Trường ĐHSP Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH-KTNN

………………………………

NGUYỄN THỊ HOA

ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG TẠO MÔ SẸO
VÀ TÁI SINH CÂY Ở MỘT SỐ GIỐNG
LÚA NHẬT BẢN

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Chuyên ngành: Di truyền học

Ngƣời hƣớng dẫn:

TS. LÊ XUÂN ĐẮC

HÀ NỘI - 2012

Nguyễn Thị Hoa

1

K34E Sinh - KTNN

Trường ĐHSP Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này, tôi xin chân thành cảm ơn TS.
Lê Xuân Đắc, Viện Công nghệ sinh học - Viện khoa học và Công nghệ Việt
Nam đã luôn tận tình giúp đỡ, hƣớng dẫn tôi trong quá trình thực hiện đề tài.
Tôi xin chân thành cảm ơn toàn thể cán bộ Trại Thực nghiệm sinh học Viện Công nghệ sinh học đã giúp đỡ và tạo mọi điều kiện tốt nhất cho tôi
hoàn thành khóa luận.
Tôi xin cảm ơn TS. Nguyễn Nhƣ Toản đã có những đóng góp quý báu
trong quá trình tôi thực hiện đề tài. Tôi xin cảm ơn thầy cô giáo trƣờng Đại
học sƣ phạm Hà Nội 2 đã truyền đạt những khiến thức và kinh nghiệm nghiên
cứu khoa học cho tôi trong suốt thời gian thực tập.
Cuối cùng, tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình và các
bạn bè - những ngƣời luôn động viên, khích lệ và giúp đỡ tôi trong suốt quá
trình học tập và thực hiện đề tài.

Hà Nội, tháng 5 năm 2012
Sinh viên

Nguyễn Thị Hoa

Nguyễn Thị Hoa

2

K34E Sinh - KTNN



Trường ĐHSP Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan khóa luận này là kết quả nghiên cứu của riêng tôi,
những tƣ liệu đƣợc trích dẫn trong khóa luận này là trung thực.
Kết quả nghiên cứu này không hề trùng lặp với bất kì công trình nghiên
cứu nào đƣợc công bố trƣớc đây.
Nếu sai tôi xin chịu hoàn toàn trách nhiệm.

Ngƣời thực hiện

Nguyễn Thị Hoa

Nguyễn Thị Hoa

3

K34E Sinh - KTNN


Trường ĐHSP Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU ............................................................................................................... 1
1. Lý do chọn đề tài ............................................................................................... 1
2. Mục đích nghiên cứu ......................................................................................... 2
3. Nội dung nghiên cứu ......................................................................................... 3
4. Địa điểm và thời gian nghiên cứu ..................................................................... 3
5. Ý nghĩa của đề tài .............................................................................................. 3
Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................... 4
1.1. Tổng quan về cây lúa ................................................................................... 4
1.1.1. Nguồn gốc ................................................................................................... 4
1.1.2. Phân loại cây lúa ......................................................................................... 5
1.2. Các phƣơng pháp chọn tạo giống lúa .......................................................... 6
1.2.1. Chọn tạo bằng phƣơng pháp đột biến ......................................................... 6
1.2.2. Tạo giống cây trồng bằng phƣơng pháp chuyển gen .................................. 8
1.2.3. Tạo giống bằng phƣơng pháp lai .............................................................. 11
1.2.4. Nhập nội giống thích nghi ......................................................................... 12
1.3. Nuôi cấy mô tế bào thực vật và ứng dụng ................................................ 13
1.3.1. Cơ sở khoa học của nuôi cấy mô tế bào thực vật...................................... 14
1.3.2. Nuôi cấy mô sẹo (callus) ........................................................................... 16
1.3.3. Hệ thống tái sinh trong nuôi cấy mô tế bào thực vật ................................ 17
1.3.4. Ứng dụng nuôi cấy mô tế bào thực vật ..................................................... 19
1.4. Tình hình sản xuất lúa gạo trên thế giới và Việt Nam .............................. 22
1.4.1. Tình hình sản xuất lúa gạo trên thế giới.................................................... 22

Nguyễn Thị Hoa

4

K34E Sinh - KTNN



Trường ĐHSP Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

1.4.2. Tình hình sản xuất lúa gạo ở Việt Nam .................................................... 24
Chƣơng 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................. 25
2.1.

Nguyên liệu ............................................................................................... 25

2.2.

Phƣơng pháp nghiên cứu .......................................................................... 25

2.2.1. Tạo nguyên liệu vô trùng .......................................................................... 26
2.2.2. Nuôi cấy tạo mô sẹo .................................................................................. 26
2.2.3. Nhân mô sẹo .............................................................................................. 26
2.2.4. Tái sinh cây ............................................................................................... 27
2.2.5. Tạo cây hoàn chỉnh ................................................................................... 27
2.2.6. Đƣa cây ra trồng ........................................................................................ 27
2.3. Thu thập và xử lý số liệu ........................................................................... 28
Chƣơng 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .......................................................... 30
3.1.

Tạo nguyên liệu vô trùng .......................................................................... 30

3.2.

Tạo mô sẹo ................................................................................................ 31


3.2.1. Ảnh hƣởng của 2,4D đến khả năng tạo mô sẹo ........................................ 31
3.2.2. Ảnh hƣởng của nồng độ BAP tới khả năng tạo mô sẹo ............................ 32
3.3.

Nhân mô sẹo ............................................................................................. 34

3.4.

