BỘ GIÁO DỤC ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH


NGUYỄN THANH HOÀI

KHẢO SÁT KHẢ NĂNG TẠO PHÔI SOMA CỦA
CÂY SÂM VIỆT NAM (Panax vietnamensis Ha et Grushv.)
TRONG NUÔI CẤY IN VITRO

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH – NĂM 2012


BỘ GIÁO DỤC ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH


NGUYỄN THANH HOÀI

KHẢO SÁT KHẢ NĂNG TẠO PHÔI SOMA CỦA
CÂY SÂM VIỆT NAM (Panax vietnamensis Ha et Grushv.)
TRONG NUÔI CẤY IN VITRO

Chuyên ngành : Sinh học thực nghiệm
Mã số

: 60 42 30
LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC
PGS.TS. NGUYỄN THỊ QUỲNH

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH – NĂM 2012


Lời cam đoan
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết
quả nêu trong luận văn này là trung thực và chưa từng được công bố trong bất kỳ
công trình nào khác.

NGUYỄN THANH HOÀI


Lời cảm ơn
Em xin chân thành cảm ơn đến Ban giám hiệu, Phòng đào tạo Sau đại học,
Khoa Sinh học trường Đại Học Sư phạm Tp.HCM đã tạo mọi điều kiện thuận lợi
giúp đỡ em trong suốt quá trình học tập và hoàn thành luận văn.
Em xin gởi lời cảm ơn sâu sắc đến PGS.TS. Nguyễn Thị Quỳnh, người cô
kính mến đã hết lòng dạy bảo, động viên và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho em
trong suốt quá trình hoàn thành luận văn tốt nghiệp.
Em xin bày tỏ lời cảm ơn đến TS. Lê Thị Trung, người cô đã hết lòng giúp đỡ,
hướng dẫn và tạo mọi điều kiện cho em trong suốt quá trình học tập và hoàn thành
luận văn tốt nghiệp.
Em xin chân thành cảm ơn Ban Giám Hiệu, các thầy cô, đặc biệt là các thầy cô
tổ Sinh – Công nghệ trường THPT Võ Thị Sáu, quận Bình Thạnh đã động viên,
giúp đỡ rất nhiều để em hoàn thành được luận văn tốt nghiệp.
Em xin chân thành cảm ơn các thầy cô trong hội đồng chấm luận văn đã cho
em những đóng góp quý báu để hoàn chỉnh luận văn này.
Xin chân thành cảm ơn chị Vân, anh Hiến, chị Hạnh, Nhung, Duy, Duyên ở

phòng Công nghệ Tế bào Thực vật, Viện Sinh học Nhiệt đới đã nhiệt tình giúp đỡ
tôi trong quá trình thực hiện những nghiên cứu trong luận văn này.
Xin chân thành cảm ơn các thầy cô, các anh chị, các bạn ở phòng Sinh lý thực
vật, Khoa Sinh học trường Đại Học Sư phạm Tp.HCM và các bạn trong lớp Cao
học chuyên ngành Sinh học thực nghiệm khóa 20, đặc biệt là “ột” Thư đã động
viên, giúp đỡ tôi trong những lúc gặp khó khăn.
Và cuối cùng, tôi xin gởi lời cảm ơn sâu sắc đến ông bà, bố mẹ, em trai và
“người dưng khác họ” thân thương đã luôn ở bên cạnh chia sẻ, động viên và hỗ trợ
tôi trong suốt quá trình học tập, làm việc và hoàn thành luận văn.
Ngày 30 tháng 03 năm 2012
NGUYỄN THANH HOÀI


MỤC LỤC
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH
MỞ ĐẦU .....................................................................................................................1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .....................................................................3
1.1. GIỚI THIỆU VỀ CÂY SÂM VIỆT NAM ....................................................4
1.1.1. Đặc điểm sinh học của cây sâm Việt Nam ..............................................4
1.1.1.1. Phân loại............................................................................................4
1.1.1.2. Đặc điểm hình thái ............................................................................4
1.1.1.3. Phân bố và đặc điểm sinh thái ..........................................................8
1.1.1.4. Thành phần hóa học ..........................................................................9
1.1.2. Nguồn gốc, lịch sử phát triển trồng và khai thác cây sâm Việt Nam ....11
1.1.3. Tác dụng dược lý của sâm việt Nam .....................................................13
1.1.3.1. Bộ phận dùng làm thuốc .................................................................13
1.1.3.2. Tính năng và tác dụng dược lý........................................................14
1.1.4. Bảo tồn và nhân giống ...........................................................................14

1.1.5. Tình hình nghiên cứu vi nhân giống cây sâm Việt Nam trong nước và
trên thế giới .......................................................................................................16
1.1.5.1. Tình hình nghiên cứu vi nhân giống cây sâm Việt Nam trong nước ..
.........................................................................................................16
1.1.5.2. Tình hình nghiên cứu vi nhân giống cây sâm Việt Nam trên thế giới
.........................................................................................................19
1.2. NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO THỰC VẬT VÀ ỨNG DỤNG .........................20
1.2.1. Lịch sử nuôi cấy mô tế bào thực vật......................................................20


