BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

----------

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
CHUYÊN NGÀNH VI SINH VẬT HỌC

PHÂN LẬP CÁC DÒNG VI KHUẨN NỘI SINH
TRONG CÂY DIẾP CÁ (Houttuynia cordata T.)
Ở TỈNH CÀ MAU

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN
PGS.TS. NGUYỄN HỮU HIỆP

SINH VIÊN THỰC HIỆN
VÕ CHÍ MẢI
MSSV: 3113728
Lớp: Vi Sinh Vật Học K37

Cần Thơ, Tháng 7/2014


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

----------

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

CHUYÊN NGÀNH VI SINH VẬT HỌC

PHÂN LẬP CÁC DÒNG VI KHUẨN NỘI SINH
TRONG CÂY DIẾP CÁ (Houttuynia cordata T.)
Ở TỈNH CÀ MAU

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN
PGS.TS. NGUYỄN HỮU HIỆP

SINH VIÊN THỰC HIỆN
VÕ CHÍ MẢI
MSSV: 3113728
Lớp: Vi Sinh Vật Học K37

Cần Thơ, Tháng 7/2014


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 37 - 2014

Trường ĐHCT

PHẦN KÝ DUYỆT

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN

SINH VIÊN THỰC HIỆN

(Ký tên)

(Ký tên)


PGS.TS. Nguyễn Hữu Hiệp

Võ Chí Mải

PHÊ DUYỆT CỦA HỘI ĐỒNG BẢO VỆ LUẬN VĂN

…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………

Cần Thơ, ngày

tháng

năm 2014

CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG
(Ký tên)

Chuyên ngành Vi sinh vật học

ii

Viện NC & PT Công nghệ sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 37 - 2014


Trường ĐHCT

LỜI CẢM TẠ
Bốn năm học tập và nghiên cứu ở trường Đại học Cần Thơ, đây không phải là
thời gian quá dài trong cuộc đời nhưng nó là khoảng thời gian tôi không bao giờ quên
trong tâm trí của tôi. Đến nay tôi đã hoàn thành Luận văn tốt nghiệp Đại học, chuyên
ngành Vi Sinh Vật Học. Trong thời gian học tập và nghiên cứu, tôi luôn được sự hỗ
trợ và động viên từ gia đình, quý Thầy Cô và bạn bè giúp tôi vượt qua những khó
khăn, hoàn thành tốt luận văn tốt nghiệp.
Với lòng biết ơn sâu sắc, tôi xin chân thành gửi lời cảm ơn đến:
Cha mẹ và gia đình của tôi, họ luôn là nguồn động viên, an ủi khi tôi gặp khó
khăn.
Phó Giáo sư - Tiến sĩ Nguyễn Hữu Hiệp, Phó Trưởng Bộ môn Công nghệ Sinh
học Vi sinh vật, Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, Trường Đại học
Cần Thơ, Thầy hướng dẫn đề tài, đã tận tình truyền đạt kiến thức, kinh nghiệm học tập
và nghiên cứu khoa học.
Quý thầy cô của Viện NC & PT Công nghệ sinh học, đã truyền đạt những kiến
thức bổ ích cho việc hoàn thành luận văn và tìm kiếm việc làm sau này.
Cán bộ quản lí phòng thí nghiệm vi sinh vật, các anh chị cao học K19, các em
sinh viên K38, tập thể lớp Vi sinh vật K37 đã nhiệt tình giúp đỡ tôi để hoàn thành luận
văn thật tốt đẹp.
Cuối cùng, xin gửi lời chúc sức khỏe đến cha mẹ, người thân, quý Thầy Cô và tất cả
bạn bè của tôi.
Xin chân thành cảm ơn!

Cần thơ, ngày 17, tháng 11, năm 2014

Võ Chí Mải


Chuyên ngành Vi sinh vật học

iii

Viện NC & PT Công nghệ sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 37 - 2014

Trường ĐHCT

TÓM TẮT

Diếp cá là cây trồng phổ biến ở Việt Nam, chúng dùng như một loại rau hàng
ngày trong cuộc sống, một số nghiên cứu cho thấy cây Diếp cá có hoạt tính kháng
khuẩn và được ứng dụng để điều trị một số bệnh thông thường. Tuy nhiên việc nghiên
cứu tập đoàn vi khuẩn nội sinh trong cây Diếp cá chưa được nghiên cứu nhiều, vì vậy
đề tài phân lập vi khuẩn nội sinh trong cây Diếp cá đã thực hiện. Từ mẫu cây Diếp cá
được trồng tại Cà Mau, đã phân lập được 21 dòng vi khuẩn trên môi trường PDA
đặc. Đa số các dòng vi khuẩn này có dạng hình que, gram âm và có khả năng chuyển
động, ngoài ra chúng còn có các đặc tính cố định đạm, tổng hợp IAA và hòa tan lân.
Kết quả khảo sát khả năng cố định ammonium và tổng hợp IAA của vi khuẩn cho thấy
các dòng vi khuẩn này có thể tổng hợp được một lượng ammonium cao nhất ở ngày 2
sau khi chủng và giảm ở ngày 4 và 6 .Trong đó, dòng L1-DD1 có khả năng tổng hợp
lượng ammonium cao nhất (2,62 µg/mL). Nồng độ IAA được sinh ra nhiều nhất ở ngày
thứ 4 và giảm ở ngày thứ 6 là 4,49 µg/mL (do dòng L2-DD2 tổng hợp). Tám dòng vi
khuẩn có khả năng hòa tan lân khó tan, dòng R3-CM có khả năng hòa tan lân lớn nhất
lên đến 182,31% ở ngày thứ 6. Kết quả thử hoạt tính kháng khuẩn trên 2 chủng vi
khuẩn Escherichia coli và Aeromonas hydrophila cho thấy có 5 dòng có hoạt tính
kháng Escherichia coli, 4 dòng có tính kháng Aeromonas hydrophila và 2 dòng có khả

năng kháng được Escherichia coli và Aeromonas hydrophila là dòngL1-DD1 và R1DD2. Ba dòng vi khuẩn được nhận diện ở cấp độ loài bằng phương pháp giải trình tự
16S-rRNA. Dòng L1-DD1 được nhận diện là Bacillus megaterium strain ATCC 14581
(ở mức độ là 98%). Dòng R1-DD2 được nhận diện là Bacillus amyloliquefaciens
subsp. Plantarum strain FZB42 có độ tương đồng là 93% với và dòng T6-DD1 được
nhận diện là Bacillus aerius strain 24K có độ tương đồng 94%.
Từ khóa: Bacillus megaterium, Bacillus amyloliquefaciens subsp. Plantarum, Bacillus
aerius, cây Diếp cá, kháng khuẩn, tổng hợp amonium - IAA, vi khuẩn nội sinh.

