổ sung (chẳng
hạn như quá trình biodesulfurization). Hơn nữa, phản ứng có thể xảy ra trong một hệ
thống khép kín hoặc mở trong sự có mặt hoặc không có mặt ánh sáng
Giải thích về hóa chất trong phương pháp :
+ Hóa chất : Flavin mononucleotide (FMN), flavin adenine dinucleotide
(FAD),

3-(3-cholamidopropyl)

dimethyammonio)-1-propanesulfonate

(CHAPS),

cytochrome c, pyridine, và các porpyhyrin kim loại bao gồm octaethyl porphyrin
coban (II), octaethyl porphyrin đồng (II), octaethyl porphyrin sắt (III), octaethyl
porphyrin magie (II), octaethyl porphyrin nickel (II), octaethyl porphyrin vanadium
(IV), octaethyl porphyrin kẽm (II) và chlorophyll. Dithiothrietol (DTT), Hemin,
nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADPH), cytochrome C và
phenylmethyl sulfonyl fluoride. DE52 nhựa trao đổi anion, 2', 5'-adenosine
diphosphate-Sepharose 4B, (2'5'ADP) and Sepharose 4B.

Cấu trúc phân tử của octaethyl

porphyrin vanadium (IV)

Loại bỏ kim loại trong dầu mỏ - SVTH: Huỳnh Đức Kỳ - Lớp Hóa dầu

Page 9



Ứng dụng công nghệ sinh học trong công nghệ lọc dầu

+ Nguồn gốc cytochrome C reductase : Bacillus megaterium, ATCC 14581
được sử dụng như cytochrome c reductase (Miura, Y. and Fulco, A. J. J. Biol. Chem.
249:1880-1888 (1974)). Plasmid pSK-R9 có chứa một đoạn mã hóa 2.3 kb cDNA cho
một phần NADPH- cytochrome c reductase phu thuộc từ Catharanthus roseus (Meijer,
A. H. et al., Pl. J. 4:47-60 (1993)). Plasmid được electroporated và mantained trong E.
coli DR 10β theo Sambrook et al. (Sambrook, J. et al., Molecular Cloning: a
Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor,
N.Y. (1989)).
Sáng chế sẽ được mô tả cụ thể hơn qua các bước sau :
+ Bước 1 : Chuẩn bị thô cytochrome C reductase
Các Bacillus megaterium được phát triển trong môi trường tối thiểu có chứa
0,4% axit casamino ở 30oC và liên tục được khuấy trộn. E. coli chứa PSK-R9 được
nuôi cấy trong LB nước (Sambrook, J. et al., Molecular Cloning: a Laboratory
Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989))
đến một OD 0,2. IPTG sau đó thêm vào môi trường nuôi cấy (trung tâm cuối cùng 2
mM) và được ủ ở 37oC lắc thêm 4 giờ như mô tả của Meijer et al, PI. J. 4:47-60
(1993). Tế bào vi khuẩn (vi khuẩn Bacillus hoặc E. coli) được thu bằng phương pháp
ly tâm tại 4000 xg trong 5 phút và ở dạng viên resuspened chiếm 1/10 thể tích ban đầu
là 50 mM dung dịch đệm (pH = 7,8) có chứa 1mM EDTA, 5 mM DTT vad 20% (v/v)
glycerol. Các tế bào vi khuẩn bị hư hại được loại bỏ bằng phương pháp ly tâm ở
38.000 xg trong 40 phút và được lưu trữ ở 800C.
Nồng độ protein được xác định theo phương pháp của Lowry et al, J. Biol.
Chem. 193:265-275 (1951) bằng cách sử dụng albumin huyết thanh bò như một tiêu
chuẩn. Nồng độ cytochrome C reductase được ước lượng dựa trên hàm lượng flavin.
+ Bược 2 : Thanh lọc cytochrome C reductase
Bacillus megaterium ATCC 14581 được cấy vào một lít môi trường cấy tối
thiểu (3 bình 1 lít, và sử dung 2% chất cấy) và được ủ ở 300C và khuấy trộn trong 12
giờ. Các tế bào được thu hồi bằng phương pháp ly tâm ở tốc độ 5.000 rpm trong mười

phút ở 40C và được rửa qua một lần bằng sucrose 0,25M. Cytochrome C reductase
tinh khiết nhờ sử dụng phương pháp thanh lọc ba bước, cụ thể là các bước như sắc kí
Loại bỏ kim loại trong dầu mỏ - SVTH: Huỳnh Đức Kỳ - Lớp Hóa dầu