Tái sinh cây ............................................................................................... 35

3.4.1. Ảnh hƣởng của tổ hợp BAP và kinetin tới khả năng tái sinh cây............. 35
3.4.2. Ảnh hƣởng của tổ hợp BAP và NAA tới khả năng tái sinh cây ............... 37
3.5. Tạo cây hoàn chỉnh ................................................................................... 38
3.6.

Ảnh hƣởng của giá thể tới khả năng sống của cây ................................... 40

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ............................................................................. 42

Nguyễn Thị Hoa

5

K34E Sinh - KTNN


Trường ĐHSP Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp


Kết luận ............................................................................................................... 42
Kiến nghị ............................................................................................................. 42
TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................... 43

Nguyễn Thị Hoa

6

K34E Sinh - KTNN


Trường ĐHSP Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

DANH MỤC CÁC BẢNG

Trang
Bảng 3.1

Tỷ lệ hạt nhiễm khi khử trùng

30

Bảng 3.2

Tỷ lệ mô sẹo trên môi trƣờng 2,4D (2 mg/l)

31


Bảng 3.3

Tỷ lệ tạo mô sẹo trên môi trƣờng CT2

32

Bảng 3.4

Đánh giá chất lƣợng mô sẹo trên môi trƣờng nhân mô sẹo

34

Bảng 3.5

Tỷ lệ tái sinh cây trên môi trƣờng TS1

36

Bảng 3.6

Tỷ lệ tái sinh cây trên môi trƣờng TS2

37

Bảng 3.7

Khả năng tạo cây hoàn chỉnh

39


Bảng 3.8

Tỷ lệ cây sống trên các loại giá thể

41

Nguyễn Thị Hoa

7

K34E Sinh - KTNN


Trường ĐHSP Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH

Trang
Hình 3.1

Tạo giống mô sẹo NIP1 và NH3 trên môi trƣờng 0,2mg/l
BAP

Hình 3.2

33

Tỷ lệ tạo mô sẹo của các giống trên các công thức môi

trƣờng

33

Hình 3.3

Nhân mô sẹo giống NH2 trên môi trƣờng có 0,5mg/l BAP

35

Hình 3.4

Tái sinh cây giống NIP1 (BAP 2mg/l và kinetin 0,3mg/l)

38

Hình 3.5

Tạo cây hoàn chỉnh giống NH3

40

Hình 3.6

Cây lúa trồng trên giá thể nƣớc sau 10 ngày

41

Nguyễn Thị Hoa


8

K34E Sinh - KTNN


Trường ĐHSP Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

2,4 D

2,4 - Dichlorophenoxy Axetic Axit

BAP

6 - Benzyl Amino Purin

ĐC

Đối chứng

IAA

Indol - 3- Axetic Axit

IBA

3 - Indol Butyric Axit


Kinetin

6 furfuryl-amino-purin

KTST

Kích thích sinh trƣởng

MS

Môi trƣờng cơ bản của Murashige và Skoog

NAA

α- Napthalen Axetic Axit

TB

Trung bình

cs

Cộng sự

MT

Môi trƣờng

VTM


vitamin

Nguyễn Thị Hoa

9

K34E Sinh - KTNN


Trường ĐHSP Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp
MỞ ĐẦU
1. Lý do chọn đề tài

Lúa là lƣơng thực chính của các nƣớc châu Á. Nó đã đi vào văn hóa của
nhiều dân tộc, do có khẩu vị và sở thích ăn loại cơm khác nhau. Trong khi dân
Đông và Đông Nam Á thích loại gạo hạt dài nhƣ Basmati, Jasmine thì các nƣớc
Đông Bắc Á lại thích loại gạo tròn. Gạo tròn chỉ thích hợp trồng ở vùng ôn đới.
Những nƣớc ăn gạo hạt tròn thƣờng thuộc những nƣớc phát triển và sản xuất
không đủ, do đó họ sẵn sàng trả tiền cao để mua loại gạo này. Điều này trong
thời gian tới có thể sẽ thay đổi, Viện nghiên cứu lúa Quốc tế IRRI gần đây đã
chọn tạo đƣợc 2 giống lúa có dạng hạt gạo tròn nhiệt đới Japonica ở
Philippines, đó là 2 giống NSIC Rc170 và IRRI 142 để gieo trồng trên diện
rộng. Các giống lúa này mang đầy kỳ vọng giúp nông dân Philippines đạt
lợi nhuận cao hơn, và nhất là giúp ngƣời tiêu dùng có thể thƣởng thức đƣợc
gạo Nhật với giá rẻ, đồng thời cũng mở ra triển vọng mới đối với nông dân
Việt Nam.
Dù đƣợc mệnh danh là cƣờng quốc xuất khẩu gạo lớn thứ hai thế giới,

nhƣng giá gạo xuất khẩu Việt Nam vẫn thƣờng thấp hơn gạo cùng loại trên thị
trƣờng thế giới. Một trong những nguyên nhân là chất lƣợng. Hiện tại, do nhu
cầu lúa gạo của thế giới tăng cao, nên nông dân bán gạo với giá cao hơn. Tuy
nhiên, giá trị xuất khẩu gạo của Việt Nam lại kém hẳn so với giá gạo của Thái
Lan.
Đầu tƣ cho giống lúa chất lƣợng cao đạt tiêu chuẩn xuất khẩu cũng đƣợc
nhà nƣớc đầu tƣ mạnh trong những năm qua, chất lƣợng gạo Việt Nam đã cải
thiện nhiều so với trƣớc. Vào thời điểm năm 1990, gạo xuất khẩu của Việt
Nam đa phần là loại gạo chất lƣợng thấp (35 đến 45% tấm). Hiện nay, tỷ lệ
gạo 5 đến 10% tấm đã ở mức trên 50%. Tuy nhiên tỷ lệ gạo chất lƣợng cao,
gạo thơm cho những thị trƣờng xuất khẩu cao cấp vẫn còn ít.