Chuyên ngành Vi sinh vật học

iv

Viện NC & PT Công nghệ sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 37 - 2014

Trường ĐHCT

MỤC LỤC
Trang

PHẦN KÝ DUYỆT ..........................................................................................ii
LỜI CẢM TẠ ..................................................................................................iii
TÓM TẮT........................................................................................................ iv
MỤC LỤC ........................................................................................................ v
DANH SÁCH BẢNG ...................................................................................... ix
DANH SÁCH HÌNH ........................................................................................ x
CÁC TỪ VIẾT TẮT ......................................................................................xii
CHƯƠNG I: GIỚI THIỆU.............................................................................. 1

1.1

Đặt vấn đề ........................................................................................... 1

1.2

Mục tiêu đề tài .................................................................................... 2

CHƯƠNG II: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU ........................................................ 3
2.1

Tổng quan về Cà Mau ........................................................................... 3

2.1.1

Vị trí địa lý..................................................................................... 3

2.1.2

Điều kiện tự nhiên: ......................................................................... 4

2.2

Tổng quan về cây Diếp cá. .................................................................... 5

2.2.1

Tên gọi và phân loại........................................................................ 5

2.2.2


Mô tả: .............................................................................................. 6

2.2.3

Phân bố:.......................................................................................... 6

2.2.4

Thành phần hóa học:....................................................................... 6

2.2.5

Tác dụng dược lý: .......................................................................... 7

2.2.6

Tính vị, công năng: ......................................................................... 7

2.2.7

Công dụng: ..................................................................................... 7

2.3

Tổng quan về vi khuẩn nội sinh:........................................................... 7

2.3.1
2.4


Một số nhóm vi khuẩn nội sinh thường gặp: .................................. 9
Một số vi khuẩn gây bệnh ................................................................. 15

2.4.1

Vi khuẩn Escherichia coli............................................................ 15

2.4.2

Vi khuẩn Aeromonas hydrophila................................................. 17

2.5

Tình hình nghiên cứu cây Diếp cá trong và ngoài nước...................... 18

Chuyên ngành Vi sinh vật học

v

Viện NC & PT Công nghệ sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 37 - 2014

Trường ĐHCT

2.5.1

Trong nước .................................................................................. 18


2.5.2

Ngoài nước .................................................................................. 18

2.6

Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) ...................................... 20

2.6.1

Nguyên lý chung của kỹ thuật PCR ............................................. 20

2.6.2

Mồi (primer) sử dụng trong kỹ thuật PCR.................................... 21

2.6.3

Điện di gel agarose ...................................................................... 22

2.6.4

Phần mềm phân tích trình tự DNA được giải mã.......................... 24

CHƯƠNG III: PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU..... 25
3.1.

Phương tiện nghiên cứu...................................................................... 25

3.1.1.


Thời gian – Địa điểm thực hiện .................................................... 25

3.1.2.

Vật liệu ........................................................................................ 25

3.1.3.

Dụng cụ - Thiết bị ........................................................................ 25

3.1.4.

Hóa chất ....................................................................................... 26

3.2.

Phương pháp nghiên cứu.................................................................... 30

3.2.1

Thu thập và xử lý mẫu.................................................................. 30

3.2.2

Phân lập vi khuẩn nội sinh từ rễ, thân và lá của cây Diếp cá......... 30

3.2.3

Quan sát hình dạng, khả năng chuyển động và kích thước vi


khuẩn…................................................................................................ ….31
3.2.4

Nhuộm Gram vi khuẩn ................................................................. 33

3.2.5

Xác định khả năng tổng hợp NH4+ của một số dòng vi khuẩn đã

phân lập được ............................................................................................ 34
2.3.

Phương pháp xử lý số liệu:............................................................. 41

CHƯƠNG IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN............................................... 42
4.1

Kết quả phân lập và đặc điểm khuẩn lạc của các dòng vi khuẩn......... 42

4.1.1

Kết quả phân lập vi khuẩn............................................................ 42

4.1.2

Đặc điểm khuẩn lạc của các dòng vi khuẩn phân lập.................... 43

4.1.3


Hình dạng và khả năng di chuyển của 21 dòng vi khuẩn:............. 46

4.2

Khả năng cố định đạm của các dòng vi khuẩn đã phân lập dựa trên

lượng NH4+ (ammonium) tổng hợp được. .................................................... 49

Chuyên ngành Vi sinh vật học

vi

Viện NC & PT Công nghệ sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 37 - 2014

4.2.1

Trường ĐHCT

So sánh khả năng cố định đạm của các dòng vi khuẩn phân lập

được từ rễ. ................................................................................................. 50
4.2.2

So sánh khả năng cố định đạm của các dòng vi khuẩn phân lập

được từ thân............................................................................................... 51
4.2.3


So sánh khả năng cố định đạm của các dòng vi khuẩn phân lập

được từ lá. ................................................................................................. 52
4.2.4

So sánh khả năng cố định đạm của 6 dòng vi khuẩn triển vọng sống

nội sinh trong cây Diếp cá. ........................................................................ 53
4.3

Khả năng tổng hợp indol-3-acetic acid (IAA) của các dòng vi khuẩn

nội sinh phân lập từ cây Diếp cá ................................................................... 55
4.3.1

So sánh khả năng tổng hợp IAA của các dòng vi khuẩn phân lập

được từ rễ .................................................................................................. 55
4.3.2

So sánh khả năng tổng hợp IAA của các dòng vi khuẩn phân lập

được từ thân............................................................................................... 56
4.3.3

So sánh khả năng tổng hợp IAA của các dòng vi khuẩn phân lập

được từ lá .................................................................................................. 58
4.3.4


So sánh khả năng tổng hợp IAA của 8 dòng vi khuẩn triển vọng nội

sinh trong cây Diếp cá ............................................................................... 59
4.4

Khả năng hòa tan lân khó tan của các dòng vi khuẩn phân lập được. . 62

4.5

Khả năng kháng khuẩn của các dòng vi khuẩn được phân lập: ........... 64

4.5.1

Khả năng kháng khuẩn với vi khuẩn Escherichia coli .................. 64

4.5.2

Khả năng kháng khuẩn với vi khuẩn Aeromonas hydrophila ....... 66

4.6

Kết quả nhận diện một số dòng vi khuẩn bằng kỹ thuật PCR ............. 69

CHƯƠNG V: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ............................................... 72
5.1

Kết luận.............................................................................................. 72

5.2


Đề nghị ............................................................................................ 72

TÀI LIỆU THAM KHẢO.............................................................................. 73
Tiếng việt:..................................................................................................... 73
Tiếng Anh..................................................................................................... 75
Trang web:.................................................................................................... 84
Chuyên ngành Vi sinh vật học

vii

Viện NC & PT Công nghệ sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 37 - 2014

