ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC Tự NHIÊN

TRẦN THỊ THANH THANH

TẠO CHỦNG VI KHUẨN EDWARDSIELLAICTALURIĐỘT BIẾN
BẰNG PHƯƠNG PHÁP KNOCKOUT GEN wzz
(O - ANTIGEN CHAIN LENGTH DETERMINANT GENE)

Chuyên ngành: Vi sinh Mã số: 60 42 40

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC
TS. NGUYỄN QUỐC BÌNH

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH - 2010
LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành khóa Cuần này, tôi đã nhận được rất nhiều sự quan tâm, động viên, giúp đỡ của


ba mẹ, thầy cô, anh chị và các bạn.
Con xin

cảm

ơn gia

đình

đã Cuôn ủng

hộ và

động viên con trong cuộc sống cũng như trên con đường học vấn.
Em xin gởi (bi cảm ơn sâu sắc tới TS. Nguyễn Quốc Bình. Thầy đã định hướng và tạo mọi điều
kiện để em hoàn thành tốt khóa Cuận. Cảm ơn Thầy đã truyền đạt cho em nhiều kiến thức và kinh
nghiệm quý báu.
Xin chân thành cảm ơn các anh chị phỏng CNSH Thủy Sản, phỏng CNSH Y Dược đã nhiệt tình
giúp đỡ em trong thời gian qua.
Cảm ơn những người bạn của tôi đã Cuôn bên cạnh chia sẽ, động viên và cổ vũ tinh thần cho
tôi trong thời gian thực hiện khóa Cuận.

Trần Thị Thanh Thanh


Trần Thị Thanh Thanh

Luận văn Thạc sĩ Sinh học

MỤC LỤC
Trang

1.1.

Tạo chủng E. icataluri đột biến gen wzz bằng phương pháp

2.2.2.1.
2.2.2.2.
Kiểm tra dòng tế bào E. ictaluri mang pKD6 bằng phản ứng


2.2.5.1.

Tạo dòng E. coli DH5a mang plasmid chứa

3.6.4.1.

Nhân dòng đoạn gen kháng kanamycin trong E. coli DH5a

DANH MUC CÁC KÍ HIÊU, TỪ VIẾT TẮT

BHI

Brain heart infusion

CD14 Cluster of differentiation 14


Trần Thị Thanh Thanh
CNSH Công nghệ sinh học
CFU
Colony forming units

vill

DNA

Deoxyribonucleic acid

dNTP


Deoxynucleotide triphosphate

FRT

Flippase Recognition Target

LB

Luria bertani

LPS

Lipopolysaccharide

MCS

Multi cloning site

NCBI

National Center for Biotechnology Information

OMP

Outer membrane protein

OD

Optical density


PCR

Polymerase chain reaction

RNA

Ribonucleic acid

TCR

T cell receptor

Luận văn Thạc sĩ Sinh học


DANH MỤC CÁC BẢNG
TrầnThành
Thị Thanh
Thanhứng PCR....................................
Bảng 2.1.
phần phản

Luận văn Thạc sĩ Sinh học
1


DANH MỤC •CÁC HÌNH
Trần Thị Thanh Thanh

Luận văn Thạc sĩ Sinh học



Trần Thị Thanh Thanh

Luận văn Thạc sĩ Sinh học

Hình 3.6. Kết quả so sánh trình tự nucleotide của gen wzz của chủng E. ictaluri cung cấp
bởi Trung tâm CNSH so với chủng E. ictaluri 93-146 trên ngân hàng gen

Hình 3.18. Kết quả so sánh trình tự nucleotide đoạn Twzz được nhân dòng trong
pJET1.2/blunt so với chủng E. ictaluri 93-146 trên ngân hàng gen NCBI bằng công

Hình 3.31. Kết quả điện di sản phẩm PCR cặp mồi WF1/WR1 trên gel

DANH MỤC SƠ ĐỒ


Trần Thị Thanh Thanh

Luận văn Thạc sĩ Sinh học

MỞ ĐẦU
Cá tra (Pangasius hypophthalmus) là loài cá có tiềm năng xuất khẩu lớn và mang
lại lợi nhuận cao cho người nuôi. Theo Hiệp hội Chế biến và Xuất khẩu thuỷ sản Việt Nam
(The Vietnam Association of Seafood Exporters and Producers - VASEP), sản phẩm cá tra
Việt Nam đang dẫn đầu thị phần thế giới (2009). VASEP dự báo, vị trí dẫn đầu thị trường
thế giới của Cá tra Việt Nam sẽ còn giữ vững trong nhiều năm
năng kinh tế

lớn


tới.

Với tiềm

như vậy, cá trahiện là một

trong những

sản phẩm xuất khẩu chủ lực của Việt Nam. Theo quy hoạch của Bộ Nông Nghiệp & Phát
Triển Nông Thôn,
ngạch xuất khẩu

