Khóa luận tốt nghiệp

TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH - KTNN
…………………

NGUYỄN THỊ THÚY

ỨNG DỤNG KỸ THUẬT NUÔI CẤY
MÔ VÀ TẾ BÀO THỰC VẬT ĐỂ NHÂN
NHANH CÂY HOA NHÀI NHẬT
(BRUNFELDSIA HOPEANA BENTH)

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành: Di truyền học

Hà Nội - 2012

Nguyễn Thị Thúy

1

K34E Sinh - KTNN


Khóa luận tốt nghiệp

TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH - KTNN
…………………

NGUYỄN THỊ THÚY

ỨNG DỤNG KỸ THUẬT NUÔI CẤY
MÔ VÀ TẾ BÀO THỰC VẬT ĐỂ NHÂN
NHANH CÂY HOA NHÀI NHẬT
(BRUNFELDSIA HOPEANA BENTH)

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành: Di truyền học

Ngƣời hƣớng dẫn:
TS. LÊ XUÂN ĐẮC

Hà Nội - 2012

Nguyễn Thị Thúy

2

K34E Sinh - KTNN


Khóa luận tốt nghiệp

LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này, tôi xin chân thành cảm ơn TS.
Lê Xuân Đắc, Viện Công nghệ sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt
Nam đã luôn tận tình giúp đỡ, hướng dẫn tôi trong quá trình thực hiện đề tài.
Tôi xin chân thành cảm ơn toàn thể cán bộ Trại Thực nghiệm sinh học - Viện
Công nghệ sinh học đã giúp đỡ và tạo mọi điều kiện tốt nhất cho tôi hoàn

thành khóa luận.
Tôi xin cảm ơn TS. Nguyễn Như Toản đã có những đóng góp quý báu
trong quá trình tôi thực hiện đề tài. Tôi xin cảm ơn thầy cô giáo trường Đại
học sư phạm Hà Nội 2 đã truyền đạt những khiến thức và kinh nghiệm nghiên
cứu khoa học cho tôi trong suốt thời gian thực tập.
Cuối cùng, tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình và các
bạn bè - những người luôn động viên, khích lệ và giúp đỡ tôi trong suốt quá
trình học tập và thực hiện đề tài.

Hà Nội, tháng 5 năm 2012
Sinh viên

Nguyễn Thị Thúy

Nguyễn Thị Thúy

3

K34E Sinh - KTNN


Khóa luận tốt nghiệp

LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan kết quả trong luận văn tốt nghiệp này đều là sự thực,
do tôi thu thập số liệu từ thực nghiệm và qua xử lý thống kê, hoàn toàn không
có sự sao chép hay bịa đặt.
Hà Nội, tháng 5 năm 2012
Sinh viên


Nguyễn Thị Thúy

Nguyễn Thị Thúy

4

K34E Sinh - KTNN


Khóa luận tốt nghiệp

MỤC LỤC
MỞ ĐẦU

1

1. Lý do chọn đề tài

1

2. Mục tiêu đề tài

2

3. Nội dung nghiên cứu

2

4. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của đề tài


2

4.1. Ý nghĩa khoa học

2

4.2. Ý nghĩa thực tiễn

2

5. Địa điểm và thời gian nghiên cứu

2

CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

3

1.1. Các đặc điểm tự nhiên của cây Nhài nhật

3

1.2. Tình hình sản xuất hoa cây cảnh trên thế giới và Việt Nam

4

1.3. Kĩ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật và ứng dụng

5


1.3.1. Lược sử phát triển

5

1.3.2. Cơ sở khoa học của kĩ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật

8

1.3.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến nuôi cấy in vitro

9

1.3.4. Các phương pháp nhân giống in vitro

12

1.3.5. Phương pháp nhân đa chồi

16

1.3.6. Thành tựu của nuôi cấy mô tế bào thực vật

17

Nguyễn Thị Thúy

5

K34E Sinh - KTNN



Khóa luận tốt nghiệp

CHƢƠNG: 2 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

22

2.1. Vật liệu, địa điểm và thời gian nghiên cứu

22

2.1.1. Vật liệu thực vật

22

2.2.1. Dụng cụ, hóa chất

22

2.2. Phương pháp nghiên cứu

22

2.2.1. Khử trùng mẫu

22

2.2.2. Nhân nhanh bằng phương pháp nhân đa chồi

23


2.2.3. Tạo cây Nhài Nhật in vitro hoàn chỉnh

24

2.2.4. Trồng cây trong bầu

26

2.2.5. Thu thập và xử lý số liệu

27

CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

28

3.1. Tạo nguyên liệu vô trùng cây Nhài Nhật

28

3.2. Tạo đa chồi

29

3.2.1. Ảnh hưởng của BAP đến khả năng tạo chồi cây Nhài Nhật

30

3.2.2. Ảnh hưởng của tổ hợp BAP và NAA đến khả năng tạo đa


31

chồi cây Nhài Nhật
3.3. Tạo cây hoàn chỉnh

32

3.3.1. Ảnh hưởng của NAA đến khả năng hình thành rễ của cây Nhài

33

Nhật
3.3.2. Ảnh hưởng của IBA đến khả năng tạo rễ của cây Nhài Nhật

Nguyễn Thị Thúy

6

34

K34E Sinh - KTNN


Khóa luận tốt nghiệp
3.3.3. Ảnh hưởng của nồng độ MS đến sự phát triển của chồi

35

3.3.4. Ảnh hưởng của IBA trên môi trường NNE2 đến khả năng tạo rễ


36

3.3.5. Ảnh hưởng của giá thể đến tỷ lệ sống của cây trồng trong bầu

37

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

38

1. Kết luận

38

2. Kiến nghị

38

PHỤ LỤC

39

TÀI LIỆU THAM KHẢO

40

Nguyễn Thị Thúy

7


K34E Sinh - KTNN


Khóa luận tốt nghiệp

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 3.1: Tỷ lệ mẫu vô trùng và mẫu sống