Trường ĐHCT

PHỤ LỤC………………………………………………………………………...
PHỤ LỤC 1: KẾT QUẢ HÀM LƯỢNG NH4+ CỦA 21 DÒNG VI KHUẨN.
PHỤ LỤC 2: ĐƯỜNG CHUẨN NH4+ CỦA 3 NGÀY ĐO.
PHỤ LỤC 3: KẾT QUẢ THỐNG KÊ HÀM LƯỢNG NH4+ CỦA 21 DÒNG VI
KHUẨN.
PHỤ LỤC 4: KẾT QUẢ THỐNG KÊ HÀM LƯỢNG NH4+ CỦA CÁC DÒNG VI
KHUẨN Ở RỄ.
PHỤ LỤC 5: KẾT QUẢ THỐNG KÊ HÀM LƯỢNG NH4+ CỦA CÁC DÒNG VI
KHUẨN Ở THÂN.
PHỤ LỤC 6: KẾT QUẢ THỐNG KÊ HÀM LƯỢNG NH4+ CỦA CÁC DÒNG VI
KHUẨN Ở LÁ.
PHỤ LỤC 7: KẾT QUẢ THỐNG KÊ HÀM LƯỢNG NH4+ CỦA CÁC DÒNG VI

KHUẨN TRIỂN VỌNG.
PHỤ LỤC 8: KẾT QUẢ HÀM LƯỢNG IAA CỦA CÁC DÒNG VI KHUẨN
PHỤ LỤC 9: ĐƯỜNG CHUẨN IAA CỦA 3 NGÀY ĐO.
PHỤ LỤC 10: KẾT QUẢ THỐNG KÊ KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP IAA
CỦA 21 DÒNG VI KHUẨN.
PHỤ LỤC 11: KẾT QUẢ THỐNG KÊ HÀM LƯỢNG IAA CỦA CÁC DÒNG VI
KHUẨN Ở RỄ.
PHỤ LỤC 12: KẾT QUẢ THỐNG KÊ HÀM LƯỢNG IAA CỦA CÁC DÒNG VI
KHUẨN Ở THÂN
PHỤ LỤC 13: KẾT QUẢ THỐNG KÊ HÀM LƯỢNG IAA CỦA CÁC DÒNG VI
KHUẨN Ở LÁ
PHỤ LỤC 14: KẾT QUẢ THỐNG KÊ HÀM LƯỢNG IAA CỦA CÁC DÒNG VI
KHUẨN TRIỂN VỌNG.
PHỤ LỤC 15: KẾT QUẢ THỐNG KÊ HIỆU SUẤT HÒA TAN LÂN CỦA CÁC
DÒNG VI KHUẨN.
PHỤ LỤC 17 : KẾT QUẢ THỐNG KÊ KHẢ NĂNG KHÁNG VI KHUẨN A.
HYDROPHILA CỦA CÁC DÒNG VI KHUẨN NỘI SINH TRONG CÂY DIẾP
CÁ.
PHỤ LỤC 18: KẾT QUẢ TRÌNH TỰ NUCLEOTIDE CỦA CÁC DÒNG VI
KHUẨN ĐỊNH DANH.
Chuyên ngành Vi sinh vật học

viii

Viện NC & PT Công nghệ sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 37 - 2014

Trường ĐHCT


DANH SÁCH BẢNG
Trang
Bảng 1: Thành phần các chất trong phản ứng PCR................................................. 30
Bảng 2: Môi trường PDA....................................................................................... 30
Bảng 3: Môi trường NFb (g/l) (Kirchhof et al., 1997) ............................................ 30
Bảng 4: Thành phần dung dịch vi lượng............................................................... ..31
Bảng 5: Thành phần dung dịch Vitamin ............................................................... ..31
Bảng 6: Môi trường NBRIP đặc (Nautiyal, 1999) ................................................. .31
Bảng 7: Môi trường LB (Lauria Betani) .......................................................... …...31
Bảng 8: Nguồn gốc các dòng vi khuẩn phân lập trên môi trường PDA..….…….…44
Bảng 9: Đặc tính khuẩn lạc của vi khuẩn phân lập trên môi trường PDA.…...……..45
Bảng 10: Hình dạng, kích thước, khả năng chuyển động cùa các dòng vi khuẩn.....48
Bảng 11: Kết quả nhuộm Gram của 21 dòng vi khuẩn………………………......…49
Bảng 12: Kết quả giải trình tự của một số dòng triển vọng...……….…………......70

Chuyên ngành Vi sinh vật học

ix

Viện NC & PT Công nghệ sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 37 - 2014

Trường ĐHCT

DANH SÁCH HÌNH
Trang
Hình 1: Bản đồ hành chính tỉnh Cà Mau... ............................................................... 3

Hình 2: Cây Diếp cá (Houttuynia cordata T) ........................................................... 5
Hình 3: Mối liên hệ giữa thời gian và nhiệt độ trong một chu kỳ phản ứng PCR ............ 23
Hình4: Phản ứng màu của đường chuẩn NH4+ ……… . ………….………………..36
Hình 5: Phản ứng màu của đường chuẩn IAA…………..………………………….38
Hình 6: Sự phát triển của vi khuẩn tạo vòng pellicle trong môi trường NFb bán đặc
.…………….....……………………………………………………………….....…43
Hình 7: Hình ảnh một số khuẩn lạc phát triển trên môi trường PDA..…………...….47
Hình 8: hình ảnh nhuộm Gram của các dòng vi khuẩn phân lập…...………………50
Hình 9: Hàm lượng trung bình NH4+ của các dòng vi khuẩn phân lập từ rễ ………..51
Hình 10: Hàm lượng trung bình NH4+ của các dòng vi khuẩn phân lập từ thân.…….53
Hình 11: Hàm lượng trung bình NH4+ của các dòng vi khuẩn phân lập từ lá..……..54
Hình12: Hàm lượng trung bình NH4+ của các dòng vi khuẩn triển vọng..…….……55
Hình 13: Hàm lượng trung bình IAA của các dòng vi khuẩn phân lập từ rễ..….…...57
Hình 14: Hàm lượng trung bình IAA của các dòng vi khuẩn phân lập từ thân...…...59
Hình 15: Hàm lượng trung bình IAA của các dòng vi khuẩn phân lập từ lá…...…...60
Hình 16: Hàm lượng trung bình IAA của các dòng vi khuẩn triển vọng…...……….61
Hình 17: Vòng sáng halo của các dòng vi khuẩn phát triển trên môi trường NBRIP
đặc……………………………………………………………….…………………….63
Hình18: Hiệu suất hòa tan lân (E) của các dòng vi khuẩn nội sinh qua các ngày…..64
Hình 19: Khả năng kháng khuẩn của dòng T6-DD1 và R1-DD2 với vi khuẩn E.
Coli………………………………………………………………………………………………66
Hình 20: Khả năng của các dòng vi khuẩn phân lập được với E. Coli...…….….…..66
Hình 21: Khả năng kháng khuẩn của dòng R1-DD2 và L1-DD2 trên Aeromonas
hydrophila ……………………………………………………….…….………….…..67
Hình 22: Khả năng kháng khuẩn của các dòng vi khuẩn phân lập được với vi khuẩn
Aeromonas hydrophila…………………………………………………….…….……68