Nguyễn Thị Hoa

10

K34E Sinh - KTNN


Trường ĐHSP Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

Chƣơng trình chọn tạo giống lúa Japonica (dạng lúa Nhật Bản) để thích
nghi vùng nhiệt đới của IRRI bắt đầu năm 1991 với sự hợp tác của Hàn Quốc
nhằm tạo ra giống lúa Japonica năng suất chất lƣợng cao. Với điều kiện của
nhiệt độ cao ở vùng nhiệt đới, hầu hết các giống lúa Japonica này đều bị lùn,
bông nhỏ và trổ sớm vì chúng nhạy cảm với ngày ngắn cho năng suất rất thấp.
Các giống lúa Japonica đóng vai trò quan trọng trong việc nâng cao chất
lƣợng. Bên cạnh đó, các giống Japonica còn đƣợc sử dụng rộng rãi trong

việc tăng tính chống chịu lạnh, kháng bệnh cháy lá, cháy bìa lá, khô vằn,
dạng hình cây lúa, vàng (lão hóa) lá sớm, cải thiện hình dạng hạt gạo, độ
dẻo, hóa hồ và các đặc tính khác.
Những nghiên cứu chọn tạo các giống cây trồng mới để ứng dụng vào sản
xuất là rất quan trọng và đƣợc nhiều quốc gia chú trọng đầu tƣ, phát triển.
Một trong các kỹ thuật đƣợc quan tâm ứng dụng vào chọn tạo giống lúa là sử
dụng công nghệ nuôi cấy mô và tế bào thực vật. Kỹ thuật nuôi cấy mô và tế
bào thực vật đã và đang đƣợc ứng dụng rộng rãi trong các lĩnh vực nhân
giống và phục tráng cây trồng, chọn tạo giống chống chịu các điều kiện bất
lợi của môi trƣờng, chuyển gen có giá trị kinh tế vào cây trồng, kết hợp nuôi
cấy mô và đột biến thực nghiệm…
Xuất phát từ cơ sở lý luận và thực tiễn ở trên, chúng tôi tiến hành nghiên
cứu đề tài: “Đánh giá khả năng tạo mô sẹo và tái sinh cây ở một số giống
lúa Nhật Bản”, nhằm phục vụ các nghiên cứu tiếp theo đối với các giống lúa
này.
2. Mục đích nghiên cứu
Xây dựng hệ thống tạo mô sẹo, tái sinh cây trong ống nghiệm đối với một
số giống lúa Nhật Bản để phục vụ các nghiên cứu ứng dụng nhƣ đột biến mô
sẹo hay chuyển gen để chọn tạo giống lúa chất lƣợng cao.

Nguyễn Thị Hoa

11

K34E Sinh - KTNN


Trường ĐHSP Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp


3. Nội dung nghiên cứu
- Xác định môi trƣờng có khả năng tạo mô sẹo tốt nhất đối với các giống
nghiên cứu.
- Xác định môi trƣờng tối ƣu để tái sinh chồi của mô sẹo.
- Xác định môi trƣờng ra rễ của cây tái sinh tốt nhất.
- Xác định loại giá thể ra cây phù hợp nhất.
4. Địa điểm và thời gian nghiên cứu
- Địa điểm nghiên cứu: Trại thực nghiệm sinh học, Viện Công Nghệ sinh học,
Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
- Thời gian nghiên cứu: tháng 5/2011 - 4/2012.
5. Ý nghĩa của đề tài
* Ý nghĩa của khoa học:
Đề tài góp phần bổ sung quy trình kỹ thuật nuôi cấy trong ống nghiệm
đối với một số giống lúa Nhật Bản.
* Ý nghĩa của thực tiễn sản xuất:
Các kết quả nghiên cứu của đề tài này có thể phục vụ các nghiên cứu ứng
dụng nhƣ đột biến mô sẹo hay chuyển gen trên các giống lúa này để chọn tạo
giống lúa chất lƣợng cao.

Nguyễn Thị Hoa

12

K34E Sinh - KTNN


Trường ĐHSP Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

CHƢƠNG 1

TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Tổng quan về cây lúa
1.1.1. Nguồn gốc
Cây lúa trồng Oryza sativa L. (2n= 24) là loại thân thảo sống hàng năm.
Thời gian sinh trƣởng của các giống dài ngắn khác nhau và nằm trong khoảng
60 - 250 ngày. Về nguồn gốc cây lúa có nhiều nhà khoa học đã nghiên cứu và
đƣa ra nhiều ý kiến khác nhau.
+ Theo Candalle (1886) cây lúa có nguồn gốc từ Ấn Độ.
+ Theo Roselevicz (1931) cây lúa có nguồn gốc từ Đông Nam Á, đặc biệt Ấn
Độ và Đông Dƣơng.
Tuy có nhiều ý kiến khác nhau về nguồn gốc cây lúa nhƣng cho đến nay
các nhà khoa học đã thống nhất là cât lúa có nguồn gốc ở Đông Nam Á và
Nam Trung Hoa.
Việc xác định nguồn gốc cây lúa ở Đông Nam Á dựa vào các cơ sở sau
đây:
+ Đây là vùng trồng lúa có diện tích tập trung và lớn trên thế giới.
+ Tổ tiên của các loài loài lúa trồng hiện nay là lúa dại vẫn còn tìm thấy ở
nhiều nƣớc trong khu vực này.
+ Theo các tài liệu lịch sử, các di tích lịch sử khảo cổ học đã cho thấy cây lúa
đƣợc trồng ở khu vực này từ rất sớm khoảng 4000 - 5000 năm trƣớc.

