LỜI CẢM ƠN
Khóa luận tốt nghiệp này được hoàn thành tại phòng Dược liệu Biển,
Viện Hóa sinh Biển, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
Với lòng biết ơn sâu sắc, em xin bày tỏ lòng biết ơn tới Th.S Nguyễn
Xuân Cường và các anh chị phòng Dược liệu Biển, Viện Hoá sinh Biển, Viện
Khoa học và Công Nghệ Việt Nam đã tận tình hướng dẫn em trong suốt quá
trình thực hiện và hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này.
Em xin bày tỏ lòng biết ơn tới lãnh đạo Viện Hoá sinh Biển đã tạo điều
kiện cho em được học tập và sử dụng các thiết bị tiên tiến của Viện để hoàn
thành tốt các mục tiêu đề ra của khóa luận tốt nghiệp.
Em xin cảm ơn thầy giáo Trưởng khoa Hóa học T.S Nguyễn Văn Bằng
và cùng toàn thể các thầy cô giáo trong khoa Hóa học, các thầy cô giáo trong
trường ĐHSP Hà Nội 2 đã truyền đạt những kiến thức quý báu cho em trong
suốt quá trình em học tập tại trường.
Khoá luận tốt nghiệp không tránh khỏi một số thiếu sót vì vậy em rất
mong nhận được sự góp ý, chỉ bảo của các thầy cô và các bạn sinh viên quan
tâm.
Em xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 10 tháng 5 năm 2011
Sinh viên

Lê Thị Hòa


Trường Đại học sư phạm Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

LỜI CAM ĐOAN
Khóa luận “ Nghiên cứu hóa học dịch chiết cloroform cây Chiết cánh

(Mallotus glabriusculus)” được hoàn thành dưới sự hướng dẫn trực tiếp của
Th.S Nguyễn Xuân Cường. Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu
của riêng tôi. Các số liệu kết quả nêu trong khóa luận là trung thực, không
trùng với các khóa luận khác đã được công bố.

Hà Nội, ngày 10 tháng 5 năm 2011
Sinh viên

Lê Thị Hòa

Lê Thị Hòa – K33B-Hóa

ii


Trường Đại học sư phạm Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

MỤC LỤC
MỞ ĐẦU....................................................................................................... 1
Chương 1: TỔNG QUAN ............................................................................ 3
1.1. Đặc điểm, tính vị và công dụng của cây Chiết cánh......................... 3
1.1.1. Mô tả ........................................................................................... 3
1.1.2. Phân bố, sinh thái......................................................................... 4
1.1.3. Công dụng .................................................................................... 4
1.2. Lớp chất Flavonoid............................................................................ 4
1.1.2. Giới thiệu chung ........................................................................... 4
1.2.2. Các nhóm flavonoid ..................................................................... 5
1.3. Các phương pháp chiết mẫu thực vật............................................... 8

1.3.1. Đặc điểm chung của chiết............................................................. 8
1.3.2. Cơ sở của quá trình chiết.............................................................. 9
1.3.3.Quá trình chiết thực vật ................................................................. 9
1.4. Các phương pháp sắc ký trong phân lập các hợp chất hữu cơ ..... 13
1.4.1. Đặc điểm chung của phương pháp sắc ký ................................... 13
1.4.2. Cơ sở của phương pháp sắc ký ................................................... 13
1.4.3. Phân loại các phương pháp sắc ký ............................................. 14
1.5. Một số phương pháp hóa lý xác định cấu trúc của các hợp chất
hữu cơ...................................................................................................... 16
1.5.1. Điểm nóng chảy (Mp).................................................................. 16
1.5.2. Độ quay cực ([α]D) ..................................................................... 17
1.5.3. Phổ hồng ngoại (Infrared spectroscopy)..................................... 17
1.5.4. Phổ khối lượng (Mass spectroscopy) .......................................... 18
1.5.5. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (Nuclear Magnetic Resonance
Spectroscopy, NMR)..................................................................................... 18
Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........... 21
2.1. Mẫu thực vật.................................................................................... 21
2.2. Phương pháp phân lập các hợp chất .............................................. 21
2.2.1. Sắc ký lớp mỏng (TLC) ............................................................... 21
2.2.2. Sắc ký lớp mỏng điều chế............................................................ 21
2.2.3. Sắc ký cột (CC)........................................................................... 21
2.3. Phương pháp xác định cấu trúc hóa học các hợp chất .................. 22
Lê Thị Hòa – K33B-Hóa

iii


Trường Đại học sư phạm Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp


2.3.1. Điểm nóng chảy (Mp).................................................................. 22
2.3.2. Phổ khối lượng (ESI- MS)........................................................... 22
2.3.3. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR)........................................... 22
2.3.4. Độ quay cực [α]D........................................................................ 22
2.4. Dụng cụ và thiết bị........................................................................... 22
2.4.1. Dụng cụ và thiết bị chiết ............................................................. 22
2.4.2. Dụng cụ và thiết bị xác định cấu trúc ......................................... 23
2.5. Hóa chất ........................................................................................... 23
Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................ 24
3.1. Chiết phân đoạn và phân lập các hợp chất .................................... 24
3.2. Hằng số vật lý và dữ kiện phổ của các hợp chất ............................ 25
3.2.1. Hợp chất 1: Myricitrin............................................................... 25
3.2.2. Hợp chất 2: Kaempferin ............................................................. 26
3.3. Kết quả xác định cấu trúc ............................................................... 27
3.3.1. Xác định cấu trúc hóa học của hợp chất 1: Myricitrin................ 27
3.3.2. Xác định cấu trúc hóa học của hợp chất 2: Kaempferin ............. 33
KẾT LUẬN................................................................................................. 40
TÀI LIỆU THAM KHẢO......................................................................... 41