Chuyên ngành Vi sinh vật học

x


Viện NC & PT Công nghệ sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 37 - 2014

Trường ĐHCT

Hình 23: Phổ điện di các dòng vi khuẩn với cặp mồi 16S-rRNA …………………70

Chuyên ngành Vi sinh vật học

xi

Viện NC & PT Công nghệ sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 37 - 2014

Trường ĐHCT

CÁC TỪ VIẾT TẮT
BLAST

Basic Local Alignment Search Tool

DMSO

Dimethyl sulfoxide


DNA

Deoxyribo Nucleic Acid

dNTP

deoxyribonucleotide triphosphates

ĐBSCL

Đồng bằng sông Cửu Long

ĐK

Đường kính

EAC

Ehrlich Ascites Carcinoma

EAEC

Enteroaggregative E. coli

EHEC

Enterohemorrhagic E. coli

EIEC


Enteroinvasive E. coli

EPEC

Enteropacthogenic E. coli

ETEC

Enterotoxigenic E. coli

IAA

Indole – 3 – Acetic Acid

LB

Luria - Bertani

MEWC

Methanolic Wedelia chinensis

NBRIP

National Botanical Research Institute's phosphate

Nfb

nitrogen-free semisolid malate


OD

Optical Density

PCR

Polymerase Chain Reaction

PDA

Potato dextrose agar

rRNA

ribosomal ribonucleic acid

VKNS

Vi khuẩn nội sinh

Chuyên ngành Vi sinh vật học

xii

Viện NC & PT Công nghệ sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 37 - 2014

Trường ĐHCT


CHƯƠNG 1
GIỚI THIỆU
1.1

Đặt vấn đề
Trong thiên nhiên có rất nhiều cây có chất kháng sinh và nguồn dược liệu của

Việt Nam thì vô cùng phong phú, theo số liệu thống kê gần đây ở nước ta có hơn 3.800
loài cây làm thuốc trên tổng số hơn 10.600 loài thực vật. Hàng năm cả nước sử dụng
hơn 50.000 tấn cây dược liệu (htt://duoclieu.net/caythuocvn.html. ngày 19/06/2014),
trong đó có nhiều cây thuốc có tính kháng khuẩn đã được y học dân gian sử dụng từ lâu.
Chúng thường là những cây cỏ quen thuộc, mọc hoang dại hay trồng ngay trong vườn
nhà.
So sánh với kháng sinh tổng hợp, có thể thấy các cây thuốc dược liệu có chất
kháng sinh nhưng hiệu lực kháng khuẩn không mạnh bằng kháng sinh tổng hợp. Tuy
vậy chất kháng sinh từ cây dược liệu có những ưu điểm mà chất kháng sinh tổng hợp
không có. Một trong những vấn đề đó là hiện tượng quen thuốc, kháng thuốc và loạn
khuẩn do tình trạng sử dụng chất kháng sinh bị lạm dụng, tuy nhiên chất kháng sinh có
nguồn gốc từ thực vật thì các nhà khoa học chưa thấy điều này. Kháng sinh từ thực vật
rất bền vững và dễ hòa tan trong nước, nên có thể dung dưới dạng thuốc sắc là dạng bào
chế đơn giản và thông dụng nhất. Chính vì vậy, gần đây người ta chú ý nhiều đến kháng
sinh thực vật và có xu hướng trở lại với cây thuốc hoặc sản phẩm có nguồn gốc tự
nhiên.
Nhiều nghiên cứu sản xuất cây dược liệu có tính kháng khuẩn như cây Sài đất
(Wedelia chinensis M.), cây Diếp cá (Houttuynia cordata T.), cây Diệp Hạ Châu
(Phyllanthus urinaria L.)… đã được nghiên cứu chứng tỏ chúng có hoạt tính kháng
khuẩn nhờ chúng có chứa tinh dầu là các nhóm aldehyde và các dẫn xuất ceton như
methyl n-nonyl ceton, L-decanal, L-dodecanal. Nhóm terpen bao gồm các chất α pinen,
camphen,… Có tác dụng diệt các vi khuẩn Streptococcus pneumonia, Staphylococcus

aureus, Shigella, Salmonella, E. coli (Đỗ Tất Lợi, 2004; Shu-Chen et al., 2008).
Tuy nhiên, việc nghiên cứu tập đoàn vi sinh vật nội sinh ở cây dược liệu chưa
được quan tâm nhiều. Do đó việc nghiên cứu tập đoàn vi sinh vật hữu ích này để phát
triển cây dược liệu có hoạt tính kháng khuẩn hiệu quả hơn sẽ mang nhiều ý nghĩa quan
trọng trong giai đoạn hiện nay.

Chuyên ngành Vi sinh vật học

1

Viện NC & PT Công nghệ sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 37 - 2014

Trường ĐHCT

1.2
Mục tiêu đề tài
Phân lập và khảo sát được một số đặc tính tốt như tính kháng khuẩn, khả năng
tổng hợp đạm, IAA và hòa tan lân của các dòng vi khuẩn sống nội sinh trong cây Diếp
cá ở tỉnh Cà Mau.

Chuyên ngành Vi sinh vật học

2

Viện NC & PT Công nghệ sinh học



Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 37 - 2014

Trường ĐHCT

CHƯƠNG II
LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU

2.1

Tổng quan về Cà Mau
2.1.1

Vị trí địa lý

Cà Mau là tỉnh ven biển nằm ở cực nam tổ quốc Việt Nam và nằm trong các tỉnh
thuộc khu vực vùng Đồng bằng sông Cửu Long, nằm ở tọa độ từ 8o30’ – 9o10’ vĩ Bắc
và 104o80’- 105o5’ kinh Đông , Cà Mau với ba mặt giáp biển, phía Đông giáp với biển
Đông, phía Tây và phía Nam giáp với vịnh Thái Lan, phía Bắc giáp với hai tỉnh Bạc
Liêu và Kiên Giang, vùng biển của Cà mau rộng lớn với chiều dài 254 km, tiếp giáp với
3 nước như Thái Lan, Malaysia, Indonesia và là trung tâm vùng biển của thế giới ở
Đông Nam Á.
Diện tích tự nhiên của tỉnh Cà Mau là 5.329 km2 chiếm 15,3% diện tích cả nước, dân số
trên 17 triệu người, đây là vùng giàu tiềm năng phát triển.
Theo:

/>
(truy

cập


29/05/2014).
(truy cập 29/05/2104).