Nguyễn Thị Hoa

13

K34E Sinh - KTNN



Trường ĐHSP Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

1.1.2. Phân loại cây lúa
Theo hệ thống phân loại học thực vật thì cây lúa trồng có vị trí phân loại nhƣ
sau:
- Giới (Re grum): Plante - Thực vật
- Ngành (Divisio): Angios permes - Thực vật có hoa
- Lớp (Classic):

Mono cotyledones - Một lá mầm

- Bộ (Ordines):

Poales (Graminasles) - Hòa thảo có hoa

- Họ (Familia):

Pcacoe (Graminac) - Hòa thảo

- Họ phụ (Pryzoideae): Hòa thảo ƣa nƣớc
- Chi (Genus):

Oryza - Lúa

- Loài (Species): Oryza Sativa - Lúa trồng
Việc phân loại Oryza Sativa L. có nhiều quan điểm khác nhau:
- Theo Kato (1931) chia Oryza Sativa L. thành hai loại là:
+ Oryza Sativa Sub. Sp. Japonica Kato (loài phụ Nhật Bản).

+ Oryza Sativa Sub. Sp. Indica Kato (loài phụ Ấn Độ).
- Loài Oryza Sativa L. đƣợc chia làm 3 loài phụ:
+ Loài phụ Indica đƣợc trồng ở các nƣớc nhiệt đới và cận nhiệt đới (Việt
Nam, Ấn Độ, Mianma, Philippin…). Loài phụ Indica có đặc điểm hạt dài,
thân cao, mềm dễ đổ, chịu sâu bệnh khá, năng suất thấp, mẫn cảm với chu kỳ
ánh sáng.
+ Javanica phân bố ở những nơi có vĩ độ cao (bắc Trung Quốc, Nhật Bản,
Triều Tiên…), có những đặc điểm nhƣ chịu rét cao, nhƣng ít chịu sâu bệnh.
+ Japonica là loại hình trung gian giữa Indica và Javanica nhƣng gần với
Indica hơn. Javanica có đặc điểm hạt dày và rộng hơn hạt của Indica, chỉ
đƣợc trồng ở một vài nơi thuộc Indonesia (Mai Thọ Trung,1990; Khush, 1997)
[10] [14].

Nguyễn Thị Hoa

14

K34E Sinh - KTNN


Trường ĐHSP Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

Ngoài ra còn một số cách phân loại khác tùy theo tiêu chí đặt ra nhƣ:
- Dựa vào hình thái hạt lúa: lúa hạt tròn; lúa hạt dài…
- Dựa vào thành phần dinh dƣỡng: lúa nếp; lúa tẻ…
- Dựa vào thời gian sinh trƣởng: lúa ngắn ngày; lúa dài ngày…
- Dựa vào mùa vụ gieo trồng có: lúa chiêm xuân; lúa mùa; lúa hè thu…
1.2. Các phƣơng pháp chọn tạo giống lúa

1.2.1. Chọn tạo bằng phương pháp đột biến
Từ lâu, gây đột biến thực nghiệm để làm vật liệu khởi đầu cho chọn
giống đã đƣợc coi là một trong những kỹ thuật ứng dụng cao trong nông
nghiệp. Phƣơng pháp này đƣợc biết đến vào năm 1925 khi Natxon và
Philippôp phát hiện rằng tia Roentgen có khả năng gây ra biến dị di truyền ở
nấm. Đến năm 1926 - 1928, với các nghiên cứu của Muller trên ruồi dấm,
Stadler trên lúa mạch... di truyền học phóng xạ đã trở thành nền tảng cho sự ra
đời ngành chọn giống đột biến phóng xạ. Năm 1946, Auerbach và Robson
phát hiện vài hợp chất có thể gây đột biến, sau đó, ngày càng nhiều hóa chất
đƣợc tìm thấy có khả năng làm tăng tần số đột biến. Nhƣng đến nay, phƣơng
pháp sử dụng hóa chất gây đột biến bị hạn chế vì độc hại và có nguy cơ gây
ung thƣ cao.
Ở Việt Nam, lĩnh vực này đã đƣợc Giáo sƣ Lƣơng Đình Của khởi xƣớng
từ những năm 1960. Nhƣng mãi đến năm 1980, hƣớng nghiên cứu này mới
đƣợc phát triển một cách tƣơng đối có hệ thống và định hƣớng do Phan Phải
và cộng sự tiến hành. Sau đó, một loạt nghiên cứu của các tác giả nhƣ: Trần
Duy Quý, Nguyễn Hữu Đống, Trần Đình Long, Mai Quang Vinh, Đỗ Hữu Ất,
Lâm Quang Dụ, Nguyễn Văn Bích, Nguyễn Quang Xu, Lê Văn Nhạ,.. trên
nhiều đối tƣợng cây trồng khác nhau nhƣ: lúa, ngô, đậu, lạc, táo, cà chua, hoa

