TRẦN NGỌC TIỆP



LỜI CẢM ƠN

Trong quá trình thực hiện đề tài thực tập tốt nghiệp, tôi đã nhận được nhiều sự
giúp đỡ từ thầy cô, gia đình và bạn bè.
Trước hết, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Hà Viết Cường – người đã
trực tiếp hướng dẫn và đóng góp nhiều ý kiến quan trọng cho tôi trong suốt quá trình
thực hiện đề tài tốt nghiệp.
Tôi xin chân thành cảm ơn các anh chị cán bộ trung tâm nghiên cứu bệnh cây
nhiệt đới, các thầy cô giáo trong bộ môn Công nghệ sinh học đã giúp đỡ, tạo điều kiện
thuận lợi cho tôi trong quá trình thực hiện và hoàn thành đề tài tốt nghiệp.
Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình và bạn bè những người đã tạo
điều kiện, động viên, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập cũng như quá trình thực
hiện đề tài tốt nghiệp này.
Một lần nữa tôi xin chân thành cảm ơn!

Hà nội, ngày 5 tháng 8 năm 2010
Sinh viên

Trần Ngọc Tiệp

i


TRẦN NGỌC TIỆP

MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN ...................................................................................................................i
MỤC LỤC....................................................................................................................... ii
DANH MỤC BẢNG .......................................................................................................v
DANH MỤC HÌNH.........................................................................................................vi
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT..........................................................................................vii
TÓM TẮT .....................................................................................................................viii
Phần I. MỞ ĐẦU..............................................................................................................1
1. Đặt vấn đề.....................................................................................................................1
2. Mục tiêu và yêu cầu của đề tài ......................................................................................2
Phần II. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ....................................................................................3
1. Đặc điểm của họ Geminiviridae ....................................................................................3
2. Đặc điểm của chi Begomovirus .....................................................................................3
2.1. Lịch sử phát hiện, phân bố và đa dạng của Begomovirus ...........................................3
2.2. Phân loại chi Begomovirus.........................................................................................4
2.3. Triệu chứng bệnh do Begomovirus gây ra..................................................................6
2.4. Vector truyền bệnh và sự lan truyền Begomovirus .....................................................7
2.5. Thiệt hại kinh tế do Begomovirus gây ra....................................................................8
2.6. Biện pháp phòng trừ...................................................................................................9
2.7. Đặc điểm hình thái và cấu trúc bộ gen của Begomovirus .........................................10
2.7.1. Hình thái của Begomovirus ...................................................................................10
2.7.2. Cấu trúc DNA-A ...................................................................................................11
2.7.3. Cấu trúc DNA-B ...................................................................................................12
2.7.4. Đặc điểm của vùng IR...........................................................................................13
2.7.5. Cấu trúc của DNA-β .............................................................................................13
2.7.6. Cấu trúc của Nanovirus-like DNA-1 .....................................................................15
2.8. Quá trình tái bản của Begomovirus ..........................................................................16

ii



TRẦN NGỌC TIỆP



2.9. Tương tác và tái tổ hơp của Begomovirus ................................................................16
Phần III. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP ....................................................................18
3.1. Đối tượng, vật liệu, thời gian và địa điểm nghiên cứu ..............................................18
3.1.1. Đối tượng nghiên cứu............................................................................................18
3.1.2. Vật liệu nghiên cứu ...............................................................................................18
3.1.3. Địa điểm nghiên cứu .............................................................................................19
3.1.4. Thời gian nghiên cứu ............................................................................................19
3.2. Nội dung và phương pháp nghiên cứu......................................................................19
3.2.1. Tiến hành thu mẫu nghiên cứu ..............................................................................19
3.2.2. Chiết tách DNA tổng số từ mẫu mô thực vật .........................................................19
3.2.3. Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) và điện di sản phNm PCR .........20
3.2.4. Phương pháp tinh chiết sản phNm PCR..................................................................20
3.2.5. Nhân dòng bằng InsTAclone™ PCR Cloning Kit (của Fermentas) .......................20
3.2.6. Tinh chiết plasmid.................................................................................................21
3.2.7. Phương pháp giải trình tự Gen .............................................................................21
3.2.8. Phương pháp và phần mềm phân tích chuỗi DNA .................................................21
Phần IV. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN..........................................................................22
4.1. Nhân dòng và giải trình tự toàn bộ gen của ba mẫu virus Cachua 100, Cachua 89 và
Dudu 31..........................................................................................................................22
4.1.1. Thiết kế mồi nhân toàn bộ bộ gen của 3 mẫu virus ..............................................22
4.1.2. Nhân toàn bộ bộ gen của 3 mẫu virus bằng PCR .................................................24
4.1.3. Nhân dòng bộ gen của 3 mẫu virus trong vi khuNn E.coli .....................................25
4.1.4. Kiểm tra kết quả biến nạp vector tái tổ hợp bằng enzyme cắt giới hạn...................26
4.1.5. Kết quả giải trình tự gen........................................................................................28
4.2. Đặc trưng phân tử của ba mẫu virus Cachua 100, Cachua 89 và Dudu 31 ................30

4.2.1. Tổ chức bộ gen .....................................................................................................30
4.2.2. Phân tích các motif chức năng trên bộ gen của 3 mẫu virus...................................33
4.2.2.1. Phân tích vùng liên gen IR của 3 mẫu virus........................................................33

iii


TRẦN NGỌC TIỆP



4.2.2.2. Phân tích protein Rep của 3 mẫu virus ...............................................................35
4.2.2.3. Phân tích protein CP của 3 mẫu virus .................................................................37
4.2.3. So sánh trình tự và phân tích phả hệ của 3 mẫu virus ............................................40
4.2.3.1. Tìm kiếm chuỗi tương đồng trên GenBank.........................................................40
4.2.3.2. So sánh trình tự 3 virus với các begomovirus đã công bố ...................................40
4.2.3.3. So sánh iteron và IRD của 3 virus với các begomovirus đã công bố ...................44
4.2.3.4. Phân tích phả hệ .................................................................................................46
4.2.3.5. Phân tích tái tổ hợp ............................................................................................49
4.2.4. Phân loại 3 mẫu virus Dudu31, Cachua89, Cachua100..........................................52
4.2.4.1. Hai mẫu Dudu31 và Cachua89 ..........................................................................52
4.2.4.2. Mẫu Cachua100 .................................................................................................53
4.3. Phát hiện các begomovirus gây bệnh xoăn vàng lá cà chua trên đồng ruộng.............55
4.3.1. Thu thập và xử lý mẫu...........................................................................................55
4.3.2. Xác định begomovirus bằng PCR và giải trình tự................................................56
4.3.2.1. Kiểm tra sự có mặt của begomovirus bằng cặp mồi chung (degenerate primers) ..........56
4.3.2.2. Kiểm tra sự có mặt của ToLCVV và TYLCVNV bằng mồi đặc hiệu.........................56
Phần V. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHN ..................................................................................59
5.1. Kết luận.....................................................................................................................59
5.2. Kiến nghị...................................................................................................................61


