MỤC LỤC

MỤC LỤC.....................................................................................................................
DANH MỤC BẢNG...................................................................................................
DANH MỤC HÌNH....................................................................................................
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT.............................................................................
TÓM TẮT...................................................................................................................
Phần 1. MỞ ĐẦU.........................................................................................................
1.1 Đặt vấn đề.........................................................................................................................
1.2. Mục đích, yêu cầu............................................................................................................
1.2.1. Mục đích...................................................................................................................
1.2.2. Yêu cầu.....................................................................................................................

Phần 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU..............................................................................
2.1. Giới thiệu chung về cây quýt...........................................................................................
2.2. Giới thiệu chung về công nghệ chuyển gen ở thực vật....................................................
2.2.1. Các phương pháp chuyển gen...................................................................................
2.2.2. Phương pháp chuyển gen gián tiếp nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens
.............................................................................................................................................
2.2.3. Các phương pháp đánh giá cây chuyển gen..............................................................
2.3. Các nghiên cứu trong nước và trên thế giới tạo quả không hạt.......................................
2.3.1. Các nghiên cứu tạo quả không hạt trên thế giới........................................................
2.3.2. Các nghiên cứu trong nước ....................................................................................
2.4. Các nghiên cứu chuyển gen ở cây cam quýt bằng vi khuẩn A. tumefaciens.................

Phần 3. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP...............................................................
3.1. Vật liệu...........................................................................................................................
3.2. Phương pháp..................................................................................................................
3.3. Nội dung nghiên cứu......................................................................................................
3.4. Các chỉ tiêu theo dõi và xử lý số liệu.............................................................................

Phần 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN......................................................................
4.1. Ảnh hưởng của thời gian lây nhiễm đến hiệu quả biến nạp của vi khuẩn.....................
4.2. Ảnh hưởng của thời gian đồng nuôi cấy đến khả năng chuyển gen của vi khuẩn
Agrobacterium tumefaciens..................................................................................................
4.3. Ảnh hưởng của Acetosyringone (AS) đến sự biến nạp của vi khuẩn............................
4.4. Ảnh hưởng của môi trường đồng nuôi cấy đến khả năng tái sinh chồi........................
4.5. Ảnh hưởng của môi trường tái sinh đến khả năng tái sinh và hiệu
quả chuyển gen.................................................................................................................

Phần 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ.........................................................................
5.1.Kết luận...........................................................................................................................


5.2. Đề nghị...........................................................................................................................

TÀI LIỆU THAM KHẢO............................................................................................
PHỤ LỤC......................................................................................................................


DANH MỤC BẢNG
Bảng 1

Ảnh hưởng của thời gian lây nhiễm đến tỷ lệ mọc khuẩn trong thời
gian đồng nuôi cấy.........................................................................................

Bảng 2

Tỷ lệ mẫu sống sau rửa khuẩn.......................................................................

Bảng 3


Ảnh hưởng của thời gian lây nhiễm đến sự tái sinh chồi và hiệu
quả chuyển gen...............................................................................................

Bảng 4

Tỷ lệ mọc khuẩn trong thời gian đồng nuôi cấy............................................

Bảng 5

Tỷ lệ mẫu sống sau hai lần rửa khuẩn...........................................................

Bảng 6

Ảnh hưởng của thời gian đồng nuôi cấy đến hiệu quả tái sinh chồi
và hiệu quả chuyển gen của vi khuẩn............................................................

Bảng 7

Ảnh hưởng của nồng độ AS đến tái sinh chồi và hiệu quả chuyển
gen..................................................................................................................

Bảng 8

Ảnh hưởng của môi trường đồng nuôi cấy đến khả năng tái sinh và
hiệu quả biến nạp của vi khuẩn......................................................................

Bảng 9

Ảnh hưởng của BAP và IAA đến khả năng tái sinh chồi ở quýt Đường

canh................................................................................................................


DANH MỤC HÌNH

Hình 1

Cơ chế chuyển gen của vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens ....................

Hình 2

Phản ứng sinh màu của hóa chất X-gluc.........................................................

Hình 3

Chiến lược tạo quả không hạt........................................................................

Hình 4

Sơ đồ sinh và mẫn cảm auxin/GA ở bầu nhụy .............................................

Hình 5

Cây con 3 tuần tuổi........................................................................................

Hình 6

Cấu trúc vector pDU04.4522.........................................................................

Hình 7


Sơ đồ quá trình thực hiện đề tài.....................................................................

Hình 8

Ảnh mẫu cấy trong môi trường đồng nuôi cấy khi lây nhiễm ở các
thời gian khác nhau........................................................................................

Hình 7

Chồi tái sinh ở các thời gian lây nhiễm khác nhau........................................

Hình 8

Vi khuẩn mọc trong thời gian đồng nuôi cấy................................................

Hình 9

Chồi tái sinh khi đồng nuôi cấy ở các môi trường khác nhau.......................

Hình 10 Hình ảnh kết quả nhuộm gen gus..................................................................
Hình 11 Chồi tái sinh trên môi trường có nồng độ BAP và IAA khác nhau.
........................................................................................................................



DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

BA:


6-Benzyl Adenine

BAP:

6-Benzyl Adenopurine

IAA:

indol-3-acetic acid

2-ip:

2-isopentenyl-adenine

NAA:

Napthaleneacetic acid

2,4-D:

2,4-dichlorophenoxyacetic acid

Ki:

Kinetin

MS:

Murashige and Skoog, 1962


LB:

Luria-Bertani medium

AS:

Acetosyringone

CT:

Công thức

ĐC:

Đối chứng

X-gluc:

5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-glucuronide


TÓM TẮT
Từ lâu chọn tạo giống không hat trên thế giới và nước ta đã tiến hành và
thu được sản phẩm quả không hạt đáp ứng được nhu cầu thị trường. Tuy nhiên
chuyển gen thông qua Agrobacterium tạo quả không hạt trên cam quýt mới chỉ
được nghiên cứu ở nước ngoài, thu được quả không hạt ổn định và không làm ảnh
hưởng đến chất lượng quả. Vì vậy mục tiêu của đề tài là bước đầu tìm hiểu và xây
dựng được quy trình chuyển gen tạo quả không hạt cho quýt Đường canh.
Đoạn trụ trên lá mầm (epicotyl) dùng làm mẫu cấy được lây nhiễm với
dung dịch vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens C58 mang plasmid chứa gen mẫn

cảm auxin rolB kết hợp với promotor hoạt động đặc thù bầu nhụy. Kết quả thu
được từ những thí nghiệm cho thấy các yếu tố ảnh hưởng đến sự biến nạp của vi
khuẩn là thời gian lây nhiễm, thời gian đồng nuôi cấy, ảnh hưởng của hợp chất
Acetosyringone (AS) bổ sung vào môi trường đồng nuôi cấy, ảnh hưởng của môi
trường đồng nuôi cấy; ảnh hưởng của các hormon đến khả năng tái sinh của mẫu
cấy.
Kết quả thu được như sau: thời gian lây nhiễm 20 phút, thời gian đồng nuôi
cấy 2 ngày, nồng độ AS bằng không, môi trường đồng nuôi cấy là MS + 2 mg/L
BAP + 0.5 mg/L Ki + 1 mg/L NAA + 8 g/L agar + 30 g/L Sucrose. pH 5.7 là điều
kiện tốt cho sự phát triển của mẫu cấy tạo chồi. Sự tái sinh thành chồi chuyển gen
cao khi áp dụng 2 mg/L BAP và 0.2 mg/L IAA trên nền môi trường MS.

Phần 1. MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề


Cây ăn quả chi Citrus có giá trị cao về mặt dinh dưỡng đứng thứ 2 sau
chuối về tầm quan trọng và có ý nghĩa kinh tế ở Việt Nam. Nhưng hạt trong quả
của cây có múi là một đặc điểm không mong muốn, làm giảm chất lượng thương
phẩm và tính tiện lợi cho người tiêu dùng quả tươi và công nghiệp chế biến. Vì
vậy chọn tạo quả không hạt ở cây có múi thông qua chuyển gen trên thế giới đã
được nghiên cứu từ lâu. Tuy nhiên vấn đề này mới được đề cập đến ở Việt Nam từ
vài năm nay và hiện đang là vấn đề cấp thiết nhằm đáp ứng nhu cầu của thị
trường.
Tạo quả không hạt bằng phương pháp chọn tạo giống truyền thống có các
phương pháp khác nhau như lai xa, tạo cây tam bội không hạt, xử lý đột biến bằng
colchicine, dùng các chất kích thích sinh trưởng, chọn lọc các đột biến tự nhiên…
Tuy nhiên các phương pháp trên thường tốn nhiều thời gian, không định hướng
được đột biến nên kết quả thấp và không ổn định.

Bình thường sau khi thụ phấn thụ tinh tạo hợp tử, hợp tử sinh auxin kích
thích tế bào bầu nhụy phân chia, bầu nhụy lớn lên và tạo thành quả. Như vậy có
thụ tinh thì mới có quả. Tuy nhiên ở một số giống vô phối tạo quả không qua thụ
tinh, nhưng quả thường bị thui non và cần phải phun bổ sung auxin ngoại sinh để
tạo và nuôi quả.
Nhờ phát triển công nghệ chuyển gen, hiện nay người ta đã tách được nhiều
gen từ các loại sinh vật khác nhau. Trong đó có gen mẫn cảm auxin rolB từ vi
khuẩn Agrobacterium rhizogenes, gen này được gắn với promoter INO từ thực vật
hoạt động đặc thù bầu nhụy. Khi tổ hợp gen rolB-INO hoạt động, chỉ cần một
lượng auxin nhỏ sản xuất ở đâu đó trong cây cũng có thể kích thích để bầu nhụy
phân chia và lớn lên thành quả. Công nghệ này đã thành công trên các đối tượng
cà chua, cà, thuốc lá và cả họ cam quýt trên thế giới. Nhưng ở Việt Nam chưa có
nghiên cứu nào tiến hành, liệu chúng ta có thể tiếp bước những thành tựu đó tạo
quả không hạt ở nước mình không? Vì vậy chúng tôi thực hiện đề tài: “Xây dựng
quy trình chuyển gen mẫn cảm auxin hoạt động đặc thù bầu nhụy vào giống


quýt Đường Canh (Citrus reticulata) thông qua Agrobacterium tumefaciens
tạo quả không hạt”.
1.2. Mục đích, yêu cầu
1.2.1. Mục đích
Chuyển được gen rolB mẫn cảm auxin tạo quả không hạt ở giống quýt
Đường canh.
1.2.2. Yêu cầu
• Xây dựng được quy trình chuyển gen vào quýt Đường canh.
• Xác định được thời gian đồng nuôi cấy thích hợp.
• Xác định được thời gian lây nhiễm mẫu thích hợp.
• Ảnh hưởng của Acetosyringone tới khả năng biến nạp của vi khuẩn.
• Xác định được môi trường đồng nuôi cấy cho vi khuẩn chuyển gen tốt nhất
• Xác định được nồng độ chất kích thích sinh trưởng thích hợp cho sự tái

sinh chồi.
• Sử dụng chất X-gluc để phát hiện nhanh vật liệu chuyển gen có chứa gen
gus.


