BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM
-------

-------

HÀ THỊ THU THỦY

NGHIÊN CỨU SỰ PHÁT TRIỂN IN VITRO
CỦA TẾ BÀO SÂU KHOANG (Spodoptera litura)

LUẬN VĂN THẠC SĨ

HÀ NỘI - 2014


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM
-------

-------

HÀ THỊ THU THỦY

NGHIÊN CỨU SỰ PHÁT TRIỂN IN VITRO

CỦA TẾ BÀO SÂU KHOANG (Spodoptera litura)

CHUYÊN NGÀNH

: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

MÃ SỐ

: 60420201

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
PGS.TS. LÊ VĂN TRỊNH
TS. NGUYỄN HỮU ĐỨC

HÀ NỘI - 2014


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan luận văn cao học này là công trình nghiên cứu của
riêng cá nhân tôi. Các tài liệu, số liệu được nêu trong luận văn là trung thực.
Các luận điểm và các kết quả nghiên cứu chưa từng được ai công bố trong bất
cứ công trình nào khác.
Tôi xin cam đoan rằng các thông tin trích dẫn trong luận văn đều đã
được chỉ rõ nguồn gốc.
Tác giả luận văn

Hà Thị Thu Thủy

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp


Page i


LỜI CẢM ƠN

Trong suốt quá trình học tập và hoàn thành luận văn này, tôi đã nhận
được sự hướng dẫn nhiệt tình, sự giúp đỡ quý báu của các thầy cô, các anh chị
nơi tôi công tác cũng như nơi học tập. Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc
tôi xin được bày tỏ lời cảm ơn chân thành nhất tới:
PGS.TS. Lê Văn Trịnh – Giám đốc Trung tâm đấu tranh Sinh học,
Viện Bảo vệ thực vật, một người thầy đáng kính trong công việc cũng như
trong cuộc sống, đã trực tiếp hướng dẫn và định hướng chuyên môn đồng thời
tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất cho tôi trong suốt quá trình công tác và hoàn
thành tốt luận văn tốt nghiệp này.
TS. Nguyễn Hữu Đức - Phó Trưởng Khoa Công nghệ Sinh học,
Trưởng Bộ môn Công nghệ sinh học Động vật – Học viện Nông nghiệp
Việt Nam, người thầy kính mến đã luôn quan tâm, giúp đỡ tận tình và chỉ bảo
cho tôi nhiều kiến thức và kinh nghiệm quý báu để tôi có thể hoàn thành được
luận văn này.
Để thực hiện được nghiên cứu này, tôi xin chân thành cảm ơn sự tài trợ
từ đề tài cấp Nhà nước: “Nghiên cứu sản xuất chế phẩm NPV-spl
(Nucleo Polyhedrosis Virus) từ tế bào gốc sâu khoang để phòng trừ sâu hại
cây trồng nông nghiệp”.
Tôi xin chân thành cảm ơn các anh, các chị trong nhóm đề tài, Trung
tâm Sinh học và Ban Giám đốc Viện Bảo vệ thực vật đã tạo điều kiện và nhiệt
tình giúp đỡ để tôi hoàn thành tốt luận văn này.
Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô trong hội đồng chấm luận văn

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp


Page ii


đã cho tôi những đóng góp quý báu để hoàn chỉnh luận văn này.
Cuối cùng, tôi xin cảm ơn các Thầy, Cô giáo; các chuyên viên Ban quản lý
đào tạo – Học viện Nông nghiệp Việt Nam đã ủng hộ, tạo điều kiện giúp đỡ tôi
hoàn thành các thủ tục cần thiết để bảo vệ thành công luận văn này.
Hà Nội, năm 2014
Tác giả luận văn

Hà Thị Thu Thủy

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page iii


MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN .................................................................................................. i
LỜI CẢM ƠN ....................................................................................................... ii
MỤC LỤC .....................................................................................................iv
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT .................................. viii
DANH MỤC CÁC BẢNG .................................................................................. vi
DANH MỤC CÁC HÌNH .................................................................................. vii
MỞ ĐẦU ............................................................................................................... 1
1.

Tính cấp thiết của đề tài nghiên cứu ..................................................... 1

2.


Mục tiêu của đề tài ............................................................................... 2

3.

Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài .............................................. 2

Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................... 3
1.1.

Cơ sở khoa học của đề tài nghiên cứu .................................................. 3

1.2.

Kết quả nghiên cứu ở nước ngoài ......................................................... 3

1.2.1. Mô bào và điều kiện nhân nuôi tạo vật liệu tế bào ................................ 3
1.2.2. Kỹ thuật bảo quản tế bào .................................................................... 12
1.2.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng phát triển sinh khối của tế bào ............14
1.3.

Kết quả nghiên cứu ở trong nước ....................................................... 23

Chương 2. VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .........25
2.1.

Vật liệu, đối tượng và địa điểm nghiên cứu ........................................ 25

2.1.1. Vật liệu, đối tượng và phạm vi nghiên cứu ......................................... 25
2.1.2. Địa điểm nghiên cứu .......................................................................... 26

2.2.

Nội dung nghiên cứu .......................................................................... 26

2.2.1. Nghiên cứu xác định mô bào và điều kiện nhân nuôi tạo vật liệu
tế bào khởi đầu ................................................................................... 26

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page iv


2.2.2. Nghiên cứu xác định mức độ ảnh hưởng của các yếu tố môi
trường nhân nuôi đến khả năng phát triển sinh khối tế bào ................. 26
2.3.

Phương pháp nghiên cứu .................................................................... 26

2.3.1. Các thí nghiệm thu thập và phân lập tế bào sâu khoang.................... 26
2.3.2. Nghiên cứu nhân nhân nuôi in vitro tế bào sâu khoang ..................... 30
2.3.3. Phương pháp đếm tế bào .................................................................... 32
2.3.4. Phương pháp xử lý số liệu .................................................................. 34
Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ..................................................... 35
3.1.

Phân lập mô bào và nhân nuôi sơ cấp tạo vật liệu khởi đầu ................ 35

3.2.

Nhân nuôi thứ cấp .............................................................................. 42


3.3.