Hình 1: Bảng đồ tỉnh Cà Mau
(Nguồn: ngày 17/06/2014).

Chuyên ngành Vi sinh vật học

3

Viện NC & PT Công nghệ sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 37 - 2014

2.1.2

Trường ĐHCT

Điều kiện tự nhiên:

Cà Mau là vùng đất thấp thường xuyên bị ngập nước, khí hậu của Cà Mau đặc
trưng của khí hậu nhiệt đới gió mùa cận xích đạo với nền nhiệt độ cao vào loại trung
bình trong các tỉnh đồng bằng sông Cửu Long, nhiệt độ trung bình hàng năm là 26,5oC.
Cà Mau có hai mùa rõ rệt là mùa mưa và mùa khô, mùa mưa từ tháng 5 đến tháng 11,
mùa khô từ tháng 12 đến tháng 4 năm sau, lượng mưa trung bình là 165 ngày mưa/năm
với 2.360 mml, độ ẩm trung bình hàng năm là 85,6%.
Chế độ thủy triều ở khu vực tỉnh Cà Mau chịu tác động trực tiếp của chế độ bán
nhật triều không đều ở biển Đông và chế độ bán nhật triều không đều ở biển Tây, biên
độ triều ở biển Đông tương đối lớn khoảng 300-350 cm vào các ngày triều cường.

Chế độ thủy văn của hệ thống kênh rạch chịu ảnh hưởng của chế độ thủy triều
quanh năm, Cà Mau có hệ thống kênh rạch dày đặc, tổng chiều dài của hệ thống kênh
rạch lên tới 7000km chiếm 4% diện tích tự nhiên của tỉnh.
Tài nguyên đất đai, Cà Mau có các nhóm đất chính sau:
Nhóm đất mặn có diện tích 208,496 ha chiếm 40% diện tích đất tự nhiên, đất
mặn phân bố chủ yếu các huyện Đầm Dơi, U Minh, Trần Văn Thời, Tp Cà Mau, Cái
Nước, Ngọc Hiển,Thới Bình. Do đây là vùng đất mặn cùng với hiện tượng biển lấn nên
các vùng bị nhiễm mặn chủ yếu là nuôi trồng thủy sản, một số vùng như U Minh, Trần
Văn Thời có thể kết hợp một vụ lúa một vụ tôm khi mùa mưa tới.
Đất phèn có diện tích 271,926 ha chiếm 52,18% đất tự nhiên, phân bố chủ yếu
các huyện Thới Bình, U Minh, Trần Văn Thời.
Nhóm đất phèn nhiễm mặn phân bố chủ yếu ở những vùng ven biển.
Ngoài các loại đất trên còn có nhóm đất than bùn, với diện tích khoảng 8.000 ha
phân bố U Minh, Trần Văn Thời và nhóm đất bãi bồi với diện tích 15.488 ha phân bố
các huyện Ngọc Hiển và Cái Nước.
Theo; />anh?view=introduction&provinceId=1341 (truy cập 01/06/2014).

Chuyên ngành Vi sinh vật học

4

Viện NC & PT Công nghệ sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 37 - 2014

2.2

Trường ĐHCT


Tổng quan về cây Diếp cá.
2.2.1

Tên gọi và phân loại

-

Cây Diếp cá còn có tên là cây Giấp cá, Lá giấp, Ngư tinh thảo.

-

Tên khoa học là Houttuynia cordata Thunb. Saururaceae.

-

Tên tiếng Anh là heartleaf (lá hình tim) hay lizardtail (đuôi thằn lằn) (Võ Văn
Chi, 2004).

-

Giới Thực vật (Plantae)

-

Ngành Ngọc lan (Magnoliophyta)

-

Lớp Ngọc lan (Magnoliopsida)


-

Phân lớp Ngọc lan (Magnoliidae)

-

Bộ Hồ tiêu (Piperales)

-

Họ Lá giấp (Saururaceae)

-

Chi Diếp Cá (Houttuynia Thunb.)

-

Diếp Cá (Houttuynia cordata Thunb.) (Nguồn: Phạm Thành Hộ, 1999).


Hình 2: Diếp cá (Houttuynia cordata T)
(Hình chụp, ngày 07/06/2014)

Chuyên ngành Vi sinh vật học

5

Viện NC & PT Công nghệ sinh học



Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 37 - 2014

Trường ĐHCT

2.2.2 Mô tả:
Cây thảo, sống lâu năm, cao 20-40 cm. Thân ngầm mọc bò ngang trong đất, màu
trắng, hơi có lông, bén rễ ở các mấu. Thân đứng nhẵn, màu lục hoặc tím đỏ. Lá mọc so
le, hình tim, đầu nhọn, mặt trên màu lục sẵm, mặt dưới màu tím hơi có lông dọc theo
gân lá của cả hai mặt, cuống lá dài có bẹ.
Cụm hoa mọc ở ngọn thân thành bông dài 2-2,5cm, mang nhiều hoa màu vàng
nhạt. Toàn thân vò ra có mùi tanh như mùi cá. (Võ Văn Chi, 2004).
2.2.3

Phân bố:

Chi Houttuynia Thunb, chỉ có một vài loài diếp cá, phân bố ở vùng nhiệt đới và cận
nhiệt đới châu Á, từ Nhật Bản, Trung Quốc đến Việt Nam, Lào, Ấn Độ và các nước
Đông Nam Á khác. Ở Việt Nam, cây mọc hoang dại ở các tỉnh miền núi, trung du và
đồng bằng. Độ cao đến 1500 mét (Sa Pa). Cây còn trồng được nhiều nơi để làm rau và
làm thuốc.
Diếp cá thuộc loại ưa ẩm và hơi chịu bóng, thường mọc ở đất ẩm, cây sinh trưởng
gần như quanh năm, mạnh nhất là mùa xuân hè, có hoa quả hàng năm trên những cây
không bị ngắt ngọn và hái lá thường xuyên, có khả năng tái sinh mạnh từ thân rễ. Ở
vùng thị trấn Tam Đảo và núi Ngọc Linh, diếp cá mọc nhiều đến mức ảnh hưởng tới cây
trồng.
2.2.4

Thành phần hóa học:


Toàn thân cây Diếp cá có chứa tinh dầu. Thành phần chủ yếu là: Nhóm aldehyl và
các dẫn xuất ceton như methyl-n-nonyl ceton, 1-decanal, 1-dodecanal là những chất
không có tác dụng kháng khuẩn, chất có tác dụng kháng khuẩn là 3-oxododecanal.
Nhóm terpen bao gồm các chất: α-pinen, camphen, myrcen limonene, linalool, bornyl,
acetate, geraniol và caryophylen. Ngoài ra tinh dầu còn chứa acid caprinic,
laurinaldehyd, benzamid, acid hexadecanoic, acid decanoic, acid palmitic, acid linoleic,
acid oleic, acid stearic, aldehyd capric, acid clorogenic, lipid và vitamin K.
Từ lá diếp cá người ta đã phân lập được β – sitosterol, một alkaloid gọi là cordalin
và các flavonoid như afzelin, hyperin, rutin, isoquercitrin và quercitrin. (Đỗ Tất Lợi,
2004).