Phần 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Giới thiệu chung về cây quýt
Quýt là loại chứa nhiều khoáng chất, vitamin, rất cần cho sức khỏe con
người, giúp chống lão hóa, kéo dài tuổi thọ, tăng sức đề kháng chống chịu bệnh
tật. Theo Hoàng Ngọc Thuận, (2000) thì các loại cam quýt nói chung trong thành
phần thịt quả có chứa 6-12% đường (chủ yếu là đường saccaroza), hàm lượng
vitamin C có từ 40-90 mg/100g tươi, các axit hữu cơ từ 0.4-1.2%, trong đó có
nhiều chất có hoạt tính sinh học cao cùng với các chất khoáng và dầu thơm. Quả
quýt dùng để ăn tươi, làm mứt, chế nước giải khát và chữa bệnh. Tinh dầu cất từ
vỏ quả, lá, hoa được dùng nhiều trong công nghiệp thực phẩm và mỹ phẩm.
Các loại quả thuộc chi Citrus đã được dùng nhiều trong y học dân tộc của
nhiều quốc gia trên thế giới. Theo Lê Quý Đôn đã viết trong “Vân đài loại ngữ”:
“Quýt vàng là thượng phẩm, quýt đỏ, quýt vá, quýt cát là hạ phẩm, vỏ quýt có tính
khoan trung, hạ khí, hạ đờm tiêu ích…”. Hải Thượng Lãn Ông đã sử dụng nhiều
quả quýt non phơi khô trong các bài thuốc của mình. Từ thế kỷ thứ XVI, các thầy
thuốc Trung Quốc, Ấn Độ đã tìm thấy tác dụng phòng ngừa bệnh dịch hạch, trị
bệnh phổi và chảy máu dưới da của các loại cam quýt. Ở Mỹ, năm 1938 các nhà
khoa học đã sử dụng kết hợp cam quýt với insulin chữa bệnh đái tháo đường. Ở
nước Nga việc sử dụng các loại quả có múi trong y học dân gian bắt đầu từ thế kỷ
XI.
Quýt là cây ăn quả lâu năm, tương đối dễ trồng, ít kén chọn đất, là loại cây ăn
quả có năng suất ổn định nhất hiện nay. Trên thế giới quýt được trồng hơn 100
nước, chủ yếu ở các nước nhiệt đới và á nhiệt đới, năm 2001 sản suất khoảng 100
triệu tấn và diện tích chiếm 7,2 triệu ha. Các nước xuất khẩu cam quýt chính bao



gồm: Tây Ban Nha, Ixaren, Italia, Braxin, Mỹ… Các giống quýt được mô tả lần
đầu tiên vào năm 1837 và được trồng khắp các vùng trồng cam quýt trên thế giới.
Sản lượng và tỷ trọng ngày càng tăng. Theo nhiều tác giả quýt là loại có nguồn
gốc ở nước ta từ lâu đời. Vì vậy hiện nay số lượng giống được phổ biến trong sản
xuất rất nhiều mặc dù chỉ qua con đường chọn giống dân gian.
Trong các giống quýt trồng phổ biến ở nước ta hiện nay thì quýt Đường Canh
(Citrus reticulata) mà nhân dân ta vẫn quen gọi là cam được trồng hầu hết các địa
phương trong nước. Đặc điểm của loại quýt này là vỏ mỏng và dai nên nhiều nơi gọi
là cam giấy, quả tròn dẹt, vỏ màu đỏ da cam hoặc đỏ gấc rất hấp dẫn. Quả có 10-12
múi, thịt quả có màu vàng da cam đậm, con tép mịn, ăn ngọt và ít hạt. Tuy nhiên,
nhược điểm chính của loại quýt này là hàm lượng axit citric thấp (0,3-0,5%) nên có vị
ngọt mát, không thích hợp với khẩu vị người tiêu dùng ngoài nước. Vì vậy muốn phát
triển mạnh giống này để xuất khẩu cẩn phải tuyển chọn các dạng hình có hàm lượng
axit citric cao hơn (0,8-1%). Quýt Đường Canh được chọn lọc và trồng từ xa xưa ở
làng Canh Diễn, ngày nay đã phát triển khắp các huyện ngoại thành và cũng được
trồng nhiều ở các huyện Văn Giang, Mỹ Văn (Hưng Yên). Cây sinh trưởng khỏe
nhưng thấp, cành nhỏ và phân cành rất mạnh. Lá có màu xanh đậm hoặc xanh vàng,
túi dầu tinh nhỏ và có mùi thơm nhẹ. Giống chín sớm có kích thước lá to hơn giống
chín muộn, mép lá không có răng cưa, gợn sóng và dày, đuôi lá nhọn và dài, cuống
ngắn, gần như không có eo lá. Cây ra quả rất sớm, có thể có quả ngay trong vườn
ươm, trên những cây ghép. Quýt Đường Canh có tính chống chịu với sâu bệnh tốt
hơn các giống khác trồng ở đồng bằng sông Hồng. Hiệu quả kinh tế của việc trồng
giống này vẫn cao hơn trồng bưởi rất nhiều.
2.2. Giới thiệu chung về công nghệ chuyển gen ở thực vật
Công nghệ chuyển gen ở thực vật là kỹ thuật đưa một hay nhiều gen lạ đã
được thiết kế ở dạng ADN tái tổ hợp vào tế bào chủ của cây trồng làm cho gen lạ
có thể tồn tại ở dạng plasmid tái tổ hợp hoặc bộ gen tế bào chủ. Trong tế bào chủ,



các gen này hoạt động tổng hợp nên các protein đặc trưng dẫn tới việc xuất hiện
các đặc tính mới ở cơ thể chuyển gen.
2.2.1. Các phương pháp chuyển gen
Các phương pháp chuyển gen hiện nay được chia làm hai nhóm chính:
• Các phương pháp chuyển gen trực tiếp
Trong các phương pháp này gen được chuyển trực tiếp vào tế bào thực vật
thông qua những thiết bị hoặc thao tác nhất định không cần phải nhờ các sinh vật
trung gian. có các phương pháp chính sau:
• Phương pháp chuyển gen nhờ xung điện
• Phương pháp chuyển gen nhờ vi tiêm
• Phương pháp chuyển gen trực tiếp qua ống phấn
• Phương pháp chuyển gen nhờ súng bắn gen
• Chuyển gen trực tiếp vào protoplas
• Phương pháp chuyển gen nhờ siliconcacbit
• Các phương pháp chuyển gen gián tiếp:
• Phương pháp chuyển gen nhờ virus
• Phương pháp chhuyển gen thông qua Agrobacterium
2.2.2.