iv


TRẦN NGỌC TIỆP



DANH MỤC BẢNG

Bảng 4.1. Nguồn gốc 3 mẫu virus được nghiên cứu trong báo cáo này ...........................22
Bảng 4.2: Các mồi liền kề nhân toàn bộ bộ gen của ba mẫu virus Cachua 100, Cachua 89
và Dudu 31 .....................................................................................................................23
Bảng 4.3. Kiểm tra vector tái tổ hợp (miniprep) bằng BamHI và E.coRI........................27
Bảng 4.4. Đặc điểm bộ gen của 3 mẫu begomovirus .......................................................31
Bảng 4.5: Virus được công bố sẵn có trên GenBank gần gũi nhất với 3 mẫu virus. .........40
Bảng 4.6. So sánh trình tự của 3 virus Dudu31, Cachua89 và Cachua100 với một số
begomovirus ...................................................................................................................41
Bảng 4.7: So sánh iteron và IRD của 3 virus Dudu31, Cachua89 và Cachua100 với một số
begomovirus ...................................................................................................................45
Bảng 4.8. Các virus sẵn có trên GenBank dùng trong phân tích phả hệ ...........................47
Bảng 4.9. Mức đồng nhất nucleotide (%) tại các đoạn tái tổ hợp của Cachua100 ............51
Bảng 4.10. Các begomovirus hại cây trồng được phát hiện cho tới nay tại Việt Nam......54
Bảng 4.11. Kiểm tra PCR phát hiện begomovirus, TYLCVNV và ToLCVV trên các mẫu
cà chua............................................................................................................................58

v


TRẦN NGỌC TIỆP




DANH MỤC HÌNH

Hình 2.1. Triệu chứng do Begomovirus gây ra trên cà chua ..............................................7
Hình 2.2. Hình thái của Begomovirus .............................................................................10
Hình 2.3. Cấu trúc phân tử DNA-A của Begomovirus ....................................................12
Hình 3.1: Sơ đồ tổ chức bộ gien DNA-A (biểu diễn dưới dạng mạch thẳng) của
begomovirus và vị trí tương đối của cặp mồi BegoAFor1 và BegoARev1………………18
Hình 4.1. Vùng bảo thủ dùng để thiết kế mồi chung liền kề nhân toàn bộ bộ gen của 3
mẫu virus Dudu31, Cachua 89 và Cachua100. Vùng thiết kế mồi được bôi đen...............23
Hình 4.2. Vị trí tương đối của cặp mồi chung liền kề Hai50F/Hai50R trên bộ gen của
begomovirus.......................................................................................................................24
Hình 4.3. PCR nhân toàn bộ DNA-A của ba mẫu virus.. ...................................................24
Hình 4.4. Các mẫu vi khuN n XL1-blue biến nạp được cấy trải và ủ qua đêm trên môi
trường chọn lọc trắng xanh. ............................................................................................26
Hình 4.5: Kết quả điện di sản phN m miniprep đã được cắt bằng BamHI và E.coRI . .......28
Hình 4.6: Sơ đồ giải trình tự bộ gen của 3 mẫu virus được dòng hóa trên vector
pTZ57R/T.......................................................................................................................29
Hình 4.7: Tổ chức bộ gen của 3 mẫu virus.. ....................................................................32
Hình 4.8. (A) Sơ đồ vùng ori của begomovirus (Fontes và cộng sự, 1994)……………...34
Hình 4.9.(A) Sơ đồ các vùng chức năng của begomovirus (Hanley-Bowdoin và cộng
sự, 1999)………………………………………………………………………………..36
Hình 4.10. Protein CP của 3 virus Dudu31, Cachua89 và Cachua100 với các motif hoặc
gốc aa chủ chốt liên quan đến các chức năng lắp ráp virion, lan truyền qua vector và nhập
nhân được in màu và đánh dấu........................................................................................39
Hình 4.11: Cây phả hệ dựa trên toàn bộ bộ gen của begomovirus……………………….48
Hình 4.12. Nguồn gốc tái tổ hợp của ToLCHV theo Zhang và cộng sự (2010)................50
Hình 4.13: Tái tổ hợp của Cachua100. ............................................................................51

Hình 4.14: Triệu chứng của các mẫu cà chua bị bệnh xoăn vàng lá..................................55
Hình 4.15. Kiểm tra PCR phát hiện begomovirus, ToLCVVV và TYLCVNV trên 8 mẫu
cà chua............................................................................................................................57

vi


TRẦN NGỌC TIỆP



DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT
Bp

Base pair

CP

Capsit protein

CTAB

Cetryl Ammonium Bromide

DNA

Axit deoxyribonucleic

dNTP


Deoxynucleotide triphotphate

dsDNA

Double DNA

E.coli

Escherichia coli

ICTV

International Committee on Taxonomy of Viruses

IGR

Intergenic region

Kb

Kilobase

LB

Luria and Bertani

ORF

Open reading frame


PCR

Polymerase chain reaction

RE

Restriction enzyme

Ren

Replication enhancer protein

Rep

Replication protein

ssDNA

Singe strand DNA

TAE

Tris-HCl-EDTA

Taq

Thermus aquatic

TYLCD


Tomato yellow leaf curl disease

TYLCV

Tomato yellow leaf curl virus

β- ME

Beta- Mercaptoethanol

vii


TRẦN NGỌC TIỆP



TÓM TẮT
Trong nghiên cứu này chúng tôi tiến hành nhân dòng và giải trình tự toàn bộ bộ
gen của 3 mẫu begomovirus, được cho là chưa từng được phát hiện ở Việt Nam gây hại
trên cây đu đủ và cà chua, đã được Lê Văn Hải phân lập năm 2009. Kết quả là toàn bộ bộ
gen của 3 mẫu begomovirus đã được nhân dòng thành công vào tế bào E.coli chủng XL1Blue. Chúng tôi cũng đã giải trình tự và thu được toàn bộ bộ gen của 3 mẫu virus với kích
thước khoảng 2.7 kb.
Tiến hành so sánh trình tự thu được, phân tích các đặc trưng phân tử của bộ gen,
phân tích tái tổ hợp và phả hệ đã chứng minh 2 mẫu virus Dudu31 và Cachua89 là thành
viên của loài Tomato leaf curl Hainan virus mới được phát hiện gần đây (năm 2010) từ
Trung Quốc. Những phân tích và phả hệ cũng cho thấy mẫu virus Cachua100 là một virus
thuộc một loài mới của chi Begomovirus. Virus này được chúng tôi đặt tên là Tomato leaf
curl Hanoi virus (ToLCHanV).
Chúng tôi cũng tiến hành kiểm tra 8 mẫu cà chua bị bệnh xoăn vàng lá thu thu thập

tại Thanh Hóa và Bắc Ninh bằng PCR thấy tất cả chúng đều nhiễm begommovirus. Dùng
mồi đặc hiệu để kiểm tra PCR thấy 5/8 mẫu nhiễm Tomato leaf curl Vietnam virus
(ToLCVV), 3/8 mẫu nhiễm Tomato yellow leaf curl Vietnam virus (TYLCVNV), trong đó
có 1 mẫu nhiễm hỗn hợp cả 2 virus. Giải trình tự trực tiếp một mẫu (thu tại Thanh Hóa)
nhiễm begomovirus nhưng PCR âm tính với ToLCVV và TYLCVNV thấy mẫu này có thể
nhiễm ToLCHV.