Lê Thị Hòa – K33B-Hóa

iv


Trường Đại học sư phạm Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

[α]D

Độ quay cực Specific Optical Rotation

13

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân cacbon 13

C – NMR

Carbon – 13 Nuclear Magnetic Resonance
Spectroscopy
1

H – NMR

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton
Proton Magnetic Resonance Spectroscopy

1

H – 1H COSY

2D – NMR

1

H – 1H Chemical Shift Correlation Spectroscopy

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân hai chiều

Two – Dimensional NMR

CC

Sắc ký cột Column Chromatography

DEPT

Distortionless Enhancement by Polarisation Transfer

EI – MS

Phổ khối lượng va chạm electron
Electron Impact Mass Spectroscopy

FAB – MS

Phổ khối lượng bắn phá nguyên tử nhanh
Fast Atom Bombardment Mass Spectroscopy

HMBC

Heteronuclear Multiple Bond Connectivity

HMQC

Heteronuclear Multiple Quantum Connectivity

HR – FAB – MS


Phổ khối lượng bắn phá nguyên tử nhanh phân giải cao
High Resolation Fast Atom Bombardment Mass
Spectroscopy

IR

Phổ hồng ngoại Infrared Spectroscopy

Me

Nhóm metyl

MS

Phổ khối lượng

NOESY

Nuclear Overhauser Effect Spectroscopy

TLC

Sắc ký lớp mỏng Thin Layer Chromatography

Lê Thị Hòa – K33B-Hóa

v


Trường Đại học sư phạm Hà Nội 2


Khóa luận tốt nghiệp

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ BẢNG BIỂU
Trang
Hình 1.1. Lá Chiết cánh ................................................................................. 3
Hình 1.2. Flavan (2_phenyl chromen)............................................................ 5
Hình 1.3. Flavon ............................................................................................ 5
Hình 1.4. Flavonol ......................................................................................... 5
Hình 1.5. Flavanon ........................................................................................ 5
Hình 1.6. Flavanonol_3 ................................................................................. 6
Hình 1.7. Chalcon.......................................................................................... 6
Hình 1.8. Auron............................................................................................. 6
Hình 1.9. Antoxianidrin ................................................................................. 7
Hình 1.10. Leucoantoxianidrin ...................................................................... 7
Hình 1.11. (+) Catechin ................................................................................. 7
Hình 1.12. (-) Catechin .................................................................................. 7
Hình 1.13. 3_phenylchromen......................................................................... 8
Hình 1.14. 3_phenylchromen_4_one ............................................................. 8
Hình 1.15. Retonoid....................................................................................... 8
Hình 3.1. Sơ đồ chiết phân đoạn cây Chiết cánh Mallotus glabriusculus ..... 24
Hình 3.2. Sơ đồ phân lập các hợp chất từ cặn chiết cloroform ..................... 25
Hình 3.3. Phổ 1H-NMR của 1...................................................................... 27
Hình 3.4. Phổ 13C-NMR của 1 ..................................................................... 28
Hình 3.5. Cấu trúc của hợp chất 1................................................................ 28
Hình 3.6. Phổ DEPT của 1........................................................................... 29
Hình 3.7. Phổ HMBC của 1 ......................................................................... 31
Hình 3.8. Các tương tác HMBC (H  C) chính của 1 ................................. 31
Hình 3.9. Phổ ESI-MS positive của hợp chất 1 ............................................ 31
Lê Thị Hòa – K33B-Hóa


vi


Trường Đại học sư phạm Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

Hình 3.10. Phổ ESI-MS nagative của hợp chất 1 ......................................... 33

Hình 3.11. Phổ ESI-MS positive của 2 ........................................................ 34
Hình 3.12. Phổ ESI-MS negative của 2........................................................ 35
Hình 3.13 .Cấu trúc của hợp chất 2.............................................................. 35
Hình 3.14. Phổ 1H-NMR của 2 .................................................................... 36
Hình 3.15. Phổ 13C-NMR của 2 ................................................................... 38
Hình 3.16. Phổ DEPT của 2......................................................................... 39

Bảng 3.1. Số liệu phổ NMR của 1................................................................ 30
Bảng 3.2. Số liệu phổ NMR của 2................................................................ 37