24

Bảng 3.2: Ảnh hưởng BAP đến khả năng tạo chồi

30

Bảng 3.3: Ảnh hưởng của BAP và NAA đến khả năng tạo chồi

31

Bảng 3.4: Ảnh hưởng của NAA đến khả năng tạo rễ của cây

32

Nhài Nhật
Bảng 3.5: Ảnh hưởng của IBA đến khả năng tạo rễ cây Nhài

33

Nhật

Bảng 3.6: Ảnh hưởng của MS đến khả năng kéo dài chồi cây

34

Nhài Nhật
Bảng 3.7: Ảnh hưởng của IBA trên môi trường NNE2 đến khả

35

năng tạo rễ

Nguyễn Thị Thúy

8

K34E Sinh - KTNN


Khóa luận tốt nghiệp

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1: Cây Nhài Nhật tại Trại thực nghiệm sinh học

4

Hình 3.1: Mẫu vô trùng và chồi non

29


Hình 3.2: Tạo đa chồi trên môi trường NNA3

31

Hình 3.3: Tạo đa chồi trên môi trường NNB4

32

Hình 3.4: Chồi bị mô sẹo hóa trên môi trường NNC3

34

Hình 3.5: Chồi bị mô sẹo hóa trên môi trường NND2

35

Hình 3.6: Sự phát triển chồi trên môi trường NNE2

36

Hình 3.7: Sự tạo rễ trên môi trường NNF1

37

Nguyễn Thị Thúy

9

K34E Sinh - KTNN



Khóa luận tốt nghiệp

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

2,4 D

2,4 - Dichlorophenoxy Axetic Axit

BAP

6 - Benzyl Amino Purin

CTMT

Công thức môi trường

ĐC

Đối chứng

IAA

Indol - 3- Axetic Axit

IBA

3 - Indol Butyric Axit

K


Kinetin

KTST

Kích thích sinh trưởng

MS

Môi trường cơ bản của Murashige và Skoog

NAA

α- Napthalen Axetic Axit

TB

Trung bình

CS

Cộng sự

Nguyễn Thị Thúy

10

K34E Sinh - KTNN



Khóa luận tốt nghiệp

MỞ ĐẦU
1. Lý do chọn đề tài
Trong những năm gần đây cơ cấu cây trồng nông nghiệp đã chuyển đổi
nhanh chóng trong nền kinh tế thị trường, một hướng chuyển đổi quan trọng
ở nông thôn các vùng ven đô là phát triển nghề trồng hoa cây cảnh. Việc kinh
doanh hoa cây cảnh đã được xã hội đặc biệt quan tâm vì không chỉ đem lại
giá trị trong đời sống tinh thần, mà thực tế đã đem lại hiệu quả kinh tế cao
cho người sản xuất.
Trong các loài hoa cây cảnh cây, cây Nhài Nhật (Brunfeldsia hopeana
Benth) đang được người dân quan tâm trồng nhiều như là cây hoa cảnh có
giá trị. Cây Nhài Nhật có hình dáng cây và hoa hai màu rất đẹp

, được

nhiều người yêu thích vì vẻ đẹp mộc mạc và hương thơm ngọt ngào của
những bông hoa tím trắng. Cây Nhài Nhật mới chỉ được trồng ở Hà Nội và
Đà Lạt với quy mô nhỏ lẻ, chưa đáp ứng được nhu cầu ngày càng tăng của
người dân.
Hiện nay, cùng với sự phát triển mạnh mẽ của công nghệ sinh học hiện
đại, thì kỹ thuật nuôi cấy mô thực vật đã và đang được ứng dụng rộng rãi
trong các lĩnh vực nhân nhanh, phục tráng cây trồng, chọn tạo giống chống
chịu các bất lợi của môi trường, sản xuất các chất thứ cấp có hoạt tính sinh
học cao và nghiên cứu lý luận di truyền thực vật bậc cao. Kĩ thuật nuôi cấy
mô và tế bào thực vật cho phép nhân nhanh một lượng lớn cây giống trong
ống nghiệm trong thời gian ngắn nhằm tạo ra một quần thể cây con có chất
lượng đồng đều về mặt di truyền.
Xuất phát từ cơ sở trên, chúng tôi tiến hành đề tài: “Ứng dụng kỹ thuật
nuôi cấy mô và tế bào thực vật để nhân nhanh cây hoa Nhài Nhật

(Brunfeldsia hopeana Benth)’’.

