LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất tới
PGS.TS. Đinh Thị Kim Nhung và TS. Dương Minh Lam đã tận tình giúp đỡ,
chỉ bảo tôi trong suốt thời gian hoàn thành khóa luận này.
Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn tới Ban Giám Hiệu Trường Đại học Sư
phạm Hà Nội 2, các thầy cô trong khoa Sinh - KTNN, phòng thí nghiệm vi
sinh vật, cùng các thầy cô trong tổ bộ môn vi sinh đã hết lòng dạy dỗ tôi trong
suốt thời gian qua.
Cuối cùng, tôi xin cảm ơn sự giúp đỡ, quan tâm, động viên của gia đì nh,
bạn bè trong suốt quá trì nh hoàn thành khóa luận này.
Tôi xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày 01 tháng 05 năm 2012
Sinh viên

Đặng Thi Thu Huyền


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi. Các căn cứ, các
số liệu nghiên cứu trong khóa luận là trung thực. Tất cả những số liệu đều thu
từ thực nghiệm và qua xử lí thống kê, hoàn toàn không có số liệu sao chép,
bịa đặt. Đề tài này không trùng hợp với công trình nghiên cứu của các tác giả
khác.
Hà Nội, ngày 01 tháng 05 năm 2012
Sinh viên

Đặng Thị Thu Huyền


MỤC LỤC
Trang

Mở đầu
1. Lý do chọn đề tài ........................................................................................... 1
2. Mục tiêu của đề tài ........................................................................................ 2
3. Nội dung nghiên cứu ..................................................................................... 2
4. Ý nghĩa lý luận và thực tiễn của đề tài .......................................................... 3
Nội dung
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................ 4
1.1. Đặc điểm phân loại của Acetobacter xylinum ............................................ 4
1.1.1. Vị trí phân loại của Acetobacter xylinum ................................................ 4
1.1.2. Đặc điểm vi khuẩn Acetobacter xylinum ................................................ 5
1.1.3. Nhu cầu dinh dưỡng của vi khuẩn Acetobacter xylinum ........................ 7
1.2. Bỏng và đặc điểm của các nhóm thuốc trị bỏng ........................................ 9
1.2.1. Bỏng và sinh bệnh học tổn thương bỏng ................................................ 9
1.2.2. Đặc điểm của nhóm thuốc trị bỏng ....................................................... 10
1.3. Màng Bacterial cellulose .......................................................................... 11
1.3.1. Cấu trúc của màng Bacterial cellulose .................................................. 12
1.3.2. Một số tính chất của màng Bacterial cellulose ..................................... 13
1.3.3. Cơ chế tổng hợp Bacterial cellulose ..................................................... 14
1.4. Tình hình nghiên cứu của Acetobacter xylinum trên thế giới và ở
Việt Nam ................................................................................................ 16
1.4.1. Tình hình nghiên cứu Acetobacter xylinum trên thế giới...................... 16
1.4.2. Tình hình nghiên cứu Acetobacter xylinum ở Việt Nam ...................... 17
1.5. Ứng dụng của màng BC trong điều trị bỏng ở Việt Nam và trên thế giới .... 17
1.5.1. Ứng dụng của màng BC trong điều trị bỏng ......................................... 17
1.5.2. Ứng dụng màng BC trong điều trị bỏng ở Việt Nam và trên thế giới .. 18
1.5.3. Thành phần và tác dụng của nghệ và mật ong trong điều trị bỏng ....... 19
CHƢƠNG 2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.......................................... 21
2.1. Đối tượng nghiên cứu và hóa chất ........................................................... 21



2.1.1. Đối tượng nghiên cứu............................................................................ 21
2.1.2. Hóa chất................................................................................................. 21
2.1.3. Dụng cụ, thiết bị .................................................................................... 21
2.1.4. Môi trường nghiên cứu.......................................................................... 21
2.2. Phương pháp nghiên cứu.......................................................................... 22
2.2.1. Phương pháp phân biệt vi khuẩn Acetobacter xylinum bằng phương
pháp nhuộm Gram ............................................................................... 22
2.2.2. Phương pháp bảo quản chủng giống trên thạch nghiêng ...................... 22
2.2.3. Phương pháp hoạt hóa giống................................................................. 22
2.2.4. Phương pháp lên men tạo màng ............................................................ 23
2.2.5. Phương pháp xử lý và bảo quản màng BC ........................................... 23
2.2.6. Kiểm tra tính kích ứng của màng BC ................................................... 25
2.2.7. Phương pháp gây bỏng và trị bỏng trên thỏ .......................................... 25
2.2.8. Phương pháp xử lý bằng thống kê toán học.......................................... 25
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN .................... 26
3.1. Một số đặc tính hình thái của chủng vi khuẩn Acetobacter xylinum BHN2............ 26
3.2. Quá trình thu nhận màng BC của chủng vi khuẩn Acetobacter xylinum
BHN2 ....................................................................................................... 26
3.2.1. Lên men tạo màng ................................................................................. 26
3.2.2. Xử lý màng sau lên men........................................................................ 30
3.3. Lựa chọn phương pháp xử lý bảo quản màng BC ................................... 30
3.3.1. Lựa chọn phương pháp xử lý màng BC ................................................ 30
3.3.2. Lựa chọn phương pháp bảo quản màng BC.......................................... 38
3.4. Kết quả kiểm tra tính kích ứng của màng BC trên thỏ ............................ 42
3.5. Kết quả thử nghiệm tác dụng của màng BC lên vết bỏng ....................... 43
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ...................................................................... 49
1. Kết luận ....................................................................................................... 49
2. Kiến nghị ..................................................................................................... 49
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 50