Lê Thị Hòa – K33B-Hóa

vii


Trường Đại học sư phạm Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

MỞ ĐẦU

Nằm trong khu vực nhiệt đới gió mùa, lượng mưa tương đối lớn, độ ẩm
cao (khoảng trên 80%), Việt Nam hiện có một hệ thống thực vật rất phong
phú với khoảng 12000 loài, trong đó có tới 4000 loài được nhân dân ta làm
thảo dược cùng với các mục đích khác phục vụ cuộc sống con người [1].
Cùng với bề dày phát triển 4000 năm lịch sử của dân tộc, ngành đông y
đã dành được những thành tựu rực rỡ, nhiều phương thuốc cây cỏ, động vật
đã được ứng dụng hiệu quả và lưu truyền cho đến nay.
Sử dụng cây cỏ làm thuốc luôn gắn liền với lịch sử tồn tại và phát triển
của xã hội loài người. Việc sử dụng các hợp chất thiên nhiên và các sản phẩm
có nguồn gốc thiên nhiên dược phẩm chữa bệnh đang ngày càng thu hút sự
quan tâm của các nhà khoa học cũng như cộng đồng bởi ưu điểm của chúng là
độc tính thấp, dễ hấp thu và chuyển hóa trong cơ thể hơn so với các dược
phẩm tổng hợp.
Chi ba bét (Mallotus) là một chi khá lớn, gồm khoảng 150 loài phân bố
tại các khu vực Ấn Độ, Sri Lanka đến Thái Lan, Lào, Campuchia, Việt Nam
và khắp vùng Malesian. Về phía Nam, chúng phân bố tới miền Đông Fiji,
miền Bắc và Đông Australia. Lên phía Bắc, có thể bắt gặp khá nhiều loài
phân bố tại Trung Quốc, Triều Tiên và Nhật Bản. Rất nhiều loài Mallotus đã
được sử dụng làm thuốc để chữa nhiều loại bệnh khác nhau .
Cây Chiết cánh (Mallotus glabriusculus), thuộc họ Thầu dầu
(Euphorbiaceae) là một loài cây thuộc chi ba bét đã được sử dụng từ lâu trong
dân gian làm thuốc chữa bệnh, như rễ cây được dùng làm thuốc bổ phổi và
chữa ho, viêm đau họng, kiết lỵ và một số bệnh ngoài da…
Xuất phát từ ý nghĩa thực tiễn trên nên tôi đã chọn đề tài cho khóa luận
tốt nghiệp là: “Nghiên cứu hóa học dịch chiết cloroform cây Chiết cánh
Mallotus glabriusculus”.
Lê Thị Hòa – K33B-Hóa

1



Trường Đại học sư phạm Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

Luận văn này tập trung nghiên cứu thành phần hóa học từ lá cây Chiết
cánh bao gồm những nội dung chính là:
1. Thu mẫu lá cây Chiết cánh (Mallotus glabriusculus), xử lý mẫu và tạo
dịch chiết cloroform
2. Phân lập một số hợp chất Flavonoid từ cây Chiết cánh.
3. Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất đã phân lập được.

Lê Thị Hòa – K33B-Hóa

2


Trường Đại học sư phạm Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

Chương 1: TỔNG QUAN
1.1. Đặc điểm, tính vị và công dụng của cây Chiết cánh
1.1.1. Mô tả [2]
Chiết cánh (Kiết cánh) – Mallotus glabriusculus (Kurz) Pax et Hoffm
(Coelodiscus glabriusculus Kurz, C.coudercii Gagn, Mallotus coudercii
(Gagn), Airy Shaw, thuộc họ Thầu dầu – Euphorbiaceae).
Cây bụi cao tới 1m, có khi là cây gỗ cao 8-10 m. Nhánh nhẵn, hơi dẹp.
Lá mọc đối, hình trái xoan- ngọn giáo, gốc tròn, chóp nhọn, lúc non có lông
hình sao, về sau không lông, khi khô màu gỉ sắt, dài 11-20 cm, rộng 5-9 cm,

mép nguyên, gân gốc 3, các gân bên chỉ đến giữa chiều dài của phiến, gân
phụ 4-5 đôi, cuống lá ở mỗi mắt, có một dài, một ngắn (có một lá lớn hơn lá
kia), lá kèm 5 mm. Cụm hoa ở nách, rất ngắn, gần như hình xim co, cỡ 1 cm.
Hoa đực có 3 lá dài, 30 nhị hoặc hơn. Cụm hoa cái ở nách lá, dài 2,5-3 cm,
mang 1-2 hoa ở ngọn. Hoa cái có 3 lá dài và bầu hình cầu cỡ 5-6 mm. Quả
nang cỡ 12 mm, tròn, có nhiều gai. Hoa tháng 5-8.

Hình 1.1. Lá Chiết cánh

Lê Thị Hòa – K33B-Hóa

3


Trường Đại học sư phạm Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

1.1.2. Phân bố, sinh thái
Tại Việt Nam: Cây phân bố tại Kon Tum, Gia Lai, Khánh Hòa, Ninh
Thuận (Phan Giang), Đồng Nai (Biên Hòa, Bảo Chánh), Bà Rịa – Vũng Tàu
(Côn Đảo), Kiên Giang (Phú Quốc).
Trên thế giới: Lào, Campuchia, Myanma.
Cây ưa sáng, mọc trong rừng thường xanh, trên đất sa phiến thạch ở độ
cao 100 – 500 m.
1.1.3. Công dụng
Nhân dân dùng rễ cây làm thuốc bổ phổi và chữa ho với công dụng như
vị thuốc Cát cánh (chữa ho có đờm hôi tanh, ho ra máu, viêm đau họng, khản
tiếng, hen suyễn, tức ngực, khó thở, nhọt ở phổi, kiết lỵ, chế thuốc mỡ dùng
ngoài để chữa một số bệnh ngoài da).

1.2. Lớp chất Flavonoid
1.1.2. Giới thiệu chung [3,4,6,7,9]
Các Flavonoid là lớp chất phổ biến có trong thực vật.
Chúng là hợp chất có cấu tạo gồm 2 vòng benzen A, B được nối với
nhau bởi một dị vòng C với bộ khung cacbon C6 – C3 – C6.
Việc phân loại các flavonoid dựa trên sự khác nhau của nhóm C3 (các
glicozit của nó có màu vàng nhạt và màu ngà, antoxianin và antoxianidrin
màu đỏ, xanh, tía và các dạng không màu, isoflavon, catecin và
leucoantoxianidrin là các chất tan trong nước và thường nằm trong không
bào).
Các flavonoid là các dẫn xuất của 2_phenyl chromen (flavan).