Page 10


Ứng dụng công nghệ sinh học trong công nghệ lọc dầu

gel sepharose 4B, sắc kí trao đổi ion DE52 và sắc kí 2’5’ADP sepharose như đã mô tả
ở (Sambrook, J. et al., Molecular Cloning: a Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring
Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)). Nông độ protein được theo dõi
tại bước sóng 280 nm với một detector Bio Rad Econo UV. Mỗi phần nhỏ được thu
thập và đem đi khảo nghiệm khả năng hoạt động.
+ Bước 3 : Khảo nghiệm cytochrome C reductase
Khảo nghiệm hỗn hợp có chứa 100 ml enzyme thô sonicate trích xuất và 40
mM cytochrome C, 100 mM NADPH trong một thể tích nhất định có chứa 1 ml dung
dịch đệm Na3PO4 0,3M (pH = 7,4). Hỗn hợp này được ủ ở 37oC trong 30 phút khuấy
trộn trong bóng tối. Sự thoái phân bởi cytochrome C được theo dõi ở bước sóng 550
nm và tính bằng cách sử dụng hệ số extinction của 21 cm mM-1-1.
+Bước 4 : Heme bi thoái phân bởi cytochrome C reductase
Hoạt động thoái phân các heme của cytochrome C reductase được mô tả cụ
thể như trong mô tả của Yoshinaga et al. (Yoshinaga, T. et al., J. Biol. Chem.
257:7794-7802 (1982)). Hỗn hợp phản ứng có chứa 40 nM hemin, 800 nm của
NADPH và cytochrome C reductase trong dung dịch đệm K3PO4 0,1M ở pH= 7,5 ủ ở
370C trong 60 phút, khuấy trộn trong bóng tối. Phản ứng được dừng lại bằng việc
thêm vào 200 µl pyridine và 50 µl KOH 8M để tạo thành một pyridine
hemochromogen (Paul, K. G et al. ActaChem. Scand. 7:1284-1287 (1953)).Số lượng
heme bị xuống cấp được xác định bằng sự khác biệt của độ hấp thụ được đo ở các
bước sóng 540 và 557 nm của pyridine hemochromogen và được tính toán thông qua

hệ số extinction của 20,7 mM-1 cm-1.
Cytochrome C reductase có nguồn gốc từ các chất trích xuất từ dầu thô, các chất trích
xuất này được thử nghiệm cho heme suy thoái. Cytochrome C reductase có khả năng
làm giảm ít nhất 15 nm của hemin trong một giờ theo các điều kiện được mô tả ở trên
+ Bước 5 : Đặc điểm các chế phẩm enzyme của cytochrome C reductase
Để đảm bảo hoạt tính của cytochrome C reductase và đánh giá được độ tinh
khiết của nước giải hấp có chứa cytochrome C reductase, một phần cytochrome C
reductase tinh khiết từ phương pháp lọc gel sepharose 4B hoặc sắc kí trao đổi ion
sepharose 4B và DE52 đã được sử dụng để khảo nghiệm tính khử của cytochrome C.
Loại bỏ kim loại trong dầu mỏ - SVTH: Huỳnh Đức Kỳ - Lớp Hóa dầu