Nguyễn Thị Thúy

11

K34E Sinh - KTNN


Khóa luận tốt nghiệp
2. Mục tiêu đề tài
Xác định các điều kiện môi trường thích hợp để nhân nhanh cây hoa
Nhài Nhật trong ống nghiệm.
3. Nội dung nghên cứu
- Xác định phương pháp khử trùng mẫu để đưa vào ống nghiệm.
-Xác định môi trường thích hợp để tạo đa chồi cây Nhài Nhật.
-Xác định môi trường thích hợp để tạo rễ cây Nhài Nhật.
4. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của đề tài
4.1. Ý nghĩa khoa học
Góp phần nghiên cứu khả năng nhân nhanh cây hoa Nhài Nhật bằng kỹ
thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật.
4.2. Ý nghĩa thực tiễn
Ứng dụng để nhân nhanh hàng loạt cây con để phục vụ và đáp nhu cầu thị
trường hoa cây cảnh.
5. Địa điểm và thời gian nghiên cứu
Thí nghiệm được tiến hành tại : Trại thực nghiệm sinh học - Viện Công nghệ
sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
Thời gian: Từ tháng 5/2011 đến 5/2012.

Nguyễn Thị Thúy


12

K34E Sinh - KTNN


Khóa luận tốt nghiệp
CHƢƠNG 1

TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Các đặc điểm tự nhiên của cây Nhài nhật
Tên tiếng Việt: Lài nhật, Lài hai màu, Cà hoa xanh....
Tên tiếng Anh: Manaca Rain-tree
Tên Khoa Học: Brunfeldsia hopeana Benth.
Họ: Solanaceae
Nguồn gốc xuất xứ: Brazil
Phân bố ở Việt Nam: Vùng núi Trung Bộ.
Đặc điểm hình thái : Cây gỗ nhỏ, phân cành nhánh nhiều, dài, mọc
thẳng, dạng bụi, vỏ thân nứt dọc, nhẵn. Lá thuôn hình giáo, màu xanh đậm,
bóng nhẵn, mép nguyên. Hoa mọc ở nách lá hay ngọn cây, có mùi thơm, hay
nở vào ban đêm, cũng có khi nở rộ vào giữa trưa, hoa đơn độc hay tập trung
2 - 3 chiếc ở đầu cành, có cuống ngắn, cánh tràng hợp thành ống rộng, trên
chia 5 thuỳ tròn xoè ra trên mặt phẳng, lúc mới nở màu tím sau chuyển dần
sang màu trắng. Trên một cây, hoa non và già lẫn lộn nên làm cho cụm hoa
có màu sắc thay đổi.
Đặc điểm sinh lý , sinh thái: Tốc độ sinh trưởng trung bì nh . Cây Nhài
Nhật ưa khí hậu mát , ẩm, nhiều nắng . Càng hạn cây ra hoa càng nhiều , ra
hoa quanh năm.
Nhiệt độ thích hợp cho sinh trưởng là 20- 330C, nhiệt độ thấp 8-100C
cây sinh trưởng kém. Nhài nhật ưa sáng do đó cần trồng nơi thoáng, rộng,

không bị che bóng mới cho năng suất cao và hoa mới thơm. Nhài sống được
trên nhiều loại đất khác nhau như: đất đồng bằng trung tính (pH từ 6,5 - 7),
đất đồi núi hơi chua (pH từ 3,5 - 4), đất thịt nặng, đất thịt pha cát. Nhài Nhật

Nguyễn Thị Thúy

13

K34E Sinh - KTNN


Khóa luận tốt nghiệp
cần nước để sinh trưởng và ra hoa liên tục nhưng không chịu úng do đó cần
trồng nơi cao ráo, tưới tiêu thuận lợi.
Nhài Nhật là một loài hoa đặc biệt có khả năng thay đổi màu sắc từ
lam tím sang trắng. Nhài Nhật được trồng phổ biến ở Hà Nội và Đà Lạt, được
giới chơi hoa cây cảnh rất yêu thích. Là loại cây dễ trồng, phù hợp với điều
kiện nước ta, chỉ cần đất đồng bằng trung tính, đất đồi núi hơi chua, đất thịt
nặng, đất thịt pha cát, thoát nước là có thể phát triển tốt. Nó không đòi hỏi tốn
công chăm sóc, kỹ thuật canh tác cao nhưng lại mang giá trị kinh tế cao cho
người trồng.

Hình 1.1: Cây Nhài Nhật tại Trại thực nghiệm sinh học
1.2. Tình hình sản xuất hoa cây cảnh trên thế gới và Việt Nam
Trong những tháng đầu năm 2009, kim ngạch xuất khẩu hoa các loại
sang thị trường Nhật Bản đạt khá cao. Theo số liệu thống kê của Tổng cục
Hải quan, kim ngạch xuất khẩu hoa tươi, hoa khô và các loại lá trong tháng
3/2009 đạt hơn 1 triệu USD, tăng 36% so với tháng trước và tăng tới 54,1%
so với cùng kỳ năm 2008. Tính chung 3 tháng đầu năm 2009, kim ngạch xuất
khẩu hoa các loại đạt hơn 2,3 triệu USD, tăng 35% so với cùng kỳ 2008 Xuất