Chuyên ngành Vi sinh vật học

6

Viện NC & PT Công nghệ sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 37 - 2014

2.2.5

Trường ĐHCT

Tác dụng dược lý:

Theo Zhang Y et al., (2008) Diếp cá có khả năng diệt được Gonococcus (gây bệnh
lậu mủ) và ngăn cản sự phát triển của các siêu vi khuẩn cúm. Còn theo Kim et al.,
(2010) cây Diếp cá còn có khả năng ức chế sự phát triển của vi khuẩn E. Coli O157-H7.
Hoạt chất quercitrin có trong diếp cá có tác dụng lợi tiểu mạnh. Một số hoạt chất có

tác dụng điều trị loét dạ dày được phân lập từ cây diếp cá. Một chất sterol, tương tự
sitosterol phân lập từ thân rễ, kích thích tiết các chất kháng sinh từ một chủng Bacillus
tạo bào tử Gram dương.
2.2.6

Tính vị, công năng:

Diếp cá có vị chua cay, mùi tanh của cá, tính mát hơi có độc, có tác dụng thanh
nhiệt, giải độc, lợi tiểu, sát trùng.
2.2.7

Công dụng:

Diếp cá dung trị táo bón, trĩ, mụn nhọt, lở ngứa, trẻ con lên sởi, viêm phổi hoặc
phổi có mủ, đau mắt đỏ hoặc đau mắt đỏ do trực khuẩn mủ xanh, viêm ruột, kiết lỵ, bí
tiểu tiện, kinh nguyệt không đều. Còn dùng chữa sốt rét, sài giật trẻ em, đau răng, trâu
bò bị cắn.
Ở Trung Quốc, một số hợp chất kháng khuẩn đã được phân lập từ cây diếp cá và
bào chế thành thuốc viên và thuốc tiêm để trị bệnh nhiễm khuẩn.
Ở Ấn Độ, Trung Quốc, thân rễ diếp cá được ăn như rau, dùng sống hoặc nấu
chin. Ở Nhật Bản, thân rễ cây diếp cá có trong thành phần một số chế phẩm thuốc dùng
để chữa một số bệnh phụ nữ. Ở Trung Quốc, diếp cá còn dùng chữa bệnh khó tiêu và
làm thuốc bó những chỗ bị tổn thương để kích thích sự phát triển của xương. Ở Nepan,
thân rễ cây diếp cá có trong thành phần một số chế phẩm thuốc dùng để chữa một số
bệnh phụ nữ. Cả cây được coi là như thuốc làm mát, tiêu độc, chữa khó tiêu và điều
kinh. Lá được dùng trị bệnh lậu, bệnh về mắt, bệnh về da, trĩ.
2.3

Tổng quan về vi khuẩn nội sinh:
Vi khuẩn nội sinh là vi khuẩn trải qua phần lớn vòng đời trong cây trồng


(Quispel, 1992). Chúng cư trú ở trong nội mô của thực vật ký chủ, qua đó hình thành
mối quan hệ giữa vi khuẩn nội sinh với thực vật khác nhau như cộng sinh, hội sinh…
Từ vùng rễ, chúng xâm nhập vào mô thực vật xuyên qua vùng rễ theo 3 cách là: bám ở
bề mặt rễ và tìm cách chui vào rễ chính hay rễ bên (lateral roots), thông qua lông hút,
giữa các tế bào nhu mô rễ hay biểu bì rễ để sống nội sinh như: Azotobacter, Bacillus,
Chuyên ngành Vi sinh vật học

7

Viện NC & PT Công nghệ sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 37 - 2014

Beijerinckia,

Derxia,

Trường ĐHCT

Enterobacteriaeae

(Klebsiella,

Enterobacter,

Pantonae),

Pseudomonas, Alcaligenes, Azoarcus, Burkholderia, Campylobacter, Herbaspirillum

Gluconacetobacter, và Paenibacillus (Elmerich, 2007).
Tuy nhiên nó cũng có thể xâm nhập vào các mô xuyên qua khí khổng hay các vị
trí bị tổn thương của lá (Roos và Hattingh, 1983).Sau khi xâm nhập vào cây chủ, các vi
khuẩn nội sinh có thể tập trung tại vị ví xâm nhập hay phát tán khắp nơi trong cây đến
các tế bào bên trong, đi vào các khoảng trống gian bào hay vào trong hệ mạch (Zinniel
et al., 2002). Mật số của quần thể vi khuẩn nội sinh rất biến thiên, phụ thuộc chủ yếu
vào loài vi khuẩn và kiểu di truyền của cây chủ; nhưng cũng phụ thuộc vào giai đoạn
phát triển của cây chủ và các điều kiện môi trường (Pillay và Nowak, 1997; Tan et al.,
2003). Mặc dù vi khuẩn nội sinh tập trung hay tiếp cận các địa điểm mà chúng có khả
năng xâm nhập vào bên trong mô thực vật nhưng mật số tương đối thấp chỉ từ 1000 đến
100000 tế bào/gam mô thực vật (Hallmann, 2001), và chúng bắt buộc phải sinh sản một
số lượng lớn trước khi xâm nhập vào bên trong mô thực vật. Hurek et al, (1994) cho
rằng sự phân cắt hay sinh sản của vi khuẩn Azoarcus sp, được tìm thấy bên ngoài và bên
trong mô rễ lúa và cỏ Kallar.
Một số nhóm vi khuẩn nội sinh không gây hại hay gây bệnh cho cây chủ, mà trái
lại chúng có thể thúc đẩy sự phát triển của cây trồng bằng cách sản xuất các chất kích
thích sự sinh trưởng thực vật và sự cố định đạm từ không khí (Sturz et al., 2000), còn
theo Kloepper et al. (1989), các giống Azospirillum, Gluconacetobacter và
Pseudomonas là những vi khuẩn cố định đạm nhưng nhờ vào khả năng tổng hợp auxin
của chúng nên cũng được xem là là vi khuẩn vùng rễ kích thích sinh trưởng. Hơn nữa,
một số dòng vi khuẩn nội sinh có thể cải thiện sự phát triển bệnh (Benhamou et al.,
1996) và kích thích sự chống chịu của cây trồng đối với sự tác động của các nhân tố vô
sinh và hữu sinh (Hallmann et al., 1997).
Vùng rễ là nơi tiếp giáp giữa rễ thực vật và đất, là nơi lắng động các chất hữu cơ,
và là nơi xuất phát của các môi trường sống và các nguồn sống khác nhau cho các vi
sinh vật đất. Thực vật có thể thay đổi vùng rễ của chúng nhờ sự hấp thu các chất dinh
dưỡng, độ ẩm và oxy từ vùng rễ; và các chất do rễ tiết ra (El-Shatnawi và Makhadmeh,
2001). Đặc tính quan trọng của các dịch rễ là có tỉ lệ C/N cao nên có thể đẩy mạnh sự
phong phú của các vi khuẩn cố định đạm trong vùng rễ (Döbereiner, 1974). Ngược lại,
vi sinh vật vùng rễ có thể ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng của cây do sự tác động