đến năm 2010 sản lượng cá tra là 1,5

triệu tấn, đạt kim

1,5tỉ USD và đến năm 2020, sản lượng ước đạt

2 triệu tấn, kim

ngạch xuất khẩu 2 tỷ USD.
Một trong những giải pháp quan trọng để nâng cao sản lượng cá tra là nuôi công
nghiệp tập trung với quy mô lớn. Tuy nhiên, việc nuôi cá với mật độ cao tạo điều kiện cho
các bệnh nhiễm khuẩn phát triển và lây lan như bệnh mủ gan, bệnh đốm đỏ, bệnh do nấm,
kí sinh trùng ...Trong đó, đã và đang gây thiệt hại nghiêm trọng nhất là bệnh gan thận mủ
do vi khuẩn Edwardsiella ictaluri gây ra. Khi cá bị nhiễm bệnh, tỷ lệ chết có thể lên đến
90%. Để điều trị bệnh, người nuôi thường sử dụng thuốc hóa học và một số loại kháng sinh.
Tuy nhiên, việc sử dụng thuốc và hóa chất không đúng qui định và lặp đi lặp lại trong thời
gian dài đã dẫn đến tình trạng kháng thuốc và hiệu quả không cao. Hơn nữa, lượng tồn dư

kháng sinh trong cá không chỉ ảnh

hưởng tới chất lượng của

mà cònảnh hưởng
khỏe của người

tiêu dùng. Để

sản

phẩm,

đến sức

giải quyết vấn đề trên, biện pháp sử dụng vaccine

phòng bệnh được đánh giá là có hiệu quả, ít tốn kém và đảm bảo an toàn sinh học.
Do đó,

việc tìm kiếm các loại vaccine cho cá tra kháng

lại các bệnh

nhiễm
khuẩn đang là vấn đề cấp bách cho công nghiệp nuôi cá tại Việt Nam.
Đối với vi khuẩn E. ictaluri, O antigen được chứng minh là một kháng nguyên
mạnh và là yếu tố gây độc quan trọng. Chiều dài chuỗi O antigen được điều hòa bởi gen
wzz (length chain determinant gene). Nghiên cứu ở các loài vi khuẩn Gram âm khác như E.



Trần Thị Thanh Thanh

Luận văn Thạc sĩ Sinh học

coli, Samonella, Yersinia. cho thấy khi chủng vi khuẩn đột biến gen wzz thì O antigen sẽ
phân bố chiều dài chuỗi một cách ngẫu nhiên và có độc tính thấp hơn so với chủng hoang
dại.
Từ những thực tiễn nêu trên, chúng tôi thực hiện đề tài “Tạo chủng Edwardsiella
ictaluri đột biến gen wzz bằng phương pháp knockout gen” nhằm làm cơ sở cho việc sản
xuất vaccine nhược độc phòng bệnh cho cá tra.
Mục tiêu của đề tài

-

Tạo chủng E. ictaluri đột biến gen wzz bằng phương pháp knockout gen.
Nội dung đề tài bao gồm

-

Tạo dòng đoạn gen wzz của E. ictaluri trong E. coli DH5a.

-

Tạo chủng E. ictaluri mang plasmid pKD46.

-

Tạo chủng E. ictaluri đột biến gen


wzzbằng phương pháp 1

STEP.

-

Tạo chủng E. ictaluri đột biến gen

wzzbằng phương pháp 2

STEP.

-

Tạo chủng E. ictaluri đột biến gen

wzz bằng phương pháp sử dụng

suicide plasmid pGP704.
Loại bỏ plasmid pKD46 ra khỏi chủng E. ictaluri đột biến gen wzz


Chương 1 - TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1.

Sơ lược về vi khuẩn Edwardsiella ictaluri gây bệnh mủ gan trên cá tra
Edwardsiella ictalurí thuộc giống EdwardsieUa, họ Enterobacteríaceae, bộ

Enterobacteríales, lớp Gammaproteobacteria, ngành Proteobacteria. E. ictaluri là vi khuẩn

Gram âm, hình que, phần lớn ở dạng đơn, đôi và một ít ở dạng chuỗi, kích thước 1x 2 - 3
pm, không sinh bào tử, chuyển động nhờ tiêm mao, kị khí tùy ý, catalase dương tính,
cytocrom oxidase âm [14], [21].

Hình 1.1 Hình thái vi khuẩn Edwardsiella ictaluri E. ictaluri được
phân lập lần đầu tiên năm 1976 từ cá nheo Mỹ nhiễm bệnh [13]. Chúng phát triển chậm trên
môi trường nuôi cấy. Khi nuôi cấy trên môi trường thạch BHI ở 28 - 300C, sau 36 - 48 giờ,
vi khuẩn phát triển hình thành những khuẩn lạc nhỏ tròn lồi, trơn láng đường kính 1 - 2 mm.
E. ictaluri phát triển yếu hoặc không phát triển ở 370C [26], [36].
E. ictaluri gây bệnh nhiễm trùng máu ở cá nheo Mỹ [21] và bệnh gan thận mủ ở cá
tra, cá basa Việt Nam [1]. Khi phẩu thuật cá bệnh thấy xuất hiện những điểm hoại tử
màu trắng đục chủ yếu ở thận, lách, gan đường

kính từ 1 - 3 mm.

Bệnh gây chết hàng loạt và tỉ lệ chết rất cao có thể lên đến 90% [21].
E. ictaluri xâm nhiễm vào cá theo 2 con đường: (1) Từ nguồn nước, vi khuẩn có
thể xâm nhập vào cơ quan khứu giác thông qua mũi cá đang mở, chúng di chuyển vào bên
trong dây thần kinh khứu giác và sau đó lên não. Sự truyền nhiễm lan rộng từ màng não đến
sọ và da tạo nên những lỗ thủng trên đầu cá (thường gọi là triệu chứng “hole-in-the-head”);
(2) Vi khuẩn cũng có thể theo đường tiêu hóa và đi vào trong máu dẫn đến nhiễm trùng