Kiểm tra tế bào bằng kĩ thuật PCR ..................................................... 49

3.4.

Kỹ thuật bảo quản lạnh đông tế bào ở nhiệt độ - 800C ........................ 51

3.5.

Khả năng phát triển in vitro của tế bào sâu khoang ............................ 53

3.5.1. Môi trường nhân nuôi thích hợp ......................................................... 53
3.5.2. Nhiệt độ nhân nuôi thích hợp ............................................................. 55
3.5.3. Điều kiện pH môi trường nhân nuôi thích hợp ................................... 57
3.5.4. Tỷ lệ FBS bổ sung thích hợp cho nhân nuôi ....................................... 59
3.5.5. Xác định mật độ tế bào tối đa đạt được khi nhân nuôi trong các
điều kiện in vitro tối ưu ...................................................................... 63
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .............................................................................. 65
1.

Kết luận ............................................................................................. 65

2.

Đề nghị .............................................................................................. 66

TÀI LIỆU THAM KHẢO................................................................................ 67
PHỤ LỤC


Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page v


DANH MỤC CÁC BẢNG
STT
3.1

Trang

Tên bảng
Số lượng nguồn tế bào đã phân lập và nhân nuôi tạo thực liệu
dòng tế bào sâu khoang

35

3.2

Hàm lượng tế bào sau nhân nuôi sơ cấp mô tiền phôi

36

3.3

Hàm lượng tế bào sau nhân nuôi sơ cấp mô phôi

37


3.4

Hàm lượng tế bào sau nhân nuôi sơ cấp mô trứng

38

3.5

Hàm lượng tế bào từ các mẫu mô bào tiềm năng sau 10 ngày
nhân nuôi

3.6

39

Hàm lượng tế bào qua các chu kỳ nhân nuôi sơ cấp các mẫu tế
bào tiềm năng nhất

3.7

41

Hàm lượng tế bào của các nguồn thực liệu qua các chu kỳ nhân
nuôi thứ cấp

3.8

46

Ảnh hưởng của mật độ tế bào ban đầu cấy vào bình đến sự phát

triển sinh khối của tế bào

3.9

47

Hàm lượng tế bào sau khi nhân nuôi trở lại qua các tháng bảo
quản của mẫu tế bào 2.tp khi sử dụng các mức DMSO trong bảo
quản khác nhau

53

3.10

Mật độ tế bào khi nhân nuôi ở môi trường khác nhau

54

3.11

Hàm lượng tế bào ở các mức nhiệt độ nhân nuôi khác nhau

56

3.12

Ảnh hưởng của độ pH môi trường nhân nuôi đến sinh khối tế bào

58


3.13

Mật độ tế bào thu được khi bổ sung chất bổ trợ FBS với các tỷ lệ

3.14

khác nhau

61

Xác định mật độ tế bào thu được khi nhân nuôi in vitro

63

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page vi


DANH MỤC CÁC HÌNH
STT
1.1

Tên hình

Trang

Sơ đồ của một loài côn trùng cho thấy các mô có thể được sử
dụng cho sự phát triển của các dòng tế bào (Theo Lynn, 2001)


1.2

4

Số dòng tế bào được phát triển từ năm 1962 đến năm 2000 (Theo
Lynn, 2001)

9

2.1

Buồng đếm hồng cầu Neubauer

33

3.1

Tế bào sâu khoang sau 3 tuần nuôi cấy

40

3.2

Diễn biến hàm lượng tế bào trong sinh khối qua các chu kỳ nhân
nuôi sơ cấp

42

3.3


Tế bào biểu mô chiếm ưu thế

43

3.4

Tế bào tròn nhỏ, hơi dính hình thành một khối trôi nổi trên
môi trường

3.5
3.6

45

Các tế bào tròn nhỏ trôi nổi trên môi trường

45

10

Quần thể tế bào 2,0 x 10 tế bào/ml đã thu được trong 27 ngày từ
khi cấy vào bình nuôi 1,0 x 109 tế bào/ml. Sử dụng buồng đếm
hồng cầu để đếm mật độ tế bào

3.7

45

Diền biến hàm lượng tế bào qua các lần cấy chuyển trong nhân
nuôi thứ cấp


3.8

47

Ảnh hưởng của mật độ tế bào ban đầu cấy vào bình đến sự phát
triển sinh khối của tế bào

48

3.9

Ảnh điện di sản phẩm PCR các mẫu tế bào sâu khoang đã nhân nuôi

50

3.10

Cây phả hệ được xây dựng theo phương pháp Neighbor-Joining

50

3.11

Hàm lượng tế bào ở các môi trường nhân nuôi khác nhau

55

3.12


Mật độ tế bào ở các mức nhiệt độ nhân nuôi khác nhau

57

3.13

Diễn biến mật độ tế bào sâu khoang khi nhân nuôi ở các mức pH
khác nhau

3.14

59

Mật độ tế bào sâu khoang khi nhân nuôi trong môi trường có bổ
sung FBS với các tỷ lệ khác nhau

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

62
Page vii


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
STT

Tên viết tắt

1

%


Phần trăm

2

0

độ C

C

Tên viết đầy đủ

3

Cm

Centimet

4

Cs

cộng sự

5

DMSO

Dimethyl Sulfoxide


6

Excell

Excell 420-14419C

7

FBS

Fetal Bovine Serum

8

G

Gram

9

Kg

Kilogam

10

KTCN

11


Ml

Mililit

12

µl

Microlit

13

NPV

Nucleo Polyhedrosis Virus

14

PBS

Phosµphate Buffered Saline

15

Spl

Spodoptera litura

16


Schneider

Schneider S9895

17

TC-100

18

TNM-FH

Kỹ thuật công nghệ

TC-100 T3160
TNM-FH T3285

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page viii


MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của đề tài nghiên cứu
Sâu khoang (Spodoptera litura) là một đối tượng sâu hại quan trọng
trên các loại rau màu. Để phòng trừ sâu hại này, người nông dân thường phun
thuốc hóa học bảo vệ thực vật với liều lượng cao định kỳ 7 - 10 ngày/lần.
Hiện trạng sử dụng thuốc quá mức đã làm dư lượng thuốc hóa học độc hại lưu
tồn trong sản phẩm thường cao gấp 1,5 - 4,2 lần so với mức dư lượng cho