DANH MỤC BẢNG VÀ HÌNH
Trang

Bảng
Bảng 1.1. Đặc điểm sinh hóa của chủng A.xylinum theo Frateur ..................... 7
Bảng 3.1. Đặc tính của màng BC lên men sau 5 ngày .................................... 29
Bảng 3.2. Khả năng thấm hút nước của màng sau xử lý MH1 ....................... 32
Bảng 3.3. Đặc điểm của màng sau xử lý MH1 ............................................... 32
Bảng 3.4. Khả năng thấm hút nước của màng sau xử lý MH2 ....................... 34
Bảng 3.5. Đặc điểm của màng sau xử lý theo MH2 ....................................... 34
Bảng 3.6. Khả năng thấm hút của màng sau xử lý MH3 ................................ 36
Bảng 3.7. Đặc điểm của màng sau xử lý MH3 ............................................... 37
Bảng 3.8. Khả năng thấm hút mật ong của màng BC ..................................... 39
Bảng 3.9. Khả năng thấm hút nghệ của màng BC .......................................... 39
Bảng 3.10. Khả năng thấm hút NaCl 0,9% của màng BC .............................. 40
Bảng 3.11. Diện tích vết bỏng của thỏ ở các lô theo thời gian ....................... 45
Bảng 3.12. Tỷ lệ vết thương (% theo diện tích) .............................................. 45
Hình
Hình 1.1. Cấu trúc của màng BC và sợi cellulose của thực vật ...................... 12
Hình 1.2. Con đường chuyển hóa cacbon trong Acetobacter ......................... 16
Hình 3.1. Mẫu tế bào của chủng A.xylinum (Độ phóng đại 1000 lần)............ 26
Hình 3.2. Chủng A.xylinum BHN2 .................................................................. 27
Hình 3.3. Quá trình thu nhận mạng qua các ngày ........................................... 28
Hình 3.4. Màng BC sau 5 ngày lên men ......................................................... 29
Hình 3.5. Màng BC sau xử lý ......................................................................... 30
Hình 3.6a. Độ pH của màng sau xử lý MH1................................................... 31
Hình 3.6b. Bản thạch được che phủ bởi màng BC qua xử lý MH1 ................ 31
Hình 3.7a. Bản thạch được che phủ bởi màng BC qua xử lý MH2 ................ 33



Hình 3.7b. Độ pH của màng sau xử lý MH2 .................................................. 33
Hình 3.8a. Bản thạch không được che phủ ..................................................... 35
Hình 3.8b. Bản thạch được che phủ bởi gạc vô trùng..................................... 35
Hình 3.8c. Bản thạch được che phủ bởi màng BC qua xử lý MH3 ................ 35
Hình 3.8d. Độ pH của màng sau xử lý MH3 .................................................. 35
Hình 3.9. Màng BC đã sấy khô ....................................................................... 38
Hình 3.10. Đồ thị biểu diễn khả năng thấm hút chất phụ gia của màng BC .. 41
Hình 3.11a. Màng thấm hút mật ong .............................................................. 42
Hình 3.11b. Màng thấm hút nghệ ................................................................... 42
Hình 3.11c. Màng thấm hút nước muối sinh lý .............................................. 42
Hình 3.12. Thử tính kích ứng của màng ......................................................... 43
Hình 3.13. Vết bỏng khi vừa gây bỏng và sau 3 ngày .................................... 44
Hình 3.14. Đắp màng BC và gạc trị bỏng ....................................................... 44
Hình 3.15. Đồ thị biểu diễn tỷ lệ lành vết thương ở các lô điều trị ................ 46
Hình 3.16. Đắp màng BC và gạc trị bỏng ở ngày thứ 12................................ 47


DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

A.xylinum

: Acetobacter xylinum

BC

: Bacterial cellulose

CS


: Cellulose synthase

cs

: Cộng sự

GK

: Glusokinase

MH

: Mô hình

Nxb

: Nhà xuất bản

PCR

: Polymerase Chain Reaction

PGM

: Phosphoglucomutase

STT

: Số thứ tự


UGP

: Glucose-1-phosphate uridylyltransferase


MỞ ĐẦU
1. Lý do chọn đề tài
Ngày nay công nghệ sinh học đang dần trở thành một ngành kĩ thuật
chủ đạo của nhiều quốc gia trên thế giới. Gắn liền với nó là công nghệ vi sinh
với những thành tựu lớn có ý nghĩa trong đời sống, trong các ngành công
nghiệp, y học... Khó có thể tìm ra một lĩnh vực nào của công nghệ sinh học
mà lại không liên quan tới vi sinh vật.
Vi khuẩn A.xylinum thuộc nhóm vi khuẩn Gram âm hiếu khí bắt buộc,
hoá dưỡng thuộc chi Acetobacter, họ Acetobacteraceae. Vi khuẩn A.xylinum
tìm thấy trong giấm, dịch rượu, nước ép hoa quả. Khi nuôi cấy vi khuẩn này
trên môi trường dịch lỏng, chúng sẽ hình thành trên bề mặt một lớp màng
cellulose sinh học thuần khiết và được gọi là màng sinh học bacterial
cellulose (BC), đó là tập hợp các tế bào vi khuẩn liên kết với phân tử
cellulose. Cho đến nay , Acetobacter xylinum được đánh giá là loài vi khuẩn
có khả năng sinh màng BC hiệu quả nhất trong tự nhiên

. Mỗi tế bào

A.xylinum có thể chuyển hóa tới 108 phân tử glucose vào phân tử cellulose
trong 1 giờ nên khả năng tổng hợp cellulose là rất lớn [10].
Màng BC do A.xylinum tạo ra có cấu trúc hóa học và đặc tính cơ học
giống với cellulose của thực vật nhưng có thêm một số tính chất hóa lý đặc
biệt như: độ bền học, đường kính sợi nhỏ, độ tinh khiết cao, tính đàn hồi lớn,
khả năng thấm hút nước cao, khả năng polymer hóa rất lớn. Vì vậy, mà màng
BC được coi là nguồn poly mer mới , là một giải pháp trên con đường tìm

nguồn nguyên liệu mới hiện nay . Nó đã và đang thu hút được sự chú ý của
nhiều nhà khoa học ngay từ nửa sau của thế kỷ XIX và hiện được ứng dụng
trong nhiều lĩ nh vực khác nhau như : trong công nghiệp sản xuất giấy màng
BC được dùng để sản xuất giấy điện tử chất lượng cao ; trong công nghệ môi