máu. Bằng con đường này, vi khuẩn đi vào mao mạch trong biểu bì dẫn đến hoại tử và làm
mất sắc tố của da cá. Bệnh gây hoại tử ruột, gan, lách và viêm cầu thận trong vòng 2 tuần
sau khi nhiễm khuẩn [30].
Tuy nhiên, cơ chế gây độc của vi khuẩn vẫn chưa thực sự rõ ràng. Những nghiên
cứu về yếu tố gây độc của E. ictaluri chủ yếu tập trung vào LPS, OMP, các gen gây độc...
LPS là một nội độc tố. Ngoài ra, LPS còn vai trò chủ yếu trong sự xâm nhiễm của
vi khuẩn vào tế bào chủ và có khả năng kích thích đáp ứng miễn dịch mạnh mẽ. Nhiều

nghiên cứu đã xác định LPS là yếu tố gây độc quan trọng của vi khuẩn E. ictaluri [3], [30].
Hoạt tính chondroitinase phân giải mô sụn gây triệu chứng “hole in the head” ở cá. Copper
và cộng sự cho rằng hoạt tính chondroitinase cũng góp phần vào độc tính của E. ictaluri.
Khi cá nheo Mỹ được xử lý với chủng đột biến E. ictaluri MI 15 (bị mất hoạt tính
chondroitinase) cho thấy không có cá chết mà cũng không thấy dấu hiệu bệnh. Thune và
cộng sự (2007) cũng đã xác định những gen liên quan đến độc tính nằm trên vùng phát sinh
bệnh 26,135 bp chứa 33 gen thuộc hệ thống tiết loại III [30]. Ngoài ra, một số nghiên cứu
khác cũng xác định protein màng và hemolysine cũng là nhân tố gây độc của E. ictaluri
[17].

1.2.

Tình hình nghiên cứu vaccine cho cá kháng vi khuẩn Edwardsiella ictaluri

1.2.1.

Những nghiên cứu trên thế giới
Plumb J.A và cộng sự (1995) đã sử dụng chủng E. ictaluri chết (xử lý bằng

formalin) cấp cho cá tra bằng phương pháp ngâm tăng dần: ngâm một lần, ngâm hai lần,
ngâm và kết hợp cấp ba lần theo đường cho ăn. Kết quả cho tỉ lệ sống lần lượt là 56,7%;
64,2% và 68,8% so với lô đối chứng là 43,6% [22]. Hiện nay, loại vaccine vô hoạt này đã
được công ty dược phẩm Biomed (Mỹ) sản xuất và đưa ra thị trường với giấy phép tạm thời
để điều trị bệnh nhiễm trùng máu đường ruột cho cá nheo Mỹ [24].
Công ty sức khỏe thủy sản Escogen, Canada cũng đã sản xuất và đưa ra thị trường
vaccine E. ictaluri vô hoạt (cấp theo đường miệng) để phòng chống bệnh nhiễm trùng máu
đường ruột [24].
Tuy nhiên, các loại vaccine vô hoạt không tạo được đáp ứng miễn dịch trong thời
gian dài và hiệu quả không rõ ràng [16], [23], [24], [29], [31].



Nhiều công trình nghiên cứu khác chủ yếu tập trung vào các yếu tố gây độc và gây
đáp ứng miễn dịch của E. ictaluri như LPS, protein màng và các gen gây độc. Một số loại
vaccine nhược độc đã cho thấy khả năng phòng bệnh khá hiệu quả, và đã được thương mại
hóa trên thị trường [3].
Lauwrence và cộng sự (1997) đã nghiên cứu tạo chủng E. ictaluri nhược độc đột
biến gen purA. Chủng này được sử dụng làm vaccine cho cá nheo Mỹ theo phương pháp
ngâm một

lần ở nồng độ độ 3,65 x

107 CFU/ml cho tỉ lệ sống là

66,7% [16].
Nhóm tác giả Ronald L.Thune, Đại học bang Louisiana (1999) đã tạo thành công
chủng

E. ictaluri

đột biến gen aroA.

Chủng đột biến được sử dụng làm

vaccine bằng phương pháp ngâm một lần và ngâm tăng cường ở nồng độ 107 CFU/ml và
108 CFU/mL. Kết quả là tỉ lệ sống của cá đạt 54,1 - 63,8% khi được ngâm một lần và 77,3 94,4% khi được ngâm tăng cường [28].
Richard K.Cooper và cộng sự đã tạo thành công chủng E. ictaluri đột biến gen mã
hóa enzyme chondroitinase và đã đăng kí bản quyền (US patent No 5536658). Chủng này
đã được thử nghiệm tiêm cho cá với nồng độ 108 CFU/ml để kiểm tra độc lực. Lô cá đối
chứng được tiêm chủng hoang dại, sau 4 ngày cá biểu hiện bệnh và bắt đầu chết vào ngày
thứ 6. Lô cá được tiêm chủng đột biến không có dấu hiệu bệnh sau 2 tuần quan sát. Sau khi

tiếp tục tiêm chủng hoang dại, cá vẫn không có dấu hiệu bệnh trong khi lô cá đối chứng chết
toàn bộ. Kết quả cho thấy tỷ lệ bảo vệ của chủng đột biến là 100% [25].
Craig A và cộng sự đã nghiên cứu chủng đột biến E. ictaluri rifampicin - mutant
(RE - 33) sử dụng như một loại vaccine sống biến đổi (modified live vaccine). Chủng E.
ictaluri RE - 33 này đã được đăng kí bản quyền (US pantent
No. 6019981) và loại vaccine này hiện nay đã được thương mại hóa (AQUAVAC - ESC)
[2], [31].

1.2.2.