1.2.2. Sự phát sinh mô sẹo ...............................................................................21
1.2.3. Sự phát sinh cơ quan trong nuôi cấy in vitro .........................................22
1.2.3.1. Sự phát sinh rễ.................................................................................22
1.2.3.2. Sự phát sinh chồi .............................................................................23
1.2.4. Sự phát sinh phôi soma ..........................................................................25
1.2.4.1. Khái niệm phôi soma ......................................................................25
1.2.4.2. Sự phát sinh phôi soma ...................................................................27
1.2.4.3. Vai trò của chất điều hòa sinh trưởng thực vật trong sự phát sinh
phôi soma .....................................................................................................30
CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP .......................................................39
2.1. VẬT LIỆU .....................................................................................................40
2.1.1. Nguồn mẫu nuôi cấy ban đầu .................................................................40
2.1.2. Các thiết bị và dụng cụ ...........................................................................41
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................................................................42
2.2.1. Thí nghiệm 1: Nuôi cấy tạo mô sẹo từ lớp mỏng phiến lá và đoạn thân
khí sinh cây sâm Việt Nam in vitro ở các vị trí cắt khác nhau trên môi trường
MS có bổ sung NAA, IBA và TDZ. .................................................................42
2.2.2. Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của các loại auxin (2,4-D, NAA hay IBA) và
cytokinin (TDZ, Kin hay BA) lên khả năng phát sinh phôi soma ở lớp mỏng
phiến lá và đoạn thân khí sinh của cây sâm Việt Nam nuôi cấy in vitro. ........44

2.2.3. Thí nghiệm 3: Vai trò của ánh sáng lên sự phát sinh phôi soma trong
nuôi cấy lớp mỏng phiến lá và đoạn thân khí sinh của cây sâm Việt Nam nuôi
cấy in vitro. .......................................................................................................48
2.2.4. Thí nghiệm 4: Sự tăng trưởng của cụm chồi cây sâm Việt Nam nuôi cấy
in vitro dưới ảnh hưởng của nồng độ khoáng đa lượng MS và loại vitamin. .50


2.2.5. Thí nghiệm 5: Ảnh hưởng của các thành phần khoáng đa lượng, vi
lượng và nồng độ đường sucrose lên khả năng tăng trưởng của cụm chồi cây
sâm Việt Nam nuôi cấy in vitro........................................................................52
2.3. PHƯƠNG PHÁP TÍNH SỐ LIỆU ................................................................53
2.4. PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH THỐNG KÊ................................................55
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................56
3.1. THÍ NGHIỆM 1: Nuôi cấy tạo mô sẹo từ lớp mỏng phiến lá và đoạn thân khí
sinh của cây sâm Việt Nam in vitro ở các vị trí cắt khác nhau trên môi trường MS
có bổ sung NAA, IBA và TDZ. ............................................................................57
3.2. THÍ NGHIỆM 2: Ảnh hưởng của các loại auxin (2,4-D, NAA hay IBA) và
cytokinin (TDZ, Kin hay BA) lên khả năng phát sinh phôi soma ở lớp mỏng
phiến lá và đoạn thân khí sinh của cây sâm Việt Nam nuôi cấy in vitro..............67
3.3. THÍ NGHIỆM 3: Vai trò của ánh sáng lên sự phát sinh phôi soma trong nuôi
cấy lớp mỏng phiến lá và đoạn thân khí sinh của cây sâm Việt Nam nuôi cấy in
vitro . .....................................................................................................................83
3.4. THÍ NGHIỆM 4: Sự tăng trưởng của cụm chồi cây sâm Việt Nam nuôi cấy
in vitro dưới ảnh hưởng của nồng độ khoáng đa lượng MS và loại vitamin. .......88
3.5. THÍ NGHIỆM 5: Ảnh hưởng của các thành phần khoáng đa lượng, vi lượng
và nồng độ đường sucrose lên khả năng tăng trưởng của cụm chồi cây sâm Việt
Nam nuôi cấy in vitro. ..........................................................................................94
CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .................................................................99
4.1. KẾT LUẬN..................................................................................................100
4.2. ĐỀ NGHỊ .....................................................................................................101

TÀI LIỆU THAM KHẢO ..................................................................................... 102
PHỤ LỤC


DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
2,4-D

: Acid 2,4-diclorophenoxyacetic

2iP

: N6-[2-isopentenyl] adenosine

ABA

: Acid abscisic

BA

: N6-Benzyladenine

CĐHSTTV : Chất điều hòa sinh trưởng thực vật
CLC

: Môi trường khoáng cơ bản nuôi cấy mô sẹo sinh phôi từ cây
khoai lang của Cheé và cs. đề xuất năm 1992. Môi trường cho
sự tăng trưởng mô sẹo sinh phôi (CP).

cs.


: cộng sự

IAA

: Acid indol-3-acetic

IBA

: Acid indolbutyric

GA

: Gibberellin

Kin

: Kinetin (6 – furfurylaminopurin)

MS

: Môi trường khoáng cơ bản do Murashige & Skoog đề xuất năm
1962.

MS1/2

: Môi trường MS có hàm lượng khoáng đa lượng giảm một nửa

MS2/3

: Môi trường MS có hàm lượng khoáng đa lượng giảm còn 2/3


NAA

: Acid α-naphthalenacetic

NT

: nghiệm thức

SH

: Môi trường khoáng do Schenk & Hildebrandt đề xuất năm
1972.

TDZ

: Thidiazuron (N-phenyl-N’-1,2,3-thiadiazol-5-ylurea)

TLK

: Trọng lượng khô

TLT

: Trọng lượng tươi


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1. 1.