Nguyễn Thị Hoa

15

K34E Sinh - KTNN


Trường ĐHSP Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp


cúc... đã tạo ra nhiều dòng đột biến có giá trị, đƣợc chọn lọc và phát triển trực
tiếp thành các giống quốc gia hoặc các dòng có triển vọng phục vụ cho công
tác lai tạo giống mới.
Việc chọn lọc dòng/giống nào để xử lý đột biến phụ thuộc vào tính trạng
cần cải tiến. Các bức xạ bức xạ ion hoá mật độ cao chủ yếu gây ra những biến
đổi nhiễm sắc thể (sắp xếp lại, mất đoạn...), trong khi bức xạ ion hoá mật độ
thƣa (tia X, tia gamma) và bức xạ không ion hóa (tia tử ngoại) gây ra nhiều
đột biến điểm hơn. Các tác nhân hoá học đa dạng hơn nhiều về chủng loại so
với tác nhân lý học. Các tác nhân nhƣ ethyl methane sulphonate (EMS) và các
hợp chất siêu đột biến nitrozo urê (nitrozoethyl urê) gây ra tần số đột biến cao
ở nhiều loại cây trồng.
a. Xử lý bằng chiếu xạ
Để xử lý bằng chiếu xạ, hạt, cây con, các bộ phận sinh dƣỡng (hoa, bao
phấn, hạt phấn...) đƣợc đặt dƣới nguồn chiếu.
Trong quá trình xử lý phải đảo trộn nhiều lần hạt hoặc cây con, các bộ
phận sinh dƣỡng và tuân thủ điều kiện bảo hộ lao động.
Thời gian chiếu phụ thuộc vào công suất của nguồn và liều lƣợng cần xử
lý. Công suất nhỏ thì thời gian xử lý dài và ngƣợc lại.
Độ ẩm của hạt có ý nghĩa quyết định đối với tác động đột biến của tia
bức xạ vì nó ảnh hƣởng trực tiếp tới trạng thái sinh lý của hạt. Phơi khô cũng
nhƣ tăng thủy phần của hạt đều làm tăng tác động của tia bức xạ. Ngoài ra,
nhiệt độ và ôxy của hạt và của không khí cũng ảnh hƣởng tới kết quả xử lý.
Với tia bức xạ, có thể xử lý nhanh (từ vài phút đến vài giờ) hoặc xử lý
lâu dài trong trƣờng gamma (từ nhiều tuần trở lên với cƣờng độ thấp), nhƣng

Nguyễn Thị Hoa

16


K34E Sinh - KTNN


Trường ĐHSP Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

cũng có thể xử lý gián đoạn bằng cách ngắt quãng một khoảng thời gian nhất
định.
b. Xử lý bằng hoá chất
Xử lý các chất hoá học thƣờng diễn ra trong dung dịch.
Vì tác nhân đột biến hoá học rất độc và có thể gây ung thƣ nên phải thực
hiện các biện pháp bảo hộ nghiêm ngặt.
Hạt (cây con, các bộ phân sinh dƣỡng) đƣợc ngâm hoặc nhúng vào dung
dịch trong một thời gian nhất định.
Thông thƣờng để đạt hiệu quả cao và có thể lặp lại kết quả, xử lý tác
nhân hoá học đƣợc tiến hành theo nhiều bƣớc: Làm trƣơng hạt trong nƣớc, xử
lý, rửa sạch, phơi khô hạt...
Khi xử lý tác nhân hoá học, tác động của tác nhân đột biến cũng bị ảnh
hƣởng bởi trạng thái sinh lý của các bộ phận xử lý.
1.2.2. Tạo giống cây trồng bằng phương pháp chuyển gen
Kỹ thuật chuyển gen đã và đang trở thành nhân tố quan trọng trong
chƣơng trình chọn tạo giống cây trồng. Có thể chia nguyên lý chuyển gen làm
hai cách: chuyển gen trực tiếp và chuyển gen gián tiếp.
a, Chuyển gen trực tiếp
- Chuyển gen bằng xung điện:
Sử dụng xung điện với thời gian ngắn trong một điện trƣờng cực mạnh.
Khi đặt tế bào trần (protoplast) trong điện trƣờng, sự dẫn điện và tính thấm
của màng nguyên sinh bị thay đổi, kéo theo sự mất ổn định tại chỗ và tạm thời
của màng dẫn tới sự hình thành lỗ hổng trên màng tế bào. Một loạt các lỗ


Nguyễn Thị Hoa

17

K34E Sinh - KTNN


Trường ĐHSP Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

hổng trên màng tế bào đƣợc hình thành tùy thuộc vào điện trƣờng, làm cho
ADN bên ngoài môi trƣờng đƣợc truyền qua lỗ hổng vào tế bào. Một số tế
bào thực vật có thể tiếp thu ADN nhờ xung điện mà không cần xử lí trƣớc
nhƣ tế bào ngô, lúa và phôi non lúa mì. Zang và cs (1988) đã đƣa ra cây lúa
chuyển gen từ tế bào trần sử dụng phƣơng pháp xung điện. Sau một năm
Shimamoto và cs (1989) đƣa ra cây lúa chuyển gen hữu thụ đầu tiên ở giống
lúa Japonica sử dụng phƣơng pháp xung điện.
- Chuyển gen bằng vi tiêm (Microinjection):
Ngƣời ta sử dụng kim vi tiêm và kính hiển vi để tiêm một lƣợng nhỏ
ADN vào những tế bào nhất định, có thể là một tế bào nguyên vẹn. Phƣơng
pháp này có ƣu điểm là ADN đƣa vào tế bào một cách chính xác, thậm chí
vào tận nhân và có thể quan sát đƣợc. Phƣơng pháp này cần có thiết bị có độ
chính xác cao, thao tác khéo léo, kỹ thuật và kỹ năng của ngƣời thực hiện phải
chính xác.
- Chuyển gen bằng vi tiêm qua ống phấn (Pollen tube):
Khi hạt phấn rơi trên núm nhụy (quá trình thụ phấn) hạt phấn sẽ nảy
mầm hình thành ống phấn. Lúc này tiêm gen mong muốn đi theo ống phấn
mang giao tử đực vào thụ tinh với giao tử cái sẽ hình thành hợp tử có mang

