Khóa luận tốt nghiệp

Chuyên ngành Vi Sinh

LỜI CẢM ƠN
Em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới PGS.TS. Đinh Thị Kim Nhung
trưởng khoa Sinh-KTNN và ThS. Nguyễn Khắc Thanh đã hướng dẫn, chỉ bảo
tận tình, giúp đỡ và tạo điều kiện cho để em thực hiện và hoàn thành tốt khóa
luận này.
Em xin chân thành cảm ơn Ban Giám Hiệu trường ĐHSP Hà Nội 2,
khoa Sinh-KTNN, phòng thí nghiệm vi sinh vật, cùng các thầy cô trong tổ bộ
môn vi sinh, ban bảo vệ đã tạo điều kiện giúp đỡ em.
Em xin cảm ơn sự giúp đỡ quan tâm động viên của bạn bè, gia đình
trong suốt quá trình hoàn thành khóa luận.
Em xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày 19 tháng 05 năm 2011
Sinh viên

Phí Văn Tá

Phí Văn Tá

i

K33B – SP Sinh


Khóa luận tốt nghiệp

Chuyên ngành Vi Sinh

LỜI CAM ĐOAN

Để đảm bảo tính trung thực của đề tài, tôi xin cam đoan:
1. Đề tài của tôi không sao chép bất cứ tài liệu sẵn có nào.
2. Đề tài của tôi không trùng lặp với một đề tài nào khác.
3. Kết quả thu được trong đề tài là do tự bản thân tôi nghiên cứu thực
tiễn đảm bảo tính chính xác và trung thực.
Hà Nội, ngày 19 tháng 05 năm 2011
Tác giả

Phí Văn Tá

Phí Văn Tá

ii

K33B – SP Sinh


Khóa luận tốt nghiệp

Chuyên ngành Vi Sinh

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

Phí Văn Tá

MC

:


Microbial cellulose

BC

:

Bacterial cellulose

PC

:

Plant cellulose

CFU :

Colony Forming Unit

OD

:

Optical Density

cs

:

Cộng sự


iii

K33B – SP Sinh


Khóa luận tốt nghiệp

Chuyên ngành Vi Sinh

DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Vi khuẩn A.xylinum BHN2 (quan sát dưới kính hiển vi x100)
Hình 1.2. Khuẩn lạc của A.xylinum BHN2 mọc trên môi truờng thạch đĩa
Hình 1.3. Con đường sinh tổng hợp cellulose ở A.xylinum
Hình 1.4. Con đường tổng hợp cellulose từ cơ chất glucose
Hình 2.5. Đồ thị mối tương quan giữa giá trị OD 610nm và số lượng tế bào
Hình 2.6. Hoạt tính calatase của A.xylinum BHN2
Hình 2.7. Vòng phân giải CaCO3 của vi khuẩn A.xylinum BHN2
Hình 3.8. Khả năng thấm hút của màng BC
Hình 3.9. Lượng nước màng BC hút được – theo mô hình 2
Hình 3.10a. Bản thạch được che phủ bởi màng BC qua xử lý NaOH
Hình 3.10b. Bản thạch được che phủ bởi màng BC thấm dầu mù u
Hình 3.10c. Bản thạch được che phủ bởi màng BC thấm dịch nghệ
Hình 3.10d. Bản thạch được che phủ bởi gạc vô trùng
Hình 3.10e. Bản thạch không được che phủ
Hình 3.11a. Bản thạch được che phủ bởi màng BC qua xử lý NaOH
Hình 3.11b. Bản thạch được che phủ bởi màng BC thấm dịch nghệ
Hình 3.11c. Bản thạch được che phủ bởi màng BC thấm dầu mù u
Hình 3.11d. Bản thạch được che phủ bởi gạc vô trùng
Hình 3.12a. Màng BC (NaOH 0,5%) kéo theo chiều dọc tính độ bền cơ học

Hình 3.12b. Màng BC (sấy) chuẩn bị kéo theo chiều dọc
Hình 3.12c. Màng BC (sấy) kéo theo chiều dọc để tính độ bền cơ học
Hình 3.13a. Màng BC (NaOH 0,5%) chuẩn bị kéo theo chiều ngang
Hình 3.13b. Màng BC (NaOH 0,5%) kéo theo chiều ngang tính độ bền cơ học
Hình 3.13c. Màng BC (sấy) chuẩn bị kéo theo chiều ngang tính độ bền cơ học
Hình 3.13d. Màng BC (sấy) kéo theo chiều ngang tính độ bền cơ học
Hình 3.14. Màng BC chưa xử lý
Hình 3.15. Màng BC đã xử lý
Hình 3.16. Màng chưa xử lý pH từ 3-4
Hình 3.17. Màng xử lý pH từ 6-7

Phí Văn Tá

iv

K33B – SP Sinh


Khóa luận tốt nghiệp

Chuyên ngành Vi Sinh

DANH MỤC BẢNG BIỂU
Bảng 1.1. Phân loại các nhóm vi khuẩn acetic theo Frateur (1950)
Bảng 1.2. Đặc điểm sinh hoá của vi khuẩn A.xylinum theo Frateur (1950)
Bảng 2.3. Thành phần hóa học của nước dừa
Bảng 2.4. Các vitamin có trong nước dừa
Bảng 2.5. Các acid amin có trong nước dừa.
Bảng 2.6. Các bước xử lý màng BC
Bảng 3.7. Lượng nước hút được của màng BC – Theo mô hình 1

Bảng 3.8. Lượng nuớc hút đuợc của màng BC – Theo mô hình 2
Bảng 3.9. Lượng kháng sinh màng BC thấm hút được
Bảng 3.10. Lượng dịch nghệ tươi màng BC thấm hút được
Bảng 3.11. Độ bền kéo của màng qua xử lý NaOH 0,5% theo chiều dọc
Hình 3.12. Độ bền kéo của màng BC qua sấy kéo theo chiều dọc
Bảng 3.13. Độ bền kéo của màng BC xử lý NaOH 0,5% theo chiều ngang
Bảng 3.14. Độ bền kéo của màng BC qua sấy theo chiều ngang
Bảng 3.15. Kết quả đo độ thấu khí của màng