Phân biệt phôi soma với phôi hợp tử...................................................25

Bảng 2.1. Bố trí thí nghiệm 1a. .................................................................................42
Bảng 2.2. Bố trí thí nghiệm 1b. ................................................................................43
Bảng 2.3. Bố trí thí nghiệm 2a. .................................................................................45
Bảng 2.4. Bố trí thí nghiệm 2b. ................................................................................45
Bảng 2.5. Bố trí thí nghiệm 3a. .................................................................................48
Bảng 2.6. Bố trí thí nghiệm 3b. ................................................................................49
Bảng 2.7. Bố trí thí nghiệm 4. ..................................................................................50
Bảng 2.8. Bố trí thí nghiệm 5. ..................................................................................52
Bảng 3.1. Ảnh hưởng của nồng độ NAA, IBA và TDZ lên tỉ lệ mẫu tạo mô sẹo, vị
trí tạo mô sẹo từ phiến lá cây sâm Việt Nam in vitro ở ngày nuôi cấy thứ 56 ..
.............................................................................................................58
Bảng 3.2. Ảnh hưởng của nồng độ NAA, IBA và TDZ lên tỉ lệ mẫu tạo mô sẹo, vị
trí tạo mô sẹo từ thân khí sinh cây sâm Việt Nam in vitro ở ngày nuôi cấy thứ
56.

.............................................................................................................62

Bảng 3.3. Ảnh hưởng của các loại auxin và cytokinin lên sự phát sinh hình thái từ
lớp mỏng phiến lá của cây sâm Việt Nam nuôi cấy in vitro ở ngày thứ 84. ......
.............................................................................................................68
Bảng 3.4. Ảnh hưởng của các loại auxin và cytokinin lên sự phát sinh hình thái từ
đoạn thân khí sinh của cây sâm Việt Nam nuôi cấy in vitro ở ngày thứ 84. .....
.............................................................................................................75
Bảng 3.5. Ảnh hưởng của CĐHSTTV và ánh sáng lên sự phát sinh hình thái từ
đoạn thân khí sinh của cây sâm Việt Nam nuôi cấy in vitro ở ngày thứ 35. .....
.............................................................................................................85



Bảng 3.6. Ảnh hưởng của nồng độ khoáng đa lượng MS và loại vitamin lên khả
năng tăng trưởng của cụm chồi cây sâm Việt Nam nuôi cấy in vitro ở ngày
thứ 42. .............................................................................................................90
Bảng 3.7. Ảnh hưởng của thành phần khoáng đa lượng, vi lượng và nồng độ đường
sucrose lên khả năng tăng trưởng của cụm chồi cây sâm Việt Nam nuôi cấy
in vitro ở ngày thứ 49. ....................................................................................95


DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1.

Đặc điểm hình thái của cây sâm Việt Nam. ..........................................5

Hình 1.2.

Đặc điểm hình thái của một số loài sâm trong chi Panax. ....................7

Hình 1.3.

Vị trí địa lý của núi Ngọc Linh. ............................................................8

Hình 1.4.

Cấu trúc hóa học của Majonoside-R 2 . ................................................10

Hình 1.5.

Rễ củ khô của cây sâm Việt Nam. ......................................................13

Hình 1.6.


Viên ngậm sâm Việt Nam (Vinaginseng pastilles). ............................13

Hình 1.7.

Sắc kí đồ của sinh khối cây sâm Việt Nam in vitro nuôi cấy tại Phòng
Công nghệ Tế bào Thực vật, Viện Sinh học Nhiệt đới.. .....................19

Hình 1.8.

Sự phát triển rễ phụ từ trụ bì của rễ chính. ..........................................24

Hình 1.9.

Sự phát sinh chồi từ mô sẹo của cây sâm Việt Nam in vitro ..............24

Hình 1.10.

Sự phát triển của phôi hợp tử ở Capsella. ...........................................26

Hình 1.11.

Sự phát sinh phôi soma ở xoài (Mangifera indica L.). .......................26

Hình 1.12.

Sự phát sinh phôi soma trực tiếp từ lá cây Phalaenopsis ‘Little Steve’.
.............................................................................................................27

Hình 1.13.


Các giai đoạn của sự phát sinh phôi soma ở dịch treo tế bào cà rốt . .29

Hình 1.14.

Cấu trúc của auxin tự nhiên (IAA) và auxin tổng hợp (2,4-D, NAA và
IBA). ....................................................................................................31

Hình 1.15.

Các giai đoạn chính của sự thu nhận phôi soma . ...............................31

Hình 1.16.

Cấu trúc của một số dạng cytokinin. ...................................................34

Hình 1.17.

Cấu trúc của GA 3 . ..............................................................................35

Hình 1.18.

Cấu trúc của ABA . .............................................................................35

Hình 1.19.