phép. Gây độc hại đáng kể đối với sức khỏe người sản xuất và tiêu dùng sản
phẩm, gây ô nhiễm môi trường và làm tổn hại đến quần thể các loài có ích
trên đồng ruộng.
Việc sử dụng các chế phẩm trừ sâu sinh học bằng cách sử dụng tác
nhân vi rút NPV (Nucleo polyhedrosis virus) chuyên tính với sâu khoang có
hiệu quả cao trong phòng trừ sâu hại cây trồng nông nghiệp. Tuy nhiên, vi rút
NPV chỉ có thể sinh trưởng và phát triển trong mô tế bào sống, vì vậy sản
xuất chế phẩm vi rút NPV khó thực hiện với qui mô công nghiệp để phòng
chống sâu hại hiệu quả.
Lâu nay, việc sản xuất NPV vẫn tiến hành theo phương pháp thủ công
với qui mô nhỏ hẹp. Bằng cách nuôi sâu sống số lượng lớn, sau đó nhiễm vi
rút NPV của loài sâu tương ứng, rồi nghiền lọc và đem ra sử dụng (Nguyễn
Văn Cảm và Cs., 1996). Theo cách này thì sản xuất chế phẩm NPV để trừ sâu
hại khó có thể thực hiện, vì để nuôi được số lượng lớn một loài sâu hại phục
vụ sản xuất chế phẩm là một vấn đề hết sức khó khăn và phải có đủ nhà
xưởng, trang thiết bị.
Để khắc phục những hạn chế nói trên, các nước như: Mỹ, Hà Lan,
Canada, Đức, Trung Quốc, Ấn Độ, v.v. đã ứng dụng công nghệ nhân nuôi tế
bào côn trùng để sản xuất các loại chế phẩm NPV với qui mô công nghiệp. Vì
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 1


vậy, đã và đang sản xuất, cung cấp cho thị trường nhiều loại chế phẩm NPV
có hiệu lực cao trong phòng trừ sâu hại. Tuy nhiên, ở Việt Nam việc nghiên
cứu phát triển chế phẩm NPV trên cơ sở ứng dụng kỹ thuật công nghệ nhân
nuôi tế bào côn trùng vẫn là vấn đề mới và chưa được thực hiện nhiều ở các
cơ quan nghiên cứu.
Xuất phát từ những yêu cầu thực tế trên chúng tôi tiến hành đề tài:

“Nghiên cứu sự phát triển in vitro của tế bào sâu khoang (Spodoptera litura )”.
2. Mục tiêu của đề tài
Nghiên cứu phân lập và xác định mức độ tác động của các yếu tố có
ảnh hưởng đến khả năng nhân nuôi thành công tế bào sâu khoang, nhằm
phục vụ phát triển chế phẩm sinh học vi rút để phòng trừ sâu hại cây trồng
nông nghiệp.
3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
+ Ý nghĩa khoa học
Thực hiện đề tài sẽ góp phần nâng cao năng lực nghiên cứu về tế bào
côn trùng. Đặc biệt là nắm vững về khả năng phát triển của tế bào động vật
nói chung và tế bào côn trùng nói riêng. Xác định được các mô tế bào có thể
nhân nuôi, dần từng bước xây dựng ngân hàng dòng tế bào côn trùng ở Việt
Nam, làm cơ sở để phục vụ cho các nghiên cứu khoa học cơ bản và khoa học
ứng dụng về lĩnh vực nuôi cấy tế bào ở nước ta.
Việc nghiên cứu nhân nuôi tế bào của các loài côn trùng và phát triển
các kỹ thuật công nghệ nhân sinh khối tế bào côn trùng còn góp phần phục vụ
nghiên cứu giám định bệnh lý côn trùng ở Việt Nam.
+ Ý nghĩa thực tiễn
Các kết quả nghiên cứu nhân nuôi tế bào sẽ góp thêm tư liệu nhằm phát
triển sinh khối tế bào côn trùng, phục vụ sản xuất chế phẩm vi rút NPV để
phòng trừ sâu hại trên các cây trồng nông lâm nghiệp. Góp phần hạn chế sử
dụng thuốc trừ sâu hóa học độc hại, phục vụ sản xuất nông sản an toàn, chất
lượng cao cho tiêu dùng và xuất khẩu, bảo vệ sức khỏe người sản xuất, bảo
tồn các loài sinh vật có ích và an toàn môi trường đồng ruộng.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 2


Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Cơ sở khoa học của đề tài nghiên cứu
Trong mỗi loài sinh vật, để tồn tại và sinh trưởng, phát triển thì quá
trình hình thành các bộ phận cơ thể đều được duy trì dưới sự điều khiển của
gen mã hóa và tồn tại trong tế bào gốc. Đó là các tế bào có khả năng tự đổi
mới với các tính năng riêng biệt mới, có khả năng sinh ra các tế bào khác, có
khả năng phân chia liên tục trong quá trình nuôi cấy và có thể phát triển thành
các tế bào chuyên hóa trong các điều kiện môi trường thích hợp (Louise
Ainscough, 2009). Cũng như tế bào động vật nói chung, các dòng tế bào của
các loài côn trùng cũng thuộc nhóm Eukaryota, là tế bào của sinh vật có nhân
chuẩn, có màng nhân ngăn cách nhân với tế bào chất và trong nhân tế bào
phân tử DNA kết hợp với các protein tạo thành các sợi nhiễm sắc thể (Sills,
2005). Chúng được chia thành 2 nhóm cơ bản: Tế bào toàn năng (totipotent)
và tế bào vạn năng (pluripotent) bao gồm: tế bào mầm (còn gọi là nguyên
bào), tế bào phôi, tế bào đĩa mầm và tế bào tái sinh; Tế bào gốc đa năng
(multipotent) và tế bào đơn năng (unipotent), gồm: tế bào thần kinh, tế bào
máu và tế bào biểu mô ruột giữa (Phan Kim Ngọc và Cs., 2010). Việc phân
lập và xác định kỹ thuật nhân nuôi các mô tế bào này sẽ có ý nghĩa to lớn
phục vụ các mục đích khác nhau trong khoa học và thực tiễn đời sống con
người.
1.2. Kết quả nghiên cứu ở nước ngoài
1.2.1. Mô bào và điều kiện nhân nuôi tạo vật liệu tế bào
1.2.1.1. Các loại mô bào có thể phân lập để nhân nuôi
Theo tổng kết của Guy Smagghe (2009) buồng trứng là những mô đầu
tiên được sử dụng và được sử dụng chung cho nuôi cấy tế bào trong suốt thập
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 3