Những nghiên cứu ở Việt Nam
Ở nước ta hiện nay tuy đã có một số công trình nghiên cứu và phát triển vaccine

E. ictaluri cho cá tra nhưng chưa có sản phẩm thích hợp đáp ứng được nhu cầu.
Từ năm 2006 đến cuối năm 2007, Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thủy Sản II đã


kết hợp với Công ty Thuốc Thú y TW (Navetco) thực hiện đề tài cấp nhà nước “Nghiên cứu
vaccine phòng bệnh nhiễm khuẩn cho cá tra, cá ba sa, cá mú, cá giò, cá hồng mỹ nuôi công
nghiệp”, trong đó đối tượng được quan tâm đặc biệt là cá tra. Sau 2 năm thực hiện, nghiên
cứu sử dụng vaccine phòng bệnh đốm trắng cho cá tra đã đạt được một số kết quả khả quan
và có triển vọng áp dụng vào thực tế. Tuy nhiên hiện nay, vaccine vẫn còn đang thử nghiệm
chưa thương mại hóa sản phẩm

[34]

.
Công ty dược phẩm thủy sản PHARMAQ của Na Uy đã chọn cá tra Việt Nam là

đối tượng nghiên cứu vaccine cho cá nuôi ở khu vực châu Á. Từ cuối năm 2009, công ty đã

kết hợp với Đại học Cần Thơ tiến hành thử nghiệm vaccine E. ictaluri cho cá tra ở 3 điểm
thí nghiệm thuộc các tỉnh Đồng Tháp, An Giang và Bến Tre. Thử nghiệm cho kết quả khả
quan và có triễn vọng ứng dụng thực tiễn rộng rãi

[35]

.
Một nghiên cứu khác của Trường đại học Nông Lâm kết hợp với Công ty Công

nghệ Sinh học Schweizer, thử nghiệm vaccine vô hoạt (vi khuẩn đã chết) bằng phương pháp
ngâm và cho ăn 2 lần thì tỉ lệ sống là 52% [20].
Trung tâm Công Nghệ Sinh Học Thành phố Hồ Chí Minh đang tiến hành nghiên
cứu tạo các chủng E. ictaluri

đột biến nhược độc bằng phương pháp

knockout gen và phương pháp sử dụng kháng sinh rifampicin. Hiện nay, trung tâm đã tạo
được 4 chủng E. ictaluri

đột biến bao gồm: Chủng E. ictaluri kháng

rifampicin; Chủng E. ictaluri đột biến gen purA; Chủng E. ictaluri đột biến gen aroA;
Chủng E. ictaluri đột biến gen mã hóa enzyme chondroitinase. Kết quả
thử nghiệm độc lực của chủng đột biến gen purA (E. ictaluri PAM24) cho thấy chủng này
không gây chết cá ở nồng độ 3,4 x 105 CFU/ml, trong khi đó các chủng hoang dại (có ký
hiệu E. ictaluri ĐT và E. ictaluri VL33 ) gây chết cá rất cao: 92,22% và 95,56% ở nồng độ
lần lượt là 1,8x105 CFU/ml và 2,4x105 CFU/ml. Quá trình thử
đối với các

chủng


đột

nghiệm

độc lực

biếncòn lại đang

được triển khai. Một hướng nghiên cứu khác cũng đang được thực hiện tại Trung tâm là
vaccine tiểu phần dựa trên một số protein có tính kháng nguyên của E. ictaluri như OmpA,


OmpN, GAPDH. Tuy nhiên, những nghiên cứu này đang ở trong giai đoạn bước đầu thu
nhận và tinh sạch protein.

1.3.

Lipopolysacharide (LPS) và vai trò của gen wzz trong quá trình tổng hợp LPS

1.3.1.

Cấu trúc và chức năng của LPS [4], [11], [12], [27], [33]
LPS là thành phần chính của lớp màng ngoài của vi khuẩn Gram âm, góp phần

quan trọng tạo nên sự toàn vẹn cấu trúc của vi khuẩn và giúp bảo vệ màng khỏi sự tấn công
của một vài loại hóa chất. LPS cũng tăng điện tích âm của màng tế bào và giúp ổn định cấu
trúc màng nói chung.
Cấu trúc LPS gồm 3 vùng khác nhau: lipid A, oligosaccharide lõi và O antigen.


-

Lipid A thường là đường đôi glucosamine gắn với nhiều acid béo. Những chuỗi acid béo kị
nước này gắn chặt LPS vào màng tế bào vi khuẩn. Lipid A là thành phần gây độc chính của
vi khuẩn Gram âm. Khi tế bào vi khuẩn bị ly giải bởi hệ thống
những
vòng tuần

mảnh vỡ

hoàn, gây sốt, tiêu

của màng chứa

miễndịch,

lipid A được

chảy, và có thể gây sốc nội

giải phóng vào

độc tố (còn

gọi là sốc

nhiễm trùng).

-


Lõi của LPS luôn luôn chứa một thành phần oligosaccharide gắn trực tiếp với lipid A và
thường chứa đường như heptose và 3-deoxy-D-mannooctulosonic Acid (KDO, ketodeoxyoctulosonate).