viii


TRẦN NGỌC TIỆP



Phần I. MỞ ĐẦU
1. Đặt vấn đề
Cây cà chua bị tấn công bởi rất nhiều loài virus. Trong số bệnh virus hại cà chua ở
vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới, bệnh xoăn vàng lá được xem là bệnh quan trọng nhất
(Pico và cộng sự, 1996).
Nguyên nhân gây bệnh xoăn vàng lá cà chua khá phức tạp. Bệnh được xem là một
bệnh phức, có nghĩa là một bệnh nhưng do nhiều loài virus thuộc chi Begomovirus, họ
Geminiviridae gây ra (Moriones và Navas-Castillo, 2000). Các begomovirus có hình thái
phân tử dạng hình cầu kép (hình chuỳ) và có bộ gen DNA sợi vòng đơn, kích thước
khoảng 2,6 - 2,8 kb (Stanley và cộng sự, 2005). Các begomovirus không truyền qua hạt
giống nhưng lan truyền trên đồng ruộng bằng bọ phấn (Bemisia tabaci) theo kiểu bền
vững tuần hoàn (Pico và cộng sự, 1996).
Có khoảng 40 loài begomovirus hại cà chua đã được công bố trên thế giới (Stanley
và cộng sự, 2005). Trên cây cà chua, các begomovirus tạo triệu chứng giống nhau, điển
hình là: cuốn lá (cong lại hình thìa); mép lá (đặc biệt ở lá non) biến vàng; lá nhỏ hẹp; cây
nhiễm sớm còi cọc với tỷ lệ đậu quả rất thấp. Danh tính virus gây bệnh chỉ có thể biết

được dựa vào các phân tích phân tử (Moriones và Navas-Castillo, 2000).
Tại Việt Nam, bệnh xoăn vàng lá được xem là bệnh virus quan trọng nhất trên cà
chua với tỉ lệ nhiễm bệnh trên các ruộng trồng cà chua thường rất cao, có khi tới 100 %.
Bệnh đã được phát hiện thấy trên cà chua từ những năm 80. Một số nghiên cứu về tạo
kháng huyết thanh chN n đoán, lây nhiễm nhân tạo đã được thực hiện trong thời gian này
nhưng bản chất thật sự của virus vẫn chưa rõ. Gần đây, dựa vào các phân tích phân tử, có
ít nhất 3 loài begomovirus được phát hiện gây ra bệnh xoăn lá cà chua ở Việt Nam gồm
Tomato leaf curl Vietnam virus (ToLCVV) (Green và cộng sự, 2001), Tomato yellow leaf
curl Vietnam virus (TYLCVNV) (Ha và cộng sự, 2008) và Tomato yellow leaf curl
Kanchanaburi (TYLCKaV) (Ha và cộng sự, 2008). Trong số 3 loài trên, 2 loài được phân
lập trên mẫu cà chua bệnh xoăn vàng lá ở miền Bắc là ToLCVV và TLCVNV.
Cũng dựa trên các phân tích phân tử, Việt Nam dường như là trung tâm đa dạng

1


TRẦN NGỌC TIỆP



của các begomovirus (Ha va cộng sự, 2006, 2008). Mặc dù vậy số lượng loài
begomovirus xác định được trên thực vật của Việt Nam vẫn còn ít chỉ gồm 19 loài được
phân lập từ nhiều loài cây, trong đó nhiều loài là cây dại (Green và cộng sự, 2001; Revill
và cộng sự, 2003, 2004; Ha và cộng sự, 2006, 2008).
Năm 2009, Lê Văn Hải phân lập được 3 begomovirus chưa từng được phát hiện ở
Việt Nam gây hại trên cây đu đủ và cà chua. Tuy nhiên các phát hiện trên chỉ được xác
định dựa trên việc giải trình tự một đoạn của DNA-A với chiều dài 819 nts. Việc xác đinh
rõ danh tính của các loài virus trên chỉ được kết luận khi giải trình tự toàn bộ DNA-A. Kết
quả trên cũng gợi ý rằng nhiều loài begomovirus nữa đang gây hại trên cà chua và các cây
trồng khác ở Việt Nam và cần phải được xác định.

Chính vì vậy chúng tôi tiến hành đề tài:
“Xác định và đặc trưng phân tử của một số virus thuộc chi Begomovirus (họ
Geminiviridae)”
2. Mục tiêu và yêu cầu của đề tài
Mục tiêu
- Xác định và đặc trưng phân tử của một số Begomovirus ở miền Bắc Việt Nam.
Yêu cầu
- Thiết kế mồi để giải trình tự toàn bộ DNA-A của một số mẫu begomovirus
- PCR để nhân toàn bộ DNA-A
- Nhân dòng sản phN m PCR trong vector nhân dòng
- Giải trình tự sản phN m nhân dòng
- Phân tích trình tự có được sau khi giải trình tự
- Thu mẫu và xử lý mẫu bệnh virus với triệu chứng điển hình do nhóm begomovirus
gây ra trên cây cà chua
- Xác định sự có mặt của các begomovirus bằng PCR dùng mồi chung DNA-A
BegoAFor1 & BegoAReV1
- Xác định thành phần loài đã tìm ra ở miền Bắc Việt Nam sử dụng hai cặp mồi đặc
hiệu ToLCVV (ToLCVV-sp-F2 & ToLCVV-sp-R2) và TYLCVNV (TYLCVNV-sp-F1 &
TYLCVNV-sp-R1).
- Giải trình tự sản phN m PCR của một số begomovirus gây bệnh trên cây trồng.

2


TRẦN NGỌC TIỆP



Phần II. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1. Đặc điểm của họ Geminiviridae

Geminiviridae là họ virus thực vật lớn nhất với 209 thành viên đã được xác định
(Fauquet và Stanley, 2005). Các Geminivirus đặc trưng bởi bộ gen DNA vòng đơn
(ssDNA) dài khoảng 2.7 kb và được gói trong hạt cầu kép 20 mặt. Geminivirus có thể có
bộ gen đơn với một phân tử DNA, hoặc bộ gen kép chứa hai phân tử DNA (Stanley và
cộng sự, 2005). Geminivirus gây ra nhiều bệnh gây thiệt hại về kinh tế lớn trên cả cây một
lá mầm và hai lá mầm trong đó có các cây trồng quan trọng như cây sắn, cây bông, cây
đậu và cà chua.
Các geminivirus được phân thành bốn nhóm, mastrevirus, curtovirus, begomovirus
và topocuvirus dựa trên cấu trúc genome, phổ ký chủ và vector truyền bệnh. Các
geminivirus khác nhau về tổ chức genome, phản ánh sự đa dạng của các geminivirus. Tuy
nhiên, các geminivirus các đặc trưng chung sau:
-

Các gen đều được mã hóa trên cả hai sợi DNA của virus

-

Dịch mã xảy ra theo hai hướng ngược chiều nhau

-

Tồn tại một vùng liên gen (intergenic region – IGR) giữa ORF đầu tiên của sợi
DNA virus và sợi bổ sung. Trình tự nonanucleotide (TAATATTAC) trong IGR là
bảo thủ ở các phân nhóm của geminvirus và nằm ở cấu trúc thòng lọng (loop
region)

-

Gen mã hóa protein vỏ - CP nằm trên sợi virus và protein tái bản (repliacation
protein) được mã hóa trên sợi bổ sung (Lazarowitz, 1992).