Cấu trúc của ethylene . ........................................................................36


Hình 2.1. Cây sâm Việt Nam nuôi cấy in vitro tại Phòng Công nghệ Tế bào Thực

vật, Viện Sinh học Nhiệt đới. ..............................................................40
Hình 2.2. Cây sâm Việt Nam nuôi cấy trong tủ điều khiển khí hậu Percival. .........40
Hình 2.3. Thân khí sinh và phiến lá của cây sâm Việt Nam nuôi cấy in vitro. ........43
Hình 2.4. Mẫu cấy lớp mỏng phiến lá và đoạn thân khí sinh của cây sâm Việt Nam
in vitro. ................................................................................................47
Hình 2.5. Cách bố trí mẫu cấy phiến lá và đoạn thân khí sinh trên đĩa petri. ..........47
Hình 2.6. Cụm chồi cây sâm Việt Nam nuôi cấy in vitro. .......................................51
Hình 3.1. Tỉ lệ mẫu tạo mô sẹo theo thời gian nuôi cấy của lớp mỏng phiến lá cây
sâm Việt Nam in vitro. ........................................................................57
Hình 3.2. Hình thái mô sẹo hình thành từ vị trí thứ 5 của lớp mỏng phiến lá cây sâm
Việt Nam in vitro ở ngày thứ 56. ........................................................59
Hình 3.3. Tỉ lệ mẫu tạo mô sẹo theo thời gian nuôi cấy của đoạn thân khí sinh cây
sâm Việt Nam in vitro. ........................................................................61
Hình 3.4. Các thể giống phôi hình cầu và hình tim của phôi soma hình thành tại vị
trí thứ 3 của thân khí sinh cây sâm Việt Nam in vitro ở nghiệm thức có
2 mg l-1 NAA và 0,2 mg l-1 TDZ . .......................................................61
Hình 3.5. Hình thái mô sẹo hình thành từ vị trí thứ 1 của thân khí sinh cây sâm Việt
Nam in vitro sau 56 ngày nuôi cấy .....................................................63
Hình 3.6. So sánh tỉ lệ mẫu tạo mô sẹo từ mẫu cấy phiến lá và đoạn thân khí sinh
của cây sâm Việt Nam in vitro ở ngày thứ 56. ....................................65
Hình 3.7. Chồi và rễ bất định hình thành trên đoạn thân khí sinh của cây sâm Việt
Nam in vitro sau 4,5 tháng nuôi cấy. ..................................................66
Hình 3.8. Hình thái mô sẹo từ đoạn thân khí sinh của cây sâm Việt Nam in vitro
trên môi trường không có 2 mg l-1 NAA sau 9 tuần cấy chuyển. .......66


Hình 3.9. Hình thái mô sẹo và rễ hình thành từ lớp mỏng phiến lá cây sâm Việt
Nam in vitro ở các vị trí khác nhau trên môi trường MS1/2 bổ sung 2
mg l-1 2,4-D và 0,2 mg l-1 Kin ở ngày thứ 84. .....................................70
Hình 3.10. Rễ hình thành từ vị trí thứ 6 của lớp mỏng phiến lá cây sâm Việt Nam in

vitro trên môi trường MS1/2 bổ sung 2 mg l-1 IBA và 0,2 mg l-1 BA ở
ngày thứ 84.. ........................................................................................70
Hình 3.11. Mẫu cấy tại vị trí thứ 1 của phiến lá cây sâm Việt Nam in vitro sau 84
ngày nuôi cấy. .....................................................................................72
Hình 3.12. Cụm phôi soma tại vị trí gốc lớp mỏng phiến lá của cây sâm Việt Nam
in vitro sau 84 ngày nuôi cấy trên môi trường ban đầu có 2 mg l-1 IBA
và 0,2 mg l-1 Kin. .................................................................................73
Hình 3.13. Số rễ hình thành trên thân khí sinh của cây sâm Việt Nam in vitro .......76
Hình 3.14. Sự hình thành mô sẹo, chồi và rễ bất định trên mẫu cấy tại vị trí thứ 1
của thân khí sinh cây sâm Việt Nam in vitro ở ngày thứ 84. ..............77
Hình 3.15. Đoạn thân khí sinh của cây sâm Việt Nam in vitro trên môi trường
MS1/2 bổ sung 2 mg l-1 NAA và 0,2 mg l-1 BA mang một phôi hình
tim ở ngày nuôi cấy thứ 84.. ................................................................81
Hình 3.16. Phôi soma nẩy mầm thành cây hoàn chỉnh có chồi và rễ từ vị trí thứ 4
của thân khí sinh cây sâm Việt Nam in vitro trên môi trường bổ sung 2
mg l-1 IBA và 0,2 mg l-1 Kin ở ngày thứ 84. .......................................81
Hình 3.17. Chồi bất định hình thành từ vị trí thứ 4 của thân khí sinh cây sâm Việt
Nam in vitro ở ngày thứ 84. ................................................................82
Hình 3.18. Tỉ lệ mẫu tạo mô sẹo từ phiến lá của cây sâm Việt Nam in vitro vào
ngày thứ 35. .........................................................................................84
Hình 3.19. Mẫu cấy từ vị trí thứ 5 của phiến lá cây sâm Việt Nam in vitro ở ngày
thứ 35 ..................................................................................................84


Hình 3.20. Mẫu cấy từ vị trí thứ 3 của thân khí sinh cây sâm Việt Nam in vitro ở
ngày thứ 35. .........................................................................................86
Hình 3.21. Số rễ hình thành từ đoạn thân khí sinh của cây sâm Việt Nam in vitro ở
các nghiệm thức khác nhau theo thời gian nuôi cấy. ..........................86
Hình 3.22. Gia tăng số chồi/mẫu theo thời gian nuôi cấy của cụm chồi cây sâm Việt
Nam in vitro ở các nghiệm thức khác nhau.........................................89