-

O antigen (O polysaccharide hoặc O side chain) là domain ngoài cùng của LPS. O antigen
gồm nhiều phiên bản lặp lại (thường là 10 - 30 lần) của một đơn vịoligosaccharide (O unit).
Mỗi đơn vị Oligosaccharide gồm khoảng từ 2 đến 6 phân tử đường. O antigen được phơi
bày ra bên ngoài bề mặt tế bào vi khuẩn và do đó nó là mục tiêu nhận biết của kháng thể vật
chủ. O antigen có tính chuyên biệt kháng nguyên cao. Sự thay đổi trong cách sắp xếp và
liên kết giữa các phân tử đường trong O unit tạo nên các cấu trúc khác nhau của O antigen,
đặc trưng cho việc nhận biết kháng nguyên.

o antigen

Core Lipid A
Hình 1.2. Cấu trúc của LPS

Russell
Kỉghtley
rkm.com.au

píậ§m& mefTjpXgpe.

Hình 1.3. Cấu trúc LPS trên màng vi khuẩn Gram âm

membrane protein peripịasmic space-



Từ lâu, LPS được coi là nội độc tố và là nhân tố gây đáp ứng miễn dịch mạnh ở động
vật. LPS cũng tham gia vào quá trình sản xuất nhiều loại chất trung gian liên quan tới sốc
nhiễm khuẩn. LPS hoạt động như một nội độc tố đầu tiên bởi

vì nó

bám vào phức hợp receptor CD14/TLR4/MD2 và xúc tiến sự tiết các cytokine tiền viêm
trong nhiều loại tế bào, đặc biệt là ở đại thực bào. Ngoài ra, những nghiên cứu trong vài
năm gần đây cho thấy LPS có vai trò trong việc hoạt hóa nhiều nhân tố phiên mã.

1.3.2.

Quá trình tổng hợp LPS và vai trò của gen wzz
Trong quá trình tổng hợp LPS, Lipid A và oligosaccharide lõi được tổng hợp cùng

với nhau, trong khi O antigen được tổng hợp độc lập [11].
Hầu hết các O antigen được tổng hợp theo con đường phụ thuộc Wzy (Wzy
dependent pathway), tuy nhiên cũng có một vài loại O antigen được tổng hợp bằng các hình
thức polymer hóa khác (Wzy independent pathway) [11].
Trong con đường tổng hợp phụ thuộc Wzy, đầu tiên O unit được tổng hợp bằng
cách chuyển

liên tục những phân tử đường (từ đường tương ứng của

nucleotide) đến lipid vận chuyển undecaprenol-phosphate (UndP) nhờ những enzyme
glycosyltransferase chuyên biệt. Quá trình này xảy ra trong tế bào chất. Ban đầu, O unit
hoàn chỉnh vẫn tập hợp trên undecaprenylphosphate. Sau đó, enzyme O unit flippase (Wzx)
chuyển O unit từ màng trong ra màng ngoài. Ở đó, O unit được polymer hóa tạo thành O
antigen nhờ O antigen polymerase (Wzy) và sau đó được nối với lipid lõi A nhờ enzyme
WaaL ligase [4], [5], [12], [27]. Sự di chuyển cuối cùng của phân tử LPS hoàn chỉnh ra bề

mặt tế bào được giả thiết là điều hòa bởi một phức hợp protein ngoài màng Imp/RlpB [27].
Chiều dài chuỗi O antigen được điều hòa bởi gen wzz, còn được gọi là Cld [chain
length determinant] hay Rol [regulator of O antigen length]. Khi chủng vi khuẩn bị đột biến
gen wzz thì chiều dài chuỗi O antigen sẽ phân bố một cách ngẫu nhiên [27].
Đến nay, cơ chế protein Wzz ảnh hưởng tới quá trình polymer hóa vẫn chưa được
hiểu rõ. Bastin và cộng sự cho rằng Wzz hoạt động như thiết bị bấm giờ phân
tử, cho phép sự polymer hóa bởi Wzy tiếp tục trong một khoảng thời gian định trước nào đó
hoặc cho tới khi chiều dài đặc trưng của chuỗi O antigen được hình thành. Một giả thuyết
khác được đưa ra bởi Monora và cộng sự cho rằng protein


Wzz hoạt

động như một chaperone phân

tử để tập trung phức

hợp protein gồm

Wzy, WaaL và chuỗi polysaccharide đang được hình thành. Chiều dài O antigen chuyên biệt
là kết quả động học do tỉ lệ khác nhau của Wzy so với WaaL. Hiện nay vẫn chưa có bằng
chứng sinh hóa cụ thể nào cho cả hai mô hình này [27].
Gen wzz có tính chất bảo tồn loài cao. Protein Wzz nằm trong họ “polysaccharide
co - polymerase” (PCP). Thành viên của nhóm này liên quan đến sự điều hòa chiều dài
chuỗi của nhiều polysaccharide trong đó có O antigen, capsular polysaccharide, và
exopolysaccharide. Protein Wzz có cấu hình màng: hai xoắn helix xuyên màng
lượt nằm gần đầu amino và

đầu carboxyl. Đến


lần
nay,

thông tin cấu trúc của những protein trong họ này vẫn chưa được xác định rõ [27].