Chuyên ngành Vi sinh vật học

8

Viện NC & PT Công nghệ sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 37 - 2014

Trường ĐHCT

của chúng đến giá trị của các chất dinh dưỡng, sự phát triển và hình thái của rễ (Rovira
et al., 1983; Harari et al., 1988). Nhờ sự đa dạng của cây trồng và sự đa dạng của vùng
rễ nên các nhà khoa học đã khám phá được nhiều nhóm vi khuẩn nội sinh khác nhau từ
các loại cây khác nhau.
Các vi khuẩn vùng rễ làm tăng sự hấp thu dinh dưỡng và sự chuyển hóa các chất
trong các cây còn non (Rovira et al., 1983). Azospirillum brasilense đã thúc đẩy sự
phát triển lông rễ một cách mạnh mẽ và giảm sự kéo dài rễ ở Panicum miliaceum
(Harari et al., 1988). Còn theo các nghiên cứu của Hiệp et al. (2005) cho thấy khi sử
dụng vi khuẩn Azospirillum lipoferum chủng cho cây bắp dài hơn cây đối chứng không
chủng vi khuẩn nhờ đó mà cây có thể hấp thu dưỡng chất trong đất tốt hơn, đồng thời có
khả năng kháng hạn tốt hơn. Vi khuẩn nốt rễ sống trong rễ lúa giúp cây hấp thu nhiều
nitơ, lân, kali và sắt tăng từ 10 – 64% (Biswas et al., 2000). Chaintreuil et al. (2000) đã
phát hiện những vi khuẩn nốt rễ còn sống trong rễ lúa hoang (Oryza breviligulata) ở
vùng Châu Phi và chúng có nguồn gốc từ những cây điên điển (Sesbania sp.) mọc chen
lẫn với cây lúa hoang.
Như vậy vi khuẩn nốt rễ không những nội sinh ở cây họ đậu mà còn xâm nhiễm
vào cả cây hòa bản và cố định đạm sinh học cho cây.
Trong các nhóm vi khuẩn nội sinh, các nhà khoa học chú ý đến hai đặc điểm: khả
năng cố định đạm và khả năng chống lại bệnh hại, cả hai đặc điểm này có vai trò quan

trọng trong sản xuất nông nghiệp. Rediers et al.(2003) xác định một vài gen trong vi
khuẩn nội sinh cố định đạm Pseudomonas stutzeri A15 mà họ cho rằng có liên quan đến
việc quần tụ (colonization) của vi khuẩn chung quanh rễ lúa. Ngoài việc vi khuẩn nội
sinh có khả năng cố định đạm, các nhà khoa học còn nhận thấy chúng cũng có khả năng
chống lại dịch hại, ví dụ vi khuẩn Bacillus thuringiensis có khả năng sản xuất độc tố có
thể giết chết ấu trùng của nhiều loại côn trùng.
2.3.1

Một số nhóm vi khuẩn nội sinh thường gặp:

Hơn 300.000 loại thực vật được biết trên trái đất, mỗi loài có một hay nhiều loài
vi khuẩn nội sinh (Strobel et al., 2004). Tuy nhiên một số ít đươc nghiên cứu trước đây,
ngày nay các nhà khoa học đã phát hiện nhiều nhóm vi khuẩn nội sinh trong cây trồng
và cây hoang dại, bao gồm những nhóm sau:

Chuyên ngành Vi sinh vật học

9

Viện NC & PT Công nghệ sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 37 - 2014

2.3.1.1

Trường ĐHCT

Vi khuẩn Bacillus


Vi khuẩn Bacillus là những vi khuẩn Gram dương, có nội bào tử hình ovan có
khuynh hướng phình ra ở một đầu. Bacillus được phân biệt với các loài vi khuẩn sinh
nội bào tử khác bằng hình dạng tế bào hình que, sinh trưởng dưới điều kiện hiếu khí
hoặc kỵ khí không bắt buộc. Tế bào Bacillus có thể đơn hoặc chuỗi và chuyển động
bằng tiêm mao. Nhờ khả năng sinh bào tử nên vi khuẩn Bacillus có thể tồn tại trong
thời gian rất dài dưới các điều kiện khác nhau và rất phổ biến trong tự nhiên nên có thể
phân lập từ rất nhiều nguồn khác nhau như đất, nước, trầm tích biển, thức ăn, sữa,...
nhưng chủ yếu là từ đất nơi mà đóng vai trò quan trọng trong chu kỳ C và N.
Tất cả các loài thuộc chi Bacillus đều có khả năng dị dưỡng và hoại sinh nhờ sử
dụng các hợp chất hữu cơ đa dạng như đường, acid amin, acid hữu cơ,... Một vài loài có
thể lên men carbohydrat tạo thành glycerol và butanediol; hầu hết đều là loài ưa nhiệt
trung bình với nhiệt độ tối ưu là 30oC -45oC, nhưng cũng có nhiều loài ưa nhiệt với
nhiệt độ tối ưu là 65oC.
Đa số Bacillus sinh trưởng ở pH=7, một số phù hợp với pH= 9-10 như Bacillus
alcalophillus, hay có loại phù hợp với pH=2-6 như Bacillus acidocaldrius. Bacillus có
khả năng sản sinh enzyme ngoại bào (amylase, protease, cellulase…), do đó chúng được
ứng dụng rất nhiều trong công nghiệp, trong bảo vệ môi trường, …
Bacillus

có khả

năng sản sinh enzyme ngoại bào (amylase, protease,

cellulase…), do đó chúng được ứng dụng rất nhiều trong công nghiệp, trong bảo vệ môi
trường, …
Một số loài Bacillus thường gặp trong tự nhiên:
 Bacillus subtilis
Bacillus subtilis được nhà khoa học cùng thời với Robert Koch tên là Ferdinand
Cohn phát hiện và đặt tên năm 1872. Chúng được gọi là trực khuẩn cỏ khô vì nó phân
bố nhiều trong đất và đặc biệt là ở cỏ khô.