Lê Thị Hòa – K33B-Hóa

4


Trường Đại học sư phạm Hà Nội 2

A

Khóa luận tốt nghiệp
2'

8

7

6


5

9

10

O

2

3

4

3'

1'

4'
6'

B

5'

C
Hình 1.2. Flavan (2_phenyl chromen)
1.2.2. Các nhóm flavonoid [3,4,6,7,9]
1.2.2.1. Flavon và flavonol
Flavon và flavonol rất phổ biến trong tự nhiên. Công thức cấu tạo của

chúng chỉ khác nhau ở vị trí cacbon số 3.

RO

OH

O

Hình 1.3. Flavon

RO

OH
OH
O

Hình 1.4. Flavonol
1.2.2.2. Flavanon
Các flavanon nằm trong cân bằng hỗ biến các Chalcon do vòng
dihidropyron của flavanon kém bền nên dễ xảy ra mở vòng chuyển thành
chalcol.
O
RO

O

Hình 1.5. Flavanon
Lê Thị Hòa – K33B-Hóa

5


OR


Trường Đại học sư phạm Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

1.2.2.3. Flavanonol_3
Có 2 nguyên tử C bất đối là C-2 và C-3 nên chúng có tính quang hoạt.
Các hợp chất thường gặp là aromadendrin, fustin và taxifolin.
OR
O

OH
O

Hình 1.6. Flavanonol_3
1.2.2.4. Chalcon
Chalcon có thể bị đồng phân hóa thành flavonol khi đun nóng với axit
clohydric (HCl).
OR

OH

O

Hình 1.7. Chalcon
1.2.2.5. Auron
Có màu vàng đậm và không tạo màu khi thực hiện phản ứng shioda.

OR

O
CH

RO
O

Hình 1.8. Auron
1.2.2.6. Antoxianidrin
Thường gặp trong tự nhiên ở dạng glicozit dễ tan trong nước. Màu sắc
của nó thay đổi theo pH.

Lê Thị Hòa – K33B-Hóa

6


Trường Đại học sư phạm Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp
OR

O

OH

Hình 1.9. Antoxianidrin
1.1.2.7. Leucoantoxianidrin
Các hợp chất này mới chỉ tìm thấy ở dạng agycon, chưa tìm thấy ở dạng

glicozit.
O

OH
O

Hình 1.10. Leucoantoxianidrin
1.2.2.8. Catechin
Catechin là các dẫn xuất flavan_3_ol. Do có 2 trung tâm cacbon bất đối
nên chúng tồn tại dưới dạng 2 cặp đồng phân đối quang.
OH
HO

O

OH

OH

Hình 1.11. (+) Catechin
OH
HO

O

OH

OH

Hình 1.12. (-) Catechin


Lê Thị Hòa – K33B-Hóa

7


Trường Đại học sư phạm Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

1.2.2.9. Isoflavonoid:
Bao gồm các dẫn xuất của 3_phenylchroman.
O

Hình 1.13. 3_phenylchromen
O

O

Hình 1.14. 3_phenylchromen_4_one
1.2.2.10. Retonoid và neoflavonoid
Các rotenoid có quan hệ chặt chẽ với các isoflavon về mặt cấu trúc cũng
như sinh tổng hợp.

O

O

H
O

H

O
OMe
OMe

Hình 1.15. Retonoid
1.3. Các phương pháp chiết mẫu thực vật
1.3.1. Đặc điểm chung của chiết
- Chiết là quá trình tách và phân ly các chất dựa vào quá trình chuyển
một chất hòa tan trong một pha lỏng vào một pha lỏng khác không hoà tan với
nó.

Lê Thị Hòa – K33B-Hóa

8


Trường Đại học sư phạm Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

- Mục đích của chiết:
+ Chuyển một lượng nhỏ chất nghiên cứu trong một thể tích lớn dung
môi này vào một thể tích nhỏ dung môi khác nhằm nâng cao nồng độ của chất
cần nghiên cứu và được gọi là chiết làm giàu.
+ Ngoài ra còn dùng phương pháp chiết pha rắn để tách hay phân ly các
chất trong một hỗn hợp phức tạp với điều kiện chiết thích hợp. Thường dùng
trong phân lập các hợp chất thiên nhiên.
1.3.2. Cơ sở của quá trình chiết

- Dựa vào sự phân bố khác nhau của các chất trong hai chất lỏng không
hoà lẫn với nhau. Sự phân bố khác nhau là do tính tan khác nhau của các chất
trong các pha lỏng.
- Quá trình chiết dựa trên định luật Nerst:
KA = [A]hc/ [A]n
KA: Hằng số phân bố
[A]hc, [A]n: Hoạt độ xác định của chất hoà tan trong pha hữu cơ và pha
nước.
1.3.3.Quá trình chiết thực vật
Sau khi tiến hành thu hái và làm khô mẫu, tùy thuộc vào đối tượng chất
có trong các mẫu khác nhau (chất phân cực, chất không phân cực, chất có độ
phân cực trung bình…) mà ta chọn dung môi và hệ dung môi khác nhau.
1.3.3.1. Chọn dung môi chiết.
Thường thì các chất chuyển hóa thứ cấp trong cây có độ phân cực khác
nhau. Tuy nhiên những thành phần tan trong nước ít khi được quan tâm. Dung
môi dùng trong quá trình chiết cần phải được lựa chọn rất cẩn thận.