kỉ 1960 và 1970, đặc biệt với các loài thuộc bộ Lepidoptera. Phôi cũng được

sử dụng làm nguồn để nuôi cấy tế bào. Lynn (2001) đã chỉ ra rằng gần một
nửa số dòng tế bào côn trùng đã được phân lập từ phôi. Kể từ khi phôi chứa
tất cả các loại tế bào mà sẽ phân hóa vào trong mô trưởng thành và mô nhộng,
những dòng tế bào từ những mô này có thể chứa lượng lớn tế bào có hình thái
đa dạng; Hemocytes thu được một cách dễ dàng nhưng không sinh trưởng dễ
dàng trong nuôi cấy vì Melanization là vấn đề chung trong nuôi cấy hemocyte
và việc sử dụng chất ức chế phenyloxidase (có tác dụng làm giảm gluthione,
cysteine hoặc phenylthiourea) là cách để khắc phục vấn đề này.

Hình 1.1: Sơ đồ của một loài côn trùng cho thấy các mô có thể được sử
dụng cho sự phát triển của các dòng tế bào (Theo Lynn, 2001)
Ngoài các mô trên thì tổng hợp các tế bào tiền thân của mô trưởng thành
(Imaginal discs) cũng là những mô quan trọng trong sự phát triển của tế bào côn
trùng bởi vì chúng được xác định phát triển để trở thành cấu trúc đặc biệt, chúng
không bao gồm những tế bào giống nhau; Mô mỡ là mô sinh lí quan trọng có
nhiều chức năng tương đương với việc duy trì sự sống của côn trùng. Nó cũng là
mô mục tiêu của nuôi cấy tế bào côn trùng. Tế bào mô mỡ cũng là nguồn cho
nhân tố sinh trưởng vì vậy việc đồng nuôi cấy với các mô khác có thể cải thiện
sinh trưởng tế bào, đặc biệt nuôi cấy sơ cấp; Ruột giữa là mô rất quan trọng và
có mối quan hệ trong điều khiển dịch hại và bệnh lí dịch hại.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 4


Theo tổng kết của Elanchezyan K. (2009); Lynn D.E. (2005), Sudeep
A.B., Mourya D.T và Mishra A.C. (2005), các dòng tế bào côn trùng có thể
phát triển từ các mô bào phân lập từ buồng trứng, mô phôi, mô bào hồng cầu,
từ tế bào đĩa mầm (gồm các tế bào tiềm năng), thể mỡ, mô bào ruột giữa,
tuyến sinh dục, buồng trứng trưởng thành, từ sâu non mới nở và các mô tế bào

khác như: tế bào mô biểu bì, hệ thần kinh, hệ nội tiết, hệ cơ. Các mô này được
tách vô trùng và đưa vào môi trường nuôi cấy tế bào có chứa huyết thanh bào
thai (FBS). Các tế bào sinh trưởng thành lớp đơn bám dính vào bề mặt bình
nuôi cấy.
Tuy nhiên, các tác giả này cũng chỉ rõ mức độ thành công đến mức nào
thì còn tùy thuộc vào từng đối tượng côn trùng cụ thể mà định hướng mô bào
có thể phát triển thành dòng tế bào của loài côn trùng đó. Để có thể phân lập và
tạo dòng tế bào của một loài côn trùng thành công đòi hỏi phải định hướng mô
bào tách chiết phù hợp, phải có tính kiên trì, các bước thao tác kỹ thuật trong
quá trình thực hiện phải đảm bảo tuyệt đối vô trùng và môi trường nuôi cấy
phải phù hợp với từng đối tượng côn trùng và mô bào phân lập để sử dụng.
Theo Elanchezyan K. (2009), một số loại mô bào chưa thành thục có thể
phân lập nhân nuôi, như: mô phôi, sâu non mới nở, mô mầm của trưởng thành
và tế bào trứng. Tuy nhiên, việc thành lập các dòng tế bào sử dụng các mô
chưa trưởng thành hoặc mô chưa biệt hóa thì dễ thành công hơn các mô
trưởng thành hoặc mô đã biệt hóa bởi vì chúng có tỉ lệ cao hơn tế bào gốc
trong chúng. Nhưng sự phát triển các dòng tế bào từ các mô bào thành thục lại
có tính ưu việt hơn vì 5 lý do:
1/ Nhận biết hình thái của nó dễ dàng hơn khi tiến hành phân lập,
2/ Dễ nhận biết sự sinh trưởng của tế bào khi nhân nuôi sơ cấp,
3/ Dễ dàng đánh giá được ảnh hưởng của thành phần môi trường đối
với sự sống sót của loại tế bào chuyên biệt khi nhân nuôi sơ cấp,
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 5


4/ Nhận biết được sự thay đổi hình thái tế bào khi nhân nuôi và
5/ Dễ thiết kế protein đánh dấu (marker protein) để xác định gen lạ.
Cũng theo Elanchezyan (2009), dòng tế bào Lepidoptera chủ yếu được