gen chuyển vào. Phƣơng pháp này khá thành công, đặc biệt trên cây lúa và
cây bông.
- Chuyển gen bằng súng bắn gen (Microprojectile bombaroment biolistics):
Kỹ thuật chuyển gen bằng súng bắn gen đƣợc phát hiện bởi Christou và
cs (1991) và kỹ thuật này đƣợc cải tiển bởi Cao và cs (1992); Zi và cs (1993).
Ngay lập tức, kỹ thuật đƣợc áp dụng rộng rãi ở các phòng thí nghiệm chuyển
gen lúa Japonica. Gần đây kỹ thuật chuyển gen bằng súng bắn gen cũng đã

Nguyễn Thị Hoa

18

K34E Sinh - KTNN


Trường ĐHSP Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

đƣợc áp dụng thành công với các giống lúa indica và nhiều giống Japonica
(Christai và cs, 1988; Datta và cs, 1999). Cheng và cs (1998) đã có những cải
tiến rất có ý nghĩa trong việc chuyển nhiều gen vào lúa Japonica sử dụng súng
bắn gen.
Đây là kỹ thuật tƣơng đối hiện đại và có hiệu quả khi sử dụng thiết bị
(súng bắn gen) tạo đƣợc áp lực sẽ đẩy viên đạn đƣợc làm bằng kim loại trơ
(vàng, tungsten, wolfram) đã bọc plasmid mang gen đã thiết kế, có kích thƣớc
vào khoảng 1μm, với vận tốc 130 m/s, xuyên qua các lớp tế bào biểu bì, đi
vào tế bào bên trong và gen sẽ đƣợc biểu hiện ở đó khi hợp nhất với bộ gen
của tế bào chủ.
Hiệu quả chuyển gen vào lúa bằng phƣơng pháp dùng súng bắn gen

không những không phụ thuộc vào kiểu gen mà tần suất lại cao. Ở một vài
trƣờng hợp, tần suất chuyển gen bằng phƣơng pháp này ngang với cây hai lá
mầm.
b, Chuyển gen gián tiếp
- Chuyển gen gián tiếp nhờ virus:
Đối với việc chuyển gen vào thực vật thì virus thực vật cũng đƣợc coi
nhƣ một vectơ. Virus làm vectơ chuyển gen phải có các tiêu chuẩn sau:
+ Bộ gen có cấu trúc ADN
+ Có độ thiệt hại thấp hoặc không hại
+ Phổ kí chủ rộng
+ Có khả năng di chuyển qua các lỗ tế bào

Nguyễn Thị Hoa

19

K34E Sinh - KTNN


Trường ĐHSP Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

Có hai loại vius đảm nhận đƣợc vai trò chuyển gen là: Cauliflow mosaic
virus (caMV) và Genini virus.
- Chuyển gen gián tiếp nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens:
Chuyển gen vào thực vật thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens
đƣợc xem là phƣơng pháp có nhiều ƣu điểm (nhất là đối với cây hai lá mầm)
dựa vào khả năng chuyển gen tự nhiên của loài vi khuẩn đất Agrobacterium.
1.2.3. Tạo giống bằng phương pháp lai

Lai giống là phƣơng pháp cơ bản và đem lại hiệu quả cao, chủ động nên
đƣợc sử dụng rộng rãi để tạo ra giống mới.
Sử dụng phƣơng pháp lai nhằm kết hợp kiểu gen giữa bố và mẹ làm xuất
hiện những tổ hợp gen mới từ đó quyết định những tính trạng và những đặc
điểm tốt của các giống cây trồng.
Có các kiểu lai sau:
- Lai cùng loài (lai gần): là phép lai giữa các cá thể khác nhau thuộc cùng 1
loài (Bộ Nông Nghiệp & phát triển Nông Thôn, 2005) [4] .
- Lai khác loài (lai xa): là hình thức lai giữa các dạng bố, mẹ thuộc hai loài
khác nhau hoặc thuộc các chi, họ khác nhau nhằm tạo ra các biến dị mới có
giá trị. Tuy nhiên, phƣơng pháp này gặp một số khó khăn nhất định nên ít
đƣợc sử dụng.
- Phƣơng pháp tạo ƣu thế lai:
+ Lai khác dòng đơn: tạo ra 2 dòng đơn tự thụ phấn qua 5 - 7 thế hệ, sau đó
cho giao phấn với nhau.

Nguyễn Thị Hoa

20

K34E Sinh - KTNN


Trường ĐHSP Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

+ Lai khác dòng kép: cần có nhiều dạng khởi đầu tham gia để tạo ra một
giống lai mới.
Trong chọn tạo giống lúa hầu hết các nƣớc đều sử dụng phƣơng pháp lai