Lê Thị Hòa – K33B-Hóa

9


Trường Đại học sư phạm Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

Điều kiện của dung môi là phải hòa tan được những chất chuyển hóa thứ
cấp đang nghiên cứu, dễ dàng được loại bỏ, có tính trơ (không phản ứng với
chất nghiên cứu), không độc, không dễ bốc cháy.
Những dung môi này nên được chưng cất để thu được dạng sạch trước

khi sử dụng. Nếu chúng có lẫn các chất khác thì có thể ảnh hưởng đến hiệu
quả và chất lượng của quá trình chiết. Thường có một số chất dẻo lẫn trong
dung môi như các điankylphtalat, tri_n_butyl_axetylcitrat và tributylphotphat.
Những chất này có thể lẫn với dung môi trong quá trình sản xuất hoặc trong
khâu bảo quản như trong các thùng chứa hoặc các nút đậy bằng nhựa.
Methanol và clorofom thường chứa đioetylphtalat [ đi_(2_etylhexyl)
phtalat hoặc bis_2_etylheylphtalat ]. Chất này sẽ làm sai lệch kết quả phân lập
trong các quá trình nghiên cứu hóa thực vật, thể hiện hoạt tính trong thử
nghiệm sinh học và có thể làm bẩn dịch chiết của cây. Cloroform,
metylenclorit va methanol là những dung môi thường được lựa chọn trong
quá trình chiết sơ bộ một phần của cây như: lá, rễ, thân, củ, hoa, quả…
Những tạp chất của cloroform như CH2Cl2, CH2ClBr có thể phản ứng
với một vài hợp chất như các ancaloit tạo muối bậc bốn và những sản phẩm
khác.
Tương tự như vậy, sự có mặt của lượng nhỏ axit HCl cũng có thể gây ra
sự phân huỷ, sự khử nước hay sự đồng phân hóa với các hợp chất khác.
Cloroform có thể gây tổn thương cho gan và thận nên khi làm việc với chất
này cần được thao tác khéo léo, cẩn thận, ở nơi thoáng và cần đeo mặt nạ
phòng độc. Metylenclorit ít độc hơn và dễ bay hơi hơn cloroform.
Methanol và etanol 80% là những dung môi phân cực hơn các
hidrocacbon thế clo. Người ta cho rằng các dung môi thuộc nhóm rượu sẽ
thấm tốt hơn lên màng tế bào nên quá trình chiết với các dung môi này sẽ thu
được lượng lớn các thành phần trong tế bào. Trái lại, khả năng phân cực của
Lê Thị Hòa – K33B-Hóa

10


Trường Đại học sư phạm Hà Nội 2


Khóa luận tốt nghiệp

cloroform thấp hơn, nó có thể rửa giải các chất nằm ngoài tế bào. Các ancol
hòa tan phần lớn các chất chuyển hóa phân cực cùng với các hợp chất phân
cực trung bình và thấp. Vì vậy khi chiết bằng ancol thì các chất này cũng bị
hòa tan đồng thời. Thông thường dung môi cồn trong nước có những đặc tính
tốt nhất cho quá trình chiết sơ bộ.
Tuy nhiên cũng có một vài sản phẩm mới được tạo thành khi dùng
methanol trong suốt quá trình chiết [5] .Thí dụ trechlonolide A thu được từ
trechonaetes aciniata được chuyển hóa thành trechlonolide B bằng quá trình
phân hủy 1-hidroxy tropacocain cũng xảy ra khi erythroxylumnovogranatense
được chiết trong methanol nóng.
Người ta thường ít sử dụng nước để thu được dung dịch chiết thô từ cây
mà thay vào đó là dung dịch nước của methanol.
Đietyl ete hiếm khi được dùng cho quá trình chiết thực vật vì nó rất dễ
bay hơi, bốc cháy và rất độc, đồng thời nó có xu hướng tạo thành peroxit dễ
nổ, peroxit của đietyl ete dễ gây phản ứng oxi hóa với những hợp chất không
có khả năng tạo cholesterol như các carotenoit. Tiếp đến là axeton cũng có thể
tạo thành axetonit nếu 1,2_cis_điol có mặt trong môi trường axit. Quá trình
chiết dưới điều kiện axit hoặc bazơ thường được dùng với quá trình phân tách
đặc trưng, cũng có khi xử lý các dịch chiết bằng axit-bazơ có thể tạo thành
những sản phẩm mong muốn.
Sự hiểu biết về những đặc tính của những chất chuyển hóa thứ cấp trong
cây được chiết sẽ rất quan trọng để từ đó lựa chọn dung môi thích hợp cho
quá trình chiết, tránh được sự phân hủy chất bởi dung môi và quá trình tạo
thành chất mong muốn.
Sau khi chiết, dung môi được cất bằng máy cất ở nhiệt độ không quá 30400C, với một vài hóa chất chịu nhiệt có thể được thực hiện ở nhiệt độ cao
hơn.
Lê Thị Hòa – K33B-Hóa