thiết lập để phục vụ lây nhiễm, sản xuất chế phẩm sinh học vi rút côn trùng,
sử dụng như một loại thuốc trừ sâu sinh học để kiểm soát côn trùng gây hại.
Các dòng tế bào được thành lập từ những bộ phận hoặc những mô khác nhau
như mô phôi, buồng trứng, tế bào mỡ, tế bào mầm trưởng thành, v.v ở các
giai đoạn phát triển khác nhau của côn trùng thuộc bộ Lepidoptera. Số lượng
lớn nhất mà các dòng tế bào được phân lập là từ mô phôi phân lập từ buồng
trứng (Lynn, 2001).
Ở Ấn Độ, phần lớn các dòng tế bào Lepidoptera đã được thành lập từ
mô buồng trứng tiếp theo là mô phôi. Theo tổng kết của Sudeep và Cs.
(2005), đến năm 2005 Ấn Độ đã phát triển được 8 dòng tế bào từ muỗi và 9
dòng tế bào từ các loài thuộc bộ Lepidoptera. Nhưng đến 2009, Ấn Độ đã
phát triển được 15 dòng tế bào từ bộ Lepidoptera phục vụ cho các mục tiêu
nghiên cứu và phát triển chế phẩm (Elanchezyan, 2009).
Riêng đối với loài sâu khoang (Spodoptera litura), qua các tài liệu thu
thập được cho thấy có 4 công trình công bố đã phát triển được dòng tế bào
phục vụ cho nghiên cứu và nhân nuôi sinh khối.
Kết quả công bố của Shih và Cs. (1997) thì dòng tế bào sâu khoang IBLSLO1A được phát triển từ mô phôi phân lập từ nhộng. Còn Pant và Cs. (2000)
phát triển dòng tế bào từ hồng cầu sâu khoang. Theo tổng hợp của Zhang và
Cs.(2008) thì dòng tế bào sâu khoang mang mã hiệu Sl-Zsu-1 do Xie và Cs.
(1988) phát triển từ trứng sâu khoang và được nhân nuôi tiếp tục từ năm 2002,
nhưng mãi đến năm 2005 mới đi sâu nghiên cứu một cách chi tiết và đã chọn
lọc, tạo được dòng tế bào sâu khoang chính thức mang mã hiệu SI-HP (Zhang
và Cs., 2008).
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 6


1.2.1.2. Điều kiện nhân nuôi tạo vật liệu tế bào
Theo Lynn (1996) để phát triển dòng tế bào côn trùng thường gặp phải

hai vấn đề đặc biệt khó khăn. Đầu tiên là kích thước côn trùng đa số rất nhỏ
dẫn đến việc mổ và tách lấy được mô bào mong muốn rất khó khăn. Vấn đề
thứ hai đó là đa số các loài côn trùng đều sống trong môi trường bẩn vì vậy
mẫu đưa vào nuôi cấy nếu không được khử trùng sạch sẽ dễ bị nhiễm khuẩn,
nấm, mycoplasma hoặc các loại vi rút dẫn đến mẻ nuôi cấy dễ bị thất bại hoàn toàn.
Theo tổng kết của Elanchezyan K. (2009), Granados R.R., Li và
Bonning (2007), Lynn D.E. (2002) và Sudeep A.B., Mourya D.T và Mishra
A.C. (2005), trong những năm đầu của thế kỷ 20 khoa học nghiên cứu về côn
trùng trong một số lĩnh vực nghiên cứu đã có những ý tưởng đầu tiên về việc
sử dụng tế bào côn trùng trong nuôi cấy in vitro như là một công cụ thí
nghiệm cho các nghiên cứu cơ bản khác. Theo tài liệu tổng hợp của Granados
R.R., Li và Bonning (2007), thí nghiệm nhân nuôi tế bào côn trùng in vitro
đầu tiên do Goldsmidt tiến hành vào năm 1915, ông đã nuôi cấy các phần mô
tách ra từ loài tằm Hyalophora cecropia. Sau đó, vào cuối những năm 1930,
W. Trager thực hiện một bước đột phá lớn bởi đã phát triển được một môi
trường nuôi cấy dựa trên những hiểu biết về tính chất vật lý và hóa học của tế
bào máu côn trùng (Trager, 1953).
Sau đó Wyatt (1956) đã phát triển một môi trường dựa trên phân tích
sinh hóa chi tiết của tế bào máu tằm và chứng minh môi trường này gây ra sự
tăng trưởng của tế bào từ mô buồng trứng của loài tằm Bombyx mori và đóng
góp vào sự tăng trưởng và duy trì sự sống sót của tế bào trong phòng thí
nghiệm trong thời gian dài đến ba tuần. Và gần 50 năm sau nghiên cứu đầu
tiên của Goldschmidt (1915), Grace (1962) đã nghiên cứu ra môi trường nuôi
cấy cùng với việc phân lập, nhân nuôi thành công dòng tế bào đầu tiên từ bộ
Lepidoptera do vậy dòng tế bào côn trùng đầu tiên được thành lập là bởi
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 7



Grace (1967), kể từ đó nhiều dòng tế bào khác nhau đã được thành lập, chủ
yếu là ở các bộ Diptera, Lepidoptera, Hemiptera và Orthoptera.
Khi bắt đầu nuôi cấy tế bào côn trùng, một phương pháp chung giống
như phương pháp duy trì nuôi cấy tế bào động vật đã được áp dụng cho nuôi
cấy tế bào côn trùng. Tuy nhiên, điều kiện cụ thể cần phải được thay đổi và có
tiêu chuẩn riêng đối với từng loài tùy thuộc vào mô chọn để nuôi cấy ban đầu,
môi trường nuôi cấy, chất dinh dưỡng bổ sung, pH, nhiệt độ nuôi, v.v.
(Freshney, 1987). Trong thời gian 30 năm từ năm 1962 đến 1990, các nhà
khoa học đã phát triển thành công khoảng 350 - 400 dòng tế bào côn trùng.
Cho đến năm 2000, đã phân lập thành công trên 500 dòng tế bào từ các loài
côn trùng khác nhau (Lynn, 2001).
Trong số 500 dòng tế bào được phân lập, có khoảng 80% các dòng tế
bào được phân lập từ các loài côn trùng thuộc bộ Lepidoptera và Diptera, chỉ
có khoảng 20% số dòng tế bào được phân lập từ các loài động vật không
xương sống khác. Việc phát triển dòng tế bào (chủng tế bào) để phục vụ cho
nhân nuôi sinh khối thường được tiến hành qua các bước: 1/ Lựa chọn và
phân lập; 2/ Nhân nuôi sơ cấp và làm thuần; 3/ Nhân nuôi thứ cấp phát triển
thực liệu dòng tế bào và đưa vào bảo quản để phục vụ cho việc nhân nuôi sinh
khối tế bào số lượng lớn.
Hiện nay, trong số 500 dòng tế bào được phân lập, thì các dòng tế bào
bộ Lepidoptera được sử dụng phổ biến nhất cho nghiên cứu với các mục đích
khác nhau là Sf9, Sf21 và BTI-Tn5B1-4. Dòng tế bào Sf9 và Sf21 được phân
lập từ mô bào buồng trứng của loài sâu xanh da láng Spodoptera frugiferda,
còn BTI-Tn5B1-4 được phân lập từ mô phôi của loài sâu đo xanh
Trichoplusia ni.
Theo Sardud-Din và Cs. (1996), trong nhân nuôi sinh khối tế bào từ các
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 8