Hình 3.23. Số rễ hình thành từ cụm chồi cây sâm Việt Nam in vitro ở các nghiệm
thức khác nhau theo thời gian nuôi cấy. ..............................................91
Hình 3.24. Cụm chồi cây sâm Việt Nam nuôi cấy in vitro sau 42 ngày nuôi cấy với
ảnh hưởng của nồng độ khoáng đa lượng MS và loại vitamin. ..........92
Hình 3.25. Cụm chồi cây sâm Việt Nam nuôi cấy in vitro sau 49 ngày nuôi cấy với
ảnh hưởng của thành phần khoáng đa lượng, vi lượng và nồng độ
đường sucrose. .....................................................................................96


MỞ ĐẦU
Tại các nước châu Á, nhân sâm được coi là vị thuốc quý đứng đầu trong các vị
thuốc đông y “sâm nhung quế phụ”, là thuốc bổ tăng lực và có nhiều tác dụng dược
lý khác. Cây sâm Việt Nam là loại nhân sâm thứ 20 được tìm thấy trên thế giới. Các
nhà khoa học Nhật Bản và Hàn Quốc đánh giá cao và xếp cây sâm Việt Nam vào
năm loại sâm quý nhất thế giới cùng với sâm Hàn Quốc, sâm Nhật Bản, sâm Mỹ,
sâm Trung Quốc. Một số nghiên cứu cho thấy số lượng và hàm lượng các
ginsenoside của sâm Việt Nam vượt trội hơn các loài sâm khác (Nguyễn Ngọc
Dung, 1995; Nguyễn Thượng Dong, 2007).
Hiện nay, sâm Việt Nam được bán trên thị trường với giá ngày càng cao, cao
hơn sâm Triều Tiên nhiều lần, dẫn đến tình trạng bị khai thác quá mức. Cây sâm
Việt Nam hiện nằm trong số 250 loài thực vật quý hiếm và đang có nguy cơ bị tuyệt
chủng trong Sách đỏ Việt Nam. Vì vậy, việc bảo tồn và phát triển loài thực vật quý
hiếm này đòi hỏi sự quan tâm của các nhà khoa học cũng như các nhà quản lý và là
nhiệm vụ vừa quan trọng vừa cấp bách về phương diện khoa học lẫn kinh tế, xã hội.
Trong thời gian qua, một số công trình nghiên cứu nhân giống và nuôi trồng
cây sâm Việt Nam trong điều kiện tự nhiên đã được công bố, song kết quả thu được
còn nhiều hạn chế. Cây sâm trồng từ hạt sinh trưởng rất chậm và phải mất 5 – 7
năm mới tạo củ có hoạt chất. Hạt sâm gieo khoảng 6 tháng mới có thể nẩy mầm, tỷ
lệ nẩy mầm thấp, lại bị dịch bệnh, chuột bọ phá hoại, cây sâm cho hoa đậu hạt cũng
ít, một cây chỉ có 1 – 2 hạt mà sau 3 năm cây mới ra hoa. Do đó, nhu cầu về các kỹ

thuật mới về nhân giống, nuôi trồng và nhân nhanh sinh khối từ cây sâm Việt Nam
đang trở nên rất bức thiết (Đỗ Huy Bích và cs., 2004).
Nghiên cứu nhân giống vô tính bằng con đường nuôi cấy mô tế bào thực vật
đã mở ra một hướng mới trong sản xuất nguyên liệu từ cây sâm Việt Nam: chủ
động được nguồn nguyên liệu dồi dào trong thời gian ngắn, phục vụ công tác
nghiên cứu, sản xuất thuốc và các sản phẩm thực phẩm chức năng. Một số phòng thí
nghiệm trong nước đã chứng minh việc nuôi cấy mô cây sâm tạo được các hợp chất


thứ cấp như cây trồng tự nhiên, hạn chế ảnh hưởng của các điều kiện nuôi cấy
khách quan bên ngoài (Nguyễn Ngọc Dung, 1995). Sự phát sinh phôi soma là một
con đường quan trọng trong nuôi cấy mô tế bào thực vật. Đây là một phương pháp
ưu việt được sử dụng để sản xuất nhiều loại cây trồng (Ammirato và cs., 1983). Ứng
dụng con đường phát sinh phôi soma ở thực vật không chỉ phục vụ công tác vi nhân
giống mà còn được phát huy trong lĩnh vực nghiên cứu cơ bản về di truyền học,
sinh học phân tử và chuyển gen ở thực vật (Nguyễn Hữu Hổ, 2009).
Vì vậy, đề tài “KHẢO SÁT KHẢ NĂNG TẠO PHÔI SOMA CỦA CÂY
SÂM VIỆT NAM (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) TRONG NUÔI CẤY IN
VITRO” được thực hiện tại Phòng Công nghệ Tế bào Thực vật, Viện Sinh học
Nhiệt đới nhằm mục đích tìm hiểu và xây dựng nên quy trình tạo phôi soma của cây
sâm Việt Nam nuôi cấy in vitro, từ đó có thể nhân giống vô tính loài sâm quý hiếm
này và góp phần bảo tồn loài sâm đặc hữu của Việt Nam.
GIỚI HẠN CỦA ĐỀ TÀI
Đề tài chỉ tập trung khảo sát hai nguồn vật liệu từ cây sâm Việt Nam in vitro là
phiến lá và thân khí sinh, ảnh hưởng của một số CĐHSTTV và ánh sáng đến sự cảm
ứng và phát sinh phôi soma. Đồng thời, đề tài cũng nghiên cứu tìm hiểu loại môi
trường nuôi cấy nhằm tăng khả năng phát triển thành cây in vitro sau khi hình thành
phôi soma, nhằm tăng số lượng và khả năng sống sót trước khi chuyển ra trồng
trong bầu đất.