11


Trường Đại học sư phạm Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

1.3.3.2. Quá trình chiết
Hầu hết quá trình chiết đơn giản được phân loại như sau:
- Chiết ngâm.
- Chiết sử dụng một loại thiết bị là bình chiết xoclet.
- Chiết lôi cuốn theo hơi nước.
Chiết ngâm là một trong những phương pháp được sử dụng rộng rãi nhất
trong quá trình chiết thực vật bởi vì nó không đòi hỏi nhiều công sức và thời
gian. Thiết bị sử dụng là một bình thủy tinh với một cái khóa ở dưới đáy để
điều chỉnh tốc độ chảy thích hợp cho quá trình tách rửa dung môi. Dung môi
có thể nóng hoặc lạnh nhưng nóng sẽ đạt hiệu quả chiết cao hơn. Trước đây,
máy chiết ngâm đòi hỏi phải làm bằng kim loại nhưng hiện nay có thể dùng
bình thủy tinh. Thông thường quá trình chiết ngâm không được sử dụng như
phương pháp chiết liên tục bởi mẫu được ngâm với dung môi trong máy chiết
khoảng 24 giờ rồi chất chiết được lấy ra. Thông thường quá trình chiết một
mẫu chỉ thực hiện qua 3 lần dung môi vì khi đó cặn chiết sẽ không còn chứa
những chất giá trị nữa. Sự kết thúc quá trình chiết được xác định bằng một vài
cách khác nhau.
Ví dụ:
+ Khi chiết các ancaloit, ta có thể kiểm tra sự xuất hiện của hợp chất này
bằng sự tạo thành kết tủa với những tác nhân đặc trưng như tác nhân:
Đragendroff và tác nhân Mayer.
+ Các flavonoid thường là những chất không màu, vì vậy khi dịch chiết
chảy ra không có màu sẽ đánh dấu sự rửa hết những chất này trong cặn chiết.

+ Khi chiết các chất béo thì nồng độ trong các phần của dịch chiết ra và
sự xuất hiện của cặn chiết tiếp sau đó sẽ biểu thị sự kết thúc quá trình chiết.
+ Các lacton của sesquitecpen và các glicozit trợ tim, phản ứng Kedde có
thể dùng để biểu thị sự xuất hiện của chúng hoặc khi cho phản ứng với
Lê Thị Hòa – K33B-Hóa

12


Trường Đại học sư phạm Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

anilinaxetat sẽ cho biết sự xuất hiện của các hidratcacbon, và từ đó có thể biết
được khi nào quá trình chiết kết thúc.
Như vậy, tùy thuộc vào mục đích cần chiết lấy chất gì để lựa chọn dung
môi cho thích hợp và thực hiện quy trình chiết hợp lý nhằm đạt hiệu quả cao.
Ngoài ra, có thể dựa vào mối quan hệ của dung môi và chất tan của các lớp
chất mà ta có thể tách thô một số chất ngay trong quá trình chiết.
1.4. Các phương pháp sắc ký trong phân lập các hợp chất hữu cơ [8,9]
Phương pháp sắc ký (chromatography) là một phương pháp phổ biến và
hữu hiệu nhất hiện nay được sử dụng rộng rãi trong việc phân lập các hợp
chất hữu cơ nói chung và các hợp chất thiên nhiên nói riêng.
1.4.1. Đặc điểm chung của phương pháp sắc ký
Sắc ký là phương pháp tách các chất dựa vào sự khác nhau về bản chất
hấp phụ và sự phân bố khác nhau của chúng giữa 2 pha: pha tĩnh và pha động.
Sắc ký gồm có pha tĩnh và pha động. Khi tiếp xúc với pha tĩnh, các cấu
tử cả hỗn hợp sẽ phân bố giữa pha động và pha tĩnh tương ứng với tính chất
của chúng (tính bị hấp phụ, tính tan). Các chất khác nhau sẽ có ái lực khác
nhau với pha động và pha tĩnh. Trong quá trình pha động chuyển động dọc

theo hệ sắc ký hết lớp pha tĩnh này đến lớp pha tĩnh khác, sẽ lặp đi lặp lại quá
trình hấp phụ và phản hấp phụ. Kết quả là các chất có ái lực lớn với pha tĩnh
sẽ chuyển động chậm hơn qua hệ thống sắc ký so với các chất có tương tác
yếu hơn với pha này. Nhờ đặc điểm này mà người ta có thể tách các chất qua
quá trình sắc ký.
1.4.2. Cơ sở của phương pháp sắc ký
Phương pháp sắc ký dựa vào sự phân bố khác nhau của các chất giữa hai
pha tĩnh và động. Ở điều kiện nhiệt độ không đổi, định luật mô tả sự phụ
thuộc của lượng chất bị hấp phụ lên pha tĩnh với nồng độ của dung dịch

Lê Thị Hòa – K33B-Hóa

13


Trường Đại học sư phạm Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

(hoặc với chất khí là áp suất riêng phần) gọi là định luật hấp phụ đơn phân tử
đẳng nhiệt Langmuir:
n

n .b.C
1  b.C

Với:
n_ lượng chất bị hấp phụ lên pha tĩnh lúc đạt cân bằng
n∞_ lượng cực đại của chất có thể bị hấp phụ lên một chất hấp phụ nào
đó.