tế bào gốc thì tế bào sẽ phân chia liên tục trong thời gian dài ở môi trường
thích hợp. Nếu mô tế bào phân lập không chứa tế bào gốc thì tế bào sẽ phát
triển chậm hoặc phát triển với tốc độ giảm dần và cuối cùng chúng không
phân chia tiếp mà sẽ tự chết dần (Granados và Cs., 2007).

Hình 1.2: Số dòng tế bào được phát triển từ năm 1962 đến năm 2000
(Theo Lynn, 2001)
Qua 25 năm nghiên cứu, Lynn (2001, 2002) đã mô tả các phương
pháp có hiệu quả để duy trì nhiều dòng tế bào côn trùng khác nhau. Các
phương pháp này giúp phân biệt giữa dòng tế bào bám dính một cách lỏng
lẻo hoặc không bám dính với các dòng tế bào bám dính và bám dính mạnh.
Từ đó đã tổng kết thành qui trình chung cho việc nhân sinh khối tế bào côn
trùng qua 11 công đoạn với các yêu cầu cụ thể khác nhau cho từng công
đoạn nhân nuôi.
Đến năm 2007, Granados và Cs. đã đưa ra một qui trình chung nhân
nuôi tế bào qui mô công nghiệp một cách khá chi tiết và đầy đủ. Qui trình chỉ
rõ từ khâu chuẩn bị các trang thiết bị cần thiết, chuẩn bị môi trường nhân
nuôi, điều khiển điều kiện môi trường nuôi cấy (nhiệt độ, pH và không khí,
v.v.), kỹ thuật bảo quản, v.v. Các tác giả này cũng nêu rõ 2 chỉ tiêu đánh giá
chất lượng nhân nuôi dựa trên kết quả tính tổng số tế bào có trong dịch thể,
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 9


mức độ biến động của tế bào dựa trên xác định số tế bào sống có được.
Như vậy, khi nhân nuôi đối với mỗi dòng tế bào của 1 loài côn trùng
cần thiết phải có sự nghiên cứu chi tiết để xác định rõ các yếu tố thích hợp
cho sự phát triển của tế bào, gồm: chủng loại môi trường, chất bổ sung, nhiệt

độ và pH môi trường nhân nuôi.
Theo Lynn (2001, 2002), một vấn đề quan trọng cần lưu ý trong nuôi
cấy tế bào động vật nói chung cũng như nuôi cấy tế bào côn trùng nói riêng
đó là việc kiểm soát lây nhiễm trong quá trình nhân nuôi in vitro tạo vật liệu
tế bào.
Dirk Vollenbroich đã chỉ ra rằng có 5 yếu tố liên quan đến việc không
nhận biết và khắc phục được tế bào nuôi cấy bị lây nhiễm, bao gồm: một là do
kỹ thuật thao tác không đúng và nhiễm từ nguồn thực liệu ban đầu; hai là
thường chỉ được nhận biết nhiễm qua kiểm tra cảm quan (độ đục, màu sắc của
môi trường nuôi cấy chuyển sang màu vàng, v.v.); ba là có khoảng 6% các mẻ
nuôi cấy tế bào bị nhiễm mà không thể nhận biết ngay được nên không kịp
khắc phục; bốn là không nhận biết được do có chất kháng sinh trong môi
trường nuôi cấy đã ức chế tạm thời vi khuẩn; năm là không có cách khắc phục
dẫn đến tế bào bị phá hủy. Theo đó nguồn nhiễm có thể là từ mô ban đầu chưa
sạch, nhiễm chéo trong quá trình nuôi cấy, do các dụng cụ phòng thí nghiệm,
môi trường, thuốc thử chưa vô trùng và do kĩ thuật viên thao tác.
Theo Lynn (1996) cách đơn giản để tránh nhiễm khuẩn là không sử
dụng kháng sinh trong nuôi cấy duy trì dòng tế bào. Trong khi điều này nghe
có vẻ mâu thuẫn thì lí do thật đơn giản. Nếu không có kháng sinh trong môi
trường, nếu nuôi cấy bị nhiễm khuẩn thì sự nhiễm vi khuẩn đó sẽ nhận biết
được ngay trong môi trường nuôi cấy giàu dinh dưỡng chỉ trong ít ngày nuôi
cấy. Điều này giúp kĩ thuật viên phát hiện sớm nhất có thể và nuôi cấy trở lại
để phục hồi tế bào bị nhiễm.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 10


Ngược lại, nếu nuôi cấy duy trì tế bào có kháng sinh có thể cấy chuyển
tế bào trong nhiều tuần hoặc nhiều tháng với mật độ nhiễm thấp mà không