2. Đặc điểm của chi Begomovirus
2.1. Lịch sử phát hiện, phân bố và đa dạng của Begomovirus
Một vài giả thuyết đã được đề xuất về nguồn gốc của begomovirus có bộ gen đơn
như TYLCV. Phân tích các trình tự của tất cả các TYLCV đã gợi ý rằng các chủng phân
lập từ Israel và Iran có thể có bộ gen khảm (chimeric genomes) xuất hiện do tái tổ hợp
giữa tổ tiên của virus TYLCD và ToLCD, cả hai bệnh này có nguồn gốc từ các nước

3


TRẦN NGỌC TIỆP



Trung Đông (NavasCastillo và cộng sự, 2000). Các begomovirus gây bệnh TLCD có mối
quan hệ chặt chẽ hơn trong khi các begomovirus gây ToLCD đa dạng hơn (Varma và
Malathi, 2003).
TYLCD được ghi nhận đầu tiên trên thế giới từ những năm 1939-1940 tại Israel và
sự xuất hiện của bệnh xảy ra đồng thời với sự tăng quần thể bọ phấn. Cuối thập niên 80,
có những báo cáo đầu tiên về TYLCD ở châu Mỹ và châu Âu (Accotto và cộng sự, 2000).
Gần đây, bệnh còn lan truyền tới phía tây Địa Trung Hải (Ý), Nhật, Iran và các nước cộng
hoà nằm trong khu vực Châu Á thuộc Liên Xô cũ như Azerbaidan, Turmenistan,
Uzbekistan.
Ngày nay, với sự trợ giúp của các ngành công nghệ mới số lượng begomovirus
được xác định khắp nơi trên thế giới ngày càng nhiều. Số lượng begomovirus đã được xác
định không ngừng gia tăng loài từ 185 loài năm 2005 (Fauques và Stanley, 2005) và 266
loài năm 2008 (Fauquet và cộng sự, 2008C).
Tại Việt Nam, bệnh do begomovirus cụ thể là bệnh xoăn vàng lá cà chua được phát
hiện lần đầu tiên năm 1970. Bệnh phát sinh và gây hại hầu hết ở các vùng trong cả nước

như: Hà Nội, Hải Dương, Hưng Yên, Bắc Ninh, Bắc Giang, Vĩnh Phúc, Hải Phòng… (Vũ
Triệu Mân và Lê Lương Tề, 2001).
Hiện nay, dựa vào phân tích phân tử đã phát hiện được 19 loài begomovirus ở Việt
Nam. Tuy nhiên chỉ có 5 loài là được phát hiện trên cây trồng là: Tomato leaf curl Việt
Nam virus (ToLCVV) (Green và cộng sự, 2001); Papaya leaf curl China virus
(PaLCuCNV) trên cây thuốc lá; Tomato yellow leaf curl Kanchanaburi virus (TYLCKV)
trên cây cà chua, cà pháo; Tomato yellow leaf curl Vietnam virus (ToLCVNV) trên cây cà
chua; ( Hà Viết Cường và cộng sự, 2008); Tomato leaf curl Dan Xa virus (ToLCDXV)
trên cây cà chua (Badwil và cộng sự, 2008).
2.2. Phân loại chi Begomovirus
Nghiên cứu hệ thống phát sinh có thể chia begomovirus ra làm hai nhóm chính là
nhóm tân thế giới (New world) bao gồm khu bao gồm Châu Mỹ và nhóm cựu thế giới

4


TRẦN NGỌC TIỆP



(Old world) là khu vực bán cầu đông bao gồm châu Âu, châu Phi, châu Á (Padidam và
cộng sự, 1999; Rybicky, 1994).
Các begomovirus của hai nhóm tân thế giới và cựu thế giới được phân biệt nhau
bởi đặc điểm bộ gen. Tất cả các begomovirus ở cụm Tân thế giới đều có bộ gen kép, trong
khi đó các begomovirus ở cụm Cựu thế giới có cả bộ gen đơn và kép, thêm vào đó tất cả
các begomovirus của cụm Cựu thế giới có thêm một gen AV2 trên DNA-A, gen này
không tồn tại ở các virus của cụm Tân thế giới (Rybicki, 1994; Stanley và cộng sự, 2005).
Begomovirus ở cụm Tân thế giới có chuỗi PWRsmaGT ở đầu N trong vỏ protein (CP) mã
hóa bởi gen AV1, chuỗi này không có mặt ở begomovirus của cụm Cựu thế giới
(Harrison và cộng sự, 2005).

Rybicki (1994) dự đoán rằng bọ phấn di chuyển từ Châu Á sang châu Mỹ có thể đã
mang tổ tiên virus của cụm Tân thế giới mà chúng ta quan sát thấy ngày nay. Các virus
này sau đó tiến hóa theo một hướng khác với các virus ở cụm Cựu thế.
Gần đây dựa trên phân tích hệ thống phát sinh phát hiện ra rằng CoYVV ở Việt
Nam không có ORF AV2 và có chuỗi PWRsmaGT ở đầu N trong protein vỏ (CP), virus
này giống với cụm Tân thế giới hơn là cụm Cựu thế giới. Sự có mặt của CoYVV ở Việt
Nam đã đưa ra giả thuyết rằng virus giống với cụm Tân thế giới có thể đã có mặt ở Cựu
thế giới trước khi bị phân chia ở kỷ Gondwana (Hà Viết Cường và cộng sự, 2008).
Hiện nay, việc phân loại begomovirus chủ yếu dựa trên so sánh trình tự của chuỗi
phân tử DNA-A. Theo Fauquet và cộng sự 2008, việc phân loại loài trong chi
begomovirus tuân thủ một số tiêu chuN n sau:
- Thành phần của genome có hay không có DNA-B
- Tổ chức bộ gen có hay không có gen AV2
- Mức độ tương đồng khi so sánh trình tự toàn bộ chuỗi DNA-A <89% thì ghi nhận
loài mới.
- Protein Rep không có khả năng tái bản trans trong thành phần bộ gen thì có thể
ghi nhận loài mới. Tuy nhiên cần lưu ý rằng chỉ một thay đổi nhỏ ở vị trí liên kết với Rep
có thể ngăn cản sự tương tác chức năng và sự tái tổ hợp của virus.