CHƯƠNG 1.
TỔNG QUAN TÀI LIỆU


1.1. GIỚI THIỆU VỀ CÂY SÂM VIỆT NAM
1.1.1. Đặc điểm sinh học của cây sâm Việt Nam
1.1.1.1. Phân loại
Theo Hoàng Thị Sản (2003), Đỗ Huy Bích và cs. (2004), cây sâm Việt Nam
được phân loại như sau:
Giới

:

Plantae

Ngành

:

Magnoliophyta (Ngọc Lan)

Lớp

:

Magnoliopsida

(Ngọc Lan)


Bộ

:

Araliales

(Nhân sâm)

Họ

:

Araliaceae

(Nhân sâm)

Chi

:

Panax

(Sâm)

Loài

:

Panax vietnamensis Ha et Grushv.


(Thực vật)

Tên nước ngoài: Vietnamese ginseng.
Tên khác: Sâm Việt, Sâm Ngọc Linh, Sâm Khu Năm, Sâm trúc, Sâm đốt trúc,
Trúc tiết nhân sâm, Củ ngải rọm con, Thuốc dấu (dân tộc Xê Đăng).
1.1.1.2. Đặc điểm hình thái
Cây sâm Việt Nam là loài cây thân thảo đa niên (thậm chí trên 100 năm), cao
40 – 100 cm, sinh trưởng chậm (Phạm Hoàng Hộ, 2000; Đỗ Huy Bích và cs., 2004).
Cây sâm Việt Nam có hai loại thân là thân khí sinh (mọc trên mặt đất) và thân
rễ (nằm dưới mặt đất) (Hình 1.1a). Thân khí sinh mảnh, mọc thẳng, màu lục hoặc
hơi tím, nhỏ, đường kính 4 – 8 mm, thường tàn lụi hàng năm, thỉnh thoảng cũng tồn
tại vài thân trong vài năm. Lá của cây sâm Việt Nam thuộc loại lá kép chân vịt, mọc
vòng (Hình 1.1b). Cuống lá kép dài 6 – 12 mm, mang 3 – 5 lá chét ở ngọn thân khí
sinh, lá chét chính giữa lớn hơn cả với chiều dài lá 10 – 15 cm, chiều rộng 3 – 5 cm.
Phiến lá chét hình trứng ngược hoặc hình mác, gốc hình nêm, đầu thuôn dài thành
mũi nhọn, mép khía răng cưa nhỏ. Gân lá hình lông chim, thường có 10 cặp gân phụ
hình mạng. Phiến lá màu xanh lục, mảnh, dễ rách, có nhiều lông tơ ở hai mặt, mặt
dưới ít hơn. Cây sâm Việt Nam từ 1 – 3 năm tuổi chỉ có một lá kép duy nhất, từ
năm tuổi thứ 4 trở đi mới có 2 đến 3 lá.


Hình 1.1. Đặc điểm hình thái của cây sâm Việt Nam.
(a) Cây sâm Việt Nam Panax vietnamensis Ha et Grushv.; (b) Lá cây sâm Việt Nam
ở Tu Mơ Rông (Kon Tum); (c) Hoa; (d) Quả.
(Nguồn: Sách đỏ Việt Nam; ; />

Cụm hoa được hình thành ở cây sâm Việt Nam trên 4 – 5 năm tuổi, mọc thành
tán đơn ở ngọn thân khí sinh, cuống hoa dài 10 – 20 cm, có thể kèm 1 – 4 tán phụ
hay một hoa riêng lẻ ở phía dưới tán chính (Hình 1.1c). Mỗi tán có 60 – 100 hoa,
cuống hoa ngắn từ 1 – 1,5 cm, đài có 5 răng dài, hoa có 5 cánh, màu lục vàng với 5