phát hiện được. Điều đó có thể giải thích là do chất kháng sinh được sử dụng
liên tục sẽ làm chậm sự phát triển của vi khuẩn trong tế bào bị nhiễm mà mắt
thường không nhận biết được nhưng thực tế nuôi cấy đó đã bị nhiễm khuẩn.
Bằng cách đó, tất cả các tế bào nuôi cấy sẽ bị nhiễm khuẩn lan rộng và khi đó
cũng sẽ có ít hi vọng phục hồi.
Vì lý do nêu trên, Lynn (1996) cho rằng chỉ nên sử dụng kháng sinh
trong những thí nghiệm ngắn (những thí nghiệm mà tế bào không được sử
dụng lâu dài trong nuôi cấy duy trì) và nuôi cấy sơ cấp. Trong trường hợp
nuôi cấy sơ cấp, sau mỗi lần nhân sinh khối tế bào môi trường nuôi cấy cũ
được thay thế bằng môi trường mới có chất kháng sinh (thường sau lần cấy
chuyển thứ 5). Như thế tránh được hầu hết mọi sự nhiễm khuẩn.
Theo Lynn (1996) thì mối lo ngại chính khi nuôi cấy tế bào côn trùng
lại là việc tế bào bị nhiễm vi rút và mycoplasma. Để tránh nhiễm vi rút và
mycoplasma thì giải pháp tốt nhất đó là không bao giờ được sử dụng pipet hút
bằng miệng và môi trường, huyết thanh không chính hãng. Bên cạnh đó, ông
cũng khẳng định một lợi thế khi làm việc với tế bào côn trùng là rất nhiều các
chất gây nhiễm khi nuôi cấy tế bào động vật có xương sống phải đối mặt thì
lại không phải là một vấn đề với các tế bào côn trùng.
Ví dụ như, phần lớn mycoplasma trong phòng thí nghiệm thích nghi ở
370C nhưng nhiệt độ nuôi cấy tế bào côn trùng lại không thích hợp cho sự
tăng trưởng của mycoplasma (260C - 280C). Trong trường hợp nhiễm vi rút
thì nguồn gây nhiễm lớn nhất là huyết thanh. Vì đây thường là nguồn huyết
thanh từ trâu, bò, những huyết thanh thường sẽ không tái tạo trong côn trùng.
Tuy nhiên đây là ý tưởng hay để sàng lọc các nguồn gây nhiễm này. Trong
trường hợp là mycoplasma, một số thử nghiệm được tiến hành. Chúng bao
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 11



gồm các xét nghiệm tăng trưởng sử dụng mycoplasma môi trường nuôi cấy;
Hiện hình bằng thuốc nhuộm huỳnh quang (Hoechst 33258) hoặc đồng nuôi
cấy với 6-methylpurine - chất mà chuyển hóa mycoplasma để tạo thành các
thành phần độc hại.
Trong những phương pháp này phương pháp sử dụng thuốc nhuộm
Hoechst 33258 dường như hiệu quả nhất nhưng đòi hỏi phải có kính hiển vi
huỳnh quang để quan sát các DNA trong mycoplasma phát sáng sau khi
nhuộm. Việc phát hiện vi rút có thể được thực hiện có hiệu quả chỉ khi sử
dụng kính hiển vi điện tử, vì đây là những chất gây ô nhiễm bên trong tế bào
và mới quan sát được dưới kính hiển vi điện tử.
Để loại bỏ tất cả các nguồn gây nhiễm trong nuôi cấy tế bào côn trùng cần
phải kiểm tra vô trùng ở tất cả các giai đoạn nuôi cấy, mỗi tháng cho nuôi cấy
các dòng tế bào liên tục, mỗi tuần trong trường hợp phòng thí nghiệm bị nhiễm,
trước mỗi lần bảo quản và trong trường hợp gặp cùng một vấn đề với những kết
quả bị lặp đi lặp lại. Khi phát hiện nhiễm cần cô lập nuôi cấy bị nhiễm ngay lập
tức, ngay lập tức kiểm tra tế bào bảo quản và cô lập tất cả các mẫu bảo quản liên
quan đến mẫu nhiễm, khử trùng phòng thí nghiệm theo qui trình tiêu chuẩn và
loại bỏ ngay lập tức những tế bào không thể phục hồi thay thế.
1.2.2. Kỹ thuật bảo quản tế bào
Qua nghiên cứu, Lynn (2002) đã đề xuất một qui trình kỹ thuật để duy
trì thực liệu dòng tế bào côn trùng qua 17 bước tiến hành. Tác giả đã chỉ dẫn
các thao tác và các yêu cầu về môi trường, dụng cụ, nhiệt độ và cách làm một
cách khá chi tiết. Cũng theo tác giả này, thì nguồn thực liệu dòng tế bào có
thể bảo quản theo 3 cách khác nhau:
1/ Bảo quản ở nhiệt độ thấp: duy trì ổn định ở nhiệt độ bảo quản là 40C
- 50C và định kỳ hàng tháng phải tiến hành nhân nuôi phục hồi.
2/ Bảo quản trong nitơ lỏng: là phương pháp bảo quản lâu dài và rất ổn
định, nhưng trước khi bảo quản cần bổ sung vào môi trường bảo quản một số
thành phần trợ giúp như Glyceron hoặc DMSO để duy trì sức sống của tế bào
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp


Page 12


và hạn chế tế bào bị chết trong quá trình bảo quản.
3/ Bảo quản theo phương pháp lạnh đông trong nhiệt độ -700C bằng
cách: Tế bào 5 - 6 ngày tuổi được ly tâm để loại bỏ dịch môi trường nuôi cấy.
Sau đó, cho vào môi trường bảo quản chứa 10% Glycerol hoặc DMSO và đưa
vào các ống tuýp nhỏ 1 – 2 ml. Rồi đưa vào hộp bảo quản, tốt nhất là sử dụng
các hộp nhôm.
Qui trình KTCN nhân nuôi, bảo quản và duy trì lâu bền các dòng tế bào
cũng được nhiều tài liệu đề cập tới. Thậm chí, một số tài liệu trình bày một
cách chi tiết và đầy đủ các khâu KTCN cần thiết, kể cả phương pháp xử lý
cho những sai sót có thể xảy ra trong quá trình nhân nuôi, bảo quản và khi
đưa ra sử dụng sau bảo quản.
Trong lĩnh vực sinh học, theo Lynn (2002) thì nuôi cấy tế bào côn trùng
hiện nay thường được sử dụng trong sinh lý học côn trùng, sinh học phát
triển, bệnh lý, và sinh học phân tử. Vì những lĩnh vực này đã phát triển thành
một phương pháp chuẩn mực, do các kết quả nghiên cứu đa dạng của nhiều
nhà khoa học trong việc sử dụng các kỹ thuật khác nhau trong nuôi cấy tế bào
của các loài côn trùng khác nhau. Theo Elanchezyan K. (2009); Granados
R.R., Li và Bonning (2007), thì động vật chân đốt đã trở thành trung tâm thu
hút các nhà khoa học do tầm quan trọng của chúng trong nông nghiệp và y
học, chúng đóng một vai trò quan trọng như vật chủ trung gian hay vector của
tác nhân gây bệnh gây ra cho con người và động vật nuôi.
Nuôi cấy tế bào động vật không xương sống, đặc biệt dòng tế bào côn
trùng là một trong những công cụ giá trị nhất trong sinh học, trong công nghệ
sinh học, trong sinh học dược phẩm và nghiên cứu thuốc trừ sâu sinh học.
Việc phân lập các mô bào và nhân nuôi phát triển thành các dòng tế bào có ý
nghĩa to lớn để phục vụ cho nghiên cứu cơ bản cũng như nghiên cứu ứng