Page 11


Ứng dụng công nghệ sinh học trong công nghệ lọc dầu

Tính khử của cytochrome C trong các tế bào trích xuất được tạo ra trên bề mặt sau khi
cho li tâm ở 30.000 xg trong 20 phút. Một phần hoạt tính sẽ được phục hồi từ các
mảnh protein sau khi lọc gel, DE52 trao đổi ion và 2’5’-ADP ái lực sắc ký. Các đoạn
từ 5 – 9 của cytochrome C suy thoái cho thấy hoạt tính cao hơn hẳn, trong khi đó các
đoạn khác khi khảo nghiện không phát hiện ra hoạt tính
Các đoạn tương ứng khác nhau của cytochrome C reduction được điện di trên 10% gel
SDS polyacrylamide và gel Coomassie màu. Ba dải màu có cương độ cao (khoảng 80
– 100 kDa) được biểu hiện trong một số đoạn, thiết lập hoạt tính cao hơn. Các protein
có cường độ 80 kDa nhiều khả năng có chứa cytochrome C reductase.
+ Bước 6 : Sự suy thoái của các metal porphyrin bằng cytochrome C reductase
Ba hỗn hợp khác nhau đã được thử nghiệm để xác định các điều kiện tối ưu
cho việc nghiên cứu demetalization. Hai hỗn hợp, chứa nước và hệ ba cấu tử được mô
tả bởi Fedorak et al. (Fedorak, P. M. et al. Enzyme Microb. Technol. 15:429-437
(1993)) và chứa KCl (9mM) và bộ đệm phosphate (3mM, pH 3). Hệ ba cấu tử thứ ba

có chứa bộ đệm phosphate 100 mM, pH 7,1 và không chứa KCl. Các metal porphyrin
được hòa tan trong methylene chloride, sau đó cho 10 ml vào các ống nghiệm. Sau khi
methylene chloride bốc hơi, hỗn hợp phản ứng được thêm vào các ống, tổng thể tích
của hỗn hợp phản ứng là 2ml có chứa metal porphyrin (nồng độ cuối là 17 mM),
cytochrome C reductase và NADPH (nồng độ cuối là 400 nM) hỗn hợp được ủ ở 370C
trong 60 phút khuấy trộn trong bóng tối. Metal porphyrin suy thoái được xác định qua
phép đo quang phổ bằng sự biến mất tại cao điểm Soret hoặc bằng sự khác biệt của
phổ hấp thụ được đo ở bước sóng giữa 540 và 557 nm của hemochromogen pyridin.
+ Bước 7 : Sự suy thoái của Nickel porphyrin bởi cytochrome C reductase
Nickel porphyrin được chọn làm mô hình của metalloporphyrin cho phản ứng
demetalization. Các hỗn hợp phản ứng khác nhau được thử nghiệm để xác định điều
kiện tối ưu cho phản ứng. . Hai hỗn hợp, chứa nước và hệ ba cấu tử được mô tả bởi
Fedorak et al. (Fedorak, P. M. et al. Enzyme Microb. Technol. 15:429-437 (1993)) và
chứa KCl (9mM) và bộ đệm phosphate (3mM, pH 3). Hệ ba cấu tử thứ ba có chứa bộ
đệm phosphate 100 mM, pH 7,1 và không chứa KCl.Nickel porphyrin được hòa tan
trong methylene chloride và cho 10 ml vào ống nghiệm. Sau khi methylene chloride
Loại bỏ kim loại trong dầu mỏ - SVTH: Huỳnh Đức Kỳ - Lớp Hóa dầu

Page 12


Ứng dụng công nghệ sinh học trong công nghệ lọc dầu

bốc hơi hỗn hợp phản ứng được thêm vào các ống. Tổng thể tích hỗn hợp phản ứng là
2ml có chứa Nickel porphyrin (nồng độ cuối là 17 mM) cytochrome C reductase và
NADPH (nồng độ cuối là 400 nM) hỗn hợp được ủ ở 370C trong 60 phút, khuấy trộn
trong bóng tối. Sự suy thoái của Nickel porphyrin trong trong hai dạng hệ thì không
đáng kể khi nồng độ của dung dịch đệm và pH quá thấp. Xử lý Nickel porphyrin trong
một dung môi khác có chứa 11% toluene, 46% isopropanol, và 43% bộ đệm
phosphate kết quả là giảm được 50%, cao điểm Soret ở tại 392nm. Hai cao điểm khác