1


trường đã sử dụng màng BC làm màng phân t ách để xử lý nước và biến đổi
độ nhớt của nước (Brown 1989, Jonas và Fonah 1998) [17], [32]. Ngoài ra ,
màng BC còn được dùng làm chất mang đặc biệt cho các sợi pin và tế bào
năng lượng (Brown 1989), làm các sợi truyền quang , là môi trường cơ chất
trong sinh học sử dụng cố đị nh protein thay cho sắc ký
thực phẩm sử dụng vi khuẩn

. Trong công nghiệp

A.xylinum nuôi trên môi trường nước dừa tạo

màng BC để sản xuất thạch dừa . Trong lĩ nh vực mỹ phẩm và dược phẩm, lợi
dụng những đặc tí nh của màng BC như tính thông thoáng , khả năng kháng
khuẩn, tính tương đồng về cấu trúc với sợi collagen trong da nên màng BC
được coi là nguồn nguyên liệu quý giá dùng làm mặt n ạ dưỡng da , da nhân
tạo, dùng trong điều trị bỏng và tổn thương da.
Do nhu cầu màng trị bỏng lớn, nhưng hầu hết đều phải nhập ngoại với
giá thành cao. Trong khi đó màng BC có thể tự sản xuất trong nước từ những
nguồn nguyên liệu dễ kiếm và giá thành thấp và có n hững đặc tí nh tốt phù
hợp cho các ứng dụng trong thực tế , đặc biệt là trị bỏng . Nên nếu chế tạo
thành công màng BC từ vi khuẩn A.xylinum sẽ có ý nghĩa rất cao trong tình
hình điều trị bỏng ở nước ta hiện nay. Từ những lý do đó tôi đi đến chọn đề

tài nghiên cứu “Nghiên cứu tác dụng của màng BC từ vi khuẩn Acetobacter
xylinum BHN2 tới khả năng lành vết thương trên thỏ”.
2. Mục tiêu của đề tài
Khảo sát, đánh giá khả năng lành vết thương và nghiên cứu tác dụng trị
bỏng của màng BC trên thỏ.
3. Nội dung nghiên cứu
3.1. Nghiên cứu một số đặc tính sinh học của chủng A.xylinum BHN2.
3.2. Nghiên cứu quá trình thu nhận màng BC của chủng vi khuẩn
Acetobacter xylinum BHN2.
3.3. Nghiên cứu phương pháp xử lý và bảo quản màng BC.

2


3.4. Nghiên cứu tác dụng của màng BC tới khả năng lành vết thương trên thỏ
gây bỏng nhân tạo.
4. Ý nghĩa lý luận và thực tiễn của đề tài
4.1. Nghiên cứu phương pháp xử lý và bảo quản màng BC.
4.2. Nghiên cứu khả năng tạo màng sinh học BC và ứng dụng trị bỏng với
mục đích tìm kiếm màng trị bỏng giá thành thấp.

3


CHƢƠNG 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Đặc điểm phân loại của Acetobacter xylinum
1.1.1. Vị trí phân loại của Acetobacter xylinum
Tên gọi: Acetobacter xylinum là một tên gọi chính chính thức theo hệ
thống danh pháp quốc tế 1990.

Vi khuẩn acetic nói chung, A.xylinum nói riêng đã và đang thu hút được
sự quan tâm của rất nhiều nhà khoa học trên thế giới từ xưa tới nay. Ngay từ
thế kỷ XIX các nhà khoa học đã tiến hành phân lập và phân loại chúng. Tuy
nhiên cho đến nay việc phân loại vi khuẩn này vẫn còn nhiều tranh cãi.
Năm 1950, Frateur đã xếp A.xylinum vào nhóm Meroxydans.
Năm 1957, theo “Bergey’s manual of determinative bacteriology” 19
ông đã xếp A.xylinum vào chi Acetobacter, thuộc họ Pseudomonadaceae, bộ
Pseudomonadales, lớp Schizomycetes.
Tuy nhiên, đến năm 1974, theo “Bergey’s manual of determinative
bacteriology”  22 A.xylinum lại được coi như là một loài phụ của Acetobacter
aceti, thuộc chi Acetobacter và được nhóm vào những chi không rõ nguồn
gốc.
Cùng với thời gian loài vi khuẩn này lại được sắp xếp vào những vị trí
khác nhau. Như theo “Applied and Envitromene microbiology”

 25 và

“Bergey’s manual of determinative bacteriology”  28 thì họ Acetobacteracae
gồm hai chi vi khuẩn acetic quan trọng là Acetobacter và Gluconbacter. Vi
khuẩn A.xylinum được xếp vào chi Acetobacter.
Tới nay, đã tồn tạo nhiều quan điểm khác nhau trong việc phân loại vi
khuẩn acetic nói chung và A.xylinum nói riêng. Vấn đề này vẫn đang gây
nhiều tranh cãi, đòi hỏi cần có nhiều hơn những nghiên cứu tiếp theo.
4


1.1.2. Đặc điểm vi khuẩn Acetobacter xylinum
 Đặc điểm hình thái, tế bào học
Đặc điểm A.xylinum là trực khuẩn hình que, kích thước khoảng 2µm,
đứng riêng lẻ hoặc xếp thành từng chuỗi, không có khả năng di động. Các tế

bào được bao bọc bởi màng nhầy có bản chất là cellulose. Màng này bắt màu
xanh khi nhuộm với thuốc nhuộm iot và dung dịch acid sulfuric 60%. Chúng
tích lũy khoảng 4,5% acid acetic, khi nồng độ acid acetic quá cao vượt quá
giới hạn cho phép nó sẽ ức chế hoạt động của vi khuẩn.
A.xylinum thường sống chung với nấm chè trong một loại nước giải
khát dân gian làm từ nước chè loãng gọi là “Thủy hoài sâm”, Người Trung
Quốc gọi là “Hải bảo” hay “Vị bảo”, người Nga gọi là “Nấm chè”, người
Pháp gọi là “Chamignon De Longue Vie – nấm trường sinh”, người Nhật gọi
chúng là “Kombuchan” 31 .
Vi khuẩn A.xylinum thuộc nhóm vi khuẩn Gram âm, hiếu khí bắt buộc,
hóa dưỡng. Tế bào của chúng thường tìm thấy trong giấm, dịch rượu, nước ép
hoa quả, trong đất  22 .
 Đặc điểm nuôi cấy
Trên môi trường thạch đĩa, vi khuẩn A.xylinum hình thành khuẩn lạc
nhẵn hoặc xù xì, rìa mép khuẩn lạc bằng phẳng hay gợn sóng, màu trắng hoặc
trong suốt, khuẩn lạc bằng phẳng hoặc lồi lên dễ tách khỏi môi trường 16 .
Trên môi trường dịch thể, trong điều kiện nuôi cấy tĩnh, chúng sẽ hình
thành trên bề mặt môi trường một lớp màng cellulose. Màng cellulose là tập
hợp những bó sợi cellulose liên kết với nhau, chúng được hình thành từ tập
hợp các sợi microfiril 30 . Nó bao bọc xung quanh tế bào vi khuẩn có chức
năng bảo vệ chúng khỏi tác động bên ngoài môi trường. Vì vậy, chúng có thể
tồn tại ở những vùng nước thải. Ngược lại trong điều kiện nuôi lắc, cellulose
hình thành dạng hạt nhỏ với kích thước không đều nhau và phân tán trong
5


môi trường dinh dưỡng tạo ra những đặc tính hình thái khác hẳn cellulose
trong điều kiện nuôi cấy tĩnh như: sự phân nhánh của sợi cellulose nhiều hơn,
đường kính bó sợi lớn hơn (0,05 - 0,1µm) 13 .
 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa

Theo Bergey, pH tối thích cho vi khuẩn A.xylinum là 5,4 - 6,2; nhiệt độ
tối thích là 25 - 30oC. Một số nghiên cứu chỉ ra A.xylinum có thể sinh trưởng
ở nhiệt độ 12 - 35oC. pH từ 3-8 trong đó pH tối thích là 6. Năm 1947, Hestrin
và cs đã tìm ra môi trường nuôi cấy A.xylinum tạo màng BC bao gồm 2%
đường glucose, 0,5% pepton, 0,5% cao men, 0,27% NaHPO4, 0,115% citric
acid monohydrate, pH thích hợp là 4,5. Hiện nay, vẫn còn nhiều ý kiến khác
nhau về điều kiện nhiệt độ, pH tối thích cho chủng vi khuẩn A.xylinum sinh
trưởng và tạo màng.
Dựa vào khả năng oxy hóa acid acetic, Beijerinck (1898) phân chia các
loài vi khuẩn A.xylinum thành 2 nhóm:
Nhóm 1: Có khả năng oxy hóa acid acetic thành CO2và H2O
Sử dụng muối ammonium làm nguồn nitơ duy nhất (sinh trưởng trên
môi trường Hoyer). Dạng điển hình là vi khuẩn A.aceti.
Không sử dụng muối ammonium là nguồn nitơ duy nhất: trên bề mặt
môi trường dịch thể nuôi cấy có tạo thành lớp màng nhày chứa cellulose, điển
hình là vi khuẩn A.xylinum. Trên bề mặt môi trường dịch thể nuôi cấy không
tạo màng nhày, điển hình là A.zancens, A.pasteurianu, A.kneizigianus.
Nhóm 2: Không có khả năng oxy hóa acid acetic
Tạo sắc tố nâu trên môi trường glucose: sắc tố nâu đen đến nhạt
(A.melagenus), sắc tố hồng (A.zancens).
Không tạo sắc tố: nhiệt độ thích hợp nhất là 30 - 35oC (A.suboxydans),
nhiệt độ thích hợp nhất là 18 - 21oC (A.oxydans). Theo quan điểm này
A.xylinum là chủng thuộc chi Acetobacter, họ Pseudomanadaceae, bộ
Pseudomonadales, lớp Schizomycetes.
6


Đến năm 1950, Frateur đã chính thức đưa ra một khóa phân loại mới
căn cứ vào các tiêu chuẩn như: khả năng oxy hóa acid acetic thành CO2 và
H2O, hoạt tính catalase, khả năng sinh trưởng trên môi trường Hoyer. Theo

quan

điểm

này

A.xylinum

là

chủng

thuộc

chi

Acetobacter,

họ

Pseudomanadaceae, bộ Pseudomonadales, lớp Schizomycetes.
Bảng 1.1. Đặc điểm sinh hóa của chủng vi khuẩn A. xylinum theo Frateur  21
Đặc điểm

STT

Hiện tƣợng

Kết quả


Oxy hóa ethanol thành Chuyển hóa môi trường chứa
1

acid acetic

Bromphenol Blue 0,04% từ màu

+

xanh sang màu vàng
2
3

4

Sinh trưởng trên môi Sinh khối không phát triển
trường Hoyer
Chuyển

hóa

glycerol Tạo kết tủa đỏ gạch trong dịch sau

thành dihydroxyaceton
Chuyển

5

Hiện tượng sủi bọt khí


Hoạt tính catalase

hóa

thành acid

lên men

+
-

+

glucose Vòng sáng xuất hiện xung quanh
khuẩn lạc trên môi trường chứa

+

CaCO3
6

7

Kiểm tra khả năng sinh Không hình thành sắc tố nâu
sắc tố nâu
Kiểm tra khả năng tổng Váng vi khuẩn xuất hiện màu lam
hợp cellulose

-


+

1.1.3. Nhu cầu dinh dưỡng của vi khuẩn Acetobacter xylinum
1.1.3.1. Ảnh hưởng của nguồn cacbon
Để vi khuẩn sinh trưởng và phát triển tốt hơn cần cung cấp nguồn
cacbon phù hợp. Tùy nhóm vi sinh vật mà nguồn cacbon được cung cấp là vô
cơ hay hữu cơ. Giá trị dinh dưỡng và khả năng hấp thụ cacbon phụ thuộc vào

7


hai yếu tố: thành phần hoá học và tính chất sinh lý của nguồn thức ăn, đặc
điểm sinh lý của từng loại vi sinh vật.
Người ta sử dụng đường làm thức ăn nuôi cấy phần lớn các vi sinh vật
dị dưỡng. Đường đơn ở nhiệt độ cao có thể bị chuyển hoá thành loại hợp chất
có màu tối khó hấp thụ. Trong môi trường kiềm sau khử trùng, đường còn dễ
bị chuyển hoá làm biến đổi pH môi trường. Để tránh hiện tượng này khi khử
trùng môi trường có chứa đường người ta thường chỉ hấp ở áp lực 0,5atm ở
110oC trong 20 phút. Từ các loại đường đơn tốt nhất nên sử dụng phương
pháp hấp gián đoạn (phương pháp Tyndal). Để nuôi cấy các loại vi sinh vật
khác người ta sử dụng các nồng độ đường không giống nhau, với vi khuẩn
thường dùng 0,5 - 0,2% đường. Hầu hết các vi sinh vật chỉ đồng hoá được các
loại đường ở dạng đồng phân D [6].
Các hợp chất hữu cơ chứa cả cacbon cả nitơ (pepton, nước thịt, nước
chiết ngô, nước chiết nấm men, nước chiết đại mạch,...) có thể vừa sử dụng
làm nguồn cacbon, vừa sử dụng làm nguồn nitơ đối với vi sinh vật [6].
1.1.3.2. Nhu cầu nitơ của vi sinh vật
Nguồn nitơ vô cơ dễ hấp thu nhất đối với vi sinh vật là NH3 và NH4+. Tuy
nhiên, khi nuôi cấy vi khuẩn trong môi trường có sử dụng NH4+ thì sau khi chúng
đồng hóa NH4+ trong môi trường sẽ tích lũy anion vô cơ (SO42-, Cl- …) làm hạ

thấp rất nhiều trị số pH của môi trường. Muối anion của các axit hữu cơ ít làm
chua môi trường hơn do đó có lúc được sử dụng nhiều hơn (mặc dù đắt hơn).
Muối nitrat là nguồn thức ăn nitơ thích hợp với nhiều loại tảo, nấm sợi,
xạ khuẩn nhưng lại ít thích hợp với vi khuẩn, vì sau khi vi khuẩn sử dụng hết
NO3- các ion kim loại còn lại sẽ kiềm hóa môi trường [6], [9].
Vi sinh vật có khả năng đồng hóa tốt nitơ chứa trong các thức ăn hữu
cơ. Các thức ăn này vừa là nguồn cacbon vừa là nguồn cung cấp nitơ cho vi
sinh vật. Vi sinh vật không có khả năng hấp thụ trực tiếp các protein cao phân

8


tử, chỉ có các polypeptid không chứa quá 5 gốc axit amin mới có thể di
chuyển trực tiếp qua màng tế bào chất của vi sinh vật [5], [7].
1.1.3.3. Hàm lượng ethanol trong dung dịch lên men
Ethanol được sử dụng như một cơ chất. Hàm lượng ethanol có thể
thay đổi từ 2 - 10% V. Hàm lượng cao hơn sẽ làm giảm năng suất lên
men. Theo Hong - Joo Son lại công bố hàm lượng ethanol có thể thay đổi
từ 0,2 - 1% tốt nhất ở 0,6%. Theo Nodes, lượng ethanol duy trì trong môi
trường luôn giữ ở 3 - 3,5%. Các tác giả Ebner và Heirich, cho lượng
ethanol dùng từ 7 - 10%V. Để tránh hiện tượng oxy hoá hoàn toàn acid
acetic cần có một lượng ethanol sót trong sản phẩm từ 0,2 - 0,5% để ức
chế tự tổng hợp enzyme oxy hoá acid acetic và muối acetate [5], [7], [17],
[20]. Ngoài việc oxy hoá ethanol, vi khuẩn acetic còn có kh

ả năng oxy

hoá các rượu khác thành các axit tương ứng.
1.2. Bỏng và đặc điểm của các nhóm thuốc trị bỏng
1.2.1. Bỏng và sinh bệnh học tổn thương bỏng

1.2.1.1. Bỏng
Bỏng là tổn thương do tác dụng trực tiếp của các các yếu tố như sức
nhiệt là loại thường gặp nhất: sức nhiệt khô (lửa, kim loại nóng chảy, tia lửa
điện; sức nhiệt ướt (nước sôi, dầu mỡ, hơi nước); hóa chất (axit, bazơ); điện
năng; bức xạ vật lý (tia hồng ngoại, tử ngoại, tia phóng xạ).
Trong bỏng nhiệt, khi mô tế bào bị nóng đến 43 - 45oC, sự sống của
tế bào bị đe doạ. Nếu nóng đến 46 - 47oC, lượng Adenozin Triphotphat
(ATP) giảm 50%. Nếu nóng đến 50oC thì tổn thương còn có thể phục hồi,
nóng từ 50 - 60oC thì các thành phần protein bị biến thoái, không thể phục
hồi. Nếu nóng đến 60 - 70oC thì mô tế bào bị hoại tử ngay khi tác nhân
nhiệt tiếp xúc.
1.2.1.2. Sinh bệnh học tổn thương bỏng
Da là tổ chức che phủ toàn bộ cơ thể đồng thời có nhiều chức năng như:
điều hòa nhiệt độ cơ thể, hàng rào bảo vệ cơ thể, là cơ quan xúc giác, bài tiết
9


một số chất bài tiết qua mồ hôi. Khi bị bỏng thì da là bộ phận dễ bị tổn
thương nhất khi đó da sẽ không còn giữ được vai trò bảo vệ cơ thể chống
nhiễm trùng nữa. Ở vết thương bỏng có biểu hiện hoại tử, viêm, sưng, thoát
dịch huyết tương,…làm cho bệnh nhân có cảm giác đau rát. Nếu vết bỏng
không được xử lý kịp thời có thể gây nhiễm trùng huyết, lan rộng hoại tử nên
làm tăng diện tích sẹo và di chứng sẹo sau này [33].
Các cách phân loại độ sâu của tổn thương bỏng:
Dupuytren chia bỏng làm 6 độ: da đỏ, nốt phỏng, hoại tử trung bì, hoại
tử toàn lớp da, hoại tử cơ và xương.
Quân y Pháp chia làm 2 loại: bỏng kín và bỏng hở.
Một số nước Âu Mỹ chia theo độ sâu của bỏng thành 3 độ: độ I, độ II
(độ II nông, độ II sâu), độ III (độ III nông, độ III sâu).
Nga chia bỏng theo 4 độ: độ I, độ II, độ III, độ IV.

Hiện nay, chúng ta chia mức độ tổn thương thành 2 nhóm: bỏng nông
và bỏng sâu với 5 mức độ [33].
1.2.2. Đặc điểm của nhóm thuốc trị bỏng
 Nhóm thuốc làm se khô: tạo màng che phủ vết thương bỏng mới
Cao đặc xoan trà (B76) từ vỏ cây xoan trà: thuốc tác dụng với dịch
huyết tương và mô liên kết trung bì, gắn chặt bám dính vào vết thương bỏng
mới tạo thành một màng thuốc che phủ vết thương bỏng.
Thuốc bỏng chế từ cây thuốc khác có tác dụng tương tự: cao lá sim,
kháo nhậm, kháo vàng,…
 Nhóm thuốc làm rụng nhanh vết hoại tử ở vết bỏng: để chống nhiễm
độc, nhiễm trùng, ghép da sớm.
Sử dụng hóa chất acid salicilic 40%.
Men Trypsin, Chymotrypsin.
Thực vật: dùng papain (mủ đu đủ), bromelain (dứa xanh, nước lá mã đề,
củ nghệ, ráy dại).
10


 Nhóm thuốc ức chế vi khuẩn, kháng khuẩn.
Sến dưới dạng thuốc Maduxin, Maduxin oil có tác dụng ức chế với trực
khuẩn mủ xanh, tụ cầu vàng, E.coli.
Vàng đằng: kháng khuẩn, tạo vòng vô trùng với tụ cầu ,…
Lân touyn, lá móng tay, lá sòi: ức chế vi khuẩn mủ xanh.
 Nhóm tái tạo vết thương.
Kích thích tổ chức hạt phát triển, kích thích biểu mô:
Ngoài ra còn dùng: Dầu gan cá thu, mỡ rau má, kem nghệ (kem nghệ
ngoài việc kích thích liền da còn có tác dụng làm giảm bớt thay đổi màu sắc
của sẹo)
Mật ong, mỡ trăn, cũng được sử dụng trong những vết loét lâu liền,
bỏng sâu, diện hẹp, làm tăng cường dinh dưỡng tại chỗ. Là môi trường ưu

trương chống phù nề, giảm mức độ nhiễm khuẩn.
 Nhóm che phủ da tạm thời.
Da ếch, da lợn (dị loại). Sử dụng dạng tươi đông khô, tiệt trùng bằng tia
gâm tác dụng là một màng sinh học để: hạn chế thoát huyết tương, hạn chế vi
khuẩn xâm nhập, kích thích biểu mô và tổ chức hạt, giảm đau.
 Nhóm chống sẹo lồi
Rau má tươi, khô, sắc lấy nước uống hàng ngày, còn có chế phẩm
viên Ramasol.
1.3. Màng Bacterial cellulose
Bacterial cellulose (BC) là lớp màng đặc do vi khuẩn A.xylinum tạo nên
trên bề mặt môi trường có bản chất là hemicellulose. Hemicellulose là những
polysaccarit không hòa tan vào nước nhưng hòa tan vào dung dịch kiềm tính.
Màng BC được nghiên cứu đầu tiên bởi A.J.Brown năm 1886. Nó đã thu hút
được sự chú ý từ nửa sau của thế kỷ XX, những nghiên cứu tập trung sâu vào
cơ chế tổng hợp cũng như cấu trúc và đặc tính của nó.

11


1.3.1. Cấu trúc của màng Bacterial cellulose
Bằng các kỹ thuật hiện đại đã xác định được cấu trúc của cellulose vi
khuẩn. Kỹ thuật nhiễu xạ tia X phân biệt các dạng cấu trúc và kích thước của
cellulose vi khuẩn. Các kỹ thuật phổ Rama, phân tích phổ hồng ngoại và phổ
cộng hưởng từ hạt nhân giúp xác định các dạng kết tinh của BC. Màng BC có
đường kính bằng 1/100 đường kính của cellulose thực vật. BC có cấu trúc
siêu mịn và độ chịu lực của BC gần bằng với độ chịu lực của nhôm. Khi đem
so sánh đường kính của BC và đường kính của các sợi nhân tạo ta thấy: kích
thước của màng BC còn nhỏ hơn cả kích thước của sợi tổng hợp hóa học có
đường kính nhỏ nhất [30].
Tóc


: 100μm

Bông, vải, gỗ thông, sợi tổng hợp

: 10μm

Sợi tổng hợp kỹ thuật cao

: 1μm

Sợi collagen

: 0,1μm

BC

: 0,01μm

So sánh đƣờng kính của sợi BC với các sợi tự nhiên và nhân tạo BC

Hình 1.1. Cấu trúc của màng BC và sợi cellulose thực vật
BC là một chuỗi polymer do các glucopyranose nối với nhau bằng liên
kết β – 1,4 glucan.

12


Các sợi mới sinh ra của BC kết hợp lại với nhau để hình thành nên các
sợi sơ cấp (subfibril) có chiều rộng khoảng 1,5nm, là những sợi mảnh nhất có

nguồn gốc tự nhiên. Các sợi sơ cấp kết hợp lại thành các vi sợi (microfibril).
Các vi sợi nằm trong các bó (bundle) và cuối cùng thành các dải (ribbon).
Những dải lớn từ tế bào này khi đẩy ra ngoài sẽ liên kết với với những dải lớn
của tế bào khác bằng liên kết hydro hoặc vandesvan tạo thành dạng sệt (gel)
hay một lớp màng mỏng. Kích thước bên của màng tăng lên khi quần thể vi
khuẩn sinh trưởng. Những điểm tạo màng BC mới có thể xuất hiện, chính vì
thế mà màng BC được mở rộng [8].
Trong khi chiều rộng các sợi cellulose được tạo ra từ gỗ thông là 30000
- 75000nm. Những tập hợp dải vi sợi cellulose mịn có chiều dài thay đổi từ
1000 - 9000nm làm thành cấu trúc lưới dày đặc, được ổn định bởi các liên kết
hydro. Thông thường BC có mức độ polymer hóa từ 2000 - 6000 và một vài
trường hợp đạt tới 16000 - 20000 trong khi mức polymer hóa ở cellulose thực
vật là 13000 - 14000.
Cấu trúc BC phụ thuộc chặt chẽ vào điều kiện nuôi cấy  26 . Ở điều
kiện nuôi cấy tĩnh vi khuẩn tổng hợp màng cellulose trên bề mặt nuôi cấy, tại
ranh giới giữa bề mặt dịch lỏng và không khí giàu oxy. Các màng BC được
gọi là S – BC (static BC) trên môi trường nuôi cấy tĩnh.
1.3.2. Một số tính chất của màng Bacterial cellulose
Chung và Shyu (1999) đã nghiên cứu tính chất của BC như độ cứng, độ
dính và ảnh hưởng của dinh dưỡng đường, muối,… lên bản chất của BC. Các
mảnh BC có độ cứng là 3,68 kg/cm2. Độ cứng của miếng BC giảm khi chúng
được nhúng vào dung dịch đường và độ cứng tăng lên khi được nhúng vào
dung dịch muối [15].
Sản phẩm của BC có một số tính chất như sau:
 Độ bền hóa học, độ bền cơ học và sức căng cao.

13


 Khả năng giữ nước và độ ẩm cao, do đó có thể điều chỉnh độ xốp.

 Do khả năng S – BC hình thành sẵn màng, khi ứng dụng trong làm
vải không cần qua khâu dệt, làm giấy không cần qua khâu bột giấy.
 Có thể theo dõi, kiểm soát lý tính của cellulose do cấu trúc của BC
có khả năng biến đổi trong quá trình nuôi cấy.
 Kiểm soát được kích thước, cấu trúc và chất lượng của cellulose
trong quá trình nuôi cấy tạo cellulose.
 BC là cellulose sinh học duy nhất được tổng hợp mà không gắn ligin,
có thể dễ dàng bị phân hủy bởi một số nhóm vi sinh vật. Vì vậy, BC được
xem là nguồn vật liệu mới có nhiều ưu thế trong tương lai.
1.3.3. Cơ chế tổng hợp Bacterial cellulose
Cellulose là sản phẩm cuối cùng của quá trình chuyển hóa cacbon trong
vi khuẩn A.xylinum. Quá trình này thường gắn liền với quá trình dị hóa,
nhưng không kết hợp với bất kỳ quá trình đồng hóa nào, kể cả tổng hợp
protein.
Tác giả Alina Krystynowicz đã chứng minh vai trò của 4 enzyme (GK,
PGM, UGP, CS) tham gia xúc tác quá trình tổng hợp cellulose ở vi khuẩn.
A.xylinum trong đó UGP là enzym có vai trò quan trọng nhất. Tác giả
Saxena chứng minh vị trí tổng hợp ở tế bào A.xylinum nằm giữa lớp màng
lypopolysacchride và lớp màng sinh chất. Vì enzyme CS nằm trên màng sinh
chất nên cellulose là sản phẩm ngoại bào.
Quan sát dưới kính hiển vi điện tử khi nhuộm âm bản và đông lạnh thấy
mỗi tế bào có 46 điểm tổng hợp cellulose. Khoảng cách giữa mỗi điểm là 12 15nm, kích thước của mỗi điểm là 3,5nm. Khi tế bào phân chia, các vị trí tổng
hợp cellulose được phân bố về hai tế bào con. Các chuỗi polymer β – 1,4
glucopynanose từ mỗi vị trí sẽ liên kết với các chuỗi ở vị trí khác tạo dải lớn có
kích thước trung bình 1,6 × 5,8nm, tốc độ kéo dài sợi là 2μm. Quá trình sinh

14


trưởng của vi khuẩn A.xylinum diễn ra đồng thời với quá trình tạo màng trên bề

mặt môi trường dịch lỏng. Lớp màng đó được xác định là cellulose dựa trên các
thuộc tính hóa học, tính tan, khả năng hấp thụ ánh sáng. Nó chính là hàng rào
ngăn cản oxy, chỉ tế bào nào tiếp xúc trực tiếp với oxy thì có khả năng tổng hợp
cellulose. Ngược lại, những tế bào không tiếp xúc trực tiếp với oxy không có khả
năng tổng hợp cellulose. Theo tác giả Nguyễn Lân Dũng, vi khuẩn Acetobacter
có bào nhầy cấu tạo bởi cellulose. Thành phần cấu tạo chủ yếu của bao nhầy là
các polysaccarit, ngoài ra còn có các polypeptit, protein. Bao nhầy có tác dụng
bảo vệ, cung cấp chất dinh dưỡng, giúp vi khuẩn bám vào giá thể.
Các enzyme tham gia vào quá trình sinh tổng hợp cellulose vi khuẩn
bao gồm:
PGM: phosphoglucomutase
UGP: UDP – glucose pyrophosphorylase
Fru – 6 – P: fructose – 6 – phosphate
Glc – 1 – P: glucose – 1 – phosphate
UDPGlc: uridine diphosphoglucose
FBP: fructose – 1,6 – biphosphate phosphatase
G6PDH: glucose – 6 – phosphate dehydrogenase
CS: cellulose synthase
PGI: phosphoglucoisomerase
PTS: hệ thống phosphotransferase
Fru – bi – P: fructose – 1,6 – bi – phosphate

15


Hình 1.2. Con đƣờng chuyển hóa cacbon trong Acetobacter xylinum
1.4. Tình hình nghiên cứu của Acetobacter xylinum trên thế giới và ở
Việt Nam
1.4.1. Tình hình nghiên cứu Acetobacter xylinum trên thế giới
Hiện nay, vi khuẩn A.xylinum và ứng dụng của nó đang được sự quan

tâm của nhiều nhà khoa học trên thế giới. Tập trung theo hai hướng cơ bản:
Hƣớng 1: Chủ yếu là phân lập tuyển chọn, nghiên cứu các đặc tính sinh học
của A.xylinum từ đó xác định vị trí phân loại của chúng trong sinh giới.
Hƣớng 2: Nghiên cứu về quá trình sinh tổng hợp, đặc điểm và ứng dụng của
BC từ vi khuẩn A.xylinum.
Đó là các nghiên cứu về khả năng tổng hợp cellulose của các chủng
A.xylinum, ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng và điều kiện nuôi cấy đến
quá trình sinh tổng hợp cellulose. Mở đầu là S.Hestrin, M.Schramm và cs

 27 ,

sau đó là một loạt các nghiên cứu tương tự  25, 26 . Tiếp đến là

16


nghiên cứu cơ chế tổng hợp màng BC, con đường chuyển hóa cacbon trong vi
khuẩn A.xylinum. Gần đây cơ chế sinh tổng hợp cellulose, các hệ enzyme
tham gia và con đường chuyển hóa cacbon trong vi khuẩn A.xylinum mới dần
được sáng tỏ 16 . Từ nửa sau thế kỷ XIX đến nay đã có nhiều công trình
nghiên cứu về ứng dụng của màng BC đắp lên vết thương hở, vết bỏng và đã
thu được kết quả tốt.
1.4.2. Tình hình nghiên cứu Acetobacter xylinum ở Việt Nam
Tại Việt Nam có một số các nghiên cứu công bố liên qua đến A.xylinum,
sự hình thành BC và ứng dụng màng BC. Các công trình mới chỉ bước đầu
nghiên cứu quá trình tạo màng, đặc tính cấu trúc màng làm cơ sở chế tạo màng
trị bỏng 8 , sản xuất thạch dừa 5 . Gần đây nhất là nghiên cứu ứng dụng màng
BC làm chất nền và giá đỡ để cố định tế bào vi khuẩn của Nguyễn Thúy Hương
và Phạm Thành Hồ.
Năm 2006, Bộ môn Vi sinh, Ký Sinh Đại học Y Dược Tp. HCM đã chế

tạo thành công màng trị bỏng sinh học có tẩm dầu mù u bằng phương pháp lên
men. Nó có khả năng thấm nước cao, kết dính chặt và trơ về mặt hóa học nên có
vai trò như màng sinh học, có thể thay thế da tạm thời. Với các hoạt chất tái sinh
mô và các chất sát khuẩn đều có nguồn gốc thiên nhiên.
Mới đây nhóm nghiên cứu của tác giả Đinh Thị Kim Nhung cũng đang
bước đầu ứng dụng màng BC trong điều trị bỏng trên người.
1.5. Ứng dụng của màng BC trong điều trị bỏng ở Việt Nam và trên thế giới
1.5.1. Ứng dụng của màng BC trong điều trị bỏng
Hiện nay người ta có nhiều dược phẩm dùng để trị bỏng như
Madecassol, Polyvinyl, Polymethan,…trong đó những nghiên cứu điều trị
bỏng tạo các chế phẩm sinh học như màng ối, da lợn, màng da ếch,…đã
chứng minh có hiệu lực tốt. Một trong những chế phẩm có tác dụng rất tốt
trong điều trị bỏng là màng Bacterial cellulose (BC). Màng BC có cấu trúc và

17


đặc tính rất giống với cellulose của thực vật (gồm các phân tử glucose liên kết
với nhau bằng liên kết β - 1,4 glucopyranose), cellulose vi khuẩn khác với
cellulose thực vật ở chỗ: không chứa các hợp chất cao phân tử như ligin,
hemicellulose, peptin và sáp nến do vậy chúng có nhiều đặc tính vượt trội với
độ dẻo dai, bền chắc.
Việc điều trị bỏng tại chỗ vết thương bỏng là một công tác có ý nghĩa
đặc biệt quan trọng. Đối với vết bỏng nông, điều trị tại chỗ vết bỏng có tác
dụng giảm đau, ngăn chặn các biến chứng nhiễm khuẩn, tạo điều kiện tốt cho
quá trình tái tạo phục hồi. Đối với những trường hợp bỏng sâu, điều trị tại chỗ
có tác dụng lớn trong việc điều trị phỏng các biến chứng của nhiễm khuẩn
toàn thân, ngăn ngừa sự mất nước và dịch trong cơ thể (là nguy cơ dẫn đến tử
vong cao), loại bỏ nhanh các tổ chức hoại tử, tạo điều kiện tốt cho quá trình
hình thành mô hạt và biểu mô hóa hình thành sẹo, chuẩn bị tốt nền ghép da

trong phẫu thuật. So với gạc vô trùng bán thông dụng trên thị trường dùng
trong điều trị bỏng thì màng BC có nhiều ưu điểm hơn do hạn chế gây đau,
gây tổn thương vết bỏng nhiễm trùng trong mỗi lần thay. Vì vậy màng BC
tổng hợp từ A.xylinum có những đặc tính làm màng sinh học trị bỏng, trong
ghép mô, cơ quan nội tạng.
1.5.2. Ứng dụng màng BC trong điều trị bỏng ở Việt Nam và trên thế giới
Nghiên cứu về màng BC từ vi khuẩn A.xylinum và những ứng dụng của
nó đã được tiến hành ở nhiều nước trên thế giới. BC ứng dụng rất nhiều trong
các lĩnh vực công nghệ khác nhau như: dùng làm màng phân tích cho quá
trình xử lý nước, chất mang đặc biệt cho các pin và năng lượng cho tế bào,
dùng làm chất biến đổi độ nhớt trong sản xuất các sợi truyền quang, làm môi
trường cơ chất trong sinh học, thực phẩm hay thay thế thực phẩm, sản xuất
giấy điện tử, làm cơ chất để cố định protein hay cho sắc ký,… hay Brown đã
dùng BC làm vải đặc biệt.

18