nhị, chỉ nhị hình sợi, màu trắng; bầu trên 1 ô với 1 vòi nhụy. Hoa nở từ tháng 4 đến
tháng 7, ra quả từ tháng 9 – 10 hàng năm. Quả hạch, hình trứng, màu đỏ thắm, có
một chấm đen ở đỉnh (Hình 1.1d). Quả mang 1 – 2 hạt hình thận, màu trắng ngà, có
vân, mỗi cây trung bình có khoảng 10 – 30 quả. Quả chín rụng xuống đất, tồn tại
qua mùa đông và sẽ nẩy mầm vào đầu mùa xuân năm sau (Phạm Hoàng Hộ, 2000;
Đỗ Huy Bích và cs., 2004).
Thân rễ (căn hành) nạc, mọc bò ngang như củ gừng, trên hoặc dưới mặt đất
khoảng 1 – 3 cm, đường kính 1 – 2 cm, dài 30 – 40 cm, mang nhiều rễ phụ, có
nhiều đốt cong ngoằn ngoèo, không phân nhánh, dài 3 – 15 cm, đường kính 0,5 –
1,5 cm. Vỏ của thân rễ có màu nâu nhạt hay màu vàng xám, ruột màu trắng ngà,
phần cuối thân rễ đôi khi có một củ hình cầu. Thân rễ cứng, giòn, có mùi thơm nhẹ
đặc trưng, vị đắng, hơi ngọt. Mỗi năm, từ đỉnh chồi của thân rễ (kể cả phần thân rễ
phân nhánh) chỉ mọc lên một thân khí sinh mới. Thân rễ mang những vết sẹo do
thân khí sinh rụng hàng năm để lại. Mỗi vết sẹo tương đương 1 năm tuổi của cây
sâm. Căn cứ vào các vết sẹo trên thân rễ, người ta tính được tuổi của cây sâm (Phạm
Hoàng Hộ, 2000; Đỗ Huy Bích và cs., 2004).
Rễ củ có dạng hình con quay dài 2,4 – 4 cm, đường kính 1,5 – 2 cm, thường
hợp thành bó 2 – 4 rễ củ hình thoi. Rễ củ có màu nâu nhạt, có những vân ngang và
nốt các rễ con (Hình 1.1a). Thể chất của củ nạc, chắc, khó bẻ gãy, củ có vị đắng,
nhưng hơi ngọt (Phạm Hoàng Hộ, 2000; Đỗ Huy Bích và cs., 2004).
Cây sâm Việt Nam có đặc điểm hình thái tương tự với những cây sâm khác
trong chi Panax (Hình 1.2).


Hình 1.2. Đặc điểm hình thái của một số loài sâm trong chi Panax.
a. Sâm Việt Nam (Panax vietnamensis Ha et Grushv.),
b. Sâm Triều Tiên (Panax ginseng C.A. Meyer),
c. Sâm Mỹ (Panax quinquefolius),
d. Sâm Nhật (Panax japonicus C.A. Meyer).
(Nguồn: /> />


1.1.1.3. Phân bố và đặc điểm sinh thái
Trong số hơn 10 loài đã biết của chi Panax, ở Việt Nam có ba loài mọc tự
nhiên và một loài là cây nhập trồng. Cây sâm Việt Nam là loài được phát hiện sau
cùng. Đến nay, cây sâm Việt Nam mới chỉ phát hiện được duy nhất ở vùng núi
Ngọc Linh thuộc hai tỉnh Quảng Nam và Kon Tum. Ngọc Linh là dãy núi cao thứ
hai của Việt Nam, có toạ độ địa lý từ 107o50’ – 108o7’ kinh độ Đông và từ 15o0’ –
15o10’ vĩ độ Bắc (Hình 1.3). Đỉnh cao nhất là Ngọc Linh cao 2.598 m. Những điểm
trước đây vốn có cây sâm Việt Nam mọc tự nhiên từ độ cao khoảng 1.500 – 2.200
m, chủ yếu tập trung ở độ cao 1.800 – 2.000 m thuộc địa bàn của hai huyện Đăk Tô
(tỉnh Kon Tum) và Trà My (tỉnh Quảng Nam). Ngoài ra, cây sâm Việt Nam còn
phân bố tại núi Ngọc Lum Heo (Quảng Nam), Đắc Glây (Kon tum),
núi Langbian (Lâm Đồng) (Đỗ Huy Bích và cs., 2004).

Hình 1.3. Vị trí địa lý của núi Ngọc Linh.
(Nguồn: ; />

Cây sâm Việt Nam đặc biệt ưa ẩm và ưa bóng, thường mọc rải rác hay tập
trung thành từng đám nhỏ dưới tán rừng già; độ che phủ có thể tới 80% hoặc hơn.
Cây sâm chỉ chịu được cường độ chiếu sáng bằng 1/3 ánh sáng toàn phần. Môi
trường rừng có cây sâm Việt Nam mọc tự nhiên luôn ẩm ướt và thường xuyên có
mây mù. Nhiệt độ ban ngày từ 20 – 25°C, ban đêm 15 – 18°C, lượng mưa xấp xỉ
3000 mm/năm. Đất rừng ở đây được tạo thành do lá cây mục lâu ngày, có màu nâu
đen, tơi xốp, hàm lượng mùn cao và chứa nhiều nước. Trong cùng một quần thể
sâm Việt Nam có nhiều cây ở các lứa tuổi khác nhau, điều đó chứng tỏ cây sâm Việt
Nam có khả năng tái sinh tự nhiên từ hạt khá tốt (Nguyễn Ngọc Dung, 1995; Đỗ
Huy Bích và cs., 2004).
1.1.1.4. Thành phần hóa học
Cây sâm Việt Nam có hàm lượng saponin dammaran cao nhất (12 – 15%) và
số lượng các loại saponin nhiều nhất so với các loài khác của chi Panax. Trong đó,