Phí Văn Tá

v

K33B – SP Sinh


Khóa luận tốt nghiệp

Chuyên ngành Vi Sinh

MỤC LỤC
Trang
TÓM TẮT CÔNG TRÌNH ........................................................................ 01
MỞ ĐẦU..................................................................................................... 02
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .................................................... 05
1.1. Lược sử nghiên cứu về vi khuẩn Acetobacter (vi khuẩn giấm, vi khuẩn
acetic)........................................................................................................... 05
1.2. Phân loại vi khuẩn Acetobacter ............................................................. 06
1.2.1. Các tiêu chuẩn phân loại Acetobacter ....................................... 06
1.2.2. Lược sử phân loại Acetobacter ................................................. 06

1.3. Đặc điểm của một số loài vi khuẩn Acetobacter quan trọng. .......................09
1.4. Đặc điểm phân loại của Acetobacter xylinum......................................... 12
1.4.1. Đặc điểm hình thái - tế bào học ................................................ 12
1.4.2. Đặc điểm nuôi cấy.................................................................... 12
1.4.3. Đặc điểm sinh lý – sinh hoá...................................................... 13
1.5. Nhu cầu dinh dưỡng của vi khuẩn Acetobacter xylinum ........................ 14
1.5.1. Ảnh hưởng của nguồn cacbon................................................... 14
1.5.2. Nhu cầu nitơ của vi sinh vật ..................................................... 15
1.5.3. Hàm lượng ethanol trong dung dịch lên men ............................ 16
1.6. Đặc điểm và cơ chế hình thành màng bacterial cellulose ...................... 16
1.6.1. Đặc điểm cấu trúc của màng bacterial cellulose........................ 16
1.6.2. Một số tính chất của màng bacterial cellulose........................... 17
1.6.3. Cơ chế tổng hợp bacterial cellulose .......................................... 18
1.7. Ứng dụng màng BC trong điều trị bỏng ở Việt Nam và trên thế giới ..... 21
1.7.1. Trên thế giới ............................................................................ 21
1.7.2. Ở Việt Nam .............................................................................. 21
CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU............. 23
2.1. Đối tượng nghiên cứu. ........................................................................... 23
2.2. Dụng cụ và thiết bị ........................................................................................23

Phí Văn Tá

vi

K33B – SP Sinh


Khóa luận tốt nghiệp

Chuyên ngành Vi Sinh


2.3. Hóa chất.........................................................................................................23
2.4. Môi trường nghiên cứu .......................................................................... 24
2.5. Phương pháp nghiên cứu ....................................................................... 27
2.5.1. Các phương pháp vi sinh vật..................................................... 27
2.5.2. Phương pháp hoá sinh .............................................................. 30
2.5.3. Phương pháp vật lý................................................................... 33
2.5.4. Phương pháp thống kê và xử lý kết quả .................................... 34
2.5.5. Phương pháp xử lý màng BC.................................................... 35
2.5.6. Phương pháp tạo vết thương trên thỏ thí nghiệm ...................... 36
CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU .................................................. 37
3.1. Khả năng thấm hút của màng BC từ chủng A. xylinum BHN2................ 37
3.1.1. Khả năng thấm hút nước của màng BC..................................... 37
3.1.2. Khả năng thấm hút kháng sinh Cephalexin............................... 39
3.1.3. Khả năng thấm hút nghệ ........................................................... 40
3.2. Khả năng ngăn cản một số vi sinh vật.................................................... 42
3.2.1. Khả năng ngăn cản vi khuẩn..................................................... 42
3.2.2. Khả năng ngăn cản xạ khuẩn .................................................... 43
3.3. Độ bền cơ học của màng BC ................................................................. 44
3.3.1. Theo chiều dọc ......................................................................... 45
3.3.2. Theo chiều ngang ..................................................................... 47
3.4. Độ thấu khí của màng BC...................................................................... 49
3.5. Một số chỉ tiêu đánh giá chất lượng màng ............................................. 50
3.4.1. Màu sắc .................................................................................... 50
3.4.2. Mùi vị....................................................................................... 50
3.4.3. Độ pH....................................................................................... 51
PHẦN KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ........................................................ 52
1. Kết luận ......................................................................................... 52
2. Kiến nghị........................................................................................ 53
TÀI LIỆU THAM KHẢO.......................................................................... 54


Phí Văn Tá

vii

K33B – SP Sinh


Khóa luận tốt nghiệp

Chuyên ngành Vi Sinh

TÓM TẮT CÔNG TRÌNH
Vi khuẩn A.xylinum thuộc nhóm vi khuẩn Gram âm hiếu khí bắt buộc,
hoá dưỡng thuộc chi Acetobacter, họ Acetobacteraceae. Vi khuẩn A.xylinum
tìm thấy trong giấm, dịch rượu, nước ép hoa quả. Khi nuôi cấy vi khuẩn này
trên môi trường dịch lỏng, chúng sẽ hình thành trên bề mặt một lớp màng
cellulose sinh học thuần khiết và được gọi là màng sinh học bacterial
cellulose (BC), đó là tập hợp các tế bào vi khuẩn liên kết với phân tử
cellulose.
Cho đến nay, Acetobacter xylinum được đánh giá là loài vi khuẩn có
khả năng sinh màng BC hiệu quả nhất trong tự nhiên. Nét cấu trúc quan trọng
trong cơ chế kết tinh khác hẳn với cellulose (PC) ở thực vật ở chỗ chúng
không có sự kết hợp hemixellulose, lignin hay những thành phần phụ khác,
mà được cấu tạo từ các sợi microfibril tạo nên những bó sợi song song cấu
thành mạng lưới cellulose với độ bền cơ học cao, độ tinh khiết cao, khả năng
thấm hút nước lớn. Ngoài ra, màng BC còn chứa nhiều dưỡng chất, axít hữu
cơ đồng thời là một hàng rào cản oxi và các sinh vật khác, ngăn cản sự phân
hủy các cơ chất ở trong tế bào và ngăn cản tác động của tia UV…
Nhờ những đặc tính quí đó mà ứng dụng của màng BC trong đời sống

là rất lớn. Trong đó việc áp dụng điều trị bỏng là hướng nghiên cứu được
quan tâm đặc biệt. Trước thực trạng đó, đề tài tập trung đi sâu nghiên cứu đặc
tính vật lý của màng BC ứng dụng điều trị bỏng ở thỏ. Trong nghiên cứu
chúng tôi đã thu nhận được những kết quả ban đầu về đặc tính vật lý của
màng như: khả năng ngăn cản vi sinh vật tốt; khả năng thấm hút nước và
kháng sinh cao; có khả năng chịu được lực kéo tương đối tốt cả theo chiều
dọc và chiều ngang.
Chính vì vậy, công trình có ý nghĩa thực tiễn và ứng dụng cao, góp
phần đóng góp vào quá trình nghiên cứu ứng dụng màng trong quá trình điều
trị bỏng đạt hiệu quả cao. Tạo điều kiện tiền đề cho các bước nghiên cứu tiếp
theo ứng dụng màng trong thực tiễn như: đóng gói bảo quản màng, sản xuất
màng theo qui mô công nghiệp.