phức tạp nhiều bậc.
Viện nghiên cứu lúa quốc tế IRRI (tại Manina, Philippines) dùng phƣơng
pháp lai các giống ngoại với giống địa phƣơng có kết hợp đột biến theo
phƣơng pháp lai phức tạp. Vì vậy đã tạo ra đƣợc những giống lúa tốt, nhiều
giống lúa tốt đƣợc trồng ở Việt Nam nhƣ IR5, IR8, IR64…
- Lai thuận nghịch: tiến hành lai cả thuận và nghịch giữa các dòng tự thụ phấn
để thăm dò, tìm ra tổ hợp lai có giá trị kinh tế nhất.
- Lai khác thứ tạo giống cây trồng mới: là phƣơng pháp lai giữa hai hay nhiều
thứ có nguồn gen khác nhau để tạo ra giống mới, thông thƣờng đều có biểu
hiện ƣu thế lai.
1.2.4. Nhập nội giống thích nghi
Việc nhập nội các vật liệu khởi đầu có ý nghĩa rất quan trọng trong việc
chọn giống. Nhập nội theo nghĩa rộng là đƣa vật liệu (có thể là giống, dạng
loài hoang dại họ hàng với cây trồng) vào môi trƣờng mới mà trƣớc đây chƣa
đƣợc gieo trồng. Theo nghĩa hẹp, nhập nội là di chuyển vật liệu từ nƣớc này
sang nƣớc khác. Nếu vật liệu nhập nội thích hợp tốt với môi trƣờng mới thì
sau khi khảo nghiệm có thể đƣợc công nhận là giống đƣa vào sản xuất mà
không cần thay đổi gọi là nhập nội sơ cấp (sử dụng trực tiếp). Ngƣợc lại, nếu
vật liệu nhập nội mà không thích ứng mà phải qua chọn lọc hoặc sử dụng lai
để chuyển hay kết hợp gen có ích gọi là nhập nội thứ cấp (sử dụng gián tiếp).
Những đặc tính quý của thực vật nhƣ tính chín sớm, tính chịu rét, chịu
nóng, chịu phèn, chịu mặn, kháng sâu bệnh có phẩm chất tốt… chỉ có thể hình

Nguyễn Thị Hoa

21

K34E Sinh - KTNN



Trường ĐHSP Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

thành trong những điều kiện nhất định. Các giống địa phƣơng mặc dù có
nhiều đặc tính quý, thích nghi với điều kiện địa phƣơng nhƣng vẫn không thể
nào thỏa mãn đƣợc yêu cầu ngày càng cao và đa dạng đối với giống cây trồng
của nền nông nghiệp hiện đại. Chính vì vậy, việc nhập nội giống cây trồng là
một yêu cầu không thể thiếu đối với công tác chọn giống.
Bằng phƣơng pháp nhập nội trong nhiều thập kỷ qua Việt Nam đã đƣa
vào sản xuất nhiều giống cây trồng mới nhƣ: lúa IR8, IR22, CR203, IR64,
IR17494, IR50404, Khang dân 18, nhiều giống lúa lai có nguồn gốc Trung
Quốc...
Mục đích của nhập nội giống cây trồng trong chọn tạo giống:
- Sử dụng những giống ƣu việt đang đƣợc gieo trồng trên thế giới.
- Nhập cây trồng mới và tiến hành chƣơng trình chọn giống cây trồng đó.
- Thu thập nguồn gen để sử dụng trong việc cải tiến cây trồng.
1.3. Nuôi cấy mô tế bào thực vật và ứng dụng
Kĩ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật đã trải qua hơn 100 năm phát triển.
Ngày càng có nhiều ứng dụng và làm sáng tỏ lý thuyết về tính toàn năng của
tế bào. Có thể thấy sự phát triển của kĩ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật luôn
song song với lịch sử các ngành khoa học sự sống khác. Đến nay đã có hàng
trăm loài cây đƣợc nuôi cấy mô thành công với nhiều mục đích khác nhau
nhƣ nhân nhanh, bảo tồn in vitro, nuôi cấy bao phấn… Đặc biệt, nhờ kĩ thuật
nuôi cấy mô và chuyển gen thông qua giai đoạn mô sẹo và tái sinh tạo chồi
mà nhiều giống cây trồng chuyển gen đã đƣợc tạo ra (cà chua, lúa, đậu tƣơng,
khoai tây, bông, đu đủ…) (Lê Trần Bình và cs, 1997; Đỗ Năng Vịnh, 2005)
[1] [11] .

Nguyễn Thị Hoa


22

K34E Sinh - KTNN


Trường ĐHSP Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

1.3.1. Cơ sở khoa học của nuôi cấy mô tế bào thực vật
Cơ sở lý luận của phƣơng pháp nuôi cấy mô và tế bào thực vật đó là tính
toàn năng của tế bào do Haberlandt nêu ra vào năm 1902. Theo quan điểm
của sinh học hiện đại thì tính toàn năng của tế bào là mỗi tế bào riêng rẽ mang
toàn bộ thông tin di truyền cần thiết và đủ của cơ thể sinh vật, khi gặp điều
kiện thích hợp thì mỗi tế bào đều có thể phát triển thành một cơ thể hoàn
chỉnh.
Nuôi cấy mô tế bào thực vật (plant tissue culture) là kĩ thuật đƣa một
mô, bộ phận hoặc tế bào của thực vật vào trong một hệ thống vô trùng có thể
kiểm soát về: thành phần chất khoáng, điều hòa sinh trƣởng, các chất hữu cơ
cung cấp cho cây, ánh sáng, nhiệt độ, độ ẩm để mô, bộ phận sinh trƣởng đó
phát triển theo mục đích của ngƣời nuôi cấy (Vũ Văn Vụ, 1998; Nguyễn Đức
Thành, 2000)[12][8].
Mục đích chung của nuôi cấy mô - tế bào thực vật là sử dụng các điều
kiện nhƣ: nhiệt độ, ánh sáng, thành phần dinh dƣỡng, các chất điều hoà sinh
trƣởng thực vật… để điều khiển quá trình sinh trƣởng và phát triển của tế bào,
mô nuôi cấy theo mục tiêu và yêu cầu đặt ra.
Phƣơng pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật chủ yếu hƣớng về những ứng
dụng thực tiễn nhƣ:
- Tạo đƣợc quần thể lớn và đồng nhất trong thời gian ngắn, với diện tích nhỏ,

có điều kiện hóa lý có thể kiểm soát đƣợc.
- Tạo đƣợc nhiều cây con từ mô và cơ quan cây (lóng, thân, phiến lá, hoa, hạt
phấn…) mà ngoài thiên nhiên không thực hiện đƣợc.
- Làm sạch nguồn virus cho cây bằng cách cấy đỉnh sinh trƣởng.