là tại 517 nm (β) và 552 nm (α) tương ứng. Việc sử dụng một phần cytochrome C
reductase tinh khiết (through sepharose 4 B gel filteration) đạt hiệu quả cao hơn trong
việc giảm lượng Nickel porphyrin (70%). Hoạt tính riêng của enzyme thoái phân
Nickel porphyrin là gần 0,4 µM mỗi phút mỗi µg protein khi cytochrome C reductase
trong đoạn 6 thu được từ lọc 4B sepharose được sử dụng để khảo nghiệm.
Lượng Nickel porphyrin bi thoái phân cũng được xác định bằng sự khác biệt
trong hấp thụ ở khoảng bước sóng từ 557 đến 540 nm khi Nickel porphyrin cũng
giống như protoheme. Hemes, protoheme và mesoheme, có thể được đo bằng chiều
cao của đỉnh α trên chỗ lỗm, nằm giữa đỉnh α và β, trong phổ của pyridin
hemochrome. Pyridin protohemochrome có đỉnh và đáy tại 557 và 540 nm, trong khi
đó pyridin mesohemochrome có đỉnh và đáy tại 547 và 530 nm. Trong việc sử lý cùng
một lượng Nickel porphyrin thoái phân được phát hiện bằng cách đo sự giảm (biến
mất) của kim loại tương tự thu được bằng cách sử dụng pyridin hemochrome khảo
nghiệm. Giảm 59% protoporphyrin(protoheme) là có nguồn gốc dựa vào sự khác biệt
của quang phổ trong khoảng 557 và 540 nm, trong khi đó giảm 50% của kim loại này
được phát hiên dựa trên giảm đỉnh Soret.
+ Bước 8 : Demetalization của porphyrin kim loại
Sáu porphyrin kim loại khác : octaethyl porphyrin cobalt (II), octaethyl
porphyrin đồng (II), octaethyl porphyrin sắt (III), octaethyl porphyrin magiê (II),
octaethyl porphyrin vadadi (IV) và octaethyl porphrin kẽm (II), và mooyj chất diệp lục
(a) cũng được xử lý với các cytochrome C reductase và NADPH trong hệ ba cấu tử
thay đổi. Kết quả của sự thoái phân metalloporphyrin bởi cytochrome C reductase
được tóm tắt ở Bảng 1. Một lượng đáng kể metalloporrphyrin bị thoái phân trong thời
Loại bỏ kim loại trong dầu mỏ - SVTH: Huỳnh Đức Kỳ - Lớp Hóa dầu

Page 13


Ứng dụng công nghệ sinh học trong công nghệ lọc dầu


gian ủ 1 giờ. Các đỉnh Soret đạt được với các porphyrin kim loại khác nhau giảm được
khoảng từ 3 – 37,2%. Một lượng đáng kể các đỉnh nhỏ (ví dụ, α và β) cũng bị thoái
phân. Ví dụ octaethyl porphyrin cobalt (II) biểu thị trong ba đỉnh, một đỉnh Soret tại
392 nm và hai đỉnh nhỏ hơn (α ở 552 và β ở 117 nm). Octaethyl porphyrin cobalt (II)
được xử lý với cytochrome C reductase dẫn đến việc giảm đỉnh Soret 29,3% và đỉnh
α, trong khi đỉnh β thì hoàn toàn biến mất.
Bảng 1
TABLE 1 ______________________________________ Metal porphyrins
degradation by the cytochromme c reductase. % metal porphyrin degraded with Metal
porphyrin cytochrome c reductase obtained from: Bacillus megaterium ATCC
Catharanthus

14581

roseus

______________________________________

Etioporphyrin Cobalt 29.3 31.3 Copper 13.3 22.9 Iron 36.3 N/Aa Magnesium 6.5 5.0
Nickel 45.0 55.0 Vanadium 3.0 12.1 Zinc 28.1 39.5 Deoxophylloerythroetioporphyrin
Chlorophyll a 19.7 16.7 ______________________________________ a N/A = not
available
+ Bước 9 : Phản ứng demetalization trong dầu thô bằng cytochrome C
reductase
Cytochrome C reductase thô được chế từ Bacillus megaterium, ATCC 14581
được chuẩn bị như mô tả ở trên (bước 1). Hoạt tính được xác minh và nồng độ protein
được xác định là 8 mg/ml. NADPH và bộ đệm phosphate (100 mM, pH 7,5) đã được
thêm vào enzyme. Maya dầu thô (AMOCO Research Center, Naperville, Ill.) được
pha loãng đến 50% khối lượng với hexadecane. Tổng thể tích hỗn hợp phản ứng là
10ml có chứa dầu thô đã dược pha loãng (2,5ml), đệm phosphate (7,5ml), 160 µg