Phương pháp chuyển gen gián tiếp nhờ vi khuẩn Agrobacterium

tumefaciens
Agrobacterium tumefaciens có khả năng xâm nhiễm tế bào thực vật bằng
cách chuyển một đoạn DNA của nó vào tế bào thực vật. Khi DNA vi khuẩn được
hợp nhất với nhiễm sắc thể thực vật, nó sẽ tấn công vào hệ thống tổ chức của tế
bào một cách có hiệu quả và sử dụng nó để đảm bảo cho sự sinh sôi của quần thể
vi khuẩn, gây ra bệnh khối u và bệnh lông rễ ở nhiều loài cây ăn quả và cây cảnh.


Để khai thác và sử dụng A.tumefaciens như một vector chuyển gen các nhà

khoa học đã loại bỏ gen gây khối u và gen mã hóa opine của T-DNA và thay thế
vào đó là các marker chọn lọc trong khi vẫn duy trì bờ trái và bờ phải của T-DNA
và các gen vir. Gen chuyển được xen vào giữa của các vùng bờ của T-DNA. Nó sẽ
được chuyển vào tế bào và trở nên hợp nhất với nhiễm sắc thể tế bào thực vật.
Cơ sở của phương pháp
Phương pháp này dựa trên cơ chế gây u vết thương của vi khuẩn
A.tumefaciens. Khi cây bị thương, vi khuẩn đã thâm nhập vào chỗ bị thương và
gây khối u. Tiến hành phân tích thành phần các chất trong khối u thì thấy có nhiều
chất lạ. Phân tích hóa sinh các hợp chất đó thì phát hiện các phức hợp argininxetoaxit, những hợp chất không có ở thực vật, vi khuẩn đã sử dụng những hợp
chất đó trong quá trình đồng hóa. Như vậy vi khuẩn đã chuyển vào trong tế bào
thực vật tác nhân gây u và những tác nhân đó tổng hợp nên những hợp chất mới
(Trần Quốc Dung, 2006).
Đặc điểm của vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens
Vi

khuẩn

Agrobacterium

tumefaciens

thuộc

bộ

Rhizobiales,

họ

Rhizobiaceae, chi Agrobacterium, loài Agrobacterium tumerfaciens (Smith và

Townsend, 1907).
Agrobacterium tumefacium là vi khuẩn đất nhuộm gram (-) gây ra các khối u
ở thực vật khi xâm nhiễm qua vết thương. Tác nhân gây khối u chính là Tiplasmid có trong vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens. Ti-plasmid là một plasmid
có kích thước từ 2 - 200kb. Trên Ti-plasmid có đoạn T-ADN được giới hạn bởi bờ
trái và bờ phải có trình tự nucleotid tương tự nhau. T-DNA là đoạn nucleotid có
kích thước 25kb và mang 2 loại gen: loại gen gây u mã hóa cho một enzyme liên
quan đến tổng hợp các auxin, cytokinin và hình thành khối u; loại thứ hai liên
quan tới tổng hợp opine.


T-DNA là đoạn sẽ được chuyển vào tế bào thực vật gắn vào bộ nhiễm sắc thể
và gây ra bệnh u. Trên Ti-plasmid còn có vùng vir gồm 6 nhóm từ virA đến virG
chứa các gen chịu trách nhiệm hoạt động lây nhiễm, chuyển nạp và phân giải
opine.
Cơ chế chuyển gen thông qua Agrobacterium tumefaciens:
Khi tế bào thực vật bị thương tiết ra các hợp chất kích thích gen virA và
virG vùng gen vir của T-plasmid hoạt động. Gen virA tạo nên protein thụ cảm kết
hợp hợp chất của gen virG đi đến màng tế bào nhận tín hiệu từ tế bào thực vật.
Phức hợp này cùng với chất phenolic (như Acetocyringone) kích thích yếu tố
phiên mã tạo điều kiện cho vùng gen vir hoạt động: virD tạo nên protein cắt, cắt
bờ trái và bờ phải của đoạn T-DNA; virE tạo phức hợp protein, bao bọc và vận
chuyển đoạn T-DNA bị cắt; virB tạo lỗ ở màng tế bào vi khuẩn cho đoạn T-DNA
ra khỏi tế bào.
Khi vào tế bào thực vật, dưới tác động của enzyme phân giải protein thì vỏ
protein bao quanh T-DNA bi phân hủy. Sợi đơn T-DNA chuyển thành sợi đôi và
gắn vào DNA tế bào chủ qua chỗ đứt. Sau đó là cơ chế sửa sai và ghép nối DNA
bởi enzyme ligase tạo nên DNA tái tổ hợp.
Sản phẩm gen virE2 tạo protein gắn kết sợi đơn để bảo vệ T-DNA trong
nhân tế bào. virF hoạt động trong tế bào thực vật tạo protein điều hòa chu kỳ tế
bào và kéo dài pha S của tế bào thực vật, tạo điều kiện tốt cho sự xen đoạn TDNA. (Dandekar, 2009)



Hình 1: Cơ chế chuyển gen của vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens
(Dandekar, 2009)
2.2.3. Các phương pháp đánh giá cây chuyển gen
• Đánh giá nhờ môi trường chọn lọc
Chọn lọc tế bào là thiết lập các điều kiện nuôi cấy để tế bào đó sinh trưởng và
phát triển tốt hơn. Môi trường chọn lọc là môi trường chứa các chất ức chế sinh
trưởng hoặc các chất chọn lọc ở nồng độ mà tế bào không mang gen chuyển sẽ
chết, còn tế bào mang gen chuyển có khả năng kháng được. Môi trường chọn lọc
có thể có kháng sinh, chất diệt cỏ, muối hoặc kim loại nặng… Để chọn lọc các tế
bào mang gen chuyển nạp, người ta đưa vào vector chuyển nạp các gen chọn lọc
như gentamycin, nptII, hpt, bar, strep, cat…
• Đánh giá cây chuyển gen nhờ phương pháp PCR
Đây là phương pháp sử dụng cặp mồi để tổng hợp số lượng lớn các bản sao
từ một trình tự ADN đặc biệt dựa trên hoạt động của enzyme polymerase.
Quy trình đánh giá cây chuyển gen nhờ phương pháp PCR:


Cây chuyển gen → Chuẩn bị mẫu → tách chiết DNA → PCR → điện di đọc kết
quả
• Đánh giá cây chuyển gen nhờ phương pháp lai Western blot
Western blot bao gồm các bước sau:
• Protein được phân tách bằng điện di trên gel SDS-PAGE một hoặc hai
chiều.
• Các protein được chuyển sang màng lai nitrocellulose, giữ nguyên vị trí
như đã phân tích trên gel.
• Ủ màng lai đã cố định protein với một kháng thể sơ cấp (kháng thể đặc hiệu,
bám vào protein và tạo thành một phức hợp protein-kháng thể đối với protein quan
tâm).