Hình 1.4. Quá trình tổng hợp LPS ở vi khuẩn Gram âm theo con đường phụ thuộc wzy.
1.1.3.
Một số nghiên cứu về gen wzz
Chiều dài của chuỗi O antigen ảnh hưởng đến cách vi khuẩn Gram âm tương tác với
các protein bổ thể của hệ miễn dịch tự nhiên. Chuỗi O antigen càng dài sẽ ngăn chặn bổ thể


tiếp cận với bề mặt tế bào để ly giải vi khuẩn. Những chủng đột biến bị mất hoàn toàn chuỗi
O antigen dễ dàng bị tiêu diệt bởi bổ thể hơn so với chủng hoang dại. Do đó, chiều dài
chuỗi O antigen có đóng vai trò quan trọng trong độc tính của vi khuẩn [15]. Chiều dài
chuỗi O antigen được điều hòa bởi gen wzz. Vì vậy, nhiều nghiên cứu đã tạo ra các chủng
đột biến gen wzz, khảo sát sự thay đổi chiều dài chuỗi O antigen và kiểm tra độc tính để tìm
ra những chủng nhược độc có triển vọng làm vaccine.
Đối với chủng E. coli O7, đột biến gen wzy biểu hiện O antigen với chỉ 1 tiểu phần
O7 antigen của chủng hoang dại. Trong khi đó, đột biến gen wzz biểu hiện chuỗi O antigen
với chiều dài ngắn hơn so với chủng hoang dại [9]. Anh hưởng của chiều dài O antigen đối
với sự kháng huyết thanh vẫn chưa được làm rõ nhưng có một vài sự liên hệ giữa chiều dài
chuỗi O antigen và độc tính của E. coli [10].
Một số loại vi khuẩn biểu hiện hai loại kiểu mẫu O antigen và được điều hòa bởi hai
gen wzz khác nhau [15]. Salmonella enterica hoang dại biểu hiện hai kiểu chuỗi O antigen:
chuỗi O antigen dài (16 đến 35 unit) được điều hòa bởi gen wzz ; chuỗi O antigen rất dài ( >
st

100 unit) được điều hòa bởi gen wzz . Murray và cộng sự đã tiến hành thử nghiệm trên
fepE


chuột với 3 chủng Salmonella enterica đột biến gen wzz.
biến

gen wzzst;chủng

đột

chủng

gen wzzf E và chủng đột biến cả

biến

ep

hai gen wzz J wzz . Kết quả cho thấy chủng đột biến cả hai gen wzz Jwzz
s

đột

fepE

s

fepE

cho kết quả

chuỗi O antigen ngắn hơn, nhạy với huyết thanh hơn và có độc lực thấp nhất. Chủng đột

biến gen wzz không biểu hiện chuỗi O antigen dài, nhạy cảm với huyết thanh và có độc lực
st

thấp hơn so với chủng hoang dại. Đột biến gen wzz không khác nhiều so với chủng hoang
fepE

dại [18].
Ở Pseudomonas aeruginosa PAO1, chủng hoang dại chủ yếu biểu hiện hai loại O
antigen dài và rất dài được điều hòa bởi hai gen wzzi và wzz2. Đột biến gen wzzi làm giảm
sự biểu hiện của chuỗi O antigen dài, đột biến gen wzz2 dẫn đến
không biểu hiện chuỗi O antigen rất dài. Chủng đột biến cả hai gen wzz1 và wzz2 giảm biểu
hiện cả hai loại chuỗi O antigen. Các chủng đột biến đã được thử nghiệm trên chuột để kiểm
tra độc tính. Kết quả chủng đột biến cả hai gen wzzi và wzz2 có độc lực thấp nhất. Đối với
chủng hoang dại, tất cả chuột đều chết ở liều gây độc khoảng 5.5 X 105 CFU nhưng đối với


chủng đột biến cả hai gen wzz1 và wzz2 thì ở liều lượng này, chúng hoàn toàn không gây
độc. Chủng đột biến gen wzz1 cho kết quả giảm độc lực đáng kể. Liều gây chết 50% của
chủng này cao gấp 4,5 lần so với chủng hoang
biến gen wzz2

có

dại.

giảm độc lực

Chủng

đột


nhưng không

đáng kể

[15].
H. Najdenski và cộng sự đã tiến hành thí nghiệm để đánh giá vai trò của O- antigen
đối với độc tính của vi khuẩn Yersinia enterocolitica O:8. Tiến hành tiêm cho thỏ với
chủng đột

biến:

3

(i) Chủng đột biến bị mất hoàn toàn O antigen, (ii)

chủng đột biến gen wzy bị mất protein Wzy nên biểu hiện LPS với chỉ một O unit duy nhất,
(iii) chủng đột biến gen wzz bị mất protein Wzz nên biểu hiện LPS với chiều dài O antigen
phân bố một cách ngẫu nhiên. Kết quả cho thấy chủng đột biến gen wzz có độc lực thấp nhất
[19].
Những kết

quảnghiên cứu

trên chứng tỏ chiều dài của O antigen có

ảnh

hưởng lớn đến độc tính của vi khuẩn. Do đó, nghiên cứu tạo ra các chủng đột biến gen wzz
mang lại nhiều hứa hẹn trong việc sản xuất vaccine sống nhược độc [19].


1.4.

Phương pháp knockout gen sử dụng hệ thống tái tổ hợp tương đồng X Red

[7], [32]
X Red bao gồm các gen gam, bet và exo mã hóa cho một hệ thống tái tổ hợp tương
đồng rất hiệu quả. Protein Gam có khả năng bất hoạt hoạt tính exonuclease V của RecBCD,
cho phép sự biến nạp đoạn DNA dạng thẳng. Sản phẩm của gen bet và exo giúp thúc
đẩy sự tái tổ hợp ở hai vùng