b_ hằng số.
C_ nồng độ của chất bị hấp phụ.
1.4.3. Phân loại các phương pháp sắc ký
Trong phương pháp sắc ký pha động là các lưu thể (các chất ở trạng thái
khí hay lỏng), còn pha tĩnh có thể là các chất ở trạng thái lỏng hay rắn. Dựa
vào trạng thái tập hợp của pha động, người ta chia sắc ký thành 2 nhóm lớn:
sắc ký khí và sắc ký lỏng. Dựa vào cách tiến hành sắc ký, người ta chia thành
các phương pháp sắc ký chủ yếu sau:
1.4.3.1. Sắc ký cột (C.C)
Đây là phương pháp sắc ký phổ biến nhất, chất hấp phụ là pha tĩnh gồm
các loại silica gel (có kích thước hạt khác nhau) pha thường và pha đảo YMC,
ODS, Dianion. Chất hấp phụ được nhồi vào cột (cột có thể bằng thủy tinh
hoặc kim loại, phổ biến nhất là cột thủy tinh). Độ mịn của chất hấp phụ hết
sức quan trọng, nó phản ánh số đĩa lý thuyết hay khả năng tách của chất hấp
phụ. Độ hạt của chất hấp phụ càng nhỏ thì số đĩa lý thuyết càng lớn, khả năng
tách càng cao và ngược lại. Tuy nhiên, nếu chất hấp phụ có kích thước hạt
càng nhỏ thì tốc độ chảy càng giảm. Trong một số trường hợp nếu lực trọng
trường không đủ lớn thì gây ra hiện tượng tắc cột (dung môi không chảy

Lê Thị Hòa – K33B-Hóa

14


Trường Đại học sư phạm Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

được), khi đó người ta phải sử dụng áp suất, với áp suất trung bình(MPC), áp
suất cao (HPLC).

Trong sắc ký cột, tỷ lệ đường kính cột (D) so với chiều cao cột (L) rất
quan trọng, nó thể hiện khả năng tách của cột. Tỷ lệ L/D phụ thuộc vào yêu
cầu tách, tức là phụ thuộc vào hỗn hợp chất cụ thể. Trong sắc ký, tỷ lệ giữa
quãng đường đi của chất cần tách so với quãng đường đi của dung môi gọi là
Rf, với mỗi chất sẽ có một giá trị Rf khác nhau. Nhờ vào sự khác nhau về Rf
này mà ta có thể tách từng chất ra khỏi hỗn hợp. Tỷ lệ chất so với tỷ lệ chất
hấp phụ cũng rất quan trọng và tùy thuộc vào yêu cầu tách. Nếu tách thô thì tỷ
lệ này thấp (từ 1/5 đến 1/10), còn nếu tách tinh thì tỷ lệ này cao hơn và tăng
vào hệ số tách (tức phụ thuộc vào sự khác nhau về Rf của các chất) mà hệ số
này vào khoảng 1/20 đến 1/30.
Trong sắc ký cột, việc đưa chất lên cột hết sức quan trọng. Tùy thuộc
vào lượng chất và dạng chất mà người ta có thể đưa chất lên cột bằng các
phương pháp khác nhau. Nếu lượng chất nhiều và chạy thô, thì phổ biến là
tẩm chất vào silica gel rồi làm khô, tơi hoàn toàn rồi đưa lên cột. Nếu tách
tinh, thì đưa trực tiếp chất lên cột bằng cách hòa tan chất bằng dung môi chạy
cột với lượng tối thiểu. Việc nhồi cột (bằng chất hấp phụ) cũng hết sức quan
trọng. Có 2 cách đưa chất hấp phụ lên cột:
+ Cách 1: Nhồi cột khô. Theo cách này, chất hấp phụ được đưa trực tiếp
vào cột khi cột còn khô, sau đó dùng que mềm để gõ nhẹ lên thành cột để
chất hấp phụ sắp xếp chặt trong cột. Sau đó dùng dung môi chạy cột để chạy
cột đến khi cột trong suốt.
+ Cách 2: Nhồi cột ướt, tức là chất hấp phụ được hòa tan trong dung môi
chạy cột trước với lượng dung môi tối thiểu. Sau đó đưa dần vào cột đến khi
đủ lượng cần thiết.

Lê Thị Hòa – K33B-Hóa

15



Trường Đại học sư phạm Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

Khi chuẩn bị cột phải lưu ý không được để bọt khí bên trong (nếu có bọt
khí gây nên hiện tượng chảy rối trong cột và giảm hiệu quả tách), và cột
không được nứt, gãy, dò.
Tốc độ chảy của dung môi cũng ảnh hưởng đến hiệu quả tách. Nếu tốc
độ dòng chảy quá lớn sẽ làm giảm hiệu quả tách, còn nếu tốc độ dòng chảy
quá thấp sẽ kéo dài thời gian tách và ảnh hưởng đến tiến độ công việc.
1.4.3.2. Sắc ký lớp mỏng.
Sắc ký lớp mỏng (SKLM) thường được sử dụng để kiểm tra và định
hướng cho sắc ký cột. SKLM được tiến hành trên bản mỏng tráng sẵn silica
gel trên đế nhôm hay đế thủy tinh.
Ngoài ra SKLM còn được dùng để điều chế thu chất trực tiếp.
Bằng việc sử dụng SKLM điều chế (bản được tráng silica gel dày hơn),
có thể đưa lượng chất nhiều hơn lên bản và sau khi chạy sắc ký người ta có
thể cạo riêng phần silica gel có chứa chất cần tách rồi giải hấp phụ bằng dung
môi thích hợp để thu được từng chất riêng biệt. Có thể phát hiện chất trên bản
mỏng bằng đèn tử ngoại, bằng chất phát hiện màu đặc trưng cho từng lớp chất
hoặc sử dụng dung dịch H2SO4 10%.
1.5. Một số phương pháp hóa lý xác định cấu trúc của các hợp chất hữu
cơ
Cấu trúc của chất phân lập ra được xác định bằng sự kết hợp của nhiều
phương pháp khác nhau. Tuỳ thuộc vào cấu trúc hoá học của từng hợp chất
mà người ta sử dụng các phương pháp khác nhau. Cấu trúc càng phức tạp thì
yêu cầu phối hợp các phương pháp càng cao.
1.5.1. Điểm nóng chảy (Mp)
Đối với chất rắn kết tinh, điểm chảy là một tiêu chuẩn vật lý rất quan
trọng. Thông thường việc phân tích đầu tiên sau khi thu được một sản phẩm