Phí Văn Tá

1

K33B – SP Sinh


Khóa luận tốt nghiệp

Chuyên ngành Vi Sinh

MỞ ĐẦU
1. Lý do chọn đề tài
Vi khuẩn A.xylinum thuộc nhóm vi khuẩn Gram âm hiếu khí bắt buộc,
hoá dưỡng thuộc chi Acetobacter, họ Acetobacteraceae. Vi khuẩn A.xylinum
tìm thấy trong giấm, dịch rượu, nước ép hoa quả. Khi nuôi cấy vi khuẩn này
trên môi trường dịch lỏng, chúng sẽ hình thành trên bề mặt một lớp màng

cellulose sinh học thuần khiết và được gọi là màng sinh học bacterial
cellulose (BC), đó là tập hợp các tế bào vi khuẩn liên kết với phân tử
cellulose.
Cho đến nay, Acetobacter xylinum được đánh giá là loài vi khuẩn có
khả năng sinh màng BC hiệu quả nhất trong tự nhiên. Loài vi khuẩn Gram âm
này sống hiếu khí bắt buộc, không sinh bào tử. Mỗi tế bào Acetobacter
xylinum có thể chuyển hóa tới 108 phân tử glucose vào phân tử cellulose
trong 1 giờ nên khả năng tổng hợp cellulose là rất lớn [14].
Nét cấu trúc quan trọng trong cơ chế kết tinh khác hẳn với cellulose
(PC) ở thực vật ở chỗ chúng không có sự kết hợp hemixellulose, lignin hay
những thành phần phụ khác, mà được cấu tạo từ các sợi microfibril tạo nên
những bó sợi song song cấu thành mạng lưới cellulose với độ bền cơ học cao,
độ tinh khiết cao, khả năng thấm hút nước lớn, đường kính sợi nhỏ, khả năng
polimer hóa và trạng thái kết tinh lớn. Ngoài ra, màng BC còn chứa nhiều
dưỡng chất, axít hữu cơ đồng thời là một hàng rào cản oxi và các sinh vật
khác, ngăn cản sự phân hủy các cơ chất ở trong tế bào và ngăn cản tác động
của tia UV…
Nhờ những đặc tính độc đáo trên mà màng BC được coi là nguồn
polimer mới, là một giải pháp trên con đường tìm nguồn nguyên liệu mới hiện
nay. Nó đã và đang thu hút được sự chú ý của nhiều nhà khoa học ngay từ
nửa sau của thế kỷ XIX và hiện được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác

Phí Văn Tá

2

K33B – SP Sinh


Khóa luận tốt nghiệp


Chuyên ngành Vi Sinh

nhau như: trong công nghiệp sản xuất giấy màng BC được dùng để sản xuất
giấy điện tử chất lượng cao; trong công nghệ môi trường đã sử dụng màng BC
làm màng phân tách để xử lý nước và biến đổi độ nhớt của nước (Brown
1989, Jonas và Fonah 1998) [24], [33]. Ngoài ra, màng BC còn được dùng
làm chất mang đặc biệt cho các sợi pin và tế bào năng lượng (Brown 1989),
làm các sợi truyền quang, là môi trường cơ chất trong sinh học sử dụng cố
định protein thay cho sắc ký. Trong công nghiệp thực phẩm sử dụng vi khuẩn
A.xylinum nuôi trên môi trường nước dừa tạo màng BC để sản xuất thạch dừa.
Trong lĩnh vực mỹ phẩm và dược phẩm, lợi dụng những đặc tính quý báu của
màng BC như thông thoáng, kháng khuẩn, tính tương đồng về cấu trúc với sợi
collagen trong da nên màng BC được coi là nguồn nguyên liệu quý giá dùng
làm mặt lạ dưỡng da, da nhân tạo, dùng trong điều trị bỏng và tổn thương da.
Do nhu cầu màng trị bỏng lớn, nhưng hầu hết đều phải nhập ngoại với
giá thành cao. Trong khi đó màng BC có thể tự sản xuất trong nước từ những
nguồn nguyên liệu dễ kiếm và rẻ tiền và có những đặc tính tốt phù hợp cho
các ứng dụng trong thực tế, đặc biệt là trị bỏng. Nên nếu chế tạo thành công
màng BC từ vi khuẩn A.xylinum sẽ có ý nghĩa rất cao trong tình hình điều trị
bỏng ở nước ta hiện nay.
Nhằm nâng cao chất lượng của màng BC ứng dụng trong trị bỏng đạt
hiệu quả cao chúng tôi quyết định tiến hành nghiên cứu đề tài: “ Nghiên cứu
một số đặc tính vật lý của màng bacteria cellulose từ chủng Acetobacter
xylinum BHN2”.
2. Mục tiêu của đề tài.
- Nghiên cứu đặc tính vật lý của màng BC ứng dụng trị bỏng trên thỏ.
- Đề xuất phương pháp xử lý và bảo quản màng BC từ vi khuẩn
A.xylinum BHN2 thích hợp dùng làm màng trị bỏng.