5


TRẦN NGỌC TIỆP



- Có khả năng là tái tổ hợp giả hay không.
- Đặc điểm của protein vỏ. Mức độ tương đồng của trình tự aminoacid <90% thì
ghi nhận là loài mới, tuy nhiên mức độ tương đồng nucleotide của toàn bộ bộ gen vẫn là
cần thiết cho việc xác nhận phân loại virus.

- Vật chủ ngoài tự nhiên và kiểu hình của triệu trứng.
Tên của các loài virus mới được đặt sử dụng tiêu chuN n được đưa ra ICTV Uỷ ban
Phân loại Virus Quốc tế (International Committee on Taxonomy of Viruses) nhóm nghiên
cứu Geminiviridae (Fauquet và cộng sự, 2003).
2.3. Triệu chứng bệnh do Begomovirus gây ra
Một trong những đặc điểm gây bệnh của begomovirus là các bệnh trên một loài
cây trồng thường do nhiều loài begomovirus gây ra với triệu chứng không thể phân biệt
được. Chẳng hạn, trên cà chua, hiện nay có khoảng 40 loài begomovirus gây bệnh xoăn
vàng lá (ngọn) (Stanley và cộng sự, 2005).
Bệnh xoăn vàng lá cà chua xuất hiện triệu chứng trong vòng 2 – 4 tuần sau khi nhiễm
bệnh và phát triển đầy đủ triệu chứng trong vòng 2 tháng. Triệu chứng có thể thay đổi theo
điệu kiện môi trường, giai đoạn sinh trưởng và điều kiện sinh lý của cây tại thời điểm nhiễm
bệnh (Pico và cộng sự, 1996).
Triệu chứng sớm nhất là lá cong xuống dưới và phía trong. Về sau, lá không có hình
dạng, nhỏ hẹp, biến vàng từ mép và chót lá lan vào giữa gân, lá cuốn cong lên phía trên thành
hình thìa lìa, lá non biến vàng nhỏ hẹp, giòn và nhỏ hẹp. Cuống lá có thể xoắn vặn. Cây lùn còi
cọc, mọc nhiều cành nhánh nhỏ, đốt thân ngắn. Cây nhiễm sớm thường không ra quả do hoa bị
rụng (Pico và cộng sự, 1996).
Ở Việt Nam, bệnh trên ruộng cà chua có thể xuất hiện với những triệu chứng hỗn hợp
do nhiều loại virus gây ra, trên một cây có thể có hai loại virus trở lên, có trường hợp 4 – 5
loại virus. Trong những ruộng nặng rất khó tìm thấy ở một cây nhiễm riêng một loại virus,
tuy vậy thiệt hại nặng nhất vẫn là bệnh xoăn vàng lá cà chua do virus TYLCV (Vũ Triệu Mân
& Lê Lương Tề, 1999).
Dưới đây là một số triệu chứng do Begomovirus gây ra trên cà chua:

6


TRẦN NGỌC TIỆP




Hình 2.1. Triệu chứng do Begomovirus gây ra trên cà chua
(httpwww.avrdc.org)

2.4. Vector truyền bệnh và sự lan truyền Begomovirus
Bemisia tabaci hay còn gọi là bọ phấn khoai lang được mô tả lần đầu tiên và năm
1889 ở Hy Lạp (Gennadius, 1899). B.tabaci thuộc bộ Hemiptera, họ Aleyrodidae và phân
họ Aleyrodinae. Trung tân khởi nguyên của B.tabaci được cho là ở Ấn độ vì số lượng và
mức độ dạng phát hiện được ở đây.
Bọ phấn B.tabaci là côn trùng gây hại quan trọng trên nhiều loài cây trồng.
B.tabaci là vector truyền bệnh cho 111 loài virus gây ra hơn 114 bệnh trên cây rau và cây
lấy sợi (Markham và cộng sự, 1995; Jones, 2003).
Bọ phấn là vector truyền bệnh duy nhất của begomovirus. DNA của TYLCV đã
được tìm ra sử dụng PCR và bằng phương pháp lai Southern blot trong thế hệ sau của bọ
phấn (trứng, bọ phấn tuổi 1 và tuổi 2, trong bọ phấn trưởng thành) của sợi đơn virus trong
bọ phấn, chúng phát triển trên cây cà tím và cây bông (không phải là cây ký chủ).
TYLCV có thể truyền qua bọ phấn tối thiểu là hai thế hệ. Nếu thiếu đi cây ký chủ thì bọ
phấn chính là nguốn lưu giữ virus giữa hai mùa sản xuất (Murad Ghanim và cộng sự,
1997)

7


TRẦN NGỌC TIỆP



Begomovirus lan truyền ngoài tự nhiên nhờ bọ phấn Bemisia tabaci theo kiểu bền
vững tuần hoàn (Cohen và cộng sự, 1989).Bọ phấn dùng vòi chọc vào mô mạch dẫn để hút

dịch cây từ mạch phloem. Virus được hút qua vòi, tới diều, thấm qua màng ruột vào xoang cơ
thể, đạt tới tuyến nước bọt và cuối cùng vào ống nước bọt.
Sau thời gian chích nạp khoảng 1- 2 ngày, virus có thể được duy trì trong cơ thể bọ
phấn nhiều tuần (3 tuần đối với TYLCSV) hoặc cả đời như đối với TYLCV (Czosnek
cộng sự, 2002) .
Bọ phấn cái được chứng minh là vector truyền TYLCV hiệu quả hơn bọ phấn đực 6
lần (Martin, 1987). Trước năm 1998 TYLCV được cho là không truyền qua con cái, chỉ có
bọ phấn trưởng thành và ấu trùng là có virus. Tuy nhiên TYLCV-Mld được khẳng định là
truyền thông qua trứng ít nhất qua hai thế hệ (Ghanim và cộng sự, 1998). Virus cũng có thể
truyền qua giao phối từ bọ phấn đực sang bọ phấn cái và ngược lại (Ghanim và cộng sự,
2000). Một nghiên cứu khác trên chủng TYLCV của Israel cũng cho thấy không có DNA của
virus và cũng không nhiễm bệnh khi truyền qua con cái (Bosco và cộng sự, 2004).
2.5. Thiệt hại kinh tế do Begomovirus gây ra
Nhiều bệnh nghiêm trọng trên cây trồng đã được xác định là do begomovirus gây
ra như bệnh bệnh xoăn vàng lá (ngọn) cà chua, một bệnh được xem là bệnh virus nguy
hiểm nhất trên cà chua khắp thế giới (Moriones và Navas-Castillo, 2000). Các bệnh nguy
hiểm tương tự là bệnh khảm lá sắn (Legg và Fauquet, 2004), bệnh cuốn lá bông (Briddon,
2003). Trong đó gây thiệt hại lớn nhất là bệnh xoăn vàng lá ngọn cà chua.
Bệnh xoăn vàng lá ngọn cà chua gây thiệt hại lớn cả về năng suất và chất lượng.
Bệnh đã trở thành bệnh virus quan trọng nhất trên cây cà chua khắp thế giới, đặc biệt
vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới (Pico và cộng sự, 1996).
Ở Trung Quốc, bệnh xoăn vàng lá ngọn cà chua phổ biến và gây hại nghiêm trọng
trên những vùng trồng cà chua ở tỉnh Guangdong, Yunnan, Guangxi, Tilin. Năm 1998,
bệnh đã làm giảm 12% sản lượng cà chua ở hai tỉnh tây nam Trung Quốc là Yunnan,
Guangxi (Yin và cộng sự, 2001).

