GVHD: TS. LÊ THỊ THỦY TIÊN
HVTH: NGUYỄN THỤY HAI: 12310729
THI PHỐI PHỐI : 12310746
VŨ NGỌC LINH : 12310737


• Cây đậu phộng
Chi : Arachis
Loài : Arachis hypogaea L.
Tên tiếng Anh: peanut, groundnut.
• Vỏ đậu phộng chứa flavonoid.
• Hạt đang nảy mầm hay thân cây dưới tác động của vi sinh vật
đều sinh tổng hợp stilbene (đồng phần cis-, trans-).
• rễ cây đậu phộng chứa resveratrol với hàm lượng cao (Chen và
cs, 2001).


Stilbene
- Stilbene là phytoalexin
- Stilbene là một nhóm nhỏ của hợp
chất nhóm phenylpropanoid được
đặc trưng bởi khung 1,2diphenylethylene.
- Stilbene có khung cấu trúc cơ bản
gồm 2 vòng thơm, nối với nhau bởi
cầu nối ethylene (C6-C2-C6) thuộc
nhóm hợp chất polyphenol
- có dạng monomer, oligomer và
polimer .


Resveratrol

- 1940 phát hiện trong rễ cây Veratrum grandilorum O.
Loes.
- Resveratrol là hợp chất phổ biến nhất của nhóm stilbene.
- Tồn tại ở cả dạng đồng phân cis- và trans- .
- 1963, được tìm thấy trong rễ khô của cây Polygonum
cuspidatum (trong tiếng Nhật là Ko-jo-kon).
- Resveratrol (3,4’,5-trihydroxystilbene) ở dạng bột màu
trắng nhạt, nhiệt độ nóng chảy 253 – 2559 oC, công thức
phân tử là C14H12O3và trọng lượng phân tử 228,25 g/mol
- chống oxy hóa.
- làm giảm các bệnh về tim mạch .




• Vật liệu
- Hạt cây đậu phộng.
- Chủng vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes ATCC
15834.
• Môi trường nuôi cấy
- Môi trường Murashige and Skoog (MS)
- Môi trường Nutrient Broth (NB)
- Các tác nhân cảm ứng: AlCl2, natri acetate,vi khuẩn
- Tiền chất bổ sung: Phenylalanine


• Phương pháp
* Tạo cây con in-vitro:
• Thao tác ngoài tủ cấy: Các hạt được tách vỏ > rửa sạch bằng xà phòng -> rửa lại bằng
nước cất -> erlen chứa hạt được đậy bằng

giấy bạc và đưa vào tủ cấy vô trùng.
• Thao tác trong tủ cấy vô trùng: lắc với cồn
70o /30s- 1ph -> dung dịch sodium
hypochlorite (NaOCl) 1,5% - ngâm và lắc hạt
/7ph -> rửa lại bằng nước cất vô trùng 5 lần > cấy lên môi trường MS có bổ sung
saccharose (30 g/l) và agar (7,5 g/l) -> chiếu
sáng 16h/5 ngày ->hạt nãy mầm (cường độ
ánh sáng 2500 lux, nhiệt độ 25 – 28oC).


• Cảm ứng tạo rễ tơ, khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình
tạo rễ tơ như:
- Loại mô thích hợp để tạo rễ tơ
- Thời gian đồng nuôi cấy
- Thời gian ngâm mẫu


Loại mô thích hợp để tạo rễ tơ
Mẫu
(trụ thượng diệp, tử diệp,
trụ hạ diệp, lá, cuống lá)

Agrobacterium
rhizogenes

đồng nuôi cấy trong tối, 72h
Mẫu đối chứng
không gây
nhiễm vi khuẩn


loại VK bằng cefotaxime

nuôi cấy trên MT MS
(bổ sung saccharose 30 g/l, agar 7,5 g/l,
cefotaxime 250 mg/ml) và không có chất ĐHTT

 Phần trăm mẫu cảm ứng tạo rễ tơ và số rễ tơ trên được ghi nhận
sau 2 - 3 tuần nuôi cấy


(Tất cả các mẫu đối chứng đều không hình thành rễ)


Rễ tơ cảm ứng từ
các bộ phận khác
nhau sau 20 ngày
nuôi cấy.
A. Tử diệp
B. Trụ thượng diệp
C. Trụ hạ diệp
D. Cuống lá
E. Lá
F. Đối chứng
(Mỗi thanh ngang 1 cm)


Hình 3.2. Rễ tơ phát triển trên môi trường rắn
A. Rễ tơ cắt ra từ mẫu lá cảm ứng
B. Rễ tơ từ hình A sau 2 tuần nuôi cấy



+ Arachis hypogaea L. khá nhạy cảm với
Agrobacterium rhizogenes ATCC 15834
+ Sự cảm ứng tạo rễ tơ từ mẫu lá cao hơn so với từ
mẫu trụ hạ diệp, trụ thượng diệp, cuống lá, tử
diệp; từ đó có thể kết luận quá trình biến nạp của
vi khuẩn vào tế bào cây đậu phộng ở lá dễ dàng
hơn hơn so với các mẫu còn lại.

 mẫu lá và mẫu trụ hạ diệp được chọn làm
nguồn vật liệu đầu để xâm nhiễm, cảm ứng tạo rễ
tơ cho các thí nghiệm tiếp theo


Thời gian đồng nuôi cấy
Mẫu (trụ hạ diệp, lá)
15p

Agrobacterium
rhizogenes

Đồng nuôi cấy MT MS rắn
(24, 48, 72, 96, 120h)
loại VK bằng MT MS lỏng có cefotaxime
nuôi cấy trên MT MS rắn
(bổ sung cefotaxime 250 mg/ml)

 kiểm tra số mẫu tạo rễ tơ sau 3 tuần nuôi cấy



 Quá trình đồng nuôi
cấy đóng vai trò quan
trọng trong quá trình
biến nạp của
Agrobacterium vào tế
bào chủ.