Nguyễn Thị Hoa

23

K34E Sinh - KTNN


Trường ĐHSP Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

- Cải tiến các giống cây trồng bằng công nghệ sinh học.
Trong mấy thập kỷ qua công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật đã phát
triển mạnh mẽ ở nhiều quốc gia trên thế giới.
Nuôi cấy mô tế bào thực vật là một công cụ cần thiết trong nhiều lĩnh
vực nghiên cứu cơ bản và ứng dụng của ngành sinh học. Nhờ áp dụng các kỹ
thuật nuôi cấy mô phân sinh, mô sẹo… con ngƣời đã thúc đẩy thực vật sinh
sản nhanh hơn gấp nhiều lần tốc độ vốn có trong tự nhiên và tạo ra hàng loạt
cá thể mới giữ nguyên tính trạng di truyền của cơ thể mẹ, rút ngắn thời gian
đƣa một giống mới vào sản xuất ở quy mô lớn. Hơn nữa dựa vào kỹ thuật
nuôi cấy mô - tế bào đã duy trì và bảo quản đƣợc nhiều giống cây trồng qúy
hiếm hoặc loại bỏ đƣợc nhiều mầm bệnh (phục tráng giống) (Nguyễn Đức
Lƣợng, Lê Thị Thủy Tiên, 2007) [6].
Mặt khác sử dụng các kỹ thuật nuôi cấy và dung hợp protoplast (tế bào
trần) đã thực hiện đƣợc việc chuyển các gen mong muốn vào cây trồng….

Bên cạnh đó sự ổn định và độc lập, ít lệ thuộc vào sản xuất của thực vật ngoài
tự nhiên.
Ngoài ra, nuôi cấy mô - tế bào thực vật còn là một phƣơng pháp nghiên
cứu hiệu quả nhất quá trình phát sinh hình thái ở nhiều loài thực vật. Phƣơng
pháp này giúp mở ra những hƣớng mới trong nghiên cứu sinh lý và di truyền
thực vật nhƣ: cơ chế sinh tổng hợp các chất, sinh lý phân tử - đột biến, sinh lý
dinh dƣỡng ở tế bào thực vật và nhiều vấn đề sinh học khác…
Nuôi cấy mô - tế bào bao gồm:
- Nuôi cấy mô và cơ quan tách rời
- Nuôi cấy mô phân sinh
- Nuôi cấy phôi

Nguyễn Thị Hoa

24

K34E Sinh - KTNN


Trường ĐHSP Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

- Nuôi cấy bao phấn và hạt phấn
- Nuôi cấy tế bào đơn và tế bào trần
- Nuôi cấy mô sẹo
Các bước nhân giống bằng nuôi cấy mô (microproparation):
- Nuôi cấy đỉnh sinh trƣởng hoặc chồi đỉnh chồi bên.
- Tạo thể nhân giống in- vitro.
- Nhân giống in vitro.

- Tái sinh cây hoàn chỉnh in vitro.
- Chuyển cây in vitro ra vƣờn ƣơm.
1.3.2. Nuôi cấy mô sẹo (callus)
Mô sẹo là khối mô thực vật gồm những tế bào chƣa phân hoá, có khả năng
phân chia liên tục và có tính biến động di truyền cao. Trong nuôi cấy in vitro,
mô sẹo đƣợc tạo ra bằng cách nuôi cấy các cơ quan của thực vật (lá, hoa, quả,
thân...) trong môi trƣờng và điều kiện nuôi cấy thích hợp. Mô sẹo có thể đƣợc
duy trì trên môi trƣờng nuôi cấy bằng cách cấy chuyển định kỳ, song việc cấy
chuyển nhiều lần có ảnh hƣởng không tốt đến khả năng tái sinh cây và làm tăng
tính biến động di truyền của mô. Những cây tái sinh từ mô sẹo với những biến
đổi di truyền phong phú có ý nghĩa quan trọng trong việc tạo ra nguồn nguyên
liệu ban đầu cho quá trình chọn giống. Nhiều tác giả đã thu đƣợc những giống
cây trồng mới bằng con đƣờng nuôi cấy mô sẹo (Lê Xuân Đắc, 2008; Jain,
1998; Rahman & cv, 1998; Đinh Thị Phòng, 2001) [3] [18] [17] [13].
Nguyên liệu để tạo mô sẹo là các phần non của cây hoặc hạt, đƣợc đƣa
vào môi trƣờng nuôi cấy. Trong qúa trình nuôi cấy tạo mô sẹo, mẫu thƣờng
phải để trong tối. Tạo mô sẹo có thể coi là quá trình phản biệt hóa, đƣa những
mẫu đã biệt hóa trở về trạng thái ban đầu của phôi.
Mô sẹo khi hình thành sẽ gồm hai loại:

Nguyễn Thị Hoa

25

K34E Sinh - KTNN