tương đồng ngắn. Hệ thống này rất

hữu dụng trong việc bất hoạt các gen mục tiêu ở vi khuẩn Gram âm.
Dựa trên hệ thống X Red, một phương pháp tạo đột biến đơn giản mà không cần
tạo dòng đã được phát triển. Phương pháp này sử dụng hệ thống X Red để bất hoạt gen
thông qua sự tái tổ hợp tương đồng gữa vùng gen trên nhiễm sắc thể và đoạn DNA dạng
thẳng mang gen kháng kháng sinh với 2 bên là trình tự tương đồng với gen đích (Cassette).
Phương pháp đã được sử dụng thành công cho nhiều loại vi khuẩn Gram âm bao
gồm; E. coli, Salmonella, Yersinia, Shigella, Serratia, Klebsiella, Pseudomonas... Tuy
nhiên, độ dài trình tự tương đồng cần thiết để xảy ra tái tổ hợp tương đồng là khác nhau ở


các loài. E. coli chỉ cần trình tự tương đồng khoảng 50 nucleotide là đủ để xảy ra sự tái tổ
hợp nhưng đối với Vibrio cholerae, trình tự 100 nucleotide mới đủ để tái tổ hợp tương đồng
xảy ra. Còn đối với Y. pseudotuberculosis, đoạn tương đồng ngắn thường không đủ để xảy
ra sự tái tổ hợp mà cần phải có phải có đoạn tương đồng khoảng 500 nucleotide.

1.5. Tạo chủng E. icataluri đột biến gen wzz bằng phương pháp knockout gen và
triển vọng làm vaccine

Hiện nay, những sản phẩm được sử dụng trong phòng chống bệnh gan thận mủ do
E. ictaluri gây ra chủ yếu các loại vaccine vô hoạt. Vaccine vô hoạt là vaccine được sản
xuất trực tiếp từ chủng vi khuẩn gây bệnh, bị bất hoạt bằng nhiệt độ, áp suất hay bằng hóa
chất (formalin, glutaraldehyde...), sau đó bổ sung chất bổ trợ thích hợp để gia tăng khả năng
gây đáp ứng miễn dịch. Vaccine vô hoạt có ưu điểm là dễ sản xuất và an toàn khi sử dụng.
Tuy nhiên, loại vaccine này lại có hiệu quả không cao [34].
Trong khi đó, vaccine nhược độc sử dụng vi khuẩn sống đã giảm hoặc không còn
độc

lực lại rất có hiệu quả cao trong việc kích thích đáp ứng miễn dịch qua

trung gian tế bào cũng như duy trì nhớ miễn dịch. Do đó, việc nghiên cứu các chủng E.
ictaluri nhược độc để làm vaccine là một hướng có nhiều tiềm năng [34].
Phương pháp

tạo vi khuẩn nhược độc đơn giản nhất là phương pháp cấy

chuyền nhiều lần trong phòng thí nghiệm để làm giảm độc lực, sau đó gây nhiễm cho vật
chủ. Tuy nhiên, độc lực vi khuẩn có thể phục hồi khi chúng được tăng sinh trong cơ thể vật
chủ. Vì vậy, phương pháp này không an toàn và không thích hợp để áp dụng trong sản xuất
vaccine [34].
Hiện nay, việc tạo chủng nhược độc thường được thực hiện theo hướng tạo ra các
đột biến bằng tác nhân vật lý (nhiệt độ, tia UV), hóa học

(hóa chất, kháng

sinh), hoặc bằng phương pháp sinh học phân tử (knockout gen).
Phương pháp knockout gen được sử dụng để bất hoạt các gen độc tính hoặc các gen
cần thiết cho quá trình sinh dưỡng của vi khuẩn trong vật chủ. Các chủng này vẫn có thể
kích thích hệ thống miễn dịch của vật chủ theo con đường gây bệnh của chủng

dại

nhưng không đủ

hoang

độc để làm chết vật chủ. Vì vậy, knockout

gen là một phương pháp rất hữu dụng trong việc tạo chủng vi khuẩn đột biến nhược độc.


Đối với vi khuẩn E. ictaluri, nhiều nghiên cứu đã xác định O antigen một kháng
nguyên mạnh và là một yếu tố gây độc quan trọng. E. ictaluri biểu hiện O antigen dài và
chiều dài của O antigen được điều hòa bởi gen wzz. Ở các loài vi khuẩn Gram âm khác như
E. coli, Samonella, Pseudomonas aeruginosa, Yersinia enterocolitica, các nhà nghiên cứu
đã tạo được chủng đột biến gen wzz và cho thấy chúng có độc lực thấp hơn so với chủng
hoang dại.
Từ những cơ

sở trên, có thể thấy rằng việc sử dụng phương pháp knockout

gen dựa trên hệ thống tái tổ hợp X Red để tạo chủng E. ictaluri đột biến gen wzz mang lại
nhiều triển vọng cho việc tạo ra một loại vaccine sống nhược độc để phòng chống bệnh gan
thận mủ cho cá tra ở Việt Nam.


Chương 2 - VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.1.


Thiết bi, hóa chất, vât liêu

2.1.1.

Thiết bi và dung cu

-

Máy điện biến nạp (BTX ECM 399)

-

Máy gel doc (Biorad)

-

Máy ủ heat block techne (Dri-block DB-2D)

-

Máy ly tâm lạnh Centrifuge 5810R (Eppendorf)

-

Máy ly tâm lạnh Centrifuge 5415R (Rppendorf) 13200 max

-

Máy PCR (MasterCycler gradient) (Eppendorf)


-

Vortex (Vortex-2genie, Jencons-PLS)

-

Bộ điện di DNA Power Pac200 (Biorad)

-

Máy đo quang phổ

-

Tủ ủ 37 oC

-

Tủ ủ lắc

-

Bể điều nhiệt

-

Tủ đông sâu -80 oC

-


Tủ lạnh -20 oC

-

Tủ mát 4oC

-

Cân phân tích

-

Eppendorf 1.5 ml; 0.2 ml

-

Cuvette 2 ml; 0,2 ml

-

Và các dụng cụ chuyên dùng khác

2.1.2.