Nguyễn Thị Thúy

14

K34E Sinh - KTNN


Khóa luận tốt nghiệp
khẩu hoa các loại tiếp tục tăng cao trong 10 tháng năm 2010 với kim ngạch
đạt 11,5 triệu USD, tăng 37,9% [36].
Số liệu điều tra về tình hình phát triển hoa của Hà Nội những năm gần
đây cho thấy tỷ lệ diện tích trồng hoa các loại ngày càng tăng lên không
ngừng qua các năm. Những vùng sản xuất hoa các loại có thể kể đến: Đà Lạt,
Hà Nội, Hải Phòng, Lào Cai, Thành phố Hồ Chí Minh, trong đó Đà Lạt là nơi
lý tưởng cho việc sinh trưởng và phát triển hầu hết các loại hoa [36].
Bên cạnh đó, với địa hình đồi núi cao, chia cắt mạnh đã tạo nên những
tiểu vùng khí hậu nhiệt đới, á nhiệt đới và ôn đới, hoa là cây trồng đang trở
thành ưu thế trong sản xuất nông nghiệp tại tỉnh Lào Cai. Lào Cai có 97,5ha
hoa các loại, đạt giá trị 16.033 triệu đồng, vùng trồng hoa tập trung tại thị xã
Lào Cai và huyện Bảo Thắng [36].
Theo chương trình phát triển sản xuất hoa của Bộ nông nghiệp và Phát
triển Nông thôn, đến năm 2010, Việt Nam sẽ xuất khẩu 1 tỷ cành hoa các loại
trong đó hoa hồng, cúc và phong lan chiếm 85%. Theo chương trình này diện
tích trồng hoa của cả nước sẽ đạt 8.000ha cho sản lượng 4,5 triệu cành. Doanh
thu từ xuất khẩu hoa đạt 60 triệu USD [33].
Để đáp ứng được nhu cầu tiêu thụ hoa trong nước cũng như trên thế
giới đòi hỏi các nhà sản xuất hoa của Việt Nam phải có kế hoạch đầu tư
và phát triển một cách thích hợp, đặc biệt là trong công tác chọn tạo giống
và nhân giống… công nghệ đóng gói bảo quản để nâng cao năng xuất chất

lượng hoa.
1.3. Kĩ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật và ứng dụng
1.3.1. Lược sử phát triển
Kĩ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật đã trải qua hơn 100 năm phát
triển. Ngày càng có nhiều ứng dụng và làm sáng tỏ lý thuyết về tính toàn

Nguyễn Thị Thúy

15

K34E Sinh - KTNN


Khóa luận tốt nghiệp
năng của tế bào. Có thể thấy sự phát triển của kĩ thuật nuôi cấy mô tế
bào thực vật luôn song song với lịch sử các ngành khoa học sự sống
khác. Các giai đoạn chính của kĩ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật [1],
[6], [8], [12].
- Năm 1838, hai nhà sinh vật học người Đức là Schleiden và Schwann đã đề
xướng học thuyết cơ bản của sinh học gọi là thuyết tế bào và nêu rõ:
+ Mọi cơ thể sống đều cấu tạo từ một hoặc nhiều tế bào.
+ Tế bào là đơn vị cấu trúc chức năng cơ bản của cơ thể sống, là hình thức
nhỏ nhất của sự sống.
+ Tế bào chỉ được tạo ra từ tế bào trước đó.
- Người đầu tiên là Haberlandt (1898) đề xuất ra lý thuyết về tính toàn năng
của tế bào, ông cũng là người đầu tiên đưa ra các giả thuyết của Schleiden và
Schwann vào thực nghiệm. Ông đã đề xuất phương pháp nuôi cấy mô tế bào
thực vật để chứng minh tính toàn năng của tế bào.
Theo ông, mỗi tế bào bất kì của cơ thể sinh vật đều mang toàn bộ
lượng thông tin di truyền cần thiết và đủ của cả cơ thể sinh vật đó. Vì

vậy, khi gặp điều kiện thích hợp mỗi tế bào đều có thể phát tri ển thành
một cơ thể hoàn chỉnh. Haberlandt đã nuôi cấy mô cây một lá mầm
nhưng chưa thành công.
- Đến năm 1922, Robbins và Kotte đã thành công trong nuôi cấy đầu rễ
cây hòa thảo kéo dài 12 ngày trong môi trường lỏng gồm có muối
khoáng, glucose.
- Năm 1934, White (Mỹ) đã nuôi cấy thành công trong một thời gian dài đầu rễ
cây cà chua với môi trường lỏng chứa muối khoáng, glucose và nước chiết nấm
men. Sau đó ít lâu White đã chứng minh là có thể thay thế nước chiết nấm men
bằng hỗn hợp 3 loại vitamin nhóm B: Thiamin (B1), Piridoxin (B6), axit