8


TRẦN NGỌC TIỆP




Ở Israel và phía bắc Tây Ban Nha begomovirus gây bệnh xoăn vàng lá ngọn cà
chua (TYLCVV) còn gây giảm năng suất trên cây đậu (phaseolus vulgaris) (Brun và cộng
sự, 1996).
Năm 1980, Nguyễn Thơ đã nhận xét trên đồng ruộng bệnh virus xoăn vàng lá ngọn
gây thiệt hại đến 80 – 90% năng suất. Cây cà chua bị bệnh virus xoăn vàng lá ngọn sẽ làm
cho hoa và nụ bị rụng nhiều, quả xốp, khô nước phN m chất kém, năng suất thấp (Vũ Văn
Hải, 2007).
Theo tác giả Nguyễn Văn Viên (1999) bệnh làm giảm năng suất 37,8% khi nhiễm
ở giai đoạn sau ra hoa và giảm tới 83,2% khi cây nhiễm ở thời kỳ trước ra hoa, thậm chí
gây thất thu ở nhiều vùng sản xuất cục bộ.
2.6. Biện pháp phòng trừ
Cho tới nay, người ta chưa phát hiện thấy gen kháng R chống lại begomovirus trên
cây cà chua trồng (Lycopersicon esculentum). Tuy nhiên một số gen kháng chống lại
begomovirus đã được phát hiện thấy trên một số giống cà chua dại. Như gen Ty1 được
phân lập từ cây cà chua dại (Lycopersicon chilense) và là một gen kháng trội không hoàn
toàn (Hà Viết Cường, 2008).
Những năm gần đây công nghệ gen bước đầu được ứng dụng trong việc sản xuất
giống kháng bệnh bằng biện pháp bắn gen, chuyển gen. Chương trình sản xuất giống cà
chua kháng bệnh đã được bắt đầu từ cuối năm 1960 và được phát triển mạnh sau đó. Cơ
sở của chương trình này là việc lai để chuyển gen kháng bệnh từ các loài cà chua dại sang
loài cà chua trồng. Có từ 1-5 gen kháng bao gồm cả gen trội và gen lặn đã được công bố bởi
Zakay và cộng sự (1991), Pico và cộng sự (1996), Nakhla & Maxwell (1998). Năm 1998,
Vidavski & Czosnek cho biết tính chịu được quyết định chủ yếu bởi gen trội còn tính
kháng được quyết định bởi từ 2-3 gen lặn.
Cơ chế RNA slencing cũng đã được ứng dụng để tạo ra giống kháng được
begomovirus. Ở Việt Nam hiện nay Viện Di truyền Nông nghiệp đang tiến hành đề tài
nghiên cứu về vấn đề này. Tuy nhiên, có một vấn đề gặp phải là RNA silencing là một cơ

chế của cây chống lại virus thì virus cũng có cơ chế để chống lại sự silencing của cây.

9


TRẦN NGỌC TIỆP



Người ta đã chứng minh bằng thực nghiệm rằng AC4 của begomovirrus có thể ức chế
đường hướng RNA silencing của cây ký chủ trong tế bào chất.
Biện pháp đang đươc áp dụng hiện tại để phòng bệnh do begomovirus gây ra là diệt trừ
bọ phấn, biện pháp canh tác và sản xuất giống kháng bệnh.
Sử dụng thuốc hoá học để trừ bọ phấn là một biện pháp đã được tiến hành và cho hiệu
quả cao. Tuy nhiên việc sử dụng thuốc không chỉ gây ô nhiễm môi trường sống mà còn làm
tăng tính kháng thuốc của bọ phấn (Cahin và cộng sự, 1995).
Tác giả Phạm Thị Nhất (2000) cho biết bệnh xoăn lá cà chua rất phổ biến ở nước ta,
bệnh xoăn lá cà chua không truyền qua hạt giống, nguồn bệnh lây lan chủ yếu do virus được
giữa lại trong cơ thể của bọ phấn trắng là môi giới truyền bệnh và đề xuất biện pháp dùng bẫy
dính màu vàng để thu hút bọ phấn trắng.
2.7. Đặc điểm hình thái và cấu trúc bộ gen của Begomovirus
2.7.1. Hình thái của Begomovirus
Cũng như các geminivirus khác begomovirus có cấu trúc phân tử (virion) bao gồm 2
hình cầu 20 mặt (icosahedron), mỗi mặt là một tam giác đều với số đơn vị tam giác trên mỗi
mặt (T = 1), nối với nhau để tạo ra phân tử hình đa diện kép (gemini). Do nối với nhau nên 2
hình cầu này không hoàn chỉnh dẫn tới trên mỗi hình cầu chỉ có 55 tiểu phần protein (protein
vỏ) được sắp xếp thành 11 đơn vị hình thái, mỗi đơn vị gồm 5 tiểu phần protein (pentameric
capsome). Kết quả là toàn bộ phần tử có 110 tiểu phần và 22 đơn vị hình thái (Gafni, 2003).

Hình 2.2. Hình thái của Begomovirus

()

10


TRẦN NGỌC TIỆP



2.7.2. Cấu trúc DNA-A
DNA-A điển hình gồm có 6 ORF được sắp xếp theo hai chiều ngược nhau (AV1,
AV2, AC1, AC2, AC3, AC4) trong hai đơn vị phiên mã và được phân cách với nhau bởi
vùng liên gen (IR) (Rybiciki và cộng sự, 2000). Các gen này mã hóa cho các protein sau:
-

Protein vỏ (CP): do gen AV1 mã hóa có chức năng bao bọc genome và cũng cần

thiết cho sự lan truyền của virus (Briddon và cộng sự, 1989). CP và Pre-CP hay AV2 đều
cần thiết cho di truyển hệ thống và di truyển nội bộ ra vào bên trong nhân tế bào của vật
chủ (Gafni và Epel, 2002). AV1 cũng liên kết và bảo vệ ssDNA, màng nhân và tự liên
kết. AV1 cũng cần thiết cho lan truyền virus qua vector.
-

Protein tái bản (Rep): Gen AC1(rep) mã hóa protein tái bản (Rep protein) có chức

năng tái sinh và tương tác với Protein của ký chủ điều khiển chu kỳ tế bào (Desbiez và
cộng sự, 1995).
-