Chúng phân hủy pectin và polysaccarit ở mô thực vật và góp phần gây nên các
nốt trên củ khoai tây. Chúng sinh trưởng trên môi trường nguyên thủy xác định mà
không cần bổ sung thêm yếu tố kích thích sinh trưởng. Sự sinh trưởng phát triển của
chúng góp phần làm hỏng các nguyên liệu có nguồn gốc động thực vật. Chúng

Chuyên ngành Vi sinh vật học

10

Viện NC & PT Công nghệ sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 37 - 2014

Trường ĐHCT

không sinh trưởng trên thực phẩm có tính acid ở điều kiện tối ưu. Chúng là nguyên
nhân gây hư hỏng bánh mì.
Phần lớn thông tin chúng ta có về đặc điểm sinh học, hóa sinh, di truyền của các
vi khuẩn Gram dương khác đều nhận được từ việc nghiên cứu Bacillus subtilis.
Chúng là những vi khuẩn hình que, ngắn, nhỏ, kích thước (3 – 5) x 0,6 µm.
Chúng phát triển riêng rẻ như những sợi đơn bào ít khi kết chuỗi sợi. Khuẩn lạc khô,
không màu hay xám nhạt, có thể màu trắng hơi nhăn hoặc tạo ra lớp màng mịn lan trên
bề mặt thạch, mép nhăn hoặc lồi lõm nhiều hay ít, bám chặt vào môi trường thạch.
Bacillus subtilis sinh trưởng tốt nhất ở 36°C –50°C, tối đa khoảng 60°C. Là loại
ưa nhiệt cao. Bào tử của Bacillus subtilis cũng chịu được nhiệt khá cao. Bào tử hình bầu
dục, kích thước 0,6–0,9µm. Phân bố không theo nguyên tắc chặt chẽ nào, lệch tâm, gần
tâm nhưng không chính tâm. Chúng phát tán rộng rãi. Chúng là một thể nghỉ sinh ra
vào cuối thời kỳ sinh trưởng phát triển của vi khuẩn. Chúng không có khả năng trao đổi
chất nên có thể sống được vài năm đến vài chục năm, thậm chí đến 200-300 năm.

Vi khuẩn Bacillus subtilis được xem là vi sinh vật điển hình vì có những đặc tính
tiêu biểu không gây hại nên đây là một trong những vi khuẩn được sử dụng để sản xuất
enzyme và các hóa chất đặc biệt như: amylase, protease, inosine, ribosides, acid
amin, subtilisin. Ngoài ra nhờ khả năng bám dính proton lên bề mặt mà B. subtilis có
thể loại bỏ được chất thải phóng xạ như Thorium (IV) và Plutonium (IV). Đặc biệt, B.
subtilis được sử dụng trong lên men Natto của Nhật –một thực phẩm chức năng rất bổ
dưỡng cho sức khỏe (Ngô Tự Thành và Bùi Thị Việt Hà, 2007).
 Bacillus cereus
Đây là loại có mối quan hệ gần gũi với Bacillus anthracis, Bacillus
mycoides, Bacillus thuringiensis. Bào tử của chúng phát tán khắp nơi, trong đất, không
khí… Chúng thường sinh sôi nảy nở trên thực phẩm như cơm và có thể sinh ra độc tố
làm cho thực phẩm hư hỏng. Chúng được áp dụng để sản xuất kháng sinh.
Tế bào Bacillus cereus dày, kích thước (1 - 1,5) x (3 - 5)µm, có khi dài hơn, chúng
đứng riêng rẽ hay xếp chuỗi. Bào tử hình bầu dục kích thước 0,9 x (1,2 - 1,5)µm nằm
lệch tâm, tế bào chất của nó chứa các hạt và không bào (Lương Đức Phẩm, 2007).
Khuẩn lạc của chúng phẳng, khá khuếch tán, hơi lõm, trắng đục, mép lồi lõm (Nguyễn
Lân Dũng, 1983).
Chuyên ngành Vi sinh vật học

11

Viện NC & PT Công nghệ sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 37 - 2014

Trường ĐHCT

Theo nghiên cứu của Swetha Sunkar và C Valli Nachiyar (2011) trên cây bứa
mủ vàng (Garcinia xanthochymus), Bacillus cereus sống nội sinh có khả năng diệt các

chủng vi khuẩn E. coli, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Salmonella
typhi và Klebsiella pneumonia.
 Bacillus amyloliquefaciens
Bacillus amyloliquefaciens là một trực khuẩn gram dương có liên quan chặt chẽ
với các loài Bacillus subtilis. Hai loài này có nhiều gen tương đồng và xuất hiện tương
tự nhau không thể phân biệt được chúng một cách trực quan (Friest et al., 1987).
Bacillus amyloliquefaciens là trực khuẩn Gram dương, hình que, di động, kích
thước 0,7 - 0,9 x1,8 - 3m, nội bào tử (0,6 - 0,8 x 1 - 1,4m), là vi khuẩn hiếu khí hay
kỵ khí, phát triển tối ưu ở pH = 7, NaCl không cần thiết cho sự tăng trưởng. Nhiệt độ
giới hạn 15-50oC, nhiệt độ tối ưu 30 - 40oC ( />amyloliquefaciens.html, ngày 2/7/2014). Nó cũng tổng hợp protein barnase là một loại
kháng sinh tự nhiên ( ngày
2/7/2014).
B. amyloliquefaciens FZB42 được coi là PGPR do kiểm soát sinh học và sản xuất
IAA thúc đẩy tăng trưởng thực vật (Chen et al., 2007). Bacillus amyloliquefaciens được
tìm thấy để sản xuất hỗn hợp của acid lactic, isovaleric, isobutyric, acid acetic và cũng
được báo cáo là có khả năng hòa tan lân (Idriss et al., 2002). Sushil et al. (2013) cho
rằng dòng vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens sks_bnj_1 thúc đẩy sự tăng trưởng thực
vật và ảnh hưởng trên đất vùng rễ của đậu tương. Mẫu phân lập được xác định dựa vào
trình tự gen 16S - rRNA cho thấy 98,7% tương đồng với dòng vi khuẩn Bacillus
amyloliquefaciens sks_bnj_1 (AY 932.823) chúng có khả năng thúc đẩy sự tăng trưởng
ở cây đậu tương như: sản xuất siderophore, indole -3- acetic acid, deaminase ACC,
phosphatases, phytase, HCN, cellulase, hòa tan kẽm và đối kháng với các mầm bệnh
trong đất gây ra. Nghiên cứu này cho thấy rằng dòng vi khuẩn B. Amyloliquefaciens
sks_bnj_1 cải thiện hầu hết các thuộc tính vùng rễ, cây tăng trưởng, đồng hóa các chất
dinh dưỡng và năng suất của đậu tương.
 Bacillus polymyxa
Bacillus polymyxa là vi khuẩn Gram dương, có khuẩn lạc vô màu, phẳng hoặc lồi,
trơn, nhày, lan dần ra xung quanh, mép đôi khi có thùy. Tế bào của Bacillus polymyxa
Chuyên ngành Vi sinh vật học


12

Viện NC & PT Công nghệ sinh học