Phí Văn Tá

3

K33B – SP Sinh


Khóa luận tốt nghiệp

Chuyên ngành Vi Sinh

3. Nội dung nghiên cứu
3.1. Khả năng thấm hút của màng BC từ chủng A. xylinum BHN2
3.1.1. Khả năng thấm hút nước
3.1.2. Khả năng thấm hút kháng sinh
3.1.3. Khả năng thấm hút nghệ
3.2. Khả năng ngăn cản một số vi sinh vật
3.2.1. Khả năng ngăn cản vi khuẩn
3.2.2. Khả năng ngăn cản xạ khuẩn
3.3. Độ bền cơ học của màng BC
3.3.1. Theo chiều ngang
3.3.2. Theo chiều dọc
3.4. Độ thấu khí của màng BC
3.5. Một số chỉ tiêu đánh giá chất lượng màng
3.5.1. Màu sắc
3.5.2. Mùi vị
3.5.3. Độ pH
4. Ý nghĩa của đề tài
- Đề xuất phương pháp xử lý ban đầu màng BC.
- Nghiên cứu đặc tính vật lý của màng BC, tạo cơ sở tiền đề cho các

nghiên cứu tiếp theo ứng dụng trị bỏng trên thỏ.

Phí Văn Tá

4

K33B – SP Sinh


Khóa luận tốt nghiệp

Chuyên ngành Vi Sinh

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Lược sử nghiên cứu về vi khuẩn Acetobacter (vi khuẩn giấm, vi
khuẩn acetic)
Trong lịch sử, con người đã biết cách làm giấm bằng kinh nghiệm thực
tiễn của mình xong chưa hiểu rõ cơ sở khoa học của quá trình tạo giấm, càng
không thể giải thích được vì sao rượu loãng lại có thể chuyển thành giấm. Chỉ
đến khi khoa học phát triển, đặc biệt cùng với sự ra đời của kính hiển vi, cùng
với sự phát triển như vũ bão của công nghệ sinh học với trung tâm là vi sinh
vật học thì vấn đề này ngày càng được sáng tỏ. Ngày nay, chúng ta khẳng
định rằng tác nhân của quá trình tạo giấm chính là vi khuẩn Acetobacter hay
vi khuẩn giấm, vi khuẩn acetic.
Công trình nghiên cứu đầu tiên về vi khuẩn acetic là của Preson (1822).
Ông đã chú ý đến lớp màng mỏng phát triển trên bề mặt giấm và chứng minh
đó là loài vi sinh vật có tên gọi Mycoderma aceti.
Năm 1937, Kiitzing từ những thí nghiệm của mình đã đưa ra kết luận:
Quá trình lên men giấm được thực hiện khi có sự tham gia của vi khuẩn. Cùng
năm đó, nhà bác học nổi tiếng người Đan Mạch là Hansen trong công trình

nghiên cứu đã tách từ màng giấm 2 loại vi khuẩn thuần khiết, ông gọi nó là:
Mycoderma aceti và Mycoderma pasteurianum.
Từ 1862 đến 1868, nhờ sự trợ giúp đắc lực của kính hiển vi, Pasteur đã
chứng minh nhận xét của Kiitzing và Hansen hoàn toàn đúng đắn. Ông nghiên
cứu lớp màng xuất hiện trên bia, rượu vang và khẳng định: màng đó được tạo
từ vi khuẩn Mycoderma aceti.
Các nghiên cứu tiếp theo đều nhằm hoàn thiện, làm rõ cơ chế của quá
trình lên men giấm và từng bước phân loại vi khuẩn thành các nhóm, loài khác
nhau dựa trên những đặc tính sinh lý, sinh hóa và các ứng dụng của chúng.

Phí Văn Tá

5

K33B – SP Sinh


Khóa luận tốt nghiệp

Chuyên ngành Vi Sinh

Hiện nay, ở Việt Nam việc nghiên cứu và ứng dụng các chủng
Acetobacter trong sản xuất thạch dừa, sản xuất màng BC ứng dụng trong cuộc
sống đặc biệt là trong trị bỏng, chất bán dẫn, vật hấp thụ chất độc môi
trường… đang là lĩnh vực được nhiều nhà khoa học nghiên cứu và hứa hẹn
nhiều triển vọng trong tương lai [9], [18].
1.2. Phân loại vi khuẩn Acetobacter
1.2.1. Các tiêu chuẩn phân loại Acetobacter
Để phân loại Acetobacter, người ta dựa vào những tiêu chuẩn sau:
- Địa điểm nơi phân lập: có liên quan đến điều kiện môi trường sống.

- Đặc điểm hình thái: hình dạng tế bào, cách xắp xếp tế bào, màu sắc tế
bào khi nhuộm Gram, khả năng di động, có tiên mao hay không, vỏ nhầy…
- Đặc điểm sinh lý: mối quan hệ giữa các yếu tố: nhiệt độ, độ pH của
môi trường, khả năng hình thành sắc tố, mối quan hệ với ôxy, khả năng sử
dụng chất vô cơ và hữu cơ…
- Đặc điểm nuôi cấy: trạng thái, đặc điểm, tính chất, màu sắc… của
khuẩn lạc trên môi trường thạch. Khi nuôi cấy trên môi trường lỏng chú ý sự
biến đổi của môi trường sau thời gian nuôi cấy (đục hay trong, có mùi hay
không mùi, màu sắc môi trường có biến đổi hay không…)
1.2.2. Lược sử phân loại Acetobacter
Việc nghiên cứu Acetobacter nói chung và A.xylinum nói riêng đã và
đang thu hút được nhiều nhà khoa học trong và ngoài nước đi sâu nghiên cứu
tìm hiểu. Việc tiến hành phân loại vi khuẩn Acetobater được tiến hành từ thế
kỷ XIX. Trong đó có một số khóa phân loại đáng chú ý sau:
Khóa phân loại của Beijerinck năm 1899, ông đã tiến hành phân lập vi
khuẩn acetic thuần khiết và chia chúng thành 4 nhóm cơ bản.
Năm 1916, Janke đã tiếp theo công trình nghiên cứu của Beijerinck.
Ông đã phân loại dựa trên 2 dấu hiệu:

Phí Văn Tá

6

K33B – SP Sinh


Khóa luận tốt nghiệp

Chuyên ngành Vi Sinh


+ Một là: sử dụng muối amoni làm nguồn cung cấp nitơ trong quá trình
sinh trưởng và phát triển.
+ Hai là: không hoặc có khả năng di động trong quá trình phát triển.
- Năm 1926, Henneberg dựa vào nơi sống mà chia vi khuẩn acetic làm
4 nhóm sau:
+ Nhóm 1: Vi khuẩn không sinh trưởng trên bia, vì hoa huplon độc với
chúng.
+ Nhóm 2: Vi khuẩn sinh trưởng trên bia.
+ Nhóm 3: Vi khuẩn phát triển trên dịch rượu vang.
+ Nhóm 4: Vi khuẩn dùng để sản xuất giấm theo phương pháp nhanh.
- Năm 1934, các nhà khoa học Hoa Kỳ đã nghiên cứu thành phần dinh
dưỡng của vi khuẩn giấm thấy chúng có khả năng sử dụng các hợp chất tương
đối đơn giản làm nguồn nitơ và nguồn cacbon nên đã xếp chúng vào họ
Nitrobacteriaceae. Từ đó vi khuẩn acetic có tên gọi là Acetobacter [11].
- Năm 1936, Kenyver, Wanneil và Staniel nghiên cứu khả năng di động
của chúng thấy có hiện tượng ghép cực xoắn ở phần di động nên xếp chúng
vào họ Pseudomonadaceae.
- Năm 1948, Vanghn tiến hành nghiên cứu khả năng di động của một số
loài Acetobacter (Acetobacter aceti, Acetobacter melanoginum, Acetobacter
zances, Acetobacter pasteurianum, Acetobacter oxydans) nhờ đơn mao ở cực
và đã xác nhận vị trí của vi khuẩn acetic trong họ Pseumodonadaceae.
- Năm 1949, Krassilnicov nghiên cứu trên xạ khuẩn và vi khuẩn cùng
một số tác giả người Mỹ trong các bài báo cáo của mình đều thống nhất xếp vi
khuẩn Acetobacter vào họ Pseumodonadaceae.
- Theo khóa phân loại mới của Bergey và nhiều tác giả khác thì vi
khuẩn Acetobacter và Glucobacter – các vi khuẩn acetic được xếp vào họ
Acetobacteriaceae.

Phí Văn Tá


7

K33B – SP Sinh


Khóa luận tốt nghiệp

Chuyên ngành Vi Sinh

- Năm 1914, dựa vào khả năng ôxy hóa acid acetic, Bergey phân chia
các loài trong Acetobacter thành 2 nhóm:
+ Nhóm 1: có khả năng ôxy hóa acid acetic thành CO2 và H2O.
Sử dụng muối amoni làm nguồn nitơ duy nhất (sinh trưởng trên môi
trường Hoyer) như: Acetobacter aceti.
Không sử dụng muối amoni là nguồn nitơ duy nhất.
Trên bề mặt môi trường dịch thể không tạo màng nhầy chứa cellulose
như:
Acetobacter

rancens,

Acetobacter

pasteurianus,

Acetobacter

kneizigianus.
Trên môi trường dịch thể tạo thành màng nhầy chứa cellulose như:
Acetobacter xylinum.

+ Nhóm 2: không có khả năng ôxy hóa acid acetic.
+ Tạo thành sắc tố trên môi trường glucose: sắc tố nâu tối đến đen nhạt
(Acetobacter melanogenus); sắc tố trắng hồng (Acetobacter recens).
+ Không tạo thành sắc tố: nhiệt độ thích hợp khoảng 30-35oC
(Acetobacter sobuxydans); nhiệt độ thích hợp nhất trong khoảng 18-21oC
(Acetobacter oxydans).
Năm 1950, Frateur chính thức đưa ra một khóa phân loại mới dựa trên
các tiêu chuẩn cụ thể:
- Khả năng tạo catalaze.
- Khả năng tổng hợp các chất xetô từ rượu bậc cao như: glycerol,
manitol, sorbitol.
- Khả năng oxy hóa acid acetic thành CO2 và H2O.
- Khả năng oxy hóa glucose thành gluconic.
- Khả năng sử dụng muối amoni làm nguồn nitơ và rượu etylic làm
nguồn cacbon (sinh trưởng trên môi trường Hoyer )

Phí Văn Tá

8

K33B – SP Sinh


Khóa luận tốt nghiệp

Chuyên ngành Vi Sinh

- Tạo sắc tố nâu.
- Tổng hợp cellulose.
Trên cơ sở đó, Frateur chia vi khuẩn acetic thành các nhóm theo bảng sau:


Bảng 1.1. Phân loại các nhóm vi khuẩn acetic theo Frateur (1950)

Stt Tên nhóm

1

Suboxydans

Vi khuẩn đại diện
Acetobacter suboxydans.
Acetobacter melanogennum
Acetobacter aceti

2

Meroxydans Acetobacter xylium
Acetobacter meroxydan

3

Oxydans

Đặc điểm cơ bản
Không có khả năng oxy
hóa acid acetic thành CO2
và H2O.
Có đầy đủ các đặc điểm
trên


Acetobacter ascendans

Không có khả năng tạo

Acetobacter ransens

các hợp chất xeto từ rượu

Acetobacter lovaniens

bậc cao
Không có hoạt tính

4

Peroxydans

Acetobacter peroxydans

catalase, không oxy hóa

Acetobacter paradoxum

glucose thành acid
gluconic

1.3. Đặc điểm của một số loài vi khuẩn Acetobacter quan trọng.
1.3.1. Acetobacter aceti (Frateur 1864; Beijerinck 1898)
Trực khuẩn ngắn, dạng hình que, kích thước 0,4 – 0,8 µm x 1,0 – 1,2 µm,
không di động, thường xếp thành chuỗi dài, bắt màu Gram âm, bắt màu vàng với

thuốc nhuộm iốt. Chúng tạo thành khuẩn lạc to, sáng trên môi trường gelatin.
Nhiệt độ thích hợp cho sinh trưởng là 34oC, nếu nhiệt độ cao quá 43oC thì sẽ gây