Protein hoạt hóa phiên mã (TrAP): Do gen AC2 mã hóa, có chức năng hoạt hóa


phiên mã từ promoter CP. Gen AC2 cũng được tìm thấy trong nhân (van Wezel và cộng
sự, 2001).
-

Gen AC3 mã hóa cho protein Ren (replication enhancer protein): AC3 tương tác

với protein Rep và tăng cường sự tích lũy DNA của virus (HanleyBowdoin và cộng sự,
2000). Sunter và cộng sự (1990) cũng đã quan sát thấy rằng đột biến gen AC4 của
TGMV đã giảm bớt một lượng lớn ss- và dsDNA.
-

Gen AC4 có chức năng cảm ứng triệu trứng và liên quan tới sự phân chia tế bào

(Latham và cộng sự, 1997; Krake và cộng sự, 1998). AC4 có thể tương tác với Rep/AC1
ORF và chống lại phản ứng phòng thủ hóa học của cây trồng (van Wezel và cộng sự,
2004).
-

Protein được mã hóa bởi AV2 (pre-coat hay MP) và AC4 gần đây cũng được giả

thuyết là liên quân tới sự di truyển giữa tế bào với tế bào của DNA virus (Rojas và cộng
sự, 2001).

11


TRẦN NGỌC TIỆP




DNA của những loài có bộ gen kép tương đồng với bộ gen của các loài
begomovirus có bộ gen đơn. Tuy nhiên những loài begomovirus có bộ gen kép ở tân thể
giới, DNA-A thiếu gen AV2.

Hình 2.3. Cấu trúc phân tử DNA-A của Begomovirus
()

2.7.3. Cấu trúc DNA-B
DNA-B bao gồm gen BV1 và BC2, các gen này cần thiết cho sự di chuyển hệ
thống và từ tế bào này sang tế bào khác.
BV1 là một protein con thoi: BV1 có chức năng chức năng vận chuyển virus vào và ra
khỏi tế bào, tuy vậy nó không liên quan đến việc nhập nhân của virus trong lúc xâm nhiễm,
chức năng này được kiểm soát bởi CP.
BV1 tương tác với BC1 trong việc di chuyển giữa các tế bào: Bắt đầu từ nhân BV1
tạo một phức hợp với ssDNA, phức hợp này đi ra tế bào chất và kết hợp với BC1 tạo thành
phức hợp BV1 : ssDNA : BC1sau đó di chuyển đến sợi liên bào và chuyển sang tế bào khác
(Gafni and Epel, 2002). Vùng C cuối của BV1 Squash leaf curl virus (SqLCV) được xác
định là yếu tố cần thiết cho sự tương tác với BC1.
BC1 là một protein vận chuyển. Chức năng của BV1 giống như là một protein vận
chuyển (Rojas và cộng sự, 1998; Ward và cộng sự, 1997). Như đã được đề cập ở trên,
BC1 tương tác với BV1 thông qua phức hợp BV1:BC1:ssDNA để vận chuyển virus giữa
các tế bào (Gafni and Epel, 2002).

12


TRẦN NGỌC TIỆP




BC1 có liên quan trong tính gây bệnh. Sự kết hợp của BC1 trong tính gây bệnh đã
được chứng minh thông qua thí nghiệm chuyển gen. Thuốc lá và cà chua đã được chuyển
gen BC1 của Tomato mottle virus (TMoV) và BDMV, lần lượt những đặc điểm điển hình
của virus xâm nhiễm đã được nhận thấy.

Hình 2.4: Cấu trúc phân tử DNA-B của Begomovirus
()

2.7.4. Đặc điểm của vùng IR
Các đơn vị sao chép ngược nhau trên phân tử DNA-A và DNA-B cách nhau bởi vùng
liên gen (itergenic region (IR)), ở hầu hết các trường hợp chúng chia sẻ 1 vùng lặp lại cao xấp
xỉ 200 nucleotide, gọi là vùng chung (common region (CR)). Vùng CR có chứa một điểm
bắt đầu tái bản (ori) có tổ chức bao gồm một cấu trúc thòng lọng (Stem-loop), cấu trúc
này chứa một trình tự nuleotide bất biến ngắn TAATATTAC, tại vị trí T7-C8 cần cho việc
cắt và nối DNA của virus trong quá trình tái bản. IR có một cấu trúc nhận biết đặc hiệu của
virus đã được xác định nằm dưới cấu trúc stem-loop, nó chứa một motif được gọi là Interon
(G. R. Argüello-Astorga và R. Ruiz-Medrano, 2001), cần thiết cho nhận biết và bám vào sợi
DNA của virus để bắt đầu tái bản. Sự tái tổ hợp của virus phụ thuộc vào motif này. Các virus
có chung motif ở vùng IR có khả năng tái tổ hợp với nhau. Mỗi một motif sẽ tương ứng với
một trình tự đặc trưng trên đầu N (Interon related domain – IRD) của protein REP.
2.7.5. Cấu trúc của DNA-β
Phân tử DNA-β đã thi hút được sự chú ý kể từ khi Saunders và cộng sự (2000);
Briddon và cộng sự (2001) chứng minh rằng triệu chứng điển hình trên cây ageratum (bệnh

13


TRẦN NGỌC TIỆP




vàng gân trên cây ageratum) và cây bông (bệnh cuốn lá bông) chỉ có thể hình thành khi
Ageratum yellow vein virus (AYVV) và Cotton leaf curl virus (CLCV) cũng được lây
nhiễm với một phân tử DNA – β tương ứng. Phân tử DNA-β có bộ gen sợi vòng đơn với
kích thước xấp xỉ 1350 nucleotide mang 3 vùng đặc trưng (Briddon và cộng sự, 2003).
Vùng bảo thủ của vệ tinh (Satellite conserved region (SCR): Vùng này khoảng 200
nucleotide bao quanh cấu trúc stem-loop có mang một chuỗi trình tự ngắn
TAT/ATATTAC đặc trưng của nanovuruses và geminiviruses và một vùng bảo thủ cao
với trên 100 nucleotide đã được xác định nằm ở phía bên phải của đầu 5’ của stem-loop.
Vùng bảo tồn này có rất nhiều GC xấp xỉ khoảng 70% (Briddon và cộng sự, 2003).
Vùng giàu A (A rich region): Phân tử DNA-β chứa một vùng giàu A (đặc trưng 160180 nucleotide có khoảng 60 % A) (Briddon và cộng sự, 2003). Vị trí được xác định nằm
nằm giữa nucleotide ±700 và ±1000 (Zhou và cộng sự, 2003). Có ý kiến rằng vùng giàu A
này đã được thêm vào nhằm tăng thêm kích thước của chúng để trở thành có kích thước
xấp xỉ kích thước ½ kích thước của bộ gen virus (Mansoor và cộng sự, 2003). Bằng cách
này phân tử DNA-β có thể lắp ráp được thông qua cơ chế chọn lọc kích thước nghiêm
ngặt trong phân tử virus (Etessami và cộng sự, 1989; Rojas và cộng sự, 1998).
Vùng ngược nghĩa mã hóa: Phân tử DNA-β mang một khung đọc mở βC1 trên sợi
phía bên phải của genome, mã hóa 1 protein với kích thước 118 amino acids. Sản phN m
của βC1 đã được chứng minh là có chức năng trong biểu hiện triệu chứng và được cho là
có khả năng ngăn chặn phản ứng phòng thủ của cây (Zhou và cộng sự (2003); Cui và
cộng sự, 2005).