• Ủ màng lai với một kháng thể thứ cấp có enzyme (alkalin phosphatase hoặc
horseradish peroxidase) đi kèm. Kháng thể thứ cấp sẽ bám vào kháng thể sơ cấp
giống như kháng thể sơ cấp bám vào protein.
• Tiếp tục ủ màng lai trong một hỗn hợp phản ứng đặc hiệu với enzyme.
• Đặt một phim nhạy cảm với tia X lên màng lai để phát hiện các điểm sáng
phát ra do enzyme (Nguyễn Quang Thạch, 2005).
• Đánh giá cây chuyển gen nhờ phương pháp lai Southern blot
Nguyên tắc của phương pháp là dùng mẫu dò đã biết để xác nhận sự hiện
diện của DNA tương đồng trong mẫu.
Southern blot gồm các bước sau
• Cắt DNA bằng enzyme hạn chế thích hợp.
• Điện di sản phẩm cắt trên gel agarose.


• Làm biến tính DNA: có thể nhúng bản gel trong dung dịch NaOH 0.5M,
DNA sợi kép sẽ được tách thành sợi đơn. Chỉ DNA sợi đơn mới được chuyển lên
màng lai.
• Chuyển DNA đã biến tính lên màng lai nitrocellulose, thực hiện lai với mẫu
dò đánh dấu để kiểm tra những đoạn DNA trên màng có trình tự bổ sung với mẫu
dò.
• Sau khi kết thú phản ứng, màng lai được rửa sạch các mẫu dò không tham
gia phản ứng.
• Phát hiện vị trí lai nhờ phóng xạ tự ghi (Nguyễn Quang Thạch, 2005).
• Đánh giá cây chuyển gen nhờ sự có mặt của gen gus

Hình 2. Phản ứng sinh màu của hóa chất X-gluc
Những cây chuyển gen chứa gen mục tiêu và gen chỉ thị gus, gen gus sẽ
được biểu hiện bởi enzyme b-glucuronidase (GUS). Khi mô thực vật được nhuộm
bởi hóa chất sinh màu X-gluc những mô chứa gen gus sẽ biến thành màu xanh.
Trong plasmid thiết kế có chứa cả gen mục tiêu và gen chỉ thị. Do đó kiểm tra sự

xuất hiện của gen chỉ thị có thể kết luận là đã thành công. Phép thử GUS cho kết


quả rõ ràng, an toàn trong các phòng thí nghiệm, dễ thực hiện và không đắt tiền
(Susan và c ng s , 2002).
2.3. Các nghiên cứu trong nước và trên thế giới tạo quả không hạt.
2.3.1. Các nghiên cứu tạo quả không hạt trên thế giới
Hạt là đặc tính khộng mong muốn của nhiều loại quả bởi vì có thể chúng
cứng hoặc dai, vị đắng và nhiều hạt còn tích tụ nhiều hợp chất độc hại cho cơ thể
con người. Hạt và khoảng trống của hạt còn thay thế phần mô quả ăn được. Tính
không hạt của quả là một đặc tính hấp dẫn ở các loài, cam quýt có số hạt trên quả
lớn, xoài có hạt to hoặc như đu đủ và dưa tây có khoảng trống hạt lớn. Đối với cà
chua thì hạt có ảnh hưởng đến vị quả, hạt nhỏ, cứng khó tiêu hóa cho người và
động vật. Còn hạt trong quả cây có múi cũng là một đặc tính không mong muốn,
làm giảm chất lượng thương phẩm của quả và tính tiện lợi sử dụng đối với người
tiêu dùng và chế biến nước quả. Vì thế ngay từ 3000 năm trước công nguyên
người Ai cập và Hy lạp cổ đại đã mong muốn tạo được quả citrus không hoặc có ít
hạt.
Nghiên cứu tạo cây ăn quả có múi không hạt trên thế giới thường tập trung
vào một số hướng chính sau đây:
• Chọn lọc các biến dị tự nhiên hoặc gây đột biến bất dục đực, chủ yếu bằng
chiếu xạ chồi hay hạt (Deng, 2000). Nhược điểm lớn nhất của phương pháp này là
hầu hết các gen đột biến là lặn, không biểu hiện ra tính trạng ở thế hệ M1. Các gen
này chỉ biểu hiện ở thế hệ M2 mọc từ hạt hoa tự thụ của cây M1. Đối với cây
citrus do giao phấn nên hầu hết các gen đều tồn tại ở trạng thái dị hợp tử do vậy
người ta chỉ có thể dễ dàng chọn lọc được các gen trội. Vì thế muốn chọn lọc được
gen lặn đột biến phải tiến hành tự thụ cây M1 thu lấy hạt, trồng thành đời sau rồi
kiểm tra đánh giá các cây về tính trạng mong muốn làm như vậy phải tốn rất nhiều
thời gian và công sức.