Nguyễn Thị Thúy

16

K34E Sinh - KTNN


Khóa luận tốt nghiệp
nicotinic. Cùng năm, Gautheret thành công trong việc nuôi cấy mô tách từ mô
thượng tầng của cây Salic apraea và cây Populus nigra. Mô nuôi cấy đã phân
chia liên tục trong môi trường Knop bổ sung glucose và cysteinhyochloride.
- Went và Thimann (1937) đã phát hiện ra chất sinh trưởng thực vật đầu
tiên là axit β-indolaxetic (IAA) tác động lên quá trình phân chia tế bào
và hình thành rễ.
- Năm 1938 Gautheret đã thành công trong việc duy trì sự sinh trưởng với
thời gian vô hạn của mô sẹo cà rốt trên môi trường thạch bằng cách cấy
chuyển đều đặn 6 tuần/lần.
- Năm 1941, Overbeck (Mỹ) chứng minh tác dụng kích thích sinh trưởng của
nước dừa trong nuôi cấy phôi cây họ cà. Trong thời gian này, nhiều chất kích

thích sinh trưởng nhân tạo thuộc nhóm Auxin đã được nghiên cứu và tổng
hợp hóa học thành công như: α-napthyl axetic axit (NAA), và 2,4
Dichlorophenoxy axetic axit (2,4-D). Nhiều tác giả đã nhận thấy cùng với
nước dừa, 2,4-D và NAA đã giúp tạo mô sẹo, gây phân chia tế bào thành công
ở nhiều đối tượng thực vật mà trước đó rất khó nuôi cấy.
- Năm 1954, Skoog đã phát hiện ra Kinetin (6 furfuryl-amino-purin) là chất
điều khiển quá trình phân bào và phân hóa chồi. Sau này người ta cũng tìm
thấy Zeatin tách từ mầm ngô có hoạt tính tương tự Kinetin. Cả 2 chất này đều
thuộc nhóm Cytokinin.
- Năm 1960, Bergman đã phát triển kĩ thuật nuôi cấy tế bào đơn lên một bước
mới là tạo được khối mô sẹo từ một tế bào đơn bằng kĩ thuật gieo trải tế bào
thực vật trên đĩa thạch như trải tế bào vi sinh vật. Cũng năm 1960, Cooking
đã dùng men cellulase để phân hủy cellulose của tế bào thực vật và thu được
các tế bào trần (protoplast).

Nguyễn Thị Thúy

17

K34E Sinh - KTNN


Khóa luận tốt nghiệp
- Guha và Maheswari (1964) công bố tạo thành công cây đơn bội từ nuôi cấy
túi phấn cây cà độc dược.
- Bourgin và Nitsch (1967), Nakata (1968) tạo thành công cấy đơn bội từ bao
phấn thuốc lá, mở ra nhiều triển vọng ứng dụng tạo cây đơn bội vào công tác
giống và nghiên cưu di truyền.
- Đến năm 1971, Takebe tái sinh được cây thuốc lá hoàn chỉnh từ protoplast
thuốc lá giống Xanthi.

- Melchers (1977) lai soma thành công cây cà chua và cây khoai tây.
- Năm 1985 cây thuốc lá mang gen biến nạp đầu tiên được công bố.
- Năm 1994 là năm đánh dấu cây cà chua đầu tiên (cà chua Flav’rSav’r)
có mặt trên thị trường thực phẩm Hoa Kì. Cùng năm 1994 giống củ cải
đường mang gen kháng bệnh virus biến nạp được đưa vào sản xuất đại trà
tại Na Uy.
Đến nay đã có hàng trăm loài cây được nuôi cấy mô thành công với
nhiều mục đích khác nhau như nhân nhanh, bảo tồn in vitro, nuôi cấy bao
phấn… Đặc biệt, nhờ kĩ thuật nuôi cấy mô và chuyển gen thông qua giai đoạn
mô sẹo và tái sinh tạo chồi mà nhiều giống cây trồng chuyển gen đã được tạo
ra (cà chua, lúa, đậu tương, khoai tây, bông, đu đủ…) [12].
1.3.2. Cơ sở khoa học của kĩ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật
Cơ sở lý luận của phương pháp nuôi cấy mô và tế bào thực vật đó là
tính toàn năng của tế bào do Haberlandt nêu ra vào năm 1902. Theo quan
điểm của sinh học hiện đại thì tính toàn năng của tế bào là mỗi tế bào riêng
rẽ đó phân hóa, sẽ mang toàn bộ thông tin di truyền cần thiết và đủ của cơ
thể sinh vật. Khi gặp điều kiện thích hợp, mỗi tế bào đều có thể phát triển
thành một cơ thể hoàn chỉnh.

Nguyễn Thị Thúy

18

K34E Sinh - KTNN


Khóa luận tốt nghiệp
Quá trình phát sinh hình thái trong nuôi cấy mô và tế bào thực vật là kết
quả của quá trình phân hóa và phản phân hóa tế bào. Như vậy, kĩ thuật nuôi
cấy mô và tế bào thực vật là kĩ thuật điều khiển sự phát sinh hình thái của tế