Phí Văn Tá

9

K33B – SP Sinh


Khóa luận tốt nghiệp

Chuyên ngành Vi Sinh

hiện tượng co tế bào. Giống này có thể phát triển ở nồng độ rượu cao (11%) và
tích lũy tới 6% acid acetic. Môi trường men bia thích hợp cho sự phát triển của
loài này. Tỷ lệ % (G + C) của ADN là 56,2 – 57,2%.
1.3.2. Acetobacter pasteurinum (Hansen 1879; Beijerinck 1916)
Trực khuẩn ngắn, hình thái gần giống Acetobacter aceti, bắt màu xanh với
thuốc nhuộm iốt. Tạo váng khô và nhăn nheo. Tế bào xắp xếp rời nhau thành
chuỗi, đôi khi có dạng hình chùy phồng lên. Nhiệt độ thích hợp khoảng 30oC,
chịu độ cồn thấp hơn Acetobacter aceti. Trong điều kiện thuận lợi chúng có thể
tạo 5 - 6% acid acetic. Tỷ lệ (G + C) của ADN là 51,8- 53%.
1.3.3. Acetobacter orleanense (Henneberg 1906)
Hình thái của vi khuẩn này giống 2 vi khuẩn trên, hình que nhỏ, hai đầu
hơi nhọn, hình thành màng mỏng trên bề mặt nuôi cấy. Tế bào bắt màu vàng khi
nhuộm iốt. Giống này có thể sống được trong môi trường chứa 10 – 12% rượu
và tích lũy được 9,5% acid acetic, thường dùng chúng để chuyển rượu hóa rượu
vang thành giấm (phương pháp của Pháp). Sinh trưởng ở nhiệt độ 25 – 30oC. Tỷ
lệ %(G + C) của ADN là 56,8 – 58,7.

1.3.4. Acetobacter schiitzenbachii
Trực khuẩn hình que, kích thước khoảng 0,3 – 4 µm x 1,0 – 3,6 µm. Nó
có thể tạo váng dày và không bền trong môi trường nghèo dinh dưỡng, tích lũy
11,5 – 12% acid acetic trong dịch nuôi cấy, thường được dùng trong sản xuất
acid acetic bằng phương pháp chìm. Sử dụng làm giấm theo phương pháp nhanh
(phương pháp của Đức)
1.3.5. Acetobacter suboxydans
Hình que ngắn, đứng riêng lẻ hoặc xếp thành từng chuỗi ngắn, không có
khả năng di động, tạo váng mỏng dễ tan. Nó có thể chuyển hóa glucose thành
acid gluconic, sobit thành socbose, chịu được nồng độ cồn cao và tích lũy đến

Phí Văn Tá

10

K33B – SP Sinh


Khóa luận tốt nghiệp

Chuyên ngành Vi Sinh

13% acid acetic. Nhiệt độ thích hợp cho sinh trưởng là 28 – 30oC. Thời gian lên
men ngắn khoảng 48 giờ, nhu cầu về ôxy rất ngặt nghèo chỉ cần ngưng 10 – 20
giây thì 1/3 tế bào sẽ chết.
1.3.6. Acetobacter hoshigaki
Trực khuẩn hình que, kích thước 0,7 – 0,9 µm x 1,5 – 1,8 µm, thường
được đứng riêng lẻ không di chuyển. Trên môi trường thạch đậu tương: khuẩn
lạc nhỏ, tròn, dạng hạt sáng, sau đó trở thành màu nâu sẫm. Trên môi trường
thạch với dịch lên men: khuẩn lạc màu trắng sữa, về sau phần giữa khuẩn lạc hóa

nâu, phía ngoài màu vàng nhạt. Chúng có khả năng chuyển hóa dextran thành
acid gluconic.
1.3.7. Acetobacter curriculum
Có đặc điểm tương tự Acetobacter schiitzenbachii. Trong môi trường lên
men thuận lợi chúng có thể tạo 10 – 12% acid acetic, tạo váng chắc trên bề mặt
môi trường. Nhiệt độ lên men tối ưu từ 35 – 37oC.
1.3.8. Acetobacter plancatum
Trực khuẩn ngắn, kích thước từ 0,4 – 0,6 µm x 1,4 -1,6 µm. Trong
khoảng nhiệt độ từ 28 – 32oC chúng tạo thành các tế bào phình to, kéo dài,
không di động. Trên môi trường gelatin, rượu vang tạo thành khuẩn lạc tròn trịa,
hơi nhô lên, sáng ẩm ướt, nhớt. Nhiệt độ tối ưu là 25 -30oC.
1.3.9. Acetobacter xylinum
Acetobacter xylinum là trực khuẩn hình que, kích thước khoảng 2µm,
đứng riêng lẻ hoặc xếp thành từng chuỗi, không có khả năng di động. Chúng tích
lũy khoảng 4,5% acid acetic, khi nồng độ acid acetic trong môi trường quá cao
nó sẽ ức chế hoạt động của vi khuẩn.

Phí Văn Tá

11

K33B – SP Sinh


Khóa luận tốt nghiệp

Chuyên ngành Vi Sinh

1.4. Đặc điểm phân loại của Acetobacter xylinum
1.4.1. Đặc điểm hình thái - tế bào học

A.xylinum có dạng hình que, thẳng hay hơi cong, kích thước khoảng
2μm, tế bào đứng riêng lẻ hoặc xếp thành từng chuỗi, không có khả năng di
động, không sinh bào tử. Các tế bào được bao bọc bởi chất nhày tạo váng
nhăn và dày. Váng có chứa hemicellulose nên khi gặp H2SO4 và thuốc nhuộm
iốt sẽ bắt màu xanh (do phản ứng của hemicellulose), chúng có thể tích luỹ
4,5% acid acetic trong môi trường. Khi nồng độ acid acetic quá cao vượt quá
giới hạn cho phép, nó sẽ ức chế hoạt động của vi khuẩn [9].
Vi khuẩn A.xylinum thuộc nhóm vi khuẩn Gram âm, hiếu khí bắt buộc,
hoá dị dưỡng. Tế bào của chúng thường tìm thấy trong giấm, dịch rượu, nước
ép hoa quả, trong đất.

Hình 1.1. Vi khuẩn A.xylinum BHN2 (quan sát dưới kính hiển vi x100)
1.4.2. Đặc điểm nuôi cấy
Trên môi trường thạch đĩa, vi khuẩn A.xylinum hình thành khuẩn lạc
nhẵn hoặc xù xì, rìa mép khuẩn lạc bằng phẳng hay gợn sóng, màu trắng hoặc
trong suốt, khuẩn lạc bằng phẳng hoặc lồi lên dễ tách khỏi môi trường. Vi
khuẩn A.xylinum khi nuôi cấy trong môi trường lỏng ở điều kiện tĩnh, chúng
sẽ hình thành trên bề mặt môi trường một lớp màng BC [9], [14].