• Một chiến lược tạo giống tam bội bằng dung hợp tế bào trần hoặc lai hữu
tính lưỡng bội và tứ bội, tạo giống tam bội không hạt bằng nuôi cấy nội nhũ hạt
non (Gmitter và cộng sự, 1990) và dung hợp tế bào trần giữa cây nhị bội với cây
đơn bội (Kobayashi và cộng sự, 1997). Thành công của kỹ thuật này phụ thuộc
trước hết vào thành công của kỹ thuật nuôi cấy tế bào trần sau đó là kỹ thuật chọn
lọc tế bào dung hợp tam bội có đặc điểm mong muốn.
• Tạo cây tứ bội bằng xử lý đột biến in vitro bằng colchicine, rồi lai cây nhị
bội với cây tứ bội sau đó cứu phôi có thể tạo cây tam bội. Tuy nhiên phương pháp
này gặp một số khó khăn do: 1) Thiếu nguồn gen các giống tứ bội có khả năng
phối hợp cao để lai với cây nhị bội cho con lai tam bội không hạt, năng suất cao và
chất lượng tốt, 2) Các phôi tam bội hình thành sau khi lai thường bị kìm hãm phát
triên bởi mối bất hòa giữa nội nhũ và phôi, để phá vỡ mối bất hòa thì cần phải tiến
hành kỹ thuật cứu phôi non tam bội in vitro. 3) Cây tam bội thường cho nhiều quả
nhỏ, dễ bị rụng hàng loạt nên thường cho năng suất thấp (Gmitter, 1995).
Như vậy các phương pháp gây và chọn lọc tạo cây cam quýt không hạt khác
nhau, mỗi phương pháp do có ưu và nhược điểm riêng xét theo khả năng và thời
gian thành công, biểu hiện của tính trạng thu được và giá trị sử dụng của vật liệu
chọn giống tạo thành. Vì thế cần xây dựng một phương pháp nhằm tạo nhanh các
giống cam quýt không hạt trên cơ sở sử dụng các giống vô phối hoặc một phần có
tính vô phối, đang trồng phổ biến và thích ứng tốt.
Tuy nhiên sự hình thành hạt là một quá trình cần thiết cho sự phát triển quả:
sự phát triển của hạt thúc đẩy sự giãn nở tế bào theo hướng tổng hợp auxin và các
phân tử chưa biết khác. Sự tích lũy các chất chuyển hóa với sự phát triển phôi điều
khiển tỷ lệ phân chia tế bào trong mô quả, ngoài ra số lượng hạt phụ thuộc kích
thước và trọng lượng cuối cùng của quả. Như vậy, tính tạo quả không hạt là hình
thành quả được mà không làm thay đổi chất lượng của quả.
Thời gian gần đây, các phương pháp biến nạp di truyền được ứng dụng rộng
rãi trong các chương trình cải tiến di truyền chi citrus và thay thế các phương pháp



chọn giống truyền thống. Các nhà khoa học đã đưa ra một đề xuất táo bạo, một
hướng nghiên cứu mới nhằm tập trung những cố gắng để tạo ra bằng được quả
không hạt, không qua quá trình thụ phấn hoặc thụ tinh tạo thành công nhiều giống
dưa hấu không hạt, nho khô không hạt, cà và cà chua không hạt bằng công nghệ
chuyển gen và đã chứng tỏ được khả năng của thao tác di truyền để hiện thực
mong muốn này (Varoquaux và cộng sự, 2000). Vấn đề cơ bản của công nghệ
chuyển gen là phải làm sao tạo được quả không hạt nhưng vẫn duy trì được sự
phát triển của quả một cách bình thường để cho năng suất và chất lượng tốt.
Quy luật trong tự nhiên đó là thường quá trình phát triển của quả luôn gắn
liền với việc tạo hạt, không kết hạt thì quả không phát triển được, làm cho quả bị
thui hay bị rụng. Quá trình có thể tóm tắt xẩy ra như sau: hoa được thụ phấn, sau
đó là quá trình thụ tinh xẩy ra, tạo nên hợp tử, từ đó hạt được hình thành, hạt sinh
ra hấp thụ và kích thích bầu nhuy phát triển thành quả. Sơ đồ dưới đây nêu quá
trình phát triển của quả hạt bình thường và các hướng chiến lược tạo quả không
hạt (hình 3).

Parthenocarpy

Stenospermocarpy

Hình 3. Chiến lược tạo quả không hạt
Trong tự nhiên có hai quá trình xẩy ra có thể tạo được quả không hạt đó là: 1)
hiện tượng vô phối hay trinh sản (parthenocarpy) là hiện tượng quả phát triển
không cần xẩy ra quá trình thụ tinh vì thế quả không có hạt, 2) là trường hợp hạt bị


thui trong quá trình phát triển sớm của quả và như thế cũng tạo được quả không
hạt hoặc hạt bị lép và teo đi (stenospermocarpy). Đây là trường hợp tạo quả dưa
hấu tam bội không hạt là do trong cây quá trình phân bào giảm nhiễm xẩy ra bất

bình thường, còn trong trường hợp ở cây nho là do có một số sai sót nào đó xẩy ra
trong quá trình phát triển của nội nhũ dẫn đến làm thui hạt.
Hiện tượng vô phối được quan sát thấy ở rất nhiều loài cây trồng trong tự
nhiên thí dụ như ở giống quýt Satsuma của Nhật bản, đây là một giống có hạt phấn
bất dục do đó quả phát triển được nhưng không có hạt. Một giống quýt không hạt
khác được phát hiện có tên là Clementine, tính không hạt ở giống này là do tính tự
bất hợp của hạt phấn gây nên (Talon và cộng sự, 1992). Tuy nhiên, vấn đề chính
quan sát thấy ở nhiều giống có tính vô phối tự nhiên thường là có tỷ lệ kết quả
thấp và kích thước quả nhỏ hơn so với bình thường. Vì thế đối với kiểu vô phối ở
giống Satsuma thì người ta phải khắc phục bằng cách thụ phấn bổ sung, còn đối
với giống Clementine thì người ta phải phun thêm một số chất điều tiết sinh
trưởng nhóm gibberellin (GA), cytokinin hay auxin. Riêng đối với auxin có vai trò
làm tăng kích thước và khối lượng quả. Vì thế vấn đề đặt ra đối với cây họ cam
quýt là làm sao tạo được quả không hạt bằng cách kích thích tạo tính vô phối mà
không cần thụ phấn bổ sung và như thế sẽ không ảnh hưởng đến tỷ lệ đậu quả,
kích thước và khối lượng quả.
Hoạt động của các chất điều tiết sinh trưởng có trong bầu nhụy đóng vai trò
quan trọng làm kích thích quá trình kết quả và phát triển của quả sau thụ phấn và
thụ tinh. Nhiều ý kiến cho rằng sở dĩ có hiện tượng vô phối tự nhiên xẩy ra là do
liều lượng các chất điều tiết sinh trưởng trong bầu nhụy được tăng lên đã gây kích
thích quá trình kết tạo quả trong khi không cần có sự thụ phấn hay thụ tinh
(Gillaspy và cộng sự, 1993). Quan điểm này gần đây đã được kiểm chứng thông
qua thí nghiệm chuyển gen biểu hiện sản xuất đặc thù theo mô được trình bầy ở
(Hình 4). Sự phát triển của quả vô phối được quan sát thấy trên cây thuốc lá và cây
cà, trong các cây này có chứa gen iaaM lấy từ vi khuẩn Pseudomonas syringae