SCR=Satellite Conserved
Region

Hình 2.5: Cấu trúc của phân tử DNA-β

()
14



TRẦN NGỌC TIỆP



2.7.6. Cấu trúc của Nanovirus-like DNA-1
Phân tử Nanovirus like-DNA 1 lần đầu tiên được phát hiện cùng với một
Geminiviruses được phân lập từ cây bông bị bệnh cuốn lá bông (Cotton leaf curl virus
(CLCuV)) tại Pakistan (Man Soor và cộng sự, 1999). Tiếp theo đó sau đó những phân tử
tương tự cũng đã được tìm thấy trên một số cây trồng khác bị nhiễm bởi begomovirus có bộ
gen đơn từ các nước thuộc cựu thế giới (Briddon và cộng sự, 1994). Những phân tử này được
gọi là Nanoviruslike DNA-1 vì chúng có đặc điểm giống nanovirus. Chiều dài đầy đủ trung
bình của chúng khoảng 1375 nucleotide. Về cấu trúc các phân tử bao gồm: (1) Một cấu trúc
stem-loop gồm một vòng thòng lọng (loop) với một chuỗi bảo thủ ngắn TAGTAATAT. (2)
Một khung đọc mở trên mạch chính mã hóa cho một protein có kích thước khảng 315 aa và
tương đương với protein rep của các nanovirus. (3) Một vùng giàu A nắm ở phía dưới của
vùng mã hóa (đặc trưng 100-200 nucleotide) (Briddon và cộng sự, 2004). Trình tự Rep của
nanovirus-like DNA-1 có tính bảo thủ cao (hơn 86% trình tự amino axit giống nhau)
(Briddon và cộng sự, 2004). Các phân tử DNA-1 có thể tái bản độc lập, nhưng chúng vẫn phụ
thuộc vào sự giúp đỡ của virus cho việc di chuyển hệ thống vì chúng có thể lắp ráp được
trong phân tử begomovirus. Tuy nhiên, trái với DNA-β, các phân tử Nanovirus like-DNA 1
không có vai trò trong tính gây bệnh.

Hình 2.6: Cấu trúc của phân tử vệ tinh Nanovirus-like DNA-1

()

15



TRẦN NGỌC TIỆP



2.8. Quá trình tái bản của Begomovirus
Begomovirus, giống như các geminivirus khác, tái sinh theo cơ chế vòng lăn
(rolling circular mechanism). Cơ chế vòng lăn có thể được chia làm 2 pha và được
thực hiện trong nhân tế bào ký chủ (Gutierrez và cộng sự, 2004; Pico và cộng sự,
1996).
Pha tổng hợp sợi DNA vòng đơn (bộ gien có trong phân tử virus) thành sợi DNA
vòng kép khi bộ gien virus được chuyển vào nhân tế bào. Như vậy sợi kép sẽ gồm một sợi
virus và một sợi tương đồng virus. Pha này vẫn chưa được hiểu rõ.
Pha tái sinh theo cơ chế vòng lăn: Protein Rep (sau khi được tổng hợp) sẽ cắt sợi
virus tại chuỗi bảo toàn TATATTAC. Nhờ vật liệu cũng như enzyme DNA polymearase
của tế bào, sợi virus được tổng hợp liên tục trên sợi tương đồng virus. Protein Rep lại tiếp
tục cắt sợi virus mới được tổng hợp tại chuỗi TATATTAC (cũng vừa mới được tổng hơp)
thành một sợi virus hoàn chỉnh dưới dạng sợi đơn mạch thẳng. Protein Rep sau đó sẽ nối
2 đầu của mạch thẳng để tạo ra bộ gien virus sợi đơn mạch vòng hoàn chỉnh.
Ngoài đường hướng tái bản vòng lăn người ta còn phát hiện ra đường hướng tái tổ
hợp phụ thuộc vào tái bản (recombination dependent replication (RDR)). Đến nay đường
hướng này vẫn chưa làm rõ.
2.9. Tương tác và tái tổ hơp của Begomovirus
Cây trồng ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới thường bị nhiễm hai hoặc nhiều
geminivirus (Toress-Pahceco và cộng sự, 1996; Harrison, 1997; Sanz và cộng sự, 2000;
Pita và cộng sự 2001b; Ribeiro và cộng sự, 2003). Trong cây virus tượng tác với nhau tạo
ra phức hợp bệnh (complex disease) (Fondong và cộng sự, 2000; Chatchawankanphanich
và Maxwell, 2002; Monci và cộng sự, 2002). Kiểu tương tác đồng nhiễm bệnh của các
virus (co-infection virus) tạo ra triệu trứng rõ rệt hơn khi quan sát ở cây bị từng loại virus
riêng (Kamei, 1969; Pruss và cộng sự,1997).

Tương tác có thể là sự bổ trợ (complementation) (Berie và cộng sự, 2001) hoặc tái
tổ hợp (Sabz và cộng sự, 200; Pita và cộng sự, 2001b; Saunders và cộng sự, 2001;
Mendez Lozano và cộng sự, 2003).

16


TRẦN NGỌC TIỆP



Tác dụng phối hợp giữa hai geminivirus tái tổ hợp mới có thể xảy ra, và tạo ra
nhiều triệu trứng hơn. Ví dụ như ở Cameroon, tái tổ hợp kép (double recombinant) được
tạo thành khi đồng xâm nhiễm các isolate của African cassava mosaic virus, đã tạo ra
nhiều triệu trứng hơn so với cây bị nhiễm từng isolate riêng (Fondong và cộng sự, 2000).
Một ví dụ khác là sự tái tổ hợp tự nhiên giữa hai begomovirus là TYLCSV và TYLCV (
Tây Ba Nha), đã tạo ra virus khỏe hơn hai virus ban đầu (Monci và cộng sự, 2002).
Tái tổ hợp được cho là đóng vai trò quyết định tới sự tiến hóa của virus (Umaharan
và cộng sự, 1998), đặc biệt là ở quần thể geminivirus, góp phần tạo nên sự đa dạng di
truyền (Moffat, 1999; Sanz và cộng sự, 1999; Sanz và cộng sự, 2000). Tái tổ hợp của
begomovirus có thể xảy ra ở mức độ chủng (Fondong và cộng sự, 2000), loài (Briddon và
cộng sự, 1996; Martin và cộng sự 2001; Saunders và cộng sự, 2002), chi (Klute và cộng
sự, 1996; Saunders và Stanley, 1999), và ngay trong cùng một họ (Jones, 2003).

17