bào thực vật (khi nuôi cấy tách rời trong điều kiện nhân tạo và vô trùng) một
cách định hướng. Đây là một điểm rất quan trọng bởi vì trên cơ sở đơn vị mô,
tế bào, các nhà sinh vật học thực hiện những kĩ thuật tiên tiến cho việc lựa
chọn, cải thiện và lai tạo giống cây trồng [1], [10].
1.3.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến nuôi cấy in vitro
Mẫu nuôi cấy
Murashige (1974) ghi nhận sự quan trọng của việc lựa chọn mẫu cấy
thích hợp, điều quan trọng cho thấy một số nhân tố khi chọn lọc mẫu bao
gồm: kiểu gen, cơ quan được chọn, tuổi sinh lý, mùa vụ, giai đoạn sinh
trưởng, độ khỏe của mẫu và nguồn mẫu.
+ Kiểu gen: Kiểu gen ảnh hưởng sâu sắc đến quá trình nuôi cấy. Với loài
thuốc lá được sử dụng như cây kiểu mẫu, Cheng và Smith (1973) ghi nhận sự
khác nhau giữa các genom qua nuôi cấy sinh trưởng mô lồi. Hơn nữa,
Jaramillo và Summers (1990) ghi nhận kiểu di truyền ảnh hưởng đến số lượng
và đường kính mô sẹo qua nuôi cấy hạt phấn cây cà chua.
+ Cơ quan: Murashige (1974) cho rằng hầu hết các loại cơ quan và mô đều có
khả năng sử dụng để nuôi cấy invitro. Mẫu nuôi cấy in vitro khác nhau ở các
loài khác nhau, như ở Petunia dùng chồi đỉnh để nuôi cấy. Theo Doerschung
và Miller (1976) cho rằng: chồi mầm thích hợp làm mẫu nuôi cấy ở các cây
nảy mầm từ hạt.
+ Tuổi và tuổi sinh lý: Tuổi thực của mẫu nuôi cấy và tuổi theo mùa trong năm
của mẫu nuôi cấy cho thấy có ảnh hưởng quan trọng đến sự biệt hóa và của tuổi
sinh lý. Có nhiều nghiên cứu khác nhau về ảnh hưởng của tuổi sinh lý mẫu nuôi

Nguyễn Thị Thúy

19

K34E Sinh - KTNN



Khóa luận tốt nghiệp
cấy. Pierik (1970) ghi nhận rễ phát sinh trên lá non và không phát sinh trên lá
già.
+ Mẫu in vitro: Trong những năm gần đây, nhiều kết quả nghiên cứu cho thấy
mẫu in vitro có khả năng tái sinh cao hơn mẫu lấy từ cây mẹ trên đồng ruộng
hay trong vườn ươm như cây Azalea.
+ Sức sống của mẫu: Điều cần nhận thấy rằng mẫu cây mẹ có ảnh hưởng rất
quan trọng đến nuôi cấy in vitro, cần phải cẩn thận chọn mẫu nuôi cấy nhất là
đối với những cây bị bệnh, nếu nuôi cấy cây bị bệnh thì sẽ có một số lượng
lớn mẫu cây bị bệnh được nhân lên [10].
Điều kiện nuôi cấy
Nhiệt độ: Nhiệt độ thích hợp cho nuôi cấy mô là từ 20-27oC. Theo
Murashige (1974) nhiệt độ ảnh hưởng sâu sắc đến sự sinh trưởng và phát hấp
hay hình thành tế bào cơ quan.
Cường độ ánh sáng: Cường độ ánh sáng là một nhân tố quan trọng
trong quang hợp, ảnh hưởng đến khả năng nuôi cấy in vitro cây lá xanh. Ảnh
hưởng của ánh sáng có liên hệ đến các loài, có loài chịu ánh sáng cao, có loài
chịu ánh sáng thấp hay tối, có loài chịu ánh sáng trung bình. Việc nuôi cấy in
vitro tốt nhất trong điều kiện ánh sáng từ 1000-3000lux [9].
Môi trƣờng nuôi cấy
Lựa chọn môi trường nuôi cấy thích hợp trong nuôi cấy mô tế bào là rất
cần thiết. Vì mỗi loại cây trồng khác nhau đều cần một hàm lượng chất dinh
dưỡng khác nhau. Mặt khác môi trường cũng thay đổi tùy thuộc vào sự phân
hóa của mô cấy, tùy theo trường hợp duy trì mô ở trạng thái mô sẹo, tạo rễ,
tạo chồi hay tái sinh cây hoàn chỉnh. Việc lựa chọn môi trường cần dựa vào
tài liệu đã cho cùng đối tượng nuôi cấy hoặc thăm dò một số môi trường đã
cho để xác định môi trường cho mẫu nuôi cấy.

Nguyễn Thị Thúy


20

K34E Sinh - KTNN


Khóa luận tốt nghiệp
Chất kích thích sinh trƣởng (KTST)
Các chất kích thích sinh trưởng có vai trò rất quan trọng trong kĩ thuật
nuôi cấy mô tế bào thực vật. Bằng cách cung cấp các chất kích thích ở một
mức hợp lý thì chúng ta có thể điều khiển được quá trình phát sinh hình thái
của mẫu nuôi cấy. Auxin và cytokinin là hai nhóm chất kích thích sinh trưởng
được sử dụng phổ biến nhất hiện nay.
Auxin là chất kích thích sinh trưởng thực vật được sử dụng thường
xuyên trong nuôi cấy mô và tế bào thực vật. auxin kết hợp chặt chẽ với các
thành phần khác trong môi trường dinh dưỡng để kích thích sự tăng trưởng
của mô sẹo, huyền phù tế bào và điều hòa sự phát sinh hình thái, đặc biệt là
khi nó được phối hợp sử dụng với nhóm cytokinin. Sự áp dụng loại và nồng
độ auxin trong môi trường nuôi cấy phụ thuộc vào:
+ Kiểu tăng trưởng và phát triển của mẫu cần nghiên cứu.
+ Hàm lượng auxin nội sinh có trong mẫu nuôi cấy.
+ Sự tác động qua lại giữa auxin nội sinh và auxin ngoại sinh.
Đặc tính của Auxin
Auxin có vai trò kích thích sự tăng trưởng và kéo dài tế bào. Đặc điểm
chung của các auxin là kích thích sự phân chia tế bào. Các hoocmon của
nhóm này có các hoạt tính như tăng trưởng chiều dài thân, gióng, tính hướng
đất, tính ưu thế ngọn và phân hóa mạch dẫn.
auxin cũng kích thích sự hình thành rễ bất định và sự giãn của tế bào làm cho
kích thước tế bào tăng lên. Các auxin thường liên quan đến độ dài của thân,
đốt, chồi chính, rễ… Đối với nuôi cấy mô tế bào thực vật, auxin được sử dụng