Phí Văn Tá

12

K33B – SP Sinh


Khóa luận tốt nghiệp

Chuyên ngành Vi Sinh


Ngược lại trong điều kiện nuôi lắc, cellulose hình thành dạng hạt nhỏ
với kích thước không đều nhau và phân tán trong môi trường dinh dưỡng tạo
ra những đặc tính hình thái khác hẳn cellulose trong điều kiện nuôi cấy tĩnh
[9], [14].

Hình 1.2. Khuẩn lạc của A.xylinum BHN2 mọc trên môi truờng thạch đĩa
1.4.3. Đặc điểm sinh lý – sinh hoá
+ Đặc điểm sinh lý
Vi khuẩn A.xylinum phát triển ở nhiệt độ 25 - 350C, pH = 4 - 6. Nhiệt độ
và pH tối ưu tuỳ thuộc vào giống. Ở 370C, tế bào sẽ suy thoái hoàn toàn ngay
cả trong môi trường tối ưu.
A.xylinum có khả năng chịu được pH thấp, vì thế thường bổ sung thêm
acid acetic vào môi trường nuôi cấy để hạn chế sự nhiễm khuẩn lạ.
+ Đặc điểm sinh hoá
Năm 1950, Frateur đã chính thức đưa ra một khóa phân loại mới căn cứ
vào các tiêu chuẩn: khả năng oxy hóa acid acetic thành CO2 và H2O; hoạt tính
catalase; khả năng sinh trưởng trên môi trường Hoyer [29]…Theo quan điểm
này A.xylinum là chủng thuộc chi Acetobacter, họ Pseudomonadaceae, bộ
Pseudomonadales, lớp Schizomycetes. Đặc điểm phân biệt với các chủng khác
trong cùng một chi được trình bày ở bảng dưới đây:

Phí Văn Tá

13

K33B – SP Sinh


Khóa luận tốt nghiệp


Chuyên ngành Vi Sinh

Bảng 1.2. Đặc điểm sinh hoá của chủng vi khuẩn A.xylinum
theo Frateur (1950) [29]
STT

1

2
3

4

5

6

7

Đặc điểm
Oxy hoá ethanol thành
acid acetic
Hoạt tính catalase
Sinh trưởng trên môi
trường Hoyer

Hiện tượng

Kết quả


Chuyển hoá môi trường chứa
Bromphenol Blue 0,04% từ
màu xanh sang màu vàng
Hiện tượng sủi bọt khí

+

Sinh khối không phát triển

_

Chuyển hoá glycerol

Tạo kết tủa đỏ gạch trong dịch

thành dihydroxyaceton

sau lên men

Chuyển hoá glucose
thành acid
Kiểm tra khả năng sinh
sắc tố nâu

+

+

Vòng sáng xuất hiện xung
quanh khuẩn lạc trên môi


+

trường chứa CaCO3
Không hình thành sắc tố nâu

Kiểm tra khả năng tổng

Váng vi khuẩn xuất hiện màu

hợp cellulose

lam

_

+

1.5. Nhu cầu dinh dưỡng của vi khuẩn Acetobacter xylinum
1.5.1. Ảnh hưởng của nguồn cacbon
Để vi khuẩn sinh trưởng và phát triển tốt hơn cần cung cấp nguồn
cacbon phù hợp. Tuỳ nhóm vi sinh vật mà nguồn cacbon được cung cấp là vô
cơ hay hữu cơ. Giá trị dinh dưỡng và khả năng hấp thụ cacbon phụ thuộc vào
hai yếu tố: thành phần hoá học và tính chất sinh lý của nguồn thức ăn, đặc
điểm sinh lý của từng loại vi sinh vật.

Phí Văn Tá

14


K33B – SP Sinh


Khóa luận tốt nghiệp

Chuyên ngành Vi Sinh

Người ta sử dụng đường làm thức ăn nuôi cấy phần lớn các vi sinh vật
dị dưỡng. Đường đơn ở nhiệt độ cao có thể bị chuyển hoá thành loại hợp chất
có màu tối khó hấp thụ. Trong môi trường kiềm sau khử trùng, đường còn dễ
bị chuyển hoá làm biến đổi pH môi trường. Để tránh hiện tượng này khi khử
trùng môi trường có chứa đường người ta thường chỉ hấp ở áp lực 0,5atm ở
1100 trong 30 phút. Từ các loại đường đơn tốt nhất nên sử dụng phương pháp
hấp gián đoạn (phương pháp Tyndal). Để nuôi cấy các loại vi sinh vật khác
người ta sử dụng các nồng độ đường không giống nhau, với vi khuẩn thường
dùng 0,5-0,2% đường. Hầu hết các vi sinh vật chỉ đồng hoá được các loại
đường ở dạng đồng phân D [9].
Các hợp chất hữu cơ chứa cả cacbon cả nitơ (pepton, nước thịt, nước
chiết ngô, nước chiết nấm men, nước chiết đại mạch,...) có thể vừa sử dụng
làm nguồn cacbon, vừa sử dụng làm nguồn nitơ đối với vi sinh vật [9].
1.5.2. Nhu cầu nitơ của vi sinh vật
Nguồn nitơ vô cơ dễ hấp thu nhất đối với vi sinh vật là NH3 và NH4+.
Tuy nhiên, khi nuôi cấy vi khuẩn trong môi trường có sử dụng NH4+ thì sau
khi chúng đồng hóa NH4+ trong môi trường sẽ tích lũy anion vô cơ (SO42-, Cl…) làm hạ thấp rất nhiều trị số pH của môi trường. Muối anion của các axit
hữu cơ ít làm chua môi trường hơn do đó có lúc được sử dụng nhiều hơn (mặc
dù đắt hơn).
Muối nitrat là nguồn thức ăn nitơ thích hợp với nhiều loại tảo, nấm sợi,
xạ khuẩn nhưng lại ít thích hợp với vi khuẩn, vì sau khi vi khuẩn sử dụng hết
NO3- các ion kim loại còn lại sẽ kiềm hóa môi trường [9], [10].
Vi sinh vật có khả năng đồng hóa tốt nitơ chứa trong các thức ăn hữu

cơ. Các thức ăn này vừa là nguồn cacbon vừa là nguồn cung cấp nitơ cho vi
sinh vật. Vi sinh vật không có khả năng hấp thụ trực tiếp các protein cao phân