chiết xuất protein và NADPH (400 nM). Hỗn hợp được ủ ở 370C trong 16 giờ, khuấy
trộn trong bóng tối. Nồng độ kim loại khác nhau được đo bằng XRF phân tích. Nồng
độ của các hợp chất hữu cơ có chứa lưu huỳnh cũng được theo dõi và xem như là một
tiêu chuẩn bên trong. Kết quả của việc thực hiện phản ứng demetalization bằng việc
sử dụng cytochrome C reductase đã giảm một lượng đáng kể Ni và Va trong dầu. Tuy
nhiên một lượng lưu huỳnh đáng kể không bị thay đổi.

Loại bỏ kim loại trong dầu mỏ - SVTH: Huỳnh Đức Kỳ - Lớp Hóa dầu

Page 14


Ứng dụng công nghệ sinh học trong công nghệ lọc dầu

IV. Thảo luận.
Những vấn đề do kim loại trong dầu mỏ gây ra như nêu ở trên dẫn đến việc loại
bỏ kim loại ra khỏi dầu mỏ là cần thiết. Có nhiều phương pháp hóa học có thể loại bỏ
được kim loại ra khỏi dầu mỏ và đã được sử dụng phổ biến vì hiệu quả thực tiễn mà
nó mang lại chẳng hạn như loại bỏ kim loại với dung môi (Savastano,1991), hoặc quá
trình hidrodemetalizing (Adarme et al., 1990; Bartholdy and Hannerup, 1990). Chúng
đều là những phương pháp mang lại hiệu quả cao nhưng giả thành lại quá đắt hơn nữa
chúng thường gây ra những ô nhiễm thứ cấp cho môi trường (Hernandez et al., 1998).
Bởi những quan ngại này nên việc nghiên cứu các ứng dụng của công nghệ sinh học
vào việc loại bỏ kim loại trong dầu mỏ có cơ hội phát triển mạnh, trong thực tế công
nghệ sinh học và những ứng dụng của nó đang là lĩnh vực được chú trọng nghiên cứu
phát triển nhất không chỉ ở nghành dầu khí mà còn trong nhiều nghành khác nữa.
Phương pháp nêu trên có thể được tóm lược lại như sau :
+ Cách ly và kiểm tra vi sinh vật : Phân tích và phân lập vi sinh vật có trong
mẫu.
+ Chuẩn bị những điều kiện cần thiết để nuôi cấy : Điều kiện về nhiệt độ, thời

gian, môi trường ủ ….
+ Tách chiết, phân lập, các thể cần thiết cho quá trình (chẳng hạn như
enzyme).
+ Cho tác nhân tiếp xúc với dầu mỏ (sản phẩm các phân đoạn) và tạo điều
kiện thuận lợi cho quá trình demetalization xảy ra.
+ Thu hồi tác nhân và kim loại từ quá trình demetalization.

Loại bỏ kim loại trong dầu mỏ - SVTH: Huỳnh Đức Kỳ - Lớp Hóa dầu

Page 15


Ứng dụng công nghệ sinh học trong công nghệ lọc dầu

Tài liệu tham khảo

Hóa học dầu mỏ và khí – GS. Đinh Thị Ngọ – Nhà xuất bản khoa học và kỹ
thuật (2010)
/>Microbial demetallization of crude oil using Aspergillus sp.: vanadium oxide
octaethyl porphyrin (VOOEP) as a model of metallic petroporphyrins
(IRANIAN JOURNAL of BIOTECHNOLOGY, Vol. 5, No. 4, October 2007)
/> />A183&dq=enzymes+are+essentially+from+the+haloperoxidase+class.&source=
bl&ots=gh5V8jBwW&sig=PjvFpn_alaPmv_lh3d0GpEv_lkQ&hl=en&ei=wB6cTrT5BYaphAe
mwdiKBA&sa=X&oi=book_result&ct=result&resnum=1&sqi=2&ved=0CB8Q
6AEwAA#v=onepage&q&f=false
/>
Loại bỏ kim loại trong dầu mỏ - SVTH: Huỳnh Đức Kỳ - Lớp Hóa dầu

Page 16