Hóa chất
2.1.2.1 Hóa chất dùng để tách chiết plasmid
- Bộ kít tách chiết plasmid của Qiagen

2.1.2.2.


Hóa chất dùng để tinh sạch sản phẩm PCR


-

Bộ kít tinh sạch sản phẩm PCR của Qiagen

2.1.2.3.
-

Hóa chất dùng để tách chiết DNA từ gel agarose
Bộ kít tách chiết DNA từ gel agarose của Qiagen

2.1.2.4.

Hóa chất dùng cho phản ứng cắt giới hạn
Các enzyme

BamHl, Xbal,

cắt giới hạn được cung

Bgầl. Các thành phần

cấp bởi Biolab: SãẴ, EcoRl,

của phản ứng cắt được sử dụng theo

hướng dẫn của nhà sản xuất.


2.1.2.5.

Hóa chất dùng cho phản ứng PCR
Các thành phần cần thiết cho phản ứng PCR được cung cấp bởi Fermentas:

Taq DNA polymerase, dNTP, MgCl2, Taq buffer 10X. Thành phần phản ứng PCR
được liệt kê trong Bảng 2.1
Bảng 2.1. Thành phần của phản ứng PCR.
Thành phần

Nồng độ cuối

Thể tích cho 1 phản ứng

Taq buffer 10X

1X

(V = 25 pl)
2,5 pl

MgCl2 25 mM

1 mM

1 pl

dNTPs 25 mM

0.2 mM


0,2 pl

Taq polymerase 5 U/pl

0.04 U

0,2 pl

Mồi xuôi 10 mM

0.2 mM

0,5 pl

Mồi ngược 10 mM

0.2 mM

0,5 pl

H2O

2.1.2.6.

19,1 pl

Hóa chất dùng cho điện di DNA

Agarose (BioLab), Tris base (Promega), Acid acetic (Merck), Bromophenol blue

(Merck), Ethidium Bromide (Merck).


2.1.2.7.

ThangDNA

Thang DNA được cung cấp bởi Fermentas bao gồm:

-

Thang DNA 100 bp

-

Thang DNA 1 kb
Thang DNA 1 kb plus
GeneRuler™
1
kb
Plus
GeneRuler™ 100DNA
bp Ladder
DNA
GeneRuler™ 1 kb DNA
Ladder 1 kb Plus DN A Ladder,
O’GeneRuler™
Ladder
0’GeneRuler 100 bp DNA
ready-to-use

O’GeneRuler™ 1 kb
Ladder,
ready-to-use
bp ng/0.5
UQ %
DNAHình
Ladder,
ready-to2.1. Thang
DNA
4
(a): Thang DNA 100 bp; (b): Thang DNA 1 kb; (c): Thang DNA 1 kb plus 200
.
00 
Si
120.0 / 
10000hóa biến
2.1.2.8.1.ỌỌ0
Hóa chất dùng cho chuẩn bị tế bào khả nạp bằng phương pháp
200
3000200
45,0
3ỌỘỘ
20
40
0 14.0
nạp
9,0
í 45,0900
25ỌỌ 2
200020.0 4.0

9.0
150080.0 16.0
0045Í0
- Glycerol 10% 1000 60.0
1000 25.0 5.0
12.0
- CaCl2 1M
' 700 25.0 5.0
750 25.0
500 75.0 15.0
5.0
400 25.0 5.0
0.5
ụgAane,
25.0
2.1.2.9.
Hóa chất dùng cho chuẩn bị 500
tế bào
khả nạp bằng phương pháp
điện
300 25.0
50 biến
8 cm length
200 25.0 50
nạp
(a
(b
(c
0.5
(ig,lane,8cm

0.5 ụglare, 8 cm
- Glycerol 10%
Q,5ụg/l
length gel, 1XTAE,
length
gel.
- Nước cất vô trùng
/s


2.1.3.

Môi trường
2.1.3.1. Môi trường LB (Luria Bertami)
Trypton Yeast extract
NaCl

10
g

g
10
2.I.3.2.
Môi trường BHI (Brain Heart Infusion)1000
37 g
BHI (Merk) Nước cất đủ
Nước cất đủ

5


1000
Môi trường thạch có thành phần như môi trường
lỏng bổ sung thêm 1,5% agar. Các
loại kháng sinh dùng để chọn lọc gồm: colistin, ampicillin, kanamycin được bổ sung vào
môi trường với nồng độ cuối là 50 pg/ml. X - gal được sử dụng ở nồng độ cuối là 40
pg/ml.

2.1.4.

Chủng vi sinh vật
Các chủng vi sinh vật sử dụng trong đề tài được cung cấp bởi Trung tâm Công
Nghệ Sinh Học Thành phố Hồ Chí Minh, bao gồm:

-

Chủng Edwardseilla ictalurí hoang dại S7

2.1.5.

Chủng Escherichia coli: E.coli DH5a; E. coli DH5a Xpir; E. coli SM10 Xpir
plasmid

2.1.5.1. Plasmid pKD4

-

Kích thước 3267 bp.

-


Mang trình tự khởi đầu sao chép ori6K gamma.

-

Mang gen kháng ampicillin và gen kháng kanamycin nằm giữa hai trình tự FRT.

Được sử dụng để tạo cassette 1 STEP.