kết hợp với promoter DefH9 tách từ cây hoa mõm chó Antirrhinum majus (Rotino
và cộng sự, 1997). Những cây chuyển gen đã tạo được quả không hạt mà không
cần thụ tinh thậm trí ngay cả ở điều kiện môi trường khó khăn cho quá trình kết

quả so với cây không được chuyển gen. Chứng tỏ có sự tăng cường việc tổng hợp
auxin trong bầu nhụy xẩy ra ở giai đoạn phát triển sớm, với lượng đủ lớn để có thể
thay thế được việc thụ tinh, cho phép quả phát triển tiếp tục trong khi không có
quá trình thụ tinh thực xẩy ra (Hình 4). Cây cà chuyển gen này đã được đánh giá
qua ba thí nghiệm trên đồng ruộng và hai thí nghiệm trong nhà kính đều cho năng
suất cao hơn hẳn cây đối chứng không chuyển gen, hơn thế nữa chúng còn biểu
hiện cho chất lượng cao hơn (Acciarri. 2002).

Hình 4. Sơ đồ sinh và mẫn cảm auxin/GA ở bầu nhụy. (Rotino và cộng sự,
1997).
Một hướng nghiên cứu khác của Li và cộng sự (2003) đã tạo tính trạng không
hạt trên cam Valencia thông qua biến nạp Agrobacterium của callus phát sinh phôi
với plasmid chứa promoter pTA29-barnase hoạt động đặc thù ở tầng nuôi và sự
hoạt đông kết hợp với gen barnase sẽ phá vỡ tế bào tầng nuôi trong suốt quá trình
phát triển của bao phấn tạo hạt phấn bất dục hoặc thiếu hạt phấn kết quả là tạo quả
không hạt.
2.3.2. Các nghiên cứu trong nước .
Các giống cây ăn quả hiện trồng ở nước ta, trong đó có nhiều giống truyền
thống như bưởi Năm Roi, Phúc Trạch, Da xanh, Đoan Hùng, Diễn và nhiều giống
cam quýt khác đang trồng như cam Sành (Hà giang, Tuyên Quang), cam Xã đoài


(Nghệ An), cam Vân du (Thanh hoá); quýt vàng vỏ giòn, quýt chum (Hà giang)
vv. Tuy nhiên, các giống này phần lớn đều có nhiều hạt đã làm giảm chất lượng
quả và khó có thể xuất khẩu ra một số thị trường khó tính như Mỹ, Nhật Bản và
Châu Âu, vì thế cần thiết phải tìm cách làm cho quả của các giống này không hoặc
có ít hạt.
Trong số các giống đang trồng hiện nay có một số giống có tính vô phối
không hạt như Satsuma B.S (Mỹ), Cam Navel (Mỹ), giống Persian lime (Mỹ), các
giống này nếu trồng cách ly thì hoàn toàn không có hạt, nếu trồng xen với giống

khác thì có ít hạt đến không hạt như giống Persian lime, chúng đều có đặc điểm
bất dục đực, do hạt bị teo đi hoặc không có khả năng nẩy mầm (Đỗ Năng Vịnh và
cộng sự 2005). Cũng theo nhóm tác giả Đ.N. Vịnh còn phát hiện một số giống
trong điều kiện trồng cách ly và trồng xen đều có ít hạt như giống cam Hamlin có
2.0 - 2,8 hạt/quả, cam Valencia Olinda (2,0 - 3,2 hạt/quả), cam Đường canh (2,0 –
5,96 hạt/quả). Trong điều kiện trồng xen bưởi Năm Roi có trung bình 0,4 hạt/quả,
cam Sông con có 2,5 hạt/quả và quýt Chum có 6,2 hạt/quả. Tuy nhiên các giống
trên đều có nguồn gốc từ nước ngoài, vào Việt nam chưa thích ứng tốt và cho năng
suất thấp do tỷ lệ đậu quả thấp, nếu được chuyển gen sản sinh hoặc phản ứng đặc
thù bầu nhụy vào sẽ có khả năng cho năng suất cao hơn và trong tương lai sẽ được
trồng mở rộng ra sản xuất hơn.
Nghiên cứu chọn tạo giống cam quýt không hạt ở Việt Nam chủ yếu theo con
đường tìm kiếm các đột biến tự nhiên và nhập nội giống từ nước ngoài như đã
trình bầy ở trên. Ngô Xuân Bình (2005) đã nghiên cứu khá sâu về cơ chế tự bất
hợp ở cây có múi tạo quả không hạt. Công trình này cho thấy tự bất hợp là do cơ
chế ức chế sinh trưởng ống phấn của vòi nhụy được thụ phấn bởi hạt phấn có cùng
kiểu alen.
Viện Di truyền Nông nghiệp do PGS.TS. Đỗ Năng Vịnh đã và đang thực
hiện đề tài chọn tạo giống cam chanh quýt bưởi không hạt bằng con đường gây đa
bội rồi từ đó chọn lọc và tạo cây tam bội và đã thu được một số dòng đa bội đang