Lê Thị Hòa – K33B-Hóa

16


Trường Đại học sư phạm Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

kết tinh là việc xác định điểm chảy vì đó là tiêu chuẩn để kiểm tra mức độ
tinh khiết của hợp chất mà chỉ cần lượng rất ít mẫu thử.
Nếu điểm chảy của hai loại tinh thể thu được qua hai lần kết tinh chỉ
chênh lệch nhau không quá 0,50C thì có thể xem sản phẩm kết tinh là tinh
khiết. Khi điểm chảy xác định được, đối chiếu với tài liệu tham khảo để có thể
đưa ra kết luận sơ bộ về hợp chất đang nghiên cứu.
1.5.2. Độ quay cực ([α]D)
Ánh sáng tự nhiên đi qua một môi trường bất đẳng hướng, trong điều
kiện nhất định nào đó, do tác dụng của môi trường làm cho cường độ điện
trường chỉ còn dao động theo một phương nhất định được gọi là ánh sáng
phân cực thẳng hay ánh sáng phân cực toàn phần.
Mặt phẳng chứa tia sáng và phương dao động của vectơ điện trường
được gọi là mặt phẳng dao động, còn mặt phẳng chứa tia sáng và vuông góc
với mặt phẳng dao động gọi là mặt phẳng phân cực.
Khi cho ánh sáng phân cực thẳng đi qua dung dịch một chất quang hoạt
thì mặt phẳng phân cực sẽ bị quay một góc α. Tuỳ theo chất quang hoạt mà
góc quay này có thể sang phải (+) hay sang trái (-). Độ lớn của góc quay α
phụ thuộc vào nồng độ C (g/100ml dung dịch), chiều dài lớp dung dịch (dung
môi) l, nhiệt độ t và chiều dài sóng λ:
α = [ ]t


Cl
100

1.5.3. Phổ hồng ngoại (Infrared spectroscopy)
Phổ hồng ngoại được xây dựng dựa vào sự khác nhau về dao động của
các liên kết trong phân tử hợp chất dưới sự kích thích của tia hồng ngoại. Mỗi
kiểu liên kết sẽ đặc trưng bởi một vùng bước sóng khác nhau.

Lê Thị Hòa – K33B-Hóa

17


Trường Đại học sư phạm Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

1.5.4. Phổ khối lượng (Mass spectroscopy)
- Phổ EI-MS (Electron Impact Ionization Mass Spectroscopy): dựa vào
sự phân mảnh ion dưới tác dụng của chùm ion bắn phá với năng lượng khác
nhau, phổ biến là 70eV.
- Phổ ESI (Eletron Spray Ionization Mass Spectroscopy): gọi là phổ mù
điện tử. Phổ này được thực hiện với năng lượng bắn phá thấp hơn nhiều so
với phổ EI-MS, do đó phổ thu được chủ yếu là pic ion phân tử và các pic đặc
trưng cho sự phá vỡ các liên kết có mức năng lượng thấp, dễ bị phá vỡ.
- Phổ FAB (Fast Atom Bombardment Mass Spectroscopy): là phổ bắn
phá nguyên tử nhanh với sự bắn phá nguyên tử nhanh ở năng lượng thấp, do
đó phổ thu được cũng dễ thu được pic ion phân tử.
- Phổ khối lượng phân giải cao (High Resolution Mass Spectroscopy):

cho phép xác định pic ion phân tử hoặc ion mảnh với độ chính xác cao. Kết
quả phổ khối lượng phân giải cao cùng với kết quả phân tích nguyên tố sẽ cho
phép khẳng định chính xác công thức cộng của hợp chất hữu cơ.
1.5.5. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (Nuclear Magnetic Resonance
Spectroscopy, NMR)
- Phổ 1H- NMR: Trong phổ 1H- NMR, độ dịch chuyển hóa học (δ) của
các proton được xác định trong thang ppm từ 0 ppm đến 14 ppm tùy thuộc
vào mức độ lai hóa của nguyên tử cũng như đặc trưng riêng của từng phân tử.
Mỗi loại proton cộng hưởng ở một trường khác nhau và vì vậy chúng được
biểu diễn bằng một độ dịch chuyển khác nhau. Dựa vào những đặc trưng của
độ dịch chuyển hóa học cũng như tương tác spin coupling mà người ta có thể
xác định được cấu trúc hóa học của hợp chất.
- Phổ

13

C- NMR: Phổ này cho tín hiệu vạch phổ của Cacbon. Mỗi

nguyên tử C sẽ cộng hưởng ở một số trường khác nhau và cho một tín hiệu

Lê Thị Hòa – K33B-Hóa

18