saponin dammaran kiểu ocotillol với hàm lượng cao vượt trội (hơn 50% hoạt chất
saponin) so với các loài sâm khác, đặc biệt là hợp chất tiêu biểu Majonoside-R 2
(sâm Hàn Quốc không có) (Hình 1.4). Thân rễ và rễ củ của cây sâm Việt Nam chứa
32 hợp chất saponin nhóm triterpen, trong đó có 30 chất là saponin dammaran, là
hoạt chất có tác dụng giảm stress (Nguyễn Ngọc Dung, 1995; Nguyễn Thượng
Dong, 2007).
Theo Đỗ Huy Bích và cs. (2004), Nguyễn Thượng Dong (2007), các hợp chất
thứ cấp hiện diện trong cây sâm Việt Nam ở hai phần chính:
a) Phần dưới mặt đất (thân rễ và rễ củ)
Hợp chất saponin: Thân rễ và rễ củ cây sâm Việt Nam có 52 hợp chất
saponin gồm 26 saponin đã biết (thường thấy ở sâm Triều Tiên, sâm Mỹ, sâm Nhật)
và 26 saponin có cấu trúc mới được đặt tên là vinaginsenoside-R 1 -R 25 và 20-O-MeG.Rh 1 .
+ Các saponin dẫn chất của 20(S)-protopanaxadiol ở thân rễ và rễ củ chiếm tỉ
lệ cao hơn so với bộ phận nằm trên mặt đất, gồm 22 hợp chất với đại diện chính là
ginsenoside-Rb 1 , -Rb 3 , -Rd.


+ Các saponin dẫn chất của 20(S)-protopanaxatriol gồm 17 hợp chất với các
đại diện chính là ginsenoside-Re, -Rg 1 , notoginsenoside-R 1 .
+ Các saponin có cấu trúc ocotillol gồm 11 hợp chất, trong đó có hai loại
saponin chính là Majonoside-R 1 (0,14%) và Majonoside-R 2 (5,29%). Đặc biệt
Majonoside-R 2 chiếm gần 50% hàm lượng saponin toàn phần từ phần dưới mặt đất
của sâm Việt Nam và trở thành hợp chất chủ yếu đặc trưng cho sâm Việt Nam.
+ Các saponin dẫn chất của acid oleanolic chỉ chiếm tỉ lệ rất thấp là
ginsenoside-R 0 và hemsloside-Ma 3 .

Hình 1.4. Cấu trúc hóa học của Majonoside-R 2 .
(Nguồn: />Hợp chất polyacetylen: bảy hợp chất polyacetylen được phân lập ở phân
đoạn ít phân cực. Năm hợp chất đã được xác định cấu trúc với panaxynol và
heptadeca-1,8(E)-dien-4,6-diyn-3,10-diol là hai polyacetylen chính yếu; hai hợp

chất mới là 10-acetoxy-heptadeca-8(E)-en-4,6-diyn-3-ol và heptadeca-1,8(E),
10(E)-trien-4,6-diyn-3,10-diol.
Hợp chất steroid: β-sitosterol và daucosterin (β-sitosteryl-3-O-β-Dglucopyranosid).


Acid béo: 14 loại trong đó có các acid palmitic, acid stearic, acid oleic, acid
linoleic và acid linolenic.
Acid amin gồm 18 loại (trong đó có đủ 8 loại acid amin không thay thế) như
acid aspartic, acid glutamic, alanin, arginin, cystin, glycin, histidin, isoleucin,
leucin, lysin, methionin, phenylalanin, prolin, serin, threonin, tryptophan, tyrosin,
valin. Một số acid amin có tỉ lệ rất cao như arginin 46,66%, lysin 17,90% và
tryptophan 10,20% đã được xác định có khả năng chống lão hóa tế bào.
Nguyên tố đa lượng, vi lượng: 20 loại trong đó có K, Na, Mg, Mn, Cu, Fe,
Co, Zn, Se có tác dụng sinh học.
Hợp chất glucid gồm đường tự do 6,19% và đường toàn phần 26,77%.
Các thành phần khác như tinh dầu 0,05 – 0,1%, vitamin C 0,059%.
b) Phần trên mặt đất (lá)
Hợp chất saponin có 19 saponin dammaran đã được phân lập gồm 11 saponin
đã biết và 8 saponin có cấu trúc mới được đặt tên là vinaginsenosid-L1-L8.
+ Các saponin dẫn chất của 20(S)-protopanaxadiol.
+ Các saponin dẫn chất của 20(S)-protopanaxatriol.
+ Các saponin có cấu trúc ocotillol chỉ có một loại saponin chính là
Vinaginsenoside-R 1 (0,155%).
1.1.2. Nguồn gốc, lịch sử phát triển trồng và khai thác cây sâm Việt Nam
Trước khi có sự phát hiện từ phía các nhà khoa học, cây sâm Việt Nam đã
được các đồng bào dân tộc thiểu số Trung Trung Bộ Việt Nam, đặc biệt là dân tộc
Xê Đăng sử dụng để chữa nhiều loại bệnh theo các phương thuốc cổ truyền. Năm
1973, khu Y tế Trung Trung Bộ cử một tổ 4 cán bộ do dược sĩ Đào Kim Long làm
trưởng đoàn, kỹ sư Nguyễn Bá Hoạt, dược sĩ Nguyễn Châu Giang, dược sĩ Trần
Thanh Dân đi điều tra phát hiện cây sâm theo hướng chân núi Ngọc Linh thuộc

huyện Đắc Tô, tỉnh Kon Tum. Tháng 3 năm 1973, đoàn đã phát hiện hai cây sâm
đầu tiên ở độ cao 1800 m so với mực nước biển và sau đó là một vùng sâm rộng lớn
thuộc phía Tây núi Ngọc Linh. Sau 15 ngày nghiên cứu về hình thái, sinh thái, quần
thể, phân bố, di cư và phát tán, dược sĩ Đào Kim Long đã xác định núi Ngọc Linh là