+ thời gian đồng nuôi cấy quá ngắn, quá trình biến nạp có thể không hoàn toàn
+ thời gian đồng nuôi cấy dài có thể ảnh hưởng không tốt đến quá trình biến nạp
do ái lực của vi khuẩn với tế bào thực vật sẽ giảm hoặc sẽ ức chế cạnh tranh.


Thời gian ngâm mẫu
Để xâm nhiễm vi khuẩn vào mẫu, 3 phương pháp:
+ tiêm trực tiếp vi khuẩn vào mô
+ mẫu được cắt và ngâm trong dung dịch vi khuẩn một
thời gian

+ mẫu được cắt và tạo vết thương bởi dao cấy đã nhúng
vào dung dịch vi khuẩn
 Trong các nghiên cứu gần đây, các nhà khoa học
thường sử dụng phương pháp ngâm mẫu trong dung dịch
vi khuẩn.


Thời gian ngâm mẫu
Mẫu (trụ hạ diệp, lá)

Agrobacterium
rhizogenes


- 5p
- 10p
- 15p
- 20p
- 25p
- 30p

Đồng nuôi cấy MT MS rắn, 96h
(bổ sung saccharose 30 mg/l, agar 7,5 mg/l,
không chất điều hòa tăng trưởng)
96h

nuôi cấy trên MT MS rắn như trên
(bổ sung cefotaxime 250 mg/l)
 kiểm tra số mẫu tạo rễ tơ sau 3 tuần nuôi cấy

Loại
VK


Sự hình thành rễ tơ
có thể được chia
thành 4 bước:
 hoạt hóa
 biến đổi
 chuyển T-DNA từ
vi khuẩn vào tế bào
thực vật
 cảm ứng sự hình

thành và phát triển rễ
tơ.


Chứng minh sự chuyển gen và khảo sát khả
năng sinh trưởng của rễ tơ trong MT lỏng

- Kiểm tra sự chuyển gen

- Xây dựng đường cong tăng trưởng
của rễ tơ trong điều kiện nuôi cấy
lỏng lắc


Kiểm tra sự chuyển gen
Tách chiết
DNA bộ gen
• Đối chứng: rễ cây
đậu phộng in vitro
• Đối chứng dương:
Ri-plasmid A.
rhizogenes ATCC
15834

PCR khuếch đại
trình tự đoạn gen
chuyển.
• cặp mồi rolCF và
rolCR khuếch đại
gen rolC (626bp)

• cặp mồi rolBF và
rolBR khuếch đại
gen rolB (423 bp)

Kết luận:
gen rolB và gen
rolC từ Ri
plasmid của A.
rhizogenes ATCC
15834 đã sáp
nhập vào bộ gen
của rễ tơ Arachis
hypogaea L..


Hình 3.6. Kết quả điện di sản phẩm PCR của cặp mồi rolBF và rolBR (A);
cặp mồi rolCF và rolCR (B).
Giếng 1, 1’: Thang 100 bp
Giếng 2, 2’: Sản phẩm PCR của plasmid Ri 15834
Giếng 3,3’: Sản phẩm PCR của DNA bộ gen của rễ in vitro
Giếng 4, 5, 6, 7, 8: Sản phẩm PCR của DNA bộ gen của rễ tơ được cảm ứng từ lá, trụ
hạ diệp, trụ thượng diệp, tử diệp và cuống lá với cặp mồi rolBF và rolBR.
Giếng 4’, 5’, 6’, 7’, 8’: Sản phẩm PCR của DNA bộ gen của rễ tơ được cảm ứng từ lá,
trụ thượng diệp, trụ hạ diệp, tử diệp và cuống lá với cặp mồi rolCF và rolCR.
Giếng 9, 9’: Sản phẩm PCR của mẫu nước


Xây dựng đường cong tăng trưởng của
rễ tơ trong điều kiện nuôi cấy lỏng lắc
Rễ tơ được cảm

ứng từ mẫu lá

MT MS bổ sung
saccharose 30 g/l
điều kiện lắc 120
vòng/phút
25 – 28oC

Rễ tơ được cân
và xác định trọng
lượng 3 ngày/lần

(Trọng lượng rễ
tơ ban đầu là
0,34g)


Hình 3.7. Rễ tơ phát triển
trong môi trường lỏng lắc
theo tuần tự từ 0 đến 30
ngày (kí hiệu từ A tời M)
và hình kí hiệu N là ở
ngày 39

Về màu sắc của rễ tơ
trong quá trình tăng
trưởng, rễ phát triển đến
ngày 15 thì xuất hiện màu
vàng và càng ngày màu
càng đậm.



- rễ tơ phát triển chậm trong 6 ngày đầu

- pha tăng trưởng từ ngày nuôi cấy lỏng lắc thứ 7 đến 21
- phát triển ổn định từ ngày thứ 22 đến 30
(Trong pha tăng trưởng, rễ tơ tăng sinh khối nhanh và đáng
kể từ ngày thứ 9 đến ngày 15)
 Dựa vào kết quả này có thể chọn thời gian nuôi cấy từ
ngày 9 đến ngày 21 để bổ sung các tác nhân cảm ứng vào
môi trường nuôi cấy rễ tơ, thu nhận sinh khối để tách chiết
hợp chất stilbene khi rễ tơ 21 – 30 ngày tuổi.