cho việc phân chia tế bào và phân hóa rễ.
Những Auxin được sử dụng rộng rãi trong nuôi cấy mô tế bào thực vật:
+ IBA (3-indol Butyric Axit)

Nguyễn Thị Thúy

21

K34E Sinh - KTNN


Khóa luận tốt nghiệp

+ IAA (Indol-3-Axetic Axit)
+ NAA (α-Naptalen Axetic Axit)
+ 2,4-D (2,4-Dichlorophenoxy Axetic Axit)
Đặc tính của Cytokinin
Cytokinin là hoocmon phân bào, là dẫn xuất của Ađênin, có ảnh hưởng
đến sự phân chia tế bào, sự thay đổi ưu thế ngọn và phân hóa chồi trong nuôi
cấy mô tế bào thực vật. Các cytokinin được sử dụng thường xuyên nhất là:
+ BAP (6-Benzyl Amino Purin)
+ Kinetin (N-(2-Furfurylamin)-1-H-6- Amin)
+ Zeatin
Hàm lượng của các loại cytokinin có tác dụng kích thích từ rễ đến sự
hình thành chồi bất định, đồng thời ức chế mạnh mẽ sự tạo thành rễ của chồi
nuôi cấy. Trong các loại cytokinin nói trên thì BAP và Kinetin là hai loại hay
được sử dụng nhiều nhất.
Ngoài hai nhóm auxin và cytokinin, trong nuôi cấy mô tế bào thực vật
người ta cũng sử dụng thêm gibberellin để kích thích sự kéo dài tế bào, qua
đó làm tăng kích thước của chồi nuôi cấy. GA (Gibberellic axit) là loại

gibberellin được sử dụng thường xuyên nhất. Tuy nhiên, GA vẫn mẫn cảm
với nhiệt độ, nó mất hoạt tính đến 90% sau khi hấp vô trùng. Vì vậy, muốn sử
dụng GA ta thường phải lọc qua màng lọc vô trùng, sau đó đưa vào môi
trường nuôi cấy [14].
1.3.4. Các phương pháp nhân giống in vitro
Phương pháp nhân giống in vitro đã bổ sung cho các kĩ thuật nhân giống vô
tính cổ điển như giâm cành,chiết cành, ghép cành, tách dòng… Nhân giống in
vitro hay vi nhân giống trong ống nghiệm là một trong bốn lĩnh vực ứng dụng
chính của công nghệ tế bào thực vật (làm sạch virus, nhân nhanh các giống

Nguyễn Thị Thúy

22

K34E Sinh - KTNN


Khóa luận tốt nghiệp
cây quý, sản xuất và chuyển hóa sinh học các hợp chất tự nhiên và cải biến về
mặt di truyền các giống cây trồng) và đã mang lại hiệu quả kinh tế lớn nhất
(Lê Trần Bình và CS, 1997). Cho đến nay đã có rất nhiều nghiên cứu và ứng
dụng thành công để nhân nhanh và bảo tồn trong ống nghiệm nhiều loại cây
trồng khác nhau (Lê Xuân Đắc và CS, 2005; Lưu Trường Sinh và CS, 2005).
Có ba phương thức để tạo cây in vitro:
a. Hoạt hóa chồi nách
Hoạt hóa chồi nách bằng cách phá vỡ hiện tượng ưu thế ngọn khi nuôi
cấy các đỉnh chồi hoặc đoạn thân mang mắt ngủ. Theo phương pháp này thì
sự hoạt hóa của chồi nách diễn ra theo hai cách:
- Cách 1: Cây phát triển trực tiếp từ chồi đỉnh hoặc chồi nách (xảy ra khi nuôi
cấy loài cây hai lá mầm như khoai tây, hoa cúc, cây thuốc lá,… )

- Cách 2: Tạo cụm chồi từ chồi đỉnh hoặc chồi nách (xảy ra với cây một lá
mầm như lúa, mía…).
b. Tạo chồi bất định
Chồi bất định là chồi mọc ra rừ các cơ quan, các bộ phận khác của cây,
không phải là phôi. Ví dụ: Chồi hình thành từ callus (mô sẹo).
Tạo chồi bất định ta thường sử dụng các bộ phận của cây như: đoạn
thân, mô lá, giẻ hành… Trong quá trình này cần thực hiện quá trình phản
phân hóa và quá trình phân hóa để tế bào soma hình thành trực tiếp hoặc gián
tiếp thông qua giai đoạn phát triển mô sẹo.
c. Tạo phôi vô tính
Trong quá trình nuôi cấy in vitro, phôi có thể hình hành từ các tế bào
soma gọi là phôi vô tính. Các phôi vô tính có thể tái sinh thành cây hoàn
chỉnh hoặc có thể sử dụng làm nguyên liệu để sản xuất hạt giống nhân tạo.
Tương tự như tạo chồi bất định, để tạo phôi vô tính cũng cần thực hiện hai