khảo nghiệm, bước đầu cho một số kết quả khá khả quan. Tạo dòng tứ bội bằng xử
lý colchicine tế bào invitro. Đánh giá mức bội thể bằng máy đo độ bội thể (Flow
cytomettry) chọn dòng tứ bội sử dụng làm vật liệu lai với thể lưỡng bội tạo giống
tam bội không hạt. Một hướng tạo cây tam bội khác, tác giả sử dụng là nuôi cấy
hạt nhỏ, hạt lép từ các giống địa phương trên nền môi trường MT bổ sung các chất
kích thích sinh trưởng, sau 30 ngày đem đánh giá hình thái và đo độ bội thể chọn
lọc dòng tam bội. Ngoài ra, dung hợp tế bào trần nhị bội với tế bào trần đơn bội
tạo dòng tam bội không hạt cũng được tác giả và cộng sự thực hiện.

Trường Đại học Thái nguyên do PGS.TS. Ngô Xuân Bình đang thực hiện
đề tài chọn tạo giống cây citrus không hạt bằng gây tạo và chọn lọc các dòng đột
biến bất dục cái.
Việc nghiên cứu tạo giống cam chanh quýt bưởi bằng chuyển gen sản sinh và
mẫn cảm auxin nhằm tạo quả không hoặc ít hạt chưa được tiến hành ở Việt Nam.
2.4.

Các nghiên cứu chuyển gen ở cây cam quýt bằng vi khuẩn A.

tumefaciens
Các loài trong chi Citrus nói chung và với quýt nói riêng có hệ sinh vật học
phức tạp. Một vài kiểu gen quan trọng quy định toàn bộ hay một phần hạt phấn bất
dục hoặc noãn không sinh sản được. Vì vậy không thể sử dụng làm bố mẹ trong
các chương trình chọn giống. Mặt khác có nhiều trường hợp lai bất hợp và tự bất
hợp. Phần lớn các loài là sinh sản vô phối, có nghĩa là các phôi bất định bắt nguồn
trực tiếp từ tế bào phôi tâm bao gồm sự phát triển của phôi hợp tử. Một số giống
có tính vô phối không ổn định, mức độ vô phối khác nhau, và cũng có thể không
cho quả. Hướng chuyển gen gián tiếp thông qua vi khuẩn Agrobacterium trong
chọn giống cam quýt đã được ứng dụng phổ biến trên thế giới cho nhóm cây có
múi.
Lây nhiễm là thao tác tạo điều kiện tiếp xúc của mẫu với vi khuẩn, để vi
khuẩn bám vào mẫu và thực hiện việc chuyển gen. Thời gian lây nhiễm khác nhau
ảnh hưởng đến hiệu quả chuyển gen của vi khuẩn khác nhau. Almeida và cộng sự


(2003) đã tiến hành thí nghiệm chuyển gen đoạn epicotyl của Citrus cinensis và
Citrus limonia trong các thời gian là 5, 10, 20 và 40 phút. Tác giả đã đưa ra kết
quả lây nhiễm mẫu với vi khuẩn trong 20 phút cho hiệu quả biến nạp tốt nhất.
Năm 2003, Pena và cộng sự đã tiến hành thí nghiệm tạo cam ngọt và quýt Carrizo
chuyển gen thành công khi thời gian lây nhiễm là 15 phút.

Trong giai đoạn đồng nuôi cấy, nhiệt độ có vai trò quan trọng tới hiệu quả
chuyển gen. Dillen (1997) đã báo cáo không có sự khác biệt ở nhiệt độ 19 và 23 0C
tới hiệu quả chuyển gen, nhưng lại cho kết quả GUS + thấp khi đồng nuôi cấy ở
250C. Tác giả đã cho rằng nhiệt độ giai đoạn này ảnh hưởng đến sự ổn định của TDNA xen vào. Ghorbel (2000) đưa ra nhiệt độ trong khoảng 22 - 26 0C thuận lợi
cho chuyển gen của Agrobacterium khi sử dụng mẫu cấy là đoạn thân.
Thời gian đồng nuôi cấy là khoảng thời gian mẫu cấy và vi khuẩn được
nuôi cấy trong cùng một môi trường. Thời gian này tính từ sau khi lây nhiễm mẫu
với vi khuẩn, mẫu được đặt trong môi trường đồng nuôi cấy cho đến khi đem đi
rửa khuẩn. Vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens có bản chất là vi khuẩn gây bệnh
thực vật nên ngoài tác dụng chuyển gen nó còn có ảnh hưởng xấu đến khả năng
sống và tái sinh của thực vật. Do vậy, thời gian đồng nuôi cấy thích hợp sẽ tạo
điều kiện cho vi khuẩn xâm nhiễm và tiến hành quá trình chuyển gen vào mô thực
vật, đồng thời giúp cho bước diệt khuẩn dễ dàng. Tuy nhiên trên từng đối tượng
mô khác nhau cho kết quả tốt khác nhau. Khawale và cộng sự (2006) tiến hành
đồng nuôi cấy trong 2 ngày cho kết quả cao trên đối tượng mẫu cấy là lá mầm
(cotyledon). Almeida và cộng sự (2003) đưa ra kết quả đồng nuôi cấy 3 ngày trên
đối tượng là đoạn trụ trên lá mầm (epicotyl).
Thành phần môi trường đồng nuôi cấy có vai trò quan trọng, tạo điều kiện
cho vi khuẩn xâm nhập và thực hiện chuyển gen thành công. Pena và cộng sự
(2003), đưa ra môi trường đồng nuôi cấy thích hợp cam ngọt Valencia là môi
trường giàu auxin bao gồm thành phần môi trường MS bổ sung 2 mg/L 2,4-D, 2
mg/L IAA, 1 mg/L 2i-P, Almeida và cộng sự (2003) đã dùng môi trường EME bổ