dụng và thương mại. Điều này hoàn toàn đúng với dòng tế bào côn trùng
thuộc bộ Lepidoptera. Chúng được sử dụng để nghiên cứu khả năng tái tổ hợp
của vi rút và đã được sử dụng để sản xuất chế phẩm vi rút cho từng loài thuộc
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 13


bộ Lepidoptera, để tạo ra thuốc trừ sâu sinh học hoặc sử dụng cho protein tái
tổ hợp. Việc nghiên cứu và sử dụng tế bào côn trùng ngày càng được quan
tâm tại nhiều nước trên thế giới.
Sản phẩm tế bào nhân nuôi phục vụ việc nghiên cứu sinh lý học và tính
biệt hóa tế bào; hiển thị các gen lạ trong công nghệ tái tổ hợp gen; phát hiện
tác nhân gây bệnh; sản xuất qui mô thương mại các vacxin chữa bệnh và các
chế phẩm sinh học bảo vệ thực vật sử dụng vi rút côn trùng; sản xuất khối
lượng lớn các protein tái tổ hợp trong một thời gian ngắn sau khi đã có
chuyển dịch (cắt, bổ sung) thích hợp về gen.
Theo Granados R.R., Li và Bonning (2007) thì định hướng thời gian tới
sẽ là thời kỳ phát triển nhân nuôi tế bào côn trùng qui mô lớn và thúc đẩy sản
xuất cũng như thương mại sản phẩm từ nhân nuôi tế bào trên thị trường.
1.2.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng phát triển sinh khối của tế bào
Freshney (1987) chỉ rõ kỹ thuật nhân nuôi phát triển sinh khối tế bào
phải được điều chỉnh cho phù hợp tùy theo mô tế bào thu nhận, cũng như đối
với từng loài côn trùng cụ thể, môi trường nuôi cấy, môi trường bổ trợ, pH,
nhiệt độ của môi trường nhân nuôi và cơ chế phát triển, phân chia của tế bào
(bám dính hay huyền phù).
1.2.3.1. Môi trường thích hợp cho nhân nuôi tế bào
Theo sách được viết bởi Juan D. Claus và Cs., hầu như tất cả các môi
trường được sử dụng cho nuôi cấy các tế bào côn trùng có thành phần hóa học
xác định một thành phần. Thành phần cơ bản bao gồm hỗn hợp được xác định

về mặt hóa học của carbohydrate, axit amin, vitamin, muối và các axit hữu cơ.
Ngoài ra, các môi trường phải được bổ sung với các hợp chất hóa học xác
định khác để góp phần thúc đẩy phát triển và phân chia của tế bào, chẳng hạn
như huyết thanh bào thai bê, chiết xuất vi khuẩn hoặc protein thủy phân.
Theo Lynn (1996) điểm quan trọng nhất cần xem xét để phát triển sinh
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 14


khối một dòng tế bào mới là môi trường nhân nuôi. Nhiều môi trường được
sản xuất đặc biệt dành cho nuôi cấy tế bào các loài thuộc bộ Lepidoptera. Các
môi trường này được cải biến từ môi trường Grace như ExCell 401, SF-900
và Insect-Xpress hoặc môi trường cải biến từ môi trường BML/TC-10 đó là
môi trường TC-100 có bổ sung thêm peptit (như 1.25% phytone peptone,
1.25% peptone #P0521, 0.075% peptone P7750 và 5-10% fetal bovine serum
(Sigma)). Ngoài ra, những điểm chính cần cân nhắc trong việc lựa chọn một
môi trường cho phát triển sinh khối một loài côn trùng là pH, độ thẩm thấu, số
lượng và tỷ lệ các chất muối vô cơ có trong môi trường.
Theo Guy Smagghe (2009) môi trường nuôi cấy để sử dụng nuôi cấy tế
bào côn trùng với nhiều công thức là môi trường tiêu chuẩn cũ của Grace,
Schneider và Mitsuhashi hay Maramorosch. Môi trường được sử dụng phổ
biến bao gồm: Hink’s TNM-FH, môi trường được cải biến từ môi trường
Grace bằng cách bổ sung yeastolate lactalbumin hydrolysates và fetal bovine
serum (FBS); TC-100 (aka BML/TC-100), môi trường được cải biến từ môi
trường Grace với việc giảm một vài amino acids.
Guy Smagghe (2009) đã chỉ ra rằng môi trường tối ưu hóa được tìm ra
bởi Goodwin và Cs. (1980); Vaughn và Fan (1989); Vaughn và Weiss (1991)
có đóng góp trong sự phát triển môi trường nuôi cấy không huyết thanh với
ILP-41 đã trở thành môi trường cơ bản chung nhất được sử dụng. Hiện nay,

nhiều môi trường không huyết thanh được sử dụng rộng rãi trên toàn thế giới,
ví dụ như: dòng môi trường Ex-Cell 400, insect-EXPRESS, Sf-9000 II,
SFXInsect, Drosophila-SFM.
Lynn (2005) đã xác định môi trường nuôi cấy tế bào côn trùng cần phải
được thay thế hoặc bổ sung liên tục trong khoảng thời gian thích hợp thì tế
bào mới sinh trưởng phát triển tốt, trong đó tác giả thường bổ sung thêm môi
trường mới vào nuôi cấy trong vài tuần đầu tiên. Ông sử dụng đĩa petri 35mm
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 15