Nguyễn Thị Thúy

23

K34E Sinh - KTNN


Khóa luận tốt nghiệp
quá trình phân hóa và quá trình phản phân hóa để tách các tế bào soma hình
thành phôi trực tiếp hoặc gián tiếp thông qua giai đoạn phát triển của mô sẹo.
Sự hình thành phôi trải qua hai bước chính:
Bước 1: Sự phân hóa các tế bào có khả năng phát sinh phôi. Trong quá
trình này cần môi trường giàu auxin, vì auxin giúp cho việc cảm ứng để tạo
các tế bào phôi, đồng thời nó còn giúp kích thích cho quá trình phát triển số
lượng tế bào thông qua việc liên tiếp phân chia tế bào. Các tế bào có khả năng

phát sinh phôi là các tế bào nhỏ, nhân lớn, nhiều hạch nhân, không có không
bào, tế bào chất đậm đặc, giàu protein và ARN thông tin.
Bước 2: Sự phát triển của phôi mới hình thành. Môi trường nuôi cấy
của giai đoạn này phải nghèo hoặc không có Auxin, với nồng độ Auxin cao
kích thích sự tạo thành phôi nhưng ức chế quá trình phân hóa và quá trình
phát triển tiếp theo của phôi này. Như vậy, với nồng độ chất điều tiết sinh
trưởng hợp lý là rất quan trọng để có các phản hồi thích hợp. Nếu nồng độ
thấp có thể gây sốc cho phản ứng, nếu nồng độ cao quá sẽ gây ức chế hoặc
gây độc [9].
Các bƣớc chính trong nhân giống in vitro
Theo George (1993) quá trình nhân giống vô tính in vitro bao gồm
các bước sau:
Bước 1: Chọn lọc và chuẩn bị cây mẹ
Trước khi tiến hành nhân giống in vitro cần chọn lọc cẩn thận cây mẹ
(cây cho nguồn mẫu nuôi cấy). Các cây này cần phải sạch bệnh, đặc biệt là
bệnh virus và đang ở giai đoạn sinh trưởng và phát triển mạnh mẽ. Việc trồng
các cây mẹ trong điều kiện môi trường thích hợp với chế độ chăm sóc và
phòng bệnh hợp lý sẽ làm giảm tỉ lệ mẫu nhiễm, tăng khả năng sống và sinh
trưởng khi tra đưa mẫu vào nuôi cấy in vitro.

Nguyễn Thị Thúy

24

K34E Sinh - KTNN


Khóa luận tốt nghiệp
Bước 2: Nuôi cấy khởi động
Là giai đoạn khử trùng mẫu, giai đoạn này cần đảm bảo các yêu cầu

như tỷ lệ mẫu nhiễm thấp, tăng tỷ lệ mẫu tái sinh, mô tồn tại, sinh trưởng và
phát triển tốt. Khi lấy mẫu cần chọn đúng loại mô, đúng giai đoạn phát triển
tốt của cây. Quan trọng nhất là đỉnh chồi ngọn, đỉnh chồi nách, đỉnh chồi hoa
và sau đó là đoạn thân, mảnh lá.
Bước 3: Nhân nhanh
Là giai đoạn kích thích mô nuôi cấy phát sinh hình thái và tăng nhanh
số lượng thông qua các con đường: hoạt hóa chồi nách, tạo phôi vô tính, tạo
chồi bất định… Vấn đề là cần xác định được môi trường và điều kiện ngoại
cảnh thích hợp để có hiệu quả cao nhất. Theo nguyên tắc chung, môi trường
có nhiều cytokinin sẽ kích thích tạo chồi (auxin/cytokinin < 1: thì kích thích
tạo chồi). Chế độ nuôi cấy thường là 25-27oC và 16h chiếu sáng/ngày, cường
độ ánh sáng 2000-3000lux. Tuy nhiên đối với mỗi loại đối tượng nuôi cấy
khác nhau đòi hỏi chế độ nuôi cấy khác nhau.
Bước 4: Tạo cây in vitro hoàn chỉnh
Để tạo rễ cho chồi người ta cấy chuyển sang môi trường tạo rễ. Môi
trường tạo rễ thường được bổ sung thêm một lượng nhỏ auxin. Một số loại
cây có thể phát sinh rễ ngay cả khi ta không bổ sung auxin.
Bước 5: Đưa cây ra ngoài vườn ươm
Để đưa được cây ra bên ngoài vườn ươm phát triển tốt ta cần phải đảm
bảo một số yêu cầu sau:
- Cây đảm bảo về chiều cao, số rễ, số lá.
- Giá thể phải tơi xốp, sạch sẽ, thoát nước tốt.
- Phải điều chỉnh độ ẩm, chế độ chiếu sáng vườn ươm, cũng như chế độ dinh
dưỡng thích hợp.

Nguyễn Thị Thúy

25

K34E Sinh - KTNN