Phí Văn Tá

15

K33B – SP Sinh


Khóa luận tốt nghiệp

Chuyên ngành Vi Sinh

tử, chỉ có các polypeptid không chứa quá 5 gốc axit amin mới có thể di
chuyển trực tiếp qua màng tế bào chất của vi sinh vật [8], [10].
1.5.3. Hàm lượng ethanol trong dung dịch lên men
Ethanol được sử dụng như một cơ chất. Hàm lượng ethanol có thể thay
đổi từ 2-10% V. Hàm lượng cao hơn sẽ làm giảm năng suất lên men. Theo
Hong-Joo Son lại công bố hàm lượng ethanol có thể thay đổi từ 0,2-1% tốt
nhất ở 0,6% . Theo Nodes, lượng ethanol duy trì trong môi trường luôn giữ ở
3-3,5%. Các tác giả Ebner và Heirich, cho lượng ethanol dùng từ 7-10% V.
Để tránh hiện tượng ôxy hoá hoàn toàn acid acetic cần có một lượng ethanol
sót trong sản phẩm từ 0,2-0,5% để ức chế tự tổng hợp enzyme oxy hoá acid
acetic và muối acetate [8], [10], [23], [26], [28].
Ngoài việc oxy hoá ethanol, vi khuẩn acetic còn có khả năng oxy hoá
các rượu khác thành các axít tương ứng.
1.6. Đặc điểm và cơ chế hình thành màng bacterial cellulose
1.6.1. Đặc điểm cấu trúc của màng bacterial cellulose
Cellulose được cấu tạo bởi chuỗi polyme β - 1,4 glucopyranose mạch

thẳng. Nó có thành phần hoá học đồng nhất với cellulose thực vật, nhưng cấu
trúc và đặc tính của nó lại khác xa nhau.

Sợi cellulose của màng BC

Phí Văn Tá

Sợi cellulose của thực vật

16

K33B – SP Sinh


Khóa luận tốt nghiệp

Chuyên ngành Vi Sinh

Chuỗi polyme β - 1,4 glucopyranose mới hình thành liên kết với nhau
tạo thành sợi nhỏ (subfibril) có kích thước 1,5nm. Những sợi nhỏ kết tinh tạo
sợi lớn hơn - sợi vĩ mô, những sợi này kết hợp với nhau tạo thành bó và cuối
cùng tạo dải lớn. Những dải lớn từ tế bào này khi đẩy ra ngoài sẽ liên kết với
với những dải lớn của tế bào khác bằng liên kết hiđro hoặc Van Der Waals tạo
thành dạng sệt (gel) hay một lớp màng mỏng. Kích thước bên của màng tăng
lên khi quần thể vi khuẩn sinh trưởng. Những điểm tạo màng BC mới có thể
xuất hiện, chính vì thế mà màng BC được mở rộng [11], [20].
1.6.2. Một số tính chất của màng bacterial cellulose
Chung và Shyu (1999) đã nghiên cứu các tính chất của BC như độ
cứng, độ dính, độ dai và ảnh hưởng của dung dịch đường, muối … lên tính
2


chất của BC. Các mảnh BC có độ cứng là 3,68 kg/cm . Độ cứng của các
miếng BC giảm khi chúng được nhúng vào dung dịch đường và độ cứng tăng
lên khi được nhúng vào dung dịch muối [21].
Sản phẩm của cellulose vi khuẩn có một số tính chất như sau:
- Độ bền hóa học, độ bền cơ học và sức căng cao.
- Khả năng giữ nước và độ ẩm cao, do đó có thể điều chỉnh độ xốp.
- Do khả năng S-BC hình thành sẵn màng, khi ứng dụng trong làm vải
không cần qua khâu dệt, làm giấy không cần qua khâu bột giấy.
- Có thể theo dõi, kiểm soát lý tính của cellulose do cấu trúc của
cellulose vi khuẩn có khả năng biến đổi trong quá trình nuôi cấy.
- Kiểm soát được kích thước, cấu trúc và chất lượng của cellulose
(kiểm soát được cellulose kết tinh dị hình) trong quá trình nuôi cấy tạo
cellulose .
- Cellulose vi khuẩn là cellulose sinh học duy nhất được tổng hợp mà
không gắn lignin, có thể dễ dàng bị phân hủy bởi một số nhóm vi sinh vật. Vì
vậy, cellulose vi khuẩn được xem là nguồn vật liệu mới có nhiều ưu thế trong
tương lai [14], [18].

Phí Văn Tá

17

K33B – SP Sinh


Khóa luận tốt nghiệp

Chuyên ngành Vi Sinh


1.6.3.Cơ chế tổng hợp bacterial cellulose
Quá trình sinh tổng hợp BC là một tiến trình bao gồm nhiều bước được
điều hoà một cách chuyên biệt và chính xác bằng một hệ thống chứa nhiều
loại enzyme, phức hợp xúc tác và các protein điều hoà [7], [11].
Theo tác giả Alina Krystynowics và cộng sự có 4 enzyme tham gia xúc
tác tổng hợp cellulose ở vi khuẩn A. xylinum: Glucokinase (GK),
Phosphoglucomutase (PGM), Glucose - 1 - phosphate uridylyltransferase
(UDPG pyrophosphorylase hay UGP), Cellulose synthase (CS). Trong đó
UGP là enzyme có vai trò quan trọng nhất [7], [13].

Hình 1.3. Con đường sinh tổng hợp cellulose ở A.xylinum
Hai giai đoạn chính sinh tổng hợp cellulose vi khuẩn
Giai đoạn polymer hoá:
Đầu tiên enzyme glucokinase (GK) xúc tác phản ứng phosphoryl hoá
chuyển glucose thành glucose-6-phosphate. Enzyme phosphoglucomutase tiếp
tục chuyển hoá glucose-6-phosphate thành glucose-1-phosphate thông qua
phản ứng isomer hoá. Glucose-1-phosphate nhờ enzyme UDP-glucose

Phí Văn Tá

